Summary
עבודה זו מתארת פרוטוקול להדפסה תלת-ממדית משובצת בצורה חופשית של תאי גזע עצביים בתוך חומרים מרוכבים של חלקיקים חוץ-תאיים הניתנים לריפוי עצמי. הפרוטוקול מאפשר דפוסים ניתנים לתכנות של מבנים מחוברים של רקמות עצביות אנושיות עם נאמנות גבוהה.
Abstract
ההדפסה התלת-ממדית המשובצת של תאים בתוך מדיום תמיכה גרעיני התפתחה בעשור האחרון כגישה רבת עוצמה לייצור ביולוגי חופשי של מבנים של רקמות רכות. עם זאת, פורמולציות ג'ל גרגירי הוגבלו למספר מוגבל של ביו-חומרים המאפשרים ייצור חסכוני של כמויות גדולות של מיקרו-חלקיקי הידרוג'ל. לכן, אמצעי תמיכה בג'ל גרגירי חסרים בדרך כלל את הפונקציות של הדבקת תאים והנחיית תאים הנמצאות במטריצה החוץ תאית הטבעית (ECM).
כדי להתמודד עם זה, פותחה מתודולוגיה ליצירת חומרים מרוכבים של מטריצה חוץ-תאית (SHAPE) הניתנת לריפוי עצמי. חומרים מרוכבים מסוג SHAPE מורכבים משלב גרגירי (מיקרו-ג'לים) ופאזה רציפה (תמיסת ECM צמיגה) אשר יחדיו מאפשרים הן הדפסה באיכות גבוהה הניתנת לתכנות והן סביבה חוץ-תאית ביו-פונקציונלית מתכווננת. עבודה זו מתארת כיצד ניתן להשתמש במתודולוגיה שפותחה לייצור ביולוגי מדויק של מבנים עצביים אנושיים.
ראשית, מיקרו-חלקיקי אלגינט, המשמשים כמרכיב גרעיני בתרכובות SHAPE, מיוצרים ומשולבים עם רכיב רציף מבוסס קולגן. לאחר מכן, תאי גזע עצביים אנושיים מודפסים בתוך חומר התמיכה, ולאחר מכן חישול התמיכה. המבנים המודפסים יכולים להישמר במשך שבועות כדי לאפשר התמיינות של התאים המודפסים לנוירונים. במקביל, הפאזה הרציפה של הקולגן מאפשרת צמיחה אקסונלית וחיבור בין אזורים. לבסוף, עבודה זו מספקת מידע על אופן ביצוע הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים ואימונוציטוכימיה כדי לאפיין את המבנים העצביים האנושיים המודפסים בתלת-ממד.
Introduction
ההדפסה התלת-ממדית המדויקת והניתנת לתכנות של מבני הידרוג'ל עמוסי תאים המחקים רקמות רכות במבחנה מהווה אתגר גדול. לדוגמה, ניסיונות המבוססים על אקסטרוזיה ישירה של הידרוג'לים רכים הם בעייתיים מטבעם, שכן התכונות המכניות הירודות הנדרשות כדי לשחזר את המיקרו-סביבה in vivo מובילות לחוסר שלמות מבנית, עיוותים של התכונות שהוגדרו מראש, או קריסה מוחלטת של המבנים המיוצרים. דרך מקובלת לעקיפת בעיה זו היא הדפסת פיגום תומך מחומר קשיח יותר בעל תאימות ביולוגית המאפשר למבנה הסופי לשמור על צורתו. עם זאת, גישה זו מגבילה מאוד את אפשרויות העיצוב ודורשת כוונון ראולוגי זהיר של הדיו הסמוך.
כדי להתגבר על מגבלות ההדפסה התלת-ממדית המסורתית המבוססת על שחול שכבה אחר שכבה, הדפסה תלת-ממדית משובצת התפתחה בשנים האחרונות כחלופה רבת עוצמה לייצור חומרים רכים ורקמות 1,2,3,4,5,6. במקום להוציא את הדיו באוויר הסביבה על גבי משטח, הדיו מושקע ישירות דרך מחט מזרק בתוך אמבט תמיכה שהוא מוצק במנוחה אך נוזל באופן הפיך סביב קצה המחט הנעה כדי לאפשר שיקוע מדויק של חומר רך עמוס תאים. החומר המושקע נשמר במקומו כאשר התמיכה מתמצקת מחדש בעקבות המחט. ככזו, הדפסה תלת-ממדית משובצת מאפשרת ייצור חופשי ברזולוציה גבוהה של מבנים מורכבים מביו-חומרים רכים עם אפשרויות עיצוב מורחבות 7,8.
ג'לים גרגיריים נחקרו בהרחבה כחומרי אמבט תומכים להדפסה תלת-ממדית משובצת, מכיוון שניתן ליצור אותם כך שיציגו מעברים חלקים, מקומיים והפיכים ממוצק לנוזל בלחצי תפוקה נמוכים 9,10,11. בעוד שהם מראים תכונות ראולוגיות מצוינות להדפסה ברזולוציה גבוהה, ג'לים גרעיניים הוגבלו לקומץ ביו-חומרים12. חוסר הגיוון בפורמולציות ג'ל גרגיריות, אשר בולט במיוחד אם לוקחים בחשבון את המגוון הרחב של ביו-חומרים הזמינים עבור פורמולציות הידרוג'ל בתפזורת, נגרם על ידי הצורך בייצור חסכוני של מספר רב של מיקרוג'לים באמצעות כימיה פשוטה. בשל הנוף הביו-חומרי המוגבל של תמיכות ג'ל גרגיריות, הכוונון של המיקרו-סביבה החוץ תאית המסופקת על ידי תמיכת ההדפסה מהווה אתגר בשטח.
לאחרונה פותחה גישה מודולרית ליצירת תמיכות הדפסה תלת-ממדיות משובצות, המכונות קומפוזיציות מרוכבות של חלקיקים חוץ-תאיים (SHAPE)13 הניתנות לריפוי עצמי. גישה זו משלבת את התכונות הריאולוגיות המובהקות של ג'לים גרגיריים עם הרבגוניות הביו-פונקציונלית של פורמולציות הידרוג'ל בתפזורת. התמיכה המרוכבת המוצגת ב- SHAPE מורכבת ממיקרו-חלקיקי אלגינט ארוזים (פאזה גרגירית, ~ 70% חלק נפח) עם חלל אינטרסטיציאלי מוגבר המלא בתמיסת פרגל ECM צמיגה מבוססת קולגן (פאזה רציפה, ~ 30% חלק נפח). עוד הוכח כי תמיכת SHAPE מאפשרת שיקוע ברזולוציה גבוהה של תאי גזע עצביים אנושיים (hNSCs), אשר לאחר חישול אמבט התמיכה, ניתן להתמיין לנוירונים ולשמור עליהם במשך שבועות כדי להגיע להבשלה תפקודית. הדפסה תלת-ממדית מוטבעת בתוך אמבט התמיכה של SHAPE מתגברת על כמה מהמגבלות העיקריות הקשורות לטכניקות קונבנציונליות לייצור ביולוגי של רקמות עצביות תוך מתן פלטפורמה רב-תכליתית.
עבודה זו מפרטת את השלבים להדפסה תלת-ממדית מוטמעת של תאי עצב עצביים בתוך תמיכת SHAPE ואת ההתמיינות שלהם לאחר מכן לתאי עצב פונקציונליים (איור 1). ראשית, מיקרו-חלקיקי אלגינט נוצרים באמצעות גזירה במהלך ג'לציה פנימית. גישה זו מאפשרת יצירה קלה של כמויות גדולות של מיקרו-חלקיקים ללא צורך בציוד מיוחד וריאגנטים ציטוטוקסיים. יתר על כן, אלגינט הוא מקור חומר זמין וחסכוני ליצירת מצעי הידרוג'ל תואמים ביולוגית למגוון רחב של סוגי תאים. חלקיקי האלגינט הנוצרים משולבים עם תמיסת קולגן ליצירת חומר התמיכה המרוכב SHAPE. לאחר מכן, ה-hNSCs נקצרים ומועלים לתוך מזרק כביו-דיו תאי להדפסה תלת-ממדית. מדפסת ביולוגית תלת-ממדית משמשת להדפסה משובצת מבוססת שחול של hNSCs בתוך הקומפוזיט SHAPE. התאים המודפסים בתלת-ממד מתמיינים לתאי עצב כדי ליצור מבנים עצביים אנושיים מוגדרים מרחבית ומתפקדים. לבסוף, הפרוטוקול מתאר כיצד ניתן לאפיין את מבני הרקמה שנוצרו באמצעות דימות תאים חיים ואימונוציטוכימיה. בנוסף, ניתנים טיפים לאופטימיזציה ולפתרון בעיות. יש לציין כי ניתן להחליף הן את המרכיבים של השלב הגרעיני והן את השלב הרציף עם פורמולציות הידרוג'ל אחרות כדי להתאים למויאטים ביו-פונקציונליים שונים, תכונות מכניות ומנגנוני הצלבה, כפי שנדרש על ידי סוגי תאים ורקמות אחרים מעבר ליישומים עצביים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת המאגרים והריאגנטים
- הכן מדיום גידול תאים על ידי הוספת התוספים הבאים DMEM/F12 עם L-alanyl-L-גלוטמין דיפפטיד: 30 mM גלוקוז, 5 מיקרומטר HEPES, 0.5% w / v עשיר שומנים בסרום בקר אלבומין, 40 מיקרומטר L-אלנין, 40 מיקרומטר L-אספרגין מונוהידרט, 40 מיקרומטר L-חומצה אספרטית, 40 מיקרומטר L-חומצה גלוטמית, 40 מיקרומטר L-פרולין, 1% תוסף N2, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 20 ng / L כל אחד של גורם גדילה אפידרמיס (EGF) וגורם גדילה פיברובלסט (FGF). בצע שלבים אלה בספסל זרימת אוויר למינרית (LAF).
- הכינו תמיסת אלגינט 1% עם V במים טהורים במיוחד על ידי ערבוב נמרץ במשך 4 שעות ב-60°C. סנן סטרילי את תמיסת האלגינט המומס והחמה עם מסנן בגודל נקבוביות של 0.45 מיקרומטר בספסל LAF. אחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C.
הערה: אם הטמפרטורה של תמיסת אלגינט נמוכה מ-60°C, לא ניתן יהיה להעביר אותה דרך המסנן. - הכינו תמיסת NaHCO3 בנפח 37 גרם/ליטר במים טהורים במיוחד. התאימו את רמת החומציות של התמיסה ל-9.5 באמצעות NaOH, ובצעו סינון ועיקרו בספסל LAF. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C.
2. הכנת חומר מרוכב SHAPE
- יצירת מיקרו-חלקיקים אלגינט
- הכינו תמיסת CaCO3 במינון 2 מ"ג/מ"ל במים טהורים במיוחד בכד סטרילי. ערבבו 1:1 עם תמיסת אלגינט, וערבבו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות מערבל מגנטי.
- מוסיפים חומצה אצטית ביחס של 1:500, ומשאירים ערבוב למשך הלילה ב-650 סל"ד.
הערה: תמיסת האלגינט תתחיל לפעול באופן מיידי. הקפידו להשתמש במגנט ערבוב באורך זהה לקוטר כלי הזכוכית המשמש להבטחת ערבוב אופטימלי והומוגני של ג'ל היצירה. למחרת, התמיסה שנוצרת באמצעות ערבוב במהלך הג'לציה תיראה צמיגה (איור 2A). - שברו באופן מכני את תמיסת האלגינט הג'לי למיקרו-חלקיקים על-ידי הומוגניזציה שלה במהירות של 15,000 סל"ד למשך 10 דקות באמצעות הומוגנייזר הממוקם בספסל LAF (איור 2B).
- צנטריפוגה של המיקרו-חלקיקים ב-18,500 × גרם למשך 20 דקות (איור 2C) בטמפרטורת החדר.
- השליכו בזהירות את הסופרנאטנט בתוך ספסל ה-LAF, השהו מחדש את החלקיקים ב-DMEM המכילים 2 מילימטר NaOH ו-1% P/S, ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (איור 2D).
הערה: צבע המתלים צריך לחזור לאדום. אם המתלה נשאר צהוב, הוסיפו NaOH טיפה וערבבו עד שהוא הופך לאדום (איור 2E). - הומוגניזציה של החלקיקים ב-15,000 סל"ד למשך 3 דקות, וצנטריפוגה ב-18,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- התבוננו בגלולה (איור 2F), והוציאו את הסופרנאטנט בזהירות.
הערה: ניתן לאחסן את הגלולה של מיקרו-חלקיקי אלגינט ארוזים היטב בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף. אם תמיסת האלגינט לא עברה עיקור סינון, יש להשתמש במיקרו-חלקיקים תוך שבוע.
- ניסוח מורכב של SHAPE
- יום לפני ההדפסה, יש להשהות מחדש את כדורית המיקרו-חלקיק אלגינט בנפח כפול מזה של מדיום גידול המכיל 4% HEPES (1 M Stock) ו-4% תמיסת NaHCO3 בספסל LAF, ולדגור עליה למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגו את מתלה המיקרוג'ל ב-18,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט.
- נטרלו את הקולגן כדי לערבב אותו עם חלקיקי האלגינט בספסל LAF. דללו את תמיסת מלאי הקולגן כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל, ונטרלו אותה על ידי הוספת 4% HEPES ו-4% NaHCO3. לדוגמה, עבור 3 מ"ל של SHAPE מרוכב, ערבבו 2 מ"ל של מיקרו-חלקיקי אלגינט עם 1 מ"ל של קולגן מנוטרל (0.12 מ"ל HEPES, 0.12 מ"ל של NaHCO3, 0.16 מ"ל של מדיום צמיחה ו-0.6 מ"ל קולגן).
הערה: כל החומרים המעורבבים עם קולגן צריכים להיות מטופלים על קרח כדי למנוע פילמור קולגן. ברגע שהקולגן מנוטרל, פילמור יתחיל לאט. - צור את SHAPE מרוכב על ידי ערבוב כדורית מיקרו-חלקיק אלגינט עם קולגן מדולל ומנוטרל ביחס של 2:1. מערבבים היטב את הג'ל על ידי פיפטוף איטי למעלה ולמטה על קרח בספסל LAF.
הערה: אין לערבל, מכיוון שפעולה זו תכניס בועות לחומר התמיכה. - בספסל LAF, העבירו את החומר המרוכב שנוצר ללוח מיקרווול מקורר או לכל מיכל הדפסה מתאים, והשתמשו תוך 30 דקות (איור 3E, F).
3. תרבית hNSC והכנת דיו ביולוגי
- תרבית את התאים בבקבוק T75 מצופה בתמצית קרום מרתף במצע גידול. עברו את התאים לפחות פעמיים לאחר ההפשרה לפני שתשתמשו בהם לניסוי הדפסה תלת-ממדית.
- לפני ההדפסה, נתק את התאים באופן אנזימטי באמצעות תמיסת טריפסין 0.025% למשך 5 דקות ב-37°C, נטרל את הטריפסין עם מדיום גידול, וצנטריפוגה את תרחיף התא ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, שואפים את הסופרנטנט, ותולים מחדש את הגלולה ב 2-3 מ"ל של מדיום צמיחה.
- בצע ספירת תאים, בצע צנטריפוגה של התאים ב 400 × גרם, והשהה מחדש את הגלולה במדיום צמיחה בתוספת 0.1% קסנטן גאם (כדי למנוע מהתאים לשקוע) בריכוז סופי של 9 × 106 תאים / מ"ל.
- השתמשו במחט מתכת קהה של 21 G כדי לטעון 100 מיקרו-ליטר של מיקרו-חלקיקי אלגינט דחוסים היטב לתוך מזרק (איור 3A).
הערה: יצירת תקע עם מיקרו-חלקיקי אלגינט משרתת שתי מטרות: היא מסייעת בשמירה על יציבות האקסטרוזיה במהלך ההדפסה ומאפשרת אקסטרוזיה מלאה של הדיו הסלולרי הטעון (ללא נפח מת). - באמצעות אותה מחט, טענו את תרחיף התאים המוכן לתוך המזרק (איור 3B).
הערה: יש להיזהר במיוחד שלא להכניס בועות אוויר במהלך שלבי העמסת המזרק. בועות אוויר יגרמו לאי יציבות במהלך ההדפסה. - החלף את מחט ההעמסה במחט מתכת קהה 27 G, שתשמש להדפסה (איור 3C).
4. הדפסה תלת-ממדית מוטבעת
- עצב מבנה להדפסה באמצעות התוכנה שאליה מתבצעת הפניה (ראה טבלת חומרים).
הערה: הקפד להתאים את הגובה ההתחלתי של המבנה המודפס לעומק התמיכה ב- SHAPE composite. הצעות עיצוב ניתן למצוא באיור 4A (עיצובים של ספירלות וערימות עץ). - צור G-Code על ידי לחיצה על צור.
- הכניסו את מזרק הזכוכית עמוס התאים לראש אקסטרוזיה נפחי במדפסת ביולוגית מבוססת שחול (איור 3D).
- מדוד את אורך המחט של מזרק הזכוכית עמוס התאים על ידי לחיצה על מדידת אורך מחט.
- הניחו את צלחת המיקרווול או את המכל הטעון בקומפוזיט SHAPE על גבי המדפסת.
הערה: שמור על לוח התא או המכל בטמפרטורה של 4°C עד להדפסה כדי למנוע הצלבה מוקדמת מדי של התמיכה. - מדוד את גובה פני השטח של באר ריקה בתוך אותה צלחת מיקרווול או מיכל שבו ג'ל SHAPE נטען על ידי לחיצה על SHM (מדידת גובה פני השטח).
הערה: לחלופין, קבע את גובה פני השטח באופן ידני על ידי מדידת גובה הבאר באמצעות המחט. - הגדר את קצב האקסטרוזיה ל- 3.6 מיקרוליטר לדקה ואת קצב ההזנה ל- 0.3 מ"מ לשנייה.
הערה: הקפד לבדוק את האקסטרוזיה לפני ההדפסה. שקיעת תאים עלולה לגרום לסתימת חרירים וניתן להימנע ממנה על ידי הבלעה מראש של נפח קטן לפני ההדפסה המוטבעת בפועל או על ידי הוספת נפח משיכה למזרק הנפחי. במקרים מסוימים, קצב ההזנה צריך להישמר מתחת ל-0.5 מ"מ לשנייה כאשר המחט מוחדרת לג'ל SHAPE או יוצאת ממנו כדי למנוע גרירת הדיו. - טען את ה- G-Code לממשק המשתמש של המדפסת.
הערה: יש ליצור G-Code חדש בכל פעם שמתבצעים שינויים במבנה המעוצב. - התחל את הליך ההדפסה על-ידי לחיצה על הפעל (איור 3G).
- מיד לאחר ההדפסה, הניחו את ג'ל SHAPE בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של תרבית תאים למשך 30 דקות לחישול.
- יש להוסיף את מדיום הצמיחה בעדינות על גבי תמיכת הג'ל SHAPE המחושלת.
- למחרת, החלף את מדיום הגידול במדיום התמיינות שנוסח כדלקמן: DMEM/F12 עם L-אלניל-L-גלוטמין דיפפטיד עם 30 mM גלוקוז, 5 μM HEPES, 0.5% עם אלבומין סרום בקר עשיר בשומנים, 40 מיקרומטר L-אלנין, 40 מיקרומטר L-אספרגין מונוהידרט, 40 מיקרומטר L-חומצה אספרטית, 40 מיקרומטר L-חומצה גלוטמית, 40 מיקרומטר L-פרולין, 1% תוסף N2, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 100 מיקרומטר דיבוטיריל-מחזורי אדנוזין מונופוספט (dibutyryl-cAMP), ו-2 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי נגזר מקו תאי גליה (GDNF).
הערה: יש להקפיד לא לפגוע בהידרוג'ל במהלך השינויים הבינוניים. מטים את הצלחת ומסירים את המדיום הישן בעדינות. יש להוסיף טיפה בינונית טרייה לדופן הבאר המכילה את הג'ל ולא ישירות על גבי הג'ל. אין להשתמש בשואב כדי להסיר את המדיום. - רענן את מדיום הבידול כל יומיים עד לנקודת הסיום של הניסוי.
5. הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים
- הסר את עודפי המדיום מהג'ל.
- הוסף נפח שווה של 20 מיקרומטר Calcein AM (מדולל בתווך בידול מתמיסת המלאי) לנפח ג'ל התמיכה.
- יש לדגור במשך 40 דקות בטמפרטורה של 37°C.
- הסר את תמיסת Calcein AM והוסף נפח מתאים של אמצעי בידול טרי.
- העבירו את הצלחת למיקרוסקופ לצורך הדמיה.
6. אימונוציטוכימיה
- הסר את המדיום העודף מהג'ל.
- בעזרת מרית קטנה, מעבירים את הג'ל למיכל גדול יותר המכיל DPBS.
- שטפו שלוש פעמים במשך 20 דקות בכל פעם עם DPBS, והעבירו את הצלחת למכסה אדים.
- הסר את DPBS, הוסף מספיק תמיסת פורמלדהיד 4% כדי לכסות את הג'ל, ודגר במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- שטפו שלוש פעמים עם DPBS במשך 20 דקות בכל פעם.
- הכינו תמיסת חסימה המורכבת מסרום 5% חמור, 0.25% חומר ניקוי ו-0.02% נתרן אזיד ב-DPBS.
הערה: הכינו פי שלושה מהנפח הדרוש לכיסוי הג'ל; הוא ישמש בהמשך כבסיס לפתרונות הנוגדנים הראשוניים והמשניים. - לאחר שטיפה עם DPBS, להוסיף את הפתרון החוסם לג'ל, ולדגור במשך 6 שעות בטמפרטורת החדר כדי למנוע קשירה לא ספציפית. רוק את הצלחת בעדינות.
- הכינו את תמיסת הנוגדנים הראשונית על ידי דילול נוגדן TUBB3 בתמיסת חסימה ביחס של 1:1,000.
- הסר את התמיסה החוסמת מהג'ל, הוסף את תמיסת הנוגדנים העיקרית ודגר במשך 48 שעות ב -4 מעלות צלזיוס. רוק את הצלחת בעדינות.
- שטפו שלוש פעמים עם DPBS במשך 20 דקות בכל פעם.
- הכן את תמיסת הנוגדנים המשנית על ידי דילול 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1,000) ואת הנוגדן המשני (1:200) בתמיסת חסימה.
- לאחר שטיפה עם DPBS, לדגור את הג'ל בתמיסת נוגדנים משנית במשך 24 שעות ב 4 ° C. רוק את הצלחת בעדינות.
- יש לשטוף שלוש פעמים עם DPBS במשך 20 דקות בכל פעם, ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד להדמיה.
- לפני ההדמיה, להעביר את הג'ל המוכתם עם מרית לצלחת או צלחת היטב עם תחתית הדמיה דקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכנת מיקרו-ג'ל אלגינט באמצעות דילול גזירה במהלך ג'לציה פנימית ואחריה פיצול מכני מניבה מיקרו-ג'לים אלגינטים מפוזרים בגודלם ודמויי פתיתים בצורתם, כפי שניתן לראות באיור 2G. גודלם של חלקיקים בלתי סדירים אלה נע בין פחות ממיקרומטר אחד לקוטר של כ-40 מיקרומטר. כאשר הם ארוזים היטב, המיקרו-חלקיקים יוצרים חומר שקוף בתפזורת שהוא רק מעט יותר אטום ממדיום תרבית התאים המתאים (איור 2F). השקיפות של חומר התמיכה היא היבט חשוב של הפלטפורמה מכיוון שהיא מאפשרת הדמיה של המבנים המודפסים במהלך תקופת התרבות, כמו גם למיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה של מבנים המסומנים הן בצבעים של תאים חיים והן באמצעות אימונוציטוכימיה. כאשר הוא ספוג בתווך תרבית תאים חוצצת, הג'ל המותאם ל-pH המתקבל צריך להיות בצבע אדום, המציין תנאים פיזיולוגיים (איור 2F). חשוב לנטרל את רמת החומציות של המיקרו-חלקיקי אלגינט משתי סיבות. מיקרו-חלקיקים חומציים יכולים לפגוע ישירות בתאים. יתר על כן, סביבה חומצית תמנע חישול מוצלח של התמיכה המרוכבת SHAPE, מכיוון שהיא תפריע לפילמור הקולגן.
הדפסת דיו hNSC באמצעות הפרמטרים שתוארו לעיל מניבה חוט להט של תאים בקוטר ~200 מיקרומטר (איור 4A). הגיאומטריה המתוכנתת נשמרת הן בעת הדפסה במישור אחד והן בעת הדפסת מבנים זה על גבי זה. במקרה של הדפסה רב-שכבתית, המבנים המודפסים נשארים שלמים, עם מרחק מינימלי משכבה לשכבה של 200 מיקרומטר13. הכדאיות של התאים לא אמורה להיות מושפעת באופן משמעותי במהלך הכנת הדיו והאקסטרוזיה. הגדילים המודפסים עשירים בתאים חיים בעלי מורפולוגיה עגולה (איור 4B, משמאל). רווחים בגדילים המודפסים יכולים להופיע יום לאחר ההדפסה, גם אם המבנה המפוברק אינו מראה עיוותים מיד לאחר ההדפסה. זו ככל הנראה תוצאה של ערבוב לא הומוגני של התמיכה. מאחר שהתאים אינם מתקשרים עם חלקיקי האלגינט, הם נודדים הרחק מהאזורים העשירים באלגינטים לעבר האזורים העשירים בקולגן ובתאים, ובכך גורמים לשברים בגדילים המודפסים. יתר על כן, התמיכה ב- SHAPE צריכה להיות נטולת בועות, מכיוון שכיסי אוויר יכולים להפריע לנאמנות ההדפסה.
התמיינות מוצלחת של hNSCs אמורה להניב מבנים עשירים בתאי עצב 30 יום לאחר ההדפסה, כאשר תאים מציגים מורפולוגיה עצבית עם גופי תאים קטנים ותהליכים דקים וארוכים (איור 4B, מימין). יתר על כן, אם מדפיסים תבניות צפופות, כמו למשל יריעה מלבנית של תאים, לא אמורים להיווצר רווחים או אגרגטים נראים לעין במהלך ההתמיינות, אלא שכבה רציפה של תאים צריכה להישאר שלמה (איור 4C). בפרוטוקול זה מתואר הליך לאימונוציטוכימיה פלואורסצנטית של הדגימות המודפסות בתלת-ממד. צביעה עבור TUBB3, סמן עצבי ציטופלזמי, מאפשרת הדמיה ישירה של הרשתות העצביות שנוצרו. המיקרוסקופ הפלואורסצנטי של ההדפסים המובחנים אמור לחשוף מבנים עשירים ב-TUBB3 ועם גיאומטריה מתוחזקת (איור 4D, משמאל). במהלך תהליך ההתמיינות, התאים אינם נודדים אל מחוץ לגדילים המודפסים, כפי שניתן לראות על-ידי צביעה של גרעיני תאים באמצעות DAPI (איור 4D, באמצע). כתוצאה מכך, גופים עצביים נצפים בתוך גבולות הגיאומטריה המודפסת, עם הקרנות אקסונליות הנובעות מאות מיקרומטרים לתוך תמיכת SHAPE המקיפה את המבנה. החקירה האקסונלית של הנפח שמסביב מצביעה על כך שתמיכת SHAPE מספקת רמזים ביו-פונקציונליים המאפשרים מציאת נתיבים אקסונליים. סמנים עצביים בוגרים יותר או סמנים ספציפיים לתת-סוג יכולים לשמש באימונוציטוכימיה כדי לאפיין עוד יותר את האוכלוסיות העצביות שנוצרו. יתר על כן, המבנה העצבי המודפס יכול להיות מאופיין באמצעות RT-qPCR או אלקטרופיזיולוגיה13. עם זאת, שתי הגישות ידרשו הסרה של קולגן באמצעות קולגן, שכן שכבת ההידרוג'ל חוסמת הן את מיצוי הרנ"א והן את הגישה הפיזית לתאים באמצעות מיקרופיפטה.
איור 1: המחשה מושגית של גישת ההדפסה המשובצת SHAPE. תמיסת קולגן מעורבבת עם מיקרו-חלקיקי אלגינט ליצירת תרכובת SHAPE; מרוכב SHAPE משמש כחומר תמיכה להדפסה תלת-ממדית משובצת של hNSCs, אשר מתמיינים לנוירונים בתוך התמיכה המחושלת. התכונות הביו-תפקודיות של מרוכב SHAPE מאפשרות לתאי העצב להרחיב את ההקרנות ולאכלס את החלק הריק של התמיכה בהקרנות האקסונליות שלהם. נתון זה שונה מ Kajtez et al.13. קיצורים: SHAPE = מטריצה חוץ-תאית של חלקיקים הניתנים לריפוי עצמי; hNSCs = תאי גזע עצביים אנושיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנת מיקרו-חלקיקי אלגינט . (A) תמיסת אלגינט לאחר ג'לציה למשך הלילה. (B) מיקרו-חלקיקי אלגינט הנוצרים על-ידי הומוגניזציה. (C) גלולת החלקיקים לאחר הצנטריפוגה. (D) הגלולה הושעתה מחדש ב-DMEM (E) לפני התאמת ה-pH ולאחר התאמת ה-pH. (F) המיקרו-חלקיקים לאחר הדגירה בתווך לילה ובצנטריפוגה. (G) תמונת שדה בהיר של חלקיקי האלגינט המפוברקים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הכנה לתהליך ההדפסה בתלת-ממד. (A) תקע תרחיף (~100 μL) נטען לתוך המזרק ואחריו (B) טעינת הדיו הביולוגי התאי (כאן בתוספת חרוזים צבעוניים למטרות הדמיה). (C) קצה הפלסטיק החרוטי (21 גרם) המשמש לטעינת דיו מוחלף בקצה מחט מתכת קהה 27 G. (D) המזרק מוכנס לראש ההדפסה התלת-ממדית. (ה,ו) תרכובת SHAPE מוחדרת לבאר של צלחת בת 48 בארות. הצינור עם החומר המרוכב SHAPE נשמר על קרח כאשר אינו מטופל. (G) קצה מחט ההדפסה מוכנס לתמיכה ב-SHAPE, ומתחילה הדפסת הנתיב שהוגדר על-ידי עיצוב המחשב (כאן מתוארת הדפסת ספירלה). קיצור: SHAPE = מטריצה חוץ-תאית של חלקיקים הניתנים לריפוי עצמי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מבנים עצביים מודפסים בתלת-ממד בתוך התמיכה המרוכבת של SHAPE. (A) תמונות Brightfield של hNSCs מודפסים בתוך הידרוג'ל התמיכה. מוצגים עיצובים של מבנים ספירליים (משמאל) וערימת עץ (מימין). (B) הדמיה של תאים חיים של מבנה מודפס בתלת-ממד יום לאחר ההדפסה (משמאל) ולאחר התמיינות עצבית (מימין). (C) מבנה ריבועי מודפס בתלת-ממד שהוסר מבאר גידול עם מרית מציג שלמות מבנית. (D) תמונות קונפוקליות פלואורסצנטיות של אותו מבנה ריבועי עם תווית חיסונית עבור סמן עצבי (TUBB3) ועם גרעינים מוכתמים נגדיים (DAPI) המאשרות את ההתמיינות המוצלחת של hNSCs בתוך המבנים המודפסים בתלת-ממד. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר (A, מימין); 100 מיקרומטר (B,D). לוחות C ו- D באיור זה שונו מ- Kajtez et al.13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גישת החומר המרוכב SHAPE מספקת מסלול רב-תכליתי ליצירת אמבטיות תמיכה חיישות וביו-פונקציונאליות להדפסה תלת-ממדית מוטבעת של דיו סלולרי. בעוד פרוטוקול זה מספק דוגמה להדפסה תלת-ממדית של מבנים עצביים, ארגז הכלים של SHAPE יכול בקלות להיות מותאם לייצור ביולוגי עם מקורות תאים אחרים לצורך הנדסה מדויקת של מגוון סוגי רקמות מטרה. גישת ההדפסה תאפשר גם דפוסים מדויקים של סוגי תאים מרובים כדי לחקור את האינטראקציה ביניהם או להנדס רקמות עם סידור מרחבי מוגדר של תאי התא (למשל, תאי עצב ותאי גלייה). בניגוד לג'לים הגרגיריים המסורתיים, ה- SHAPE composite מכיל מרחב אינטרסטיציאלי מורחב (~ 30% מקטע נפח עבור הנוסחה המוצגת בפרוטוקול זה). הרכיב הגרעיני משמש כמשנה ראולוגית המספקת לחומר המרוכב תכונות חומר חיוביות להדפסה משובצת ברזולוציה גבוהה. זה פותח נתיב לקראת תכנון רציונלי של המיקרו-סביבה התאית על ידי שינוי הניסוח של הרכיב הרציף תוך שמירה על אותו רכיב גרעיני. לדוגמה, ניתן להכניס לאמבט התמיכה מולקולות ECM פונקציונליות אחרות (למשל, חומצה היאלורונית, למינינים, פיברונקטין או למנף מנגנוני קישור צולבים שונים (למשל, אנזימטיים, מבוססי אור)13. יתר על כן, האלגינט ברכיב הגרגירי יכול להיות מוחלף במיקרו-חלקיקים מחומרי הידרוג'ל שונים (למשל, ג'לטין8, פוליאתילן גליקול14,15, אגרוז16) או להיות מיוצר בגדלים ובצורות שונים בהתאם לצרכים של הנדסת רקמות שונה או יישומי מידול מחלות. ניתן לכוונן את היחס בין הפאזה הגרעינית לשלב הרציף בהתאם לצרכים של פרויקטים בודדים של הדפסה בתלת-ממד, אך הגדלת הפאזה הרציפה מעבר ל-30% עלולה לפגוע באמינות ההדפסה וברזולוציה.
במהלך שלבי ייצור המיקרוג'ל, קריטי כי ערבוב של תמיסת אלגינט לאחר הוספת חומצה אצטית יהיה יעיל לאורך כל נפח תמיסת הג'לינג. אם מהירות הערבוב נמוכה מדי או שהמערבל המגנטי קטן מדי, ייתכן שהערבוב לא יגיע לשכבות העליונות של התמיסה, מה שיהפוך לנפח גדול של הידרוג'ל בתפזורת מוצלבת, בעוד שהשכבות התחתונות ייגזרו. ההומוגניזציה של אלגינט הידרוג'ל גזוז באופן לא עקבי תגרום ליצירת מיקרו-חלקיקי אלגינט שאינם אופטימליים עבור יישומי הדפסה בתלת-ממד. יתר על כן, יש לערבב היטב את חלקיקי האלגינט עם תמיסת הקולגן, שכן תערובת לא הומוגנית תגרום לכתמים של חומר התמיכה חסר קולגן; טלאים אלה לא יהיו מחושלים, ולכן יחסרו תכונות אינטראקטיביות של תאים. ייתכנו גם טלאים חסרי מיקרו-חלקיקי אלגינט ולכן לא יתמכו בהדפסה. לפיכך, תמיכה מעורבת באופן לא הומוגני לא תוכל לתמוך בהדפסה באיכות גבוהה ותיפגע מבחינה מבנית, מכיוון שהיא לא תהיה מחושלת לאורך כל נפחה. כמו כן, יש להימנע מבועות, לא משום שהן עלולות להזיק לתאים, אלא משום שכיסי אוויר עלולים לגרום לעיוותים במהלך ההדפסה ולהפריע להדמיית המבנים. שני מקורות נפוצים של בועות הם מערבולות (מיקרו-בועות בתמיכה הקרה המתרחבות במהלך חישול התמיכה ב-37 מעלות צלזיוס) ופיפטינג נמרץ.
התמיכה המרוכבת של SHAPE בעבודה זו לא נוסחה כחומר הקרבה שיש להסיר לאחר ההדפסה, אלא כתמיכה ביו-פונקציונלית ארוכת טווח הן להתמיינות תאי גזע והן לגדילה עצבית ולהבשלה תפקודית. בהשוואה לג'לים גרגיריים שאינם מחושלים לאחר ההדפסה, היציבות המבנית והשקיפות של החומר המרוכב SHAPE המחושל מספקות סביבה מגנה לתכונות עצביות עדינות בתהליך הקיבוע והתיוג החיסוני, וככזה, חומר זה מאפשר אפיון מורפולוגי באמצעות הדמיה של אנטיגנים. כתבי פלואורסצנטיות יכולים לשמש גם כדי לעקוב אחר שינויים במורפולוגיה התאית לאורך זמן, כמו גם כדי לעקוב אחר התפשטות תאים ונדידה בתוך תמיכת ההדפסה המחושלת. יתר על כן, גישות דימות סידן יכולות לשמש כדי לספק מידע על פעילות תאית ספונטנית (למשל, ירי של פוטנציאלי פעולה בנוירונים או אפילו פעילות רשת עצבית סינכרונית). עם זאת, גירוי כימי של מבנים תאיים מהונדסים (למשל, גירוי עצבי באמצעות KCl) עשוי להיות קשה בגלל שכבת ההידרוג'ל המקיפה את התאים, אשר מאטה את הדיפוזיה ומונעת אפנון מיידי של מיקרו-סביבה תאית. גירוי אופטוגנטי מהווה אפשרות טובה יותר לשליטה בפעילות התאית, מכיוון שההידרוג'לים SHAPE אינם חוסמים גישה אופטית לתאים.
ניתן לשלב חרוזים רגישים לחמצן בדיו הביולוגי או בחומר התמיכה (באמצעות הדפסה ישירה או פיזור במהלך הכנה מרוכבת) כדי לאפשר מיפוי מרחבי וזמני חי של רמות מתח החמצן בתוך ומסביב למבנים המודפסים בעלי רגישות גבוהה13. גישה לא פולשנית זו למיפוי חמצן תלת-ממדי המבוססת על מדידות אורך חיים של זרחן מספקת נתיב לקראת הנדסת מבני רקמות עם חמצון משופר, וככל הנראה גם אספקת חומרים מזינים משופרת. חמצון לקוי עלול להוביל להיווצרות אזורים נמקיים בתוך המבנים המודפסים, להפריע להתמיינות תאי גזע ולהשפיע על חילוף החומרים העצבי. מיפוי חמצן מספק קריאה שעל בסיסה ניתן לשנות את עיצוב ההדפסה התלת-ממדית כדי לאפשר חמצון אחיד לאורך כל המבנה, כוונון עדין של רמות החמצן כך שיתאימו לתנאים פיזיולוגיים, או יצירת שיפועי חמצן.
ניתן גם לשלב תעלות מהונדסות, בתוך תמיכת ההדפסה הניתנת לחישול, על ידי הדפסת דיו להקרבה, כגון ג'לטין, המתמצק בתוך אמבט התמיכה בקור, אך ניתן לפנותו בקלות בטמפרטורהשל 37°C 4,13. תעלות יידרשו לספק חומרי מזון וחמצן למבנים רקמתיים בעלי צפיפות תאים גבוהה או ממדים החורגים מהיכולות של גישת מניפולציה מבוססת מתח חמצן המבוססת על תכנון. נוסף על כך, ניתן לנצל תעלות דמויות כלי דם כדי ליצור שיפועים של מולקולות קטנות המניעות את דפוסי הזהות התאית, מווסתות את הפעילות התאית או מנחות כימוטקסיס.
לסיכום, הדפסה תלת-ממדית משובצת בתוך הקומפוזיט SHAPE מציעה פלטפורמת חומר מודולרית הניתנת להתאמה בקלות ובעלת פוטנציאל רב-תכליתי למידול פונקציונלי של רקמות רגישות מכנית. הפרוטוקול המוצג כאן מספק הסבר מפורט על הצעדים הדרושים והעקרונות הבסיסיים הדרושים כדי ליצור את חומר התמיכה ולהדפיס את הדיו הסלולרי בנאמנות גבוהה. הגישה מנצלת חומרים זולים וציוד נגיש תוך מתן מקום להתאמה אישית של הגישה לצרכים וליישומים של חוקרים בודדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחקר מומן בעיקר על ידי תוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי BrainMatTrain (מס' H2020-MSCA-ITN-2015) במסגרת Marie Skłodowska-Curie Initial Training Network and Grant Agreement No. 676408. C.R. ו-J.U.L. רוצים להודות לקרן לונדבק (R250-2017-1425) ולקרן המחקר העצמאית דנמרק (8048-00050) על תמיכתם. אנו מודים על המימון לפרויקט HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Bhattacharjee, T., et al.
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Skylar-Scott, M. A., et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- LeBlanc, K. J., et al. Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).
- Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths. Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).
- Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures. Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).
- McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
- Kajtez, J., et al. Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs. Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).
- Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods. Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs. 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).
