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Bioengineering

मानव तंत्रिका संरचनाओं के एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग के लिए माइक्रोगेल-एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स कम्पोजिट सपोर्ट

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/65158
Automatic Translation
1, 2, 2, 3
1Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), University of Copenhagen, 2Department of Health Technology (DTU Health Tech), Technical University of Denmark, 3Department of Biotechnology and Biomedicine (DTU Bioengineering), Technical University of Denmark

Summary

यह काम स्व-उपचार एनेलेबल कण-बाह्य मैट्रिक्स कंपोजिट के अंदर तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के फ्रीफॉर्म एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल उच्च निष्ठा के साथ परस्पर जुड़े मानव तंत्रिका ऊतक संरचनाओं के प्रोग्राम करने योग्य पैटर्निंग को सक्षम बनाता है।

Abstract

एक दानेदार समर्थन माध्यम के अंदर कोशिकाओं की एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग पिछले दशक में नरम ऊतक संरचनाओं के फ्रीफॉर्म बायोफैब्रिकेशन के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में उभरी है। हालांकि, दानेदार जेल फॉर्मूलेशन को सीमित संख्या में बायोमैटेरियल्स तक सीमित कर दिया गया है जो बड़ी मात्रा में हाइड्रोगेल माइक्रोपार्टिकल्स की लागत प्रभावी पीढ़ी की अनुमति देते हैं। इसलिए, दानेदार जेल समर्थन मीडिया में आम तौर पर देशी बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में पाए जाने वाले सेल-चिपकने वाले और सेल-शिक्षाप्रद कार्यों की कमी होती है।

इसे संबोधित करने के लिए, स्व-उपचार एनेलेबल कण-बाह्य मैट्रिक्स (शेप) कंपोजिट की पीढ़ी के लिए एक पद्धति विकसित की गई है। शेप कंपोजिट में एक दानेदार चरण (माइक्रोगेल) और एक निरंतर चरण (चिपचिपा ईसीएम समाधान) होता है, जो एक साथ, प्रोग्राम करने योग्य उच्च-निष्ठा मुद्रण और एक समायोज्य जैव-कार्यात्मक बाह्य वातावरण दोनों की अनुमति देता है। यह काम बताता है कि मानव तंत्रिका संरचनाओं के सटीक बायोफैब्रिकेशन के लिए विकसित पद्धति का उपयोग कैसे किया जा सकता है।

सबसे पहले, एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स, जो शेप कंपोजिट में दानेदार घटक के रूप में काम करते हैं, को कोलेजन-आधारित निरंतर घटक के साथ निर्मित और संयुक्त किया जाता है। फिर, मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को समर्थन सामग्री के अंदर मुद्रित किया जाता है, इसके बाद समर्थन की एनीलिंग होती है। मुद्रित संरचनाओं को न्यूरॉन्स में मुद्रित कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति देने के लिए हफ्तों तक बनाए रखा जा सकता है। इसके साथ ही, कोलेजन निरंतर चरण अक्षीय वृद्धि और क्षेत्रों के अंतर्संबंध की अनुमति देता है। अंत में, यह काम 3 डी-मुद्रित मानव तंत्रिका संरचनाओं को चिह्नित करने के लिए लाइव-सेल फ्लोरेसेंस इमेजिंग और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री करने के तरीके के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

Introduction

सेल से लदी हाइड्रोगेल संरचनाओं की सटीक और प्रोग्राम करने योग्य 3 डी प्रिंटिंग जो विट्रो में नरम ऊतकों की नकल करती है, एक बड़ी चुनौती प्रस्तुत करती है। उदाहरण के लिए, नरम हाइड्रोगेल के प्रत्यक्ष एक्सट्रूज़न पर आधारित प्रयास स्वाभाविक रूप से समस्याग्रस्त हैं, क्योंकि विवो माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: उत्पन्न करने के लिए आवश्यक खराब यांत्रिक गुणों से संरचनात्मक अखंडता की कमी, पूर्वनिर्धारित विशेषताओं की विकृति, या गढ़ी गई संरचनाओं का पूर्ण पतन होता है। इस मुद्दे के लिए एक पारंपरिक समाधान एक कठोर जैव-संगत सामग्री से एक सहायक मचान मुद्रित करना है जो अंतिम निर्माण को अपना आकार बनाए रखने की अनुमति देता है। हालांकि, यह दृष्टिकोण डिजाइन की संभावनाओं को बहुत सीमित करता है और आसन्न स्याही के सावधानीपूर्वक रियोलॉजिकल फाइन-ट्यूनिंग की आवश्यकता होती है।

पारंपरिक परत-दर-परत एक्सट्रूज़न-आधारित 3 डी प्रिंटिंग की सीमाओं को दूर करने के लिए, एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग हाल के वर्षों में नरम सामग्री और ऊतक निर्माण 1,2,3,4,5,6 के लिए एक शक्तिशाली विकल्प के रूप में उभरी है। एक सतह के शीर्ष पर परिवेशी हवा में स्याही को बाहर निकालने के बजाय, स्याही को सीधे एक समर्थन स्नान के अंदर एक सिरिंज सुई के माध्यम से जमा किया जाता है जो आराम से ठोस जैसा होता है, लेकिन नरम सेल से लदी सामग्री के सटीक जमाव की अनुमति देने के लिए चलती सुई की नोक के चारों ओर विपरीत रूप से द्रवित होता है। जमा की गई सामग्री को जगह में रखा जाता है क्योंकि सुई के मद्देनजर समर्थन फिर से जम जाता है। जैसे, एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग विस्तारित डिजाइन संभावनाओं 7,8 के साथ नरम बायोमैटेरियल्स से जटिल संरचनाओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्रीफॉर्म निर्माण की अनुमति देता है।

एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग के लिए समर्थन स्नान सामग्री के रूप में दानेदार जैल का बड़े पैमाने पर पता लगाया गया है, क्योंकि उन्हें कम उपज तनाव 9,10,11 पर चिकनी, स्थानीयकृत और प्रतिवर्ती ठोस-से-तरल संक्रमण प्रदर्शित करने के लिए तैयार किया जा सकता है। जबकि वे उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रिंटिंग के लिए उत्कृष्ट रियोलॉजिकल गुण दिखाते हैं, दानेदार जैल को मुट्ठी भर बायोमैटेरियल्स12 तक सीमित कर दिया गया है। दानेदार जेल फॉर्मूलेशन में विविधता की कमी, जो विशेष रूप से स्पष्ट है यदि कोई थोक हाइड्रोगेल फॉर्मूलेशन के लिए उपलब्ध बायोमैटेरियल्स की विस्तृत श्रृंखला पर विचार करता है, तो सरल रसायनज्ञों का उपयोग करके बड़ी संख्या में माइक्रोगेल की लागत प्रभावी पीढ़ी की आवश्यकता के कारण होता है। दानेदार जेल समर्थन के सीमित बायोमटेरियल परिदृश्य के कारण, प्रिंटिंग समर्थन द्वारा प्रदान किए गए बाह्य माइक्रोएन्वायरमेंट की ट्यूनिंग क्षेत्र में एक चुनौती प्रस्तुत करती है।

हाल ही में, एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग समर्थन की पीढ़ी के लिए एक मॉड्यूलर दृष्टिकोण विकसित किया गया है, जिसे स्व-उपचार एनेलेबल कण-बाह्य मैट्रिक्स (शेप) कंपोजिट13 कहा जाता है। यह दृष्टिकोण थोक हाइड्रोगेल योगों की जैव-कार्यात्मक बहुमुखी प्रतिभा के साथ दानेदार जैल के विशिष्ट रियोलॉजिकल गुणों को जोड़ता है। प्रस्तुत शेप कम्पोजिट समर्थन में पैक ्ड एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स (दानेदार चरण, ~ 70% वॉल्यूम अंश) होते हैं, जिसमें चिपचिपा कोलेजन-आधारित ईसीएम प्रीगेल समाधान (निरंतर चरण, ~ 30% वॉल्यूम अंश) से भरा एक बढ़ा हुआ अंतरालीय स्थान होता है। यह आगे दिखाया गया है कि शेप समर्थन मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एचएनएससी) के उच्च-रिज़ॉल्यूशन जमाव की सुविधा प्रदान करता है, जो समर्थन स्नान के एनीलिंग के बाद, न्यूरॉन्स में विभेदित किया जा सकता है और कार्यात्मक परिपक्वता तक पहुंचने के लिए हफ्तों तक बनाए रखा जा सकता है। शेप सपोर्ट बाथ के अंदर एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग एक बहुमुखी मंच प्रदान करते हुए तंत्रिका ऊतक बायोफैब्रिकेशन के लिए पारंपरिक तकनीकों से संबंधित कुछ प्रमुख सीमाओं को दूर करती है।

यह काम शेप समर्थन के अंदर एचएनएससी के एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग और कार्यात्मक न्यूरॉन्स में उनके बाद के भेदभाव के लिए चरणों का विवरण देता है (चित्रा 1)। सबसे पहले, आंतरिक गेलेशन के दौरान कतरनी के माध्यम से एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स उत्पन्न होते हैं। यह दृष्टिकोण विशेष उपकरणों और साइटोटोक्सिक अभिकर्मकों की आवश्यकता के बिना माइक्रोपार्टिकल्स की बड़ी मात्रा की आसान पीढ़ी की अनुमति देता है। इसके अलावा, एल्गिनेट सेल प्रकारों की एक विविध श्रृंखला के लिए बायोकंपैटिबल हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स के गठन के लिए एक व्यापक रूप से उपलब्ध और किफायती सामग्री स्रोत है। उत्पन्न एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स को शेप समग्र समर्थन सामग्री बनाने के लिए कोलेजन समाधान के साथ जोड़ा जाता है। फिर, एचएनएससी को काटा जाता है और 3 डी प्रिंटिंग के लिए सेलुलर बायोइंक के रूप में एक सिरिंज में लोड किया जाता है। शेप कम्पोजिट के अंदर एचएनएससी के एक्सट्रूज़न-आधारित एम्बेडेड प्रिंटिंग के लिए एक 3 डी बायोप्रिंटर का उपयोग किया जाता है। 3 डी-मुद्रित कोशिकाओं को स्थानिक रूप से परिभाषित और कार्यात्मक मानव तंत्रिका संरचनाओं को जन्म देने के लिए न्यूरॉन्स में विभेदित किया जाता है। अंत में, प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे उत्पन्न ऊतक संरचनाओं को लाइव-सेल इमेजिंग और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके विशेषता दी जा सकती है। साथ ही, अनुकूलन और समस्या निवारण के लिए युक्तियाँ प्रदान की जाती हैं। विशेष रूप से, दानेदार और निरंतर चरणों के दोनों घटकों को अन्य हाइड्रोगेल योगों के साथ आदान-प्रदान किया जा सकता है ताकि विभिन्न बायोफंक्शनल मोइटीज़, मैकेनिकल गुणों और क्रॉसलिंकिंग तंत्र को समायोजित किया जा सके, जैसा कि तंत्रिका अनुप्रयोगों से परे अन्य सेल और ऊतक प्रकारों द्वारा आवश्यक है।

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Protocol

1. बफर और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. एल-एलानिल-एल-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड के साथ डीएमईएम /एफ 12 में निम्नलिखित पूरक जोड़कर सेल विकास माध्यम तैयार करें: 30 एमएम ग्लूकोज, 5 μM HEPES, 0.5% डब्ल्यू / वी लिपिड समृद्ध गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, 40 μM L-एलानिन, 40 μM L-asparagine मोनोहाइड्रेट, 40 μM L-aspartic acid, 40 μM L-ग्लूटामिक एसिड, 40 μM L-proline, 1% N2 पूरक, 1% N2 पूरक, 1% Pnicillin-streploine, 1% इन चरणों को एक लामिनार एयर-फ्लो (एलएएफ) बेंच में करें।
  2. 60 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए जोर से हिलाते हुए अल्ट्राप्योर पानी में 1% डब्ल्यू / वी एल्गिनेट घोल तैयार करें। एक एलएएफ बेंच में 0.45 μm छिद्र-आकार के फ़िल्टर के साथ घुलित, गर्म एल्गिनेट समाधान को बाँझ-फ़िल्टर करें। इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यदि एल्गिनेट समाधान का तापमान 60 डिग्री सेल्सियस से नीचे है, तो इसे फिल्टर के माध्यम से पारित करना संभव नहीं होगा।
  3. अल्ट्राप्योर पानी में 37 ग्राम /लीटर NaHCO3 घोल तैयार करें। NaOH का उपयोग करके समाधान के पीएच को 9.5 तक समायोजित करें, और एलएएफ बेंच में फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें। घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. शेप मिश्रित सामग्री तैयार करना

  1. एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल जनरेशन
    1. एक बाँझ बीकर में अल्ट्राप्योर पानी में 2 मिलीग्राम / एमएल सीएसीओ3 समाधान तैयार करें। इसे एल्गिनेट घोल के साथ 1: 1 मिलाएं, और चुंबकीय हलचल का उपयोग करके कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए हिलाएं।
    2. 1: 500 अनुपात में एसिटिक एसिड जोड़ें, और 650 आरपीएम पर रात भर हिलाना छोड़ दें।
      नोट: एल्गिनेट समाधान तुरंत जेलिंग शुरू कर देगा। बनाने वाले जेल की इष्टतम, सजातीय सरगर्मी सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लासवेयर के व्यास के समान लंबाई के साथ एक सरगर्मी चुंबक का उपयोग करना सुनिश्चित करें। अगले दिन, गेलेशन के दौरान हिलाने के माध्यम से उत्पन्न समाधान चिपचिपा दिखाई देगा (चित्रा 2 ए)।
    3. यांत्रिक रूप से जेल्ड एल्गिनेट समाधान को 10 मिनट के लिए 15,000 आरपीएम पर एक एलएएफ बेंच (चित्रा 2 बी) में रखे होमोजिनाइज़र के साथ समरूप करके माइक्रोपार्टिकल्स में विभाजित करें।
    4. कमरे के तापमान पर 20 मिनट (चित्रा 2 सी) के लिए 18,500 × ग्राम पर माइक्रोपार्टिकल्स को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. एलएएफ बेंच के अंदर सतह पर तैरनेवाले को सावधानीपूर्वक छोड़ दें, डीएमईएम में कणों को 2 एमएम एनएओएच और 1% पी / एस युक्त पुन: निलंबित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2 डी) पर रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: निलंबन का रंग लाल पर वापस जाना चाहिए। यदि निलंबन पीला रहता है, तो NaOH ड्रॉपवाइज जोड़ें, और लाल होने तक मिलाएं (चित्रा 2E)।
    6. 3 मिनट के लिए 15,000 आरपीएम पर कणों को समरूप करें, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 18,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    7. गोली (चित्रा 2 एफ) का निरीक्षण करें, और सतह पर तैरनेवाले को सावधानी से हटा दें।
      नोट: कसकर पैक किए गए एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स की गोली को आगे के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। यदि एल्गिनेट समाधान फ़िल्टर-स्टरलाइज़ नहीं किया गया था, तो माइक्रोपार्टिकल्स का उपयोग 1 सप्ताह के भीतर किया जाना चाहिए।
  2. शेप कम्पोजिट फॉर्मूलेशन
    1. मुद्रण से एक दिन पहले, एलएएफ बेंच में 4% एचईपीईएस (1 एम स्टॉक) और 4% एनएएचसीओ3 समाधान युक्त विकास माध्यम की मात्रा से दोगुनी मात्रा में एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल गोली को फिर से निलंबित करें, और इसे कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 18,500 × ग्राम पर माइक्रोगेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
    3. एलएएफ बेंच में एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स के साथ मिश्रित होने के लिए कोलेजन को बेअसर करें। एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए कोलेजन स्टॉक समाधान को पतला करें, और 4% एचईपीईएस और 4% एनएएचसीओ3 जोड़कर इसे बेअसर करें। उदाहरण के लिए, शेप कम्पोजिट के 3 एमएल के लिए, 1 एमएल न्यूट्रलाइज्ड कोलेजन (एचईपीईएस के 0.12 एमएल, एनएएचसीओ3 के 0.12 एमएल, विकास माध्यम के 0.16 एमएल और कोलेजन के 0.6 एमएल) के साथ 2 एमएल एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स मिलाएं।
      नोट: कोलेजन पोलीमराइजेशन से बचने के लिए कोलेजन के साथ मिश्रित होने वाली सभी सामग्रियों को बर्फ पर संभालने की आवश्यकता होती है। जैसे ही कोलेजन को बेअसर किया जाता है, पोलीमराइजेशन धीरे-धीरे शुरू हो जाएगा।
    4. 2: 1 अनुपात में पतला और बेअसर कोलेजन के साथ एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल गोली को मिलाकर शेप कम्पोजिट उत्पन्न करें। एलएएफ बेंच में बर्फ पर धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके जेल को अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: भंवर न करें, क्योंकि यह समर्थन सामग्री में बुलबुले पेश करेगा।
    5. एक एलएएफ बेंच में, उत्पन्न मिश्रित सामग्री को एक ठंडा माइक्रोवेल प्लेट या किसी भी उपयुक्त प्रिंटिंग कंटेनर में स्थानांतरित करें, और 30 मिनट के भीतर उपयोग करें (चित्रा 3 ई, एफ)।

3. एचएनएससी संस्कृति और बायोइंक तैयारी

  1. एक तहखाने की झिल्ली में कोशिकाओं को विकास माध्यम में लेपित टी 75 फ्लास्क में कल्चर करें। 3 डी प्रिंटिंग प्रयोग के लिए उपयोग करने से पहले पिघलने के बाद कोशिकाओं को कम से कम दो बार पारित करें।
  2. मुद्रण से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.025% ट्रिप्सिन समाधान का उपयोग करके कोशिकाओं को एंजाइमेटिक रूप से अलग करें, ट्रिप्सिन को विकास माध्यम के साथ बेअसर करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और 2-3 एमएल विकास माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें।
  3. एक सेल गिनती करें, कोशिकाओं को 400 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और 9 × 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर 0.1% ज़ैंथन गम (कोशिकाओं को तलछट से रोकने के लिए) के साथ पूरक विकास माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें।
  4. एक सिरिंज में कसकर पैक किए गए एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स के 100 μL को लोड करने के लिए 21 ग्राम कुंद धातु की सुई का उपयोग करें (चित्रा 3 ए)।
    नोट: एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स के साथ एक प्लग बनाना दो उद्देश्यों को पूरा करता है: यह मुद्रण के दौरान एक्सट्रूज़न स्थिरता बनाए रखने में मदद करता है और लोड किए गए सेलुलर स्याही (कोई मृत मात्रा नहीं) के पूर्ण एक्सट्रूज़न की अनुमति देता है।
  5. उसी सुई का उपयोग करके, तैयार सेल निलंबन को सिरिंज में लोड करें (चित्रा 3 बी)।
    नोट: सिरिंज-लोडिंग चरणों के दौरान किसी भी हवा के बुलबुले को पेश न करने के लिए अतिरिक्त सावधानी बरतें। हवा के बुलबुले मुद्रण के दौरान अस्थिरता पैदा करेंगे।
  6. लोडिंग सुई को 27 ग्राम कुंद धातु की सुई से बदलें, जिसका उपयोग मुद्रण के लिए किया जाएगा (चित्रा 3 सी)।

4. एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग

  1. संदर्भित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रिंट करने के लिए एक संरचना डिज़ाइन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: मुद्रित संरचना की प्रारंभिक ऊंचाई को शेप समग्र समर्थन की गहराई के भीतर समायोजित करना सुनिश्चित करें। डिजाइन सुझाव चित्रा 4 ए (सर्पिल और लकड़ी के ढेर डिजाइन) में पाया जा सकता है।
  2. जेनरेट पर क्लिक करके एक जी-कोड उत्पन्न करें।
  3. एक्सट्रूज़न-आधारित बायोप्रिंटर (चित्रा 3 डी) पर एक वॉल्यूमेट्रिक एक्सट्रूज़न हेड में सेल से लदी ग्लास सिरिंज डालें।
  4. सुई लंबाई माप पर क्लिक करके सेल से भरे ग्लास सिरिंज की सुई की लंबाई को मापें।
  5. प्रिंटर पर शेप कम्पोजिट से भरी माइक्रोवेल प्लेट या कंटेनर रखें।
    नोट: समर्थन के समय से पहले क्रॉसलिंकिंग को रोकने के लिए मुद्रण तक सेल प्लेट या कंटेनर को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  6. एसएचएम (सतह ऊंचाई माप) पर क्लिक करके उसी माइक्रोवेल प्लेट या कंटेनर के भीतर एक खाली कुएं की सतह की ऊंचाई को मापें जिसमें शेप जेल लोड किया गया है।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, सुई के साथ कुएं की ऊंचाई को मापकर मैन्युअल रूप से सतह की ऊंचाई निर्धारित करें।
  7. एक्सट्रूज़न दर को 3.6 μL / min पर सेट करें और फ़ीड दर 0.3 मिमी /
    नोट: मुद्रण से पहले एक्सट्रूज़न का परीक्षण करना सुनिश्चित करें। सेल अवसादन नोजल क्लॉगिंग का कारण बन सकता है और वास्तविक एम्बेडेड प्रिंटिंग से पहले एक छोटी मात्रा को पूर्व-बाहर निकालकर या वॉल्यूमेट्रिक सिरिंज में एक वापसी मात्रा जोड़कर बचा जा सकता है। कुछ मामलों में, स्याही के खींचने से बचने के लिए सुई को शेप जेल में डालने या बाहर निकलने पर फ़ीड दर को 0.5 मिमी / सेकंड से नीचे रखने की आवश्यकता होती है।
  8. प्रिंटर के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में G-कोड लोड करें।
    नोट: डिज़ाइन की गई संरचना में हर बार परिवर्तन किए जाने पर एक नया जी-कोड उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है।
  9. रन (चित्रा 3 जी) पर क्लिक करके प्रिंट प्रक्रिया शुरू करें।
  10. मुद्रण के तुरंत बाद, एनीलिंग के लिए 30 मिनट के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर शेप जेल रखें।
  11. एनाल्ड शेप जेल समर्थन के शीर्ष पर धीरे से विकास माध्यम जोड़ें।
  12. अगले दिन, विकास माध्यम को निम्नानुसार तैयार विभेदन माध्यम से प्रतिस्थापित करें: डीएमईएम /एफ 12 के साथ एल-एलानिल-एल-ग्लूटामाइन डाइपेप्टाइड के साथ 30 एमएम ग्लूकोज, 5 μM HEPES, 0.5% डब्ल्यू / वी लिपिड युक्त गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, 40 μM L-एलानिन, 40 μM L-asparagine मोनोहाइड्रेट, 40 μM L-asparagine एसिड, 40 μM L-al-spartmic एसिड, 40 μM L-proline, 1% N2 पूरक और 2 एनजी / एमएल ग्लियल सेल-लाइन व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (जीडीएनएफ)।
    नोट: सुनिश्चित करें कि मध्यम परिवर्तन के दौरान हाइड्रोगेल को नुकसान न पहुंचे। प्लेट को झुकाएं, और पुराने माध्यम को धीरे से हटा दें। जेल के ऊपर सीधे जाने के बजाय जेल युक्त कुएं की दीवार पर ताजा माध्यम ड्रॉपवाइज जोड़ें। माध्यम को हटाने के लिए एस्पिरेटर का उपयोग न करें।
  13. प्रयोगात्मक समापन बिंदु तक हर 2 दिनों में भेदभाव माध्यम को ताज़ा करें।

5. लाइव-सेल फ्लोरेसेंस इमेजिंग

  1. जेल से अतिरिक्त माध्यम निकालें।
  2. समर्थन जेल की मात्रा में 20 μM कैल्सीन एएम (स्टॉक समाधान से विभेदन माध्यम में पतला) की एक समान मात्रा जोड़ें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. कैल्सीन एएम समाधान को हटा दें, और ताजा भेदभाव माध्यम की उचित मात्रा जोड़ें।
  5. इमेजिंग के लिए प्लेट को माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करें।

6. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री

  1. जेल से अतिरिक्त माध्यम निकालें।
  2. एक छोटे स्पैटुला का उपयोग करके, जेल को डीपीबीएस युक्त एक बड़े कंटेनर में स्थानांतरित करें।
  3. डीपीबीएस के साथ हर बार 20 मिनट के लिए तीन बार धोएं, और प्लेट को फ्यूम हुड में स्थानांतरित करें।
  4. डीपीबीएस को हटा दें, जेल को कवर करने के लिए पर्याप्त 4% फॉर्मलाडेहाइड समाधान जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. हर बार 20 मिनट के लिए डीपीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  6. डीपीबीएस में 5% गधे सीरम, 0.25% डिटर्जेंट और 0.02% सोडियम एज़ाइड से युक्त ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें।
    नोट: जेल को कवर करने के लिए आवश्यक मात्रा का तीन गुना तैयार करें; इसे बाद में प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधानों के आधार के रूप में उपयोग किया जाएगा।
  7. डीपीबीएस के साथ धोने के बाद, जेल में ब्लॉकिंग समाधान जोड़ें, और अस्पष्ट बंधन को रोकने के लिए कमरे के तापमान पर 6 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। प्लेट को धीरे से हिलाएं।
  8. 1: 1,000 के अनुपात में ब्लॉकिंग समाधान में टीयूबीबी 3 एंटीबॉडी को पतला करके प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
  9. जेल से ब्लॉकिंग समाधान निकालें, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। प्लेट को धीरे से हिलाएं।
  10. हर बार 20 मिनट के लिए डीपीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  11. ब्लॉकिंग समाधान में 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई, 1: 1,000) और द्वितीयक एंटीबॉडी (1: 200) को पतला करके द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
  12. डीपीबीएस के साथ धोने के बाद, जेल को 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान में इनक्यूबेट करें। प्लेट को धीरे से हिलाएं।
  13. हर बार 20 मिनट के लिए डीपीबीएस के साथ तीन बार धोएं, और इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  14. इमेजिंग से पहले, एक स्पैटुला के साथ सना हुआ जेल एक डिश या एक पतली इमेजिंग बॉटम के साथ एक अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें।

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Representative Results

आंतरिक गेलेशन के दौरान कतरनी पतलेपन के माध्यम से एल्गिनेट माइक्रोगेल तैयार करने के बाद यांत्रिक विखंडन से एल्गिनेट माइक्रोगेल उत्पन्न होते हैं जो आकार में पॉलीस्प्रेटेड होते हैं और आकार में गुच्छे जैसे होते हैं जैसा कि चित्रा 2 जी में देखा गया है। इन अनियमित कणों का आकार व्यास में 1 μm से कम से लेकर लगभग 40 μm तक होता है। जब कसकर पैक किया जाता है, तो माइक्रोपार्टिकल्स एक पारदर्शी थोक सामग्री बनाते हैं जो संबंधित सेल कल्चर माध्यम (चित्रा 2 एफ) की तुलना में केवल थोड़ा अधिक अपारदर्शी होता है। समर्थन सामग्री की पारदर्शिता मंच का एक महत्वपूर्ण पहलू है क्योंकि यह संवर्धन अवधि के दौरान मुद्रित संरचनाओं के विज़ुअलाइज़ेशन के साथ-साथ लाइव-सेल रंगों और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री दोनों के माध्यम से लेबल किए गए निर्माणों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए अनुमति देता है। जब बफर ्ड सेल कल्चर माध्यम में भिगोया जाता है, तो परिणामस्वरूप पीएच-समायोजित जेल में लाल रंग होना चाहिए, जो शारीरिक स्थितियों को दर्शाता है (चित्रा 2 एफ)। दो कारणों से एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स के पीएच को बेअसर करना महत्वपूर्ण है। अम्लीय माइक्रोपार्टिकल्स सीधे कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकते हैं। इसके अलावा, एक अम्लीय वातावरण शेप समग्र समर्थन के सफल एनीलिंग को रोक देगा, क्योंकि यह कोलेजन पोलीमराइजेशन में हस्तक्षेप करेगा।

ऊपर वर्णित मापदंडों का उपयोग करके एचएनएससी स्याही को प्रिंट करने से कोशिकाओं का एक फिलामेंट उत्पन्न होता है जो व्यास में ~ 200 μm हैं (चित्रा 4 ए)। प्रोग्राम की गई ज्यामिति को एक विमान में मुद्रण करते समय और एक दूसरे के ऊपर संरचनाओं को प्रिंट करते समय संरक्षित किया जाता है। बहु-परत मुद्रण के मामले में, मुद्रित संरचनाएं बरकरार रहती हैं, जिसमें न्यूनतम परत-से-परत दूरी 200 μm13 होती है। स्याही की तैयारी और एक्सट्रूज़न के दौरान कोशिकाओं की व्यवहार्यता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया जाना चाहिए। मुद्रित किस्में जीवित कोशिकाओं से समृद्ध होती हैं जिनमें एक गोल आकृति विज्ञान होता है (चित्रा 4 बी, बाएं)। मुद्रित किस्में में अंतराल मुद्रण के एक दिन बाद दिखाई दे सकते हैं, भले ही गढ़ा हुआ निर्माण मुद्रण के तुरंत बाद कोई विकृति न दिखाए। यह सबसे अधिक संभावना समर्थन के असंगत मिश्रण का परिणाम है। चूंकि कोशिकाएं एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स के साथ बातचीत नहीं करती हैं, इसलिए वे एल्गिनेट समृद्ध क्षेत्रों से कोलेजन- और सेल-समृद्ध क्षेत्रों की ओर पलायन करती हैं, इस प्रकार मुद्रित किस्में में टूट जाती हैं। इसके अलावा, शेप समर्थन बुलबुला-मुक्त होना चाहिए, क्योंकि एयर पॉकेट प्रिंटिंग निष्ठा में हस्तक्षेप कर सकते हैं।

एचएनएससी के सफल भेदभाव से प्रिंटिंग के 30 दिनों के बाद न्यूरॉन-समृद्ध संरचनाएं उत्पन्न होनी चाहिए, जिसमें कोशिकाएं छोटे सेल निकायों और लंबी पतली प्रक्रियाओं के साथ न्यूरोनल आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करती हैं (चित्रा 4 बी, दाएं)। इसके अलावा, यदि घने पैटर्न मुद्रित होते हैं, जैसे कि कोशिकाओं की आयताकार शीट, तो भेदभाव के दौरान बनने वाले कोई दृश्य अंतराल या समुच्चय नहीं होने चाहिए, बल्कि कोशिकाओं की एक निरंतर परत बरकरार रहनी चाहिए (चित्रा 4 सी)। इस प्रोटोकॉल में, 3 डी-मुद्रित नमूनों के प्रतिदीप्ति इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। टीयूबीबी 3, एक साइटोप्लाज्मिक न्यूरोनल मार्कर के लिए धुंधला, उत्पन्न न्यूरोनल नेटवर्क के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। विभेदित प्रिंटों की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को TUBB3 में समृद्ध संरचनाओं को प्रकट करना चाहिए और बनाए रखी ज्यामिति (चित्रा 4 डी, बाएं) के साथ। विभेदन प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाएं मुद्रित किस्में से बाहर नहीं निकलती हैं, जैसा कि डीएपीआई (चित्रा 4 डी, मध्य) के साथ सेल नाभिक के लिए धुंधला करके देखा जा सकता है। नतीजतन, न्यूरोनल निकायों को मुद्रित ज्यामिति की सीमाओं के भीतर देखा जाता है, अक्षीय अनुमानों के साथ जो निर्माण के आसपास शेप समर्थन में सैकड़ों माइक्रोमीटर निकलते हैं। आसपास की मात्रा का अक्षीय अन्वेषण इंगित करता है कि शेप समर्थन बायोफंक्शनल संकेत प्रदान करता है जो अक्षीय पाथफाइंडिंग की अनुमति देता है। उत्पन्न न्यूरोनल आबादी को और अधिक चिह्नित करने के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री में अधिक परिपक्व न्यूरोनल मार्कर या उपप्रकार-विशिष्ट मार्करों का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, मुद्रित न्यूरोनल निर्माण को आरटी-क्यूपीसीआर या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी13 का उपयोग करके विशेषता दी जा सकती है। हालांकि, दोनों दृष्टिकोणों को कोलेजनेज का उपयोग करके कोलेजन को हटाने की आवश्यकता होगी, क्योंकि हाइड्रोगेल परत आरएनए निष्कर्षण और माइक्रोपिपेट के साथ कोशिकाओं तक भौतिक पहुंच दोनों को बाधित करती है।

Figure 1
चित्रा 1: शेप एम्बेडेड प्रिंटिंग दृष्टिकोण का वैचारिक चित्रण। शेप कम्पोजिट बनाने के लिए एक कोलेजन समाधान को एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स के साथ मिलाया जाता है; शेप कम्पोजिट का उपयोग एचएनएससी के एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग के लिए एक समर्थन सामग्री के रूप में किया जाता है, जिसे एनाल्ड सपोर्ट के अंदर न्यूरॉन्स में विभेदित किया जाता है। शेप कम्पोजिट के बायोफंक्शनल गुण न्यूरॉन्स को अनुमानों का विस्तार करने और उनके अक्षीय अनुमानों के साथ समर्थन के खाली हिस्से को आबाद करने की अनुमति देते हैं। इस आंकड़े को Kajtez et al.13 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: शेप = स्व-उपचार एनेलेबल कण-बाह्य मैट्रिक्स; एचएनएससी = मानव तंत्रिका स्टेम सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स की तैयारी। (ए) रात भर गेलेशन के बाद एल्गिनेट समाधान। (बी) होमोजेनाइजेशन द्वारा उत्पन्न एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स। (सी) सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद कण गोली। (डी) पीएच समायोजन से पहले और पीएच समायोजन के बाद डीएमईएम (ई) में गोली को फिर से निलंबित कर दिया जाता है। (एफ) माइक्रोपार्टिकल्स रात भर मध्यम और सेंट्रीफ्यूजेशन में इनक्यूबेशन के बाद। (जी) निर्मित एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स की एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: 3 डी प्रिंटिंग प्रक्रिया के लिए तैयारी। (ए) एक घोल प्लग (~ 100 μL) सिरिंज में लोड किया जाता है, इसके बाद (बी) सेलुलर बायोइंक की लोडिंग (यहां विज़ुअलाइज़ेशन उद्देश्यों के लिए रंगीन मोतियों के साथ पूरक)। (सी) स्याही लोडिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले शंक्वाकार प्लास्टिक टिप (21 ग्राम) को 27 ग्राम कुंद धातु सुई की नोक से बदल दिया जाता है। (डी) सिरिंज को 3 डी प्रिंटिंग हेड में डाला जाता है। (E, F) शेप कम्पोजिट को 48-वेल प्लेट के कुएं में पाइप किया जाता है। शेप कम्पोजिट वाली ट्यूब को संभाला नहीं जाने पर बर्फ पर रखा जाता है। (जी) प्रिंटिंग सुई टिप को शेप सपोर्ट में डाला जाता है, और कंप्यूटर डिज़ाइन द्वारा परिभाषित पथ का मुद्रण शुरू किया जाता है (यहां, सर्पिल का मुद्रण दर्शाया गया है)। संक्षिप्त नाम: शेप = स्व-उपचार एनेलेबल कण-बाह्य मैट्रिक्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: शेप समग्र समर्थन के अंदर 3 डी-मुद्रित तंत्रिका संरचनाएं । (ए) समर्थन हाइड्रोगेल के अंदर मुद्रित एचएनएससी की ब्राइटफील्ड छवियां। सर्पिल (बाएं) और वुडपाइल (दाएं) निर्माण डिजाइन प्रदर्शित किए जाते हैं। (बी) मुद्रण (बाएं) और न्यूरोनल भेदभाव (दाएं) के एक दिन बाद 3 डी मुद्रित निर्माण की लाइव-सेल इमेजिंग। (सी) एक स्पैटुला के साथ एक संवर्धन कुएं से हटाया गया एक 3 डी-मुद्रित वर्ग निर्माण संरचनात्मक अखंडता को प्रदर्शित करता है। (डी) एक न्यूरोनल मार्कर (टीयूबीबी 3) के लिए एक ही वर्ग निर्माण इम्यूनोलेबल की प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल छवियां और काउंटरस्टेन्ड नाभिक (डीएपीआई) 3 डी-मुद्रित संरचनाओं के भीतर एचएनएससी के सफल भेदभाव की पुष्टि करते हैं। स्केल बार = 500 μm (A, दाएं); 100 μm (B, D)। इस आंकड़े में पैनल सी और डी को काजतेज एट अल .13 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

शेप समग्र सामग्री दृष्टिकोण सेलुलर स्याही के एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग के लिए एनालेबल और बायोफंक्शनल सपोर्ट बाथ के निर्माण के लिए एक बहुमुखी मार्ग प्रदान करता है। जबकि यह प्रोटोकॉल तंत्रिका संरचनाओं के 3 डी प्रिंटिंग का एक उदाहरण प्रदान करता है, शेप टूलबॉक्स को आसानी से लक्ष्य ऊतक प्रकारों की एक श्रृंखला की सटीक इंजीनियरिंग के लिए अन्य सेल स्रोतों के साथ बायोफैब्रिकेशन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। मुद्रण दृष्टिकोण कई सेल प्रकारों के सटीक पैटर्न िंग के लिए उनकी बातचीत का अध्ययन करने या सेलुलर डिब्बों (जैसे, न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं) की परिभाषित स्थानिक व्यवस्था के साथ ऊतकों को इंजीनियर करने की अनुमति देगा। पारंपरिक दानेदार जैल के विपरीत, शेप कम्पोजिट में एक विस्तारित अंतरालीय स्थान होता है (इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत फॉर्मूलेशन के लिए ~ 30% वॉल्यूम अंश)। दानेदार घटक एक रियोलॉजिकल संशोधक के रूप में कार्य करता है जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन एम्बेडेड प्रिंटिंग के लिए अनुकूल सामग्री गुणों के साथ समग्र प्रदान करता है। यह एक ही दानेदार घटक को रखते हुए निरंतर घटक के निर्माण को बदलकर सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट के तर्कसंगत डिजाइन की ओर एक मार्ग खोलता है। उदाहरण के लिए, अन्य कार्यात्मक ईसीएम अणुओं को समर्थन स्नान (जैसे, हाइलूरोनिक एसिड, लैमिनिन, फाइब्रोनेक्टिन) में पेश किया जा सकता है, या विभिन्न क्रॉसलिंकिंग तंत्रों का लाभ उठाया जा सकता है (जैसे, एंजाइमेटिक, प्रकाश-आधारित)13। इसके अलावा, दानेदार घटक में एल्गिनेट को विभिन्न हाइड्रोगेल सामग्री (जैसे, जिलेटिन8, पॉलीथीन ग्लाइकॉल14,15, अगारोस 16) से माइक्रोपार्टिकल्स के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है या विभिन्न ऊतक इंजीनियरिंग या रोग मॉडलिंग अनुप्रयोगों की आवश्यकताओं के अनुरूप विभिन्न आकारों और आकारों में बनाया जा सकता है। दानेदार और निरंतर चरण के बीच के अनुपात को व्यक्तिगत 3 डी प्रिंटिंग परियोजनाओं की जरूरतों के अनुसार ट्यून किया जा सकता है, लेकिन 30% से अधिक निरंतर चरण बढ़ाने से प्रिंटिंग निष्ठा और संकल्प से समझौता हो सकता है।

माइक्रोगेल उत्पादन चरणों के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि एसिटिक एसिड के अतिरिक्त के बाद एल्गिनेट समाधान की सरगर्मी जेलिंग समाधान की मात्रा में प्रभावी हो। यदि सरगर्मी की गति बहुत कम है या चुंबकीय हलचल बहुत छोटी है, तो सरगर्मी समाधान की ऊपरी परतों तक नहीं पहुंच सकती है, जो क्रॉसलिंक्ड बल्क हाइड्रोगेल की एक बड़ी मात्रा में बदल जाएगी, जबकि निचली परतों को कतरनी होगी। असंगत रूप से कतरनी एल्गिनेट हाइड्रोगेल के समरूपीकरण के परिणामस्वरूप एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स की पीढ़ी होगी जो 3 डी प्रिंटिंग अनुप्रयोगों के लिए उप-मानक हैं। इसके अलावा, एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स को कोलेजन समाधान के साथ अच्छी तरह से मिश्रित करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि एक गैर-समरूप मिश्रण के परिणामस्वरूप कोलेजन की कमी वाली समर्थन सामग्री के पैच होंगे; इन पैच को नष्ट नहीं किया जाएगा और इस प्रकार, सेल-इंटरैक्टिव सुविधाओं की कमी होगी। ऐसे पैच भी हो सकते हैं जिनमें एल्गिनेट माइक्रोपार्टिकल्स की कमी होती है और इसलिए, प्रिंटिंग का समर्थन नहीं करेंगे। इसलिए, एक असंगत रूप से मिश्रित मुद्रण समर्थन, उच्च-निष्ठा मुद्रण का समर्थन करने में सक्षम नहीं होगा और संरचनात्मक रूप से समझौता किया जाएगा, क्योंकि इसे इसकी पूरी मात्रा में नष्ट नहीं किया जाएगा। बुलबुले से भी बचा जाना चाहिए, इसलिए नहीं कि वे कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकते हैं, बल्कि इसलिए कि हवा की जेब मुद्रण के दौरान विरूपण पैदा कर सकती है और संरचनाओं की इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकती है। बुलबुले के दो सामान्य स्रोत भंवर (ठंडे समर्थन में माइक्रोबबल जो 37 डिग्री सेल्सियस पर समर्थन एनीलिंग के दौरान फैलते हैं) और जोरदार पाइपिंग हैं।

इस काम में शेप समग्र समर्थन को मुद्रण के बाद हटाने के लिए एक बलिदान सामग्री के रूप में तैयार नहीं किया गया था, बल्कि स्टेम सेल भेदभाव और न्यूरोनल विकास और कार्यात्मक परिपक्वता दोनों के लिए दीर्घकालिक जैव-कार्यात्मक समर्थन के रूप में तैयार किया गया था। दानेदार जैल की तुलना में जो पोस्ट-प्रिंटिंग के बाद नष्ट नहीं होते हैं, एनाल्ड शेप मिश्रित सामग्री की संरचनात्मक स्थिरता और पारदर्शिता निर्धारण और इम्यूनोलेबलिंग की प्रक्रिया के दौरान नाजुक न्यूरोनल विशेषताओं के लिए एक सुरक्षात्मक वातावरण प्रदान करती है, और इस तरह, यह सामग्री एंटीजन के विज़ुअलाइज़ेशन के माध्यम से रूपात्मक लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करती है। प्रतिदीप्ति संवाददाताओं का उपयोग समय के साथ सेलुलर आकृति विज्ञान में परिवर्तन को ट्रैक करने के साथ-साथ एनाल्ड प्रिंटिंग समर्थन के भीतर सेलुलर प्रसार और प्रवासन की निगरानी के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, कैल्शियम इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग सहज सेलुलर गतिविधि (जैसे, न्यूरॉन्स में कार्रवाई क्षमता या यहां तक कि सिंक्रोनस न्यूरोनल नेटवर्क गतिविधि की फायरिंग) पर जानकारी प्रदान करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, कोशिकाओं के आसपास हाइड्रोगेल परत के कारण इंजीनियर सेलुलर संरचनाओं की रासायनिक उत्तेजना (जैसे, केसीएल का उपयोग करके न्यूरोनल उत्तेजना) मुश्किल हो सकती है, जो प्रसार को धीमा कर देती है और सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट के तात्कालिक मॉड्यूलेशन को रोकती है। ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना सेलुलर गतिविधि के नियंत्रण के लिए एक बेहतर विकल्प प्रस्तुत करती है, क्योंकि शेप हाइड्रोगेल कोशिकाओं तक ऑप्टिकल पहुंच में बाधा नहीं डालते हैं।

ऑक्सीजन-संवेदनशील मोतियों को बायोइंक में या समर्थन सामग्री में (समग्र तैयारी के दौरान प्रत्यक्ष मुद्रण या फैलाव के माध्यम से ) शामिल किया जा सकता है ताकिउच्च संवेदनशीलता के साथ मुद्रित संरचनाओं के अंदर और आसपास ऑक्सीजन तनाव के स्तर के लाइव स्थानिक और अस्थायी मानचित्रण की अनुमति मिल सके। फॉस्फोरेसेंस जीवनकाल माप के आधार पर यह नॉनइनवेसिव 3 डी ऑक्सीजन मैपिंग दृष्टिकोण बेहतर ऑक्सीकरण के साथ इंजीनियरिंग ऊतक निर्माण की ओर एक मार्ग प्रदान करता है, और संभवतः पोषक तत्वों की आपूर्ति में भी सुधार करता है। खराब ऑक्सीकरण से मुद्रित संरचनाओं के भीतर नेक्रोटिक क्षेत्रों का गठन हो सकता है, स्टेम सेल भेदभाव में हस्तक्षेप हो सकता है, और न्यूरोनल चयापचय प्रभावित हो सकता है। ऑक्सीजन मैपिंग एक रीडआउट प्रदान करती है जिसके आधार पर 3 डी प्रिंटिंग डिज़ाइन को पूरे निर्माण में समान ऑक्सीकरण की सुविधा के लिए बदला जा सकता है, शारीरिक स्थितियों से मेल खाने के लिए ऑक्सीजन के स्तर को ठीक करना, या ऑक्सीजन ग्रेडिएंट ्स की पीढ़ी।

इंजीनियर चैनलों को जिलेटिन जैसे बलिदान स्याही, को प्रिंट करके एनेलेबल प्रिंटिंग सपोर्ट के अंदर भी शामिल किया जा सकता है, जो कोल्ड सपोर्ट बाथ के अंदर जम जाता है लेकिन आसानी से 37 डिग्री सेल्सियस 4,13 पर खाली किया जा सकता है। चैनलों को उच्च सेल घनत्व या आयामों के साथ ऊतक संरचनाओं को पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की आपूर्ति करने की आवश्यकता होगी जो डिजाइन-आधारित ऑक्सीजन तनाव हेरफेर दृष्टिकोण की क्षमताओं से अधिक हैं। इसके अतिरिक्त, संवहनी जैसे चैनलों का लाभ छोटे अणुओं के ग्रेडिएंट बनाने के लिए उठाया जा सकता है जो सेलुलर पहचान के पैटर्न को चलाते हैं, सेलुलर गतिविधि को संशोधित करते हैं, या केमोटैक्सिस का मार्गदर्शन करते हैं।

सारांश में, शेप कम्पोजिट के अंदर एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग एक मॉड्यूलर सामग्री मंच प्रदान करती है जो आसानी से अनुकूलनीय है और यांत्रिक रूप से संवेदनशील ऊतकों के कार्यात्मक मॉडलिंग के लिए बहुमुखी क्षमता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल समर्थन सामग्री उत्पन्न करने और उच्च निष्ठा के साथ सेलुलर स्याही को प्रिंट करने के लिए आवश्यक आवश्यक चरणों और बुनियादी सिद्धांतों की विस्तृत व्याख्या प्रदान करता है। दृष्टिकोण व्यक्तिगत शोधकर्ताओं की जरूरतों और अनुप्रयोगों के दृष्टिकोण के निजीकरण के लिए जगह प्रदान करते हुए सस्ती सामग्री और सुलभ उपकरणों का लाभ उठाता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

अनुसंधान को मुख्य रूप से ब्रेनमैटट्रेन यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 कार्यक्रम (संख्या एच 2020-एमएससीए-आईटीएन-2015) द्वारा मैरी स्कोलोडोवस्का- क्यूरी प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क और अनुदान समझौते संख्या 676408 के तहत वित्त पोषित किया गया था। सीआर और जेयूएल लुंडबेक फाउंडेशन (आर 250-2017-1425) और स्वतंत्र अनुसंधान कोष डेनमार्क (8048-00050) को उनके समर्थन के लिए कृतज्ञता पूर्वक स्वीकार करना चाहते हैं। हम ओपनमाइंड के होराइजन-ईआईसी-2021-पाथफाइंडरओपन-01 प्रोजेक्ट के लिए कृतज्ञतापूर्वक वित्त पोषण 101047177 स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL Hamilton 81320
3DDiscovery 3D bioprinter RegenHU
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
AlbuMAX ThermoFisher 11020021
Alexa Fluor 488 secondary antibody ThermoFisher A-11001 Goat anti-Mouse
Blunt Needle, Sterican (21 G) Braun 9180109
Blunt Needle (27 G) Cellink NZ5270505001
BioCAD software SolidWorks
Calcein AM ThermoFisher 65-0853-39
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C5929
Dibutyryl-cAMP sodium salt Sigma-Aldrich D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) R&D Systems 3440-100-01
DAPI ThermoFisher 62248
DMEM/F-12, GlutaMAX ThermoFisher 10565018
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
DPBS ThermoFisher 14190094
EGF R&D Systems 236-EG
FGF R&D Systems 3718-FB
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Sigma-Aldrich 100496
GDNF R&D Systems 212-GD
Geltrex ThermoFisher A1569601
Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Buffer (1 M) ThermoFisher 15630080
L-Alanine Sigma-Aldrich 5129
L-Asparagine monohydrate Sigma-Aldrich A4284
L-Aspartic acid Sigma-Aldrich A9256
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G1251
L-Proline Sigma-Aldrich P0380
Magnetic stirrer RET basic IKA 3622000
N-2 Supplement ThermoFisher 17502048
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher 15140122
S25N-10G dispersing tool IKA 4447100
Sodium Alginate (80-120 cP) FUJIFILM Wako 194-13321
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881
T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer IKA 3720000
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin/EDTA Solution ThermoFisher R001100
TUBB3 antibody BioLegend 801213 Mouse
Xanthan gum  Sigma-Aldrich G1253

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 195
मानव तंत्रिका संरचनाओं के एम्बेडेड 3 डी प्रिंटिंग के लिए माइक्रोगेल-एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स कम्पोजिट सपोर्ट
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Kajtez, J., Radeke, C., Lind, J. U., … More

Kajtez, J., Radeke, C., Lind, J. U., Emnéus, J. Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs. J. Vis. Exp. (195), e65158, doi:10.3791/65158 (2023).

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