Summary
Bu çalışma, kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris kompozitleri içindeki nöral kök hücrelerin serbest biçimli gömülü 3D baskısı için bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, birbirine bağlı insan sinir dokusu yapılarının yüksek doğrulukla programlanabilir modellenmesini sağlar.
Abstract
Granüler bir destek ortamı içindeki hücrelerin gömülü 3D baskısı, son on yılda yumuşak doku yapılarının serbest biçimli biyofabrikasyonu için güçlü bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, granüler jel formülasyonları, büyük miktarlarda hidrojel mikropartiküllerinin uygun maliyetli bir şekilde üretilmesine izin veren sınırlı sayıda biyomalzeme ile sınırlandırılmıştır. Bu nedenle, granüler jel destek ortamı genellikle doğal hücre dışı matriste (ECM) bulunan hücre yapıştırıcı ve hücre öğretici fonksiyonlardan yoksundur.
Bunu ele almak için, kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris (SHAPE) kompozitlerinin üretimi için bir metodoloji geliştirilmiştir. SHAPE kompozitleri, birlikte hem programlanabilir yüksek doğrulukta baskıya hem de ayarlanabilir biyofonksiyonel hücre dışı ortama izin veren granüler bir fazdan (mikrojeller) ve sürekli bir fazdan (viskoz ECM çözeltisi) oluşur. Bu çalışma, geliştirilen metodolojinin insan sinir yapılarının hassas biyofabrikasyonu için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır.
İlk olarak, SHAPE kompozitlerinde granüler bileşen olarak görev yapan aljinat mikropartikülleri üretilir ve kollajen bazlı sürekli bir bileşenle birleştirilir. Daha sonra, insan nöral kök hücreleri destek materyalinin içine basılır, ardından desteğin tavlanması takip edilir. Basılı yapılar, basılı hücrelerin nöronlara farklılaşmasına izin vermek için haftalarca korunabilir. Aynı zamanda, kollajen sürekli fazı aksonal büyümeye ve bölgelerin birbirine bağlanmasına izin verir. Son olarak, bu çalışma, 3D baskılı insan sinir yapılarını karakterize etmek için canlı hücre floresan görüntüleme ve immünositokimyanın nasıl gerçekleştirileceği hakkında bilgi sağlar.
Introduction
Yumuşak dokuları in vitro olarak taklit eden hücre yüklü hidrojel yapıların hassas ve programlanabilir 3D baskısı büyük bir zorluk teşkil etmektedir. Örneğin, yumuşak hidrojellerin doğrudan ekstrüzyonuna dayanan girişimler doğası gereği sorunludur, çünkü in vivo mikroçevreyi özetlemek için gereken zayıf mekanik özellikler yapısal bütünlük eksikliğine, önceden tanımlanmış özelliklerin deformasyonlarına veya fabrikasyon yapıların tamamen çökmesine neden olur. Bu sorun için geleneksel bir geçici çözüm, son yapının şeklini korumasını sağlayan daha sert bir biyouyumlu malzemeden destekleyici bir iskele basmaktır. Bununla birlikte, bu yaklaşım tasarım olanaklarını büyük ölçüde sınırlar ve bitişik mürekkeplerin dikkatli bir şekilde reolojik ince ayarını gerektirir.
Geleneksel katman katman ekstrüzyon tabanlı 3D baskının sınırlamalarının üstesinden gelmek için, gömülü 3D baskı son yıllarda yumuşak malzeme ve doku üretimiiçin güçlü bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5,6. Mürekkebi bir yüzeyin üstündeki ortam havasında ekstrüzyon yapmak yerine, mürekkep doğrudan istirahatte katı benzeri olan bir destek banyosunun içindeki bir şırınga iğnesi aracılığıyla biriktirilir, ancak yumuşak hücre yüklü malzemenin hassas bir şekilde birikmesini sağlamak için hareketli iğne ucunun etrafında geri dönüşümlü olarak akışkanlaşır. Biriken malzeme, iğnenin ardından destek yeniden katılaştığı için yerinde tutulur. Bu nedenle, gömülü 3D baskı, genişletilmiş tasarım olanakları 7,8 ile yumuşak biyomalzemelerden karmaşık yapıların yüksek çözünürlüklü serbest biçimli üretimine izin verir.
Granüler jeller, gömülü 3D baskı için destek banyo malzemeleri olarak kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır, çünkü düşük verim gerilimlerinde pürüzsüz, lokalize ve geri dönüşümlü katıdan sıvıya geçişler sergilemek üzere formüle edilebilirler9,10,11. Yüksek çözünürlüklü baskı için mükemmel reolojik özellikler gösterirken, granüler jeller bir avuç biyomalzeme ile sınırlandırılmıştır12. Granüler jel formülasyonlarındaki çeşitlilik eksikliği, özellikle dökme hidrojel formülasyonları için mevcut olan çok çeşitli biyomalzemeler göz önüne alındığında belirgindir, basit kimyasallar kullanılarak çok sayıda mikrojelin uygun maliyetli bir şekilde üretilmesi ihtiyacından kaynaklanmaktadır. Granüler jel desteklerinin sınırlı biyomateryal manzarası nedeniyle, baskı desteği tarafından sağlanan hücre dışı mikro ortamın ayarlanması sahada bir zorluk oluşturmaktadır.
Son zamanlarda, kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris (SHAPE) kompozitleri13 olarak adlandırılan gömülü 3D baskı desteklerinin üretimi için modüler bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yaklaşım, granüler jellerin farklı reolojik özelliklerini, dökme hidrojel formülasyonlarının biyofonksiyonel çok yönlülüğü ile birleştirir. Sunulan SHAPE kompozit desteği, viskoz kollajen bazlı ECM ön jel çözeltisi (sürekli faz, ~% 30 hacim fraksiyonu) ile doldurulmuş artırılmış bir interstisyel alana sahip paketlenmiş aljinat mikropartiküllerinden (granüler faz, ~% 70 hacim fraksiyonu) oluşur. Ayrıca, SHAPE desteğinin, destek banyosunun tavlanmasından sonra nöronlara farklılaştırılabilen ve fonksiyonel olgunlaşmaya ulaşmak için haftalarca muhafaza edilebilen insan nöral kök hücrelerinin (hNSC'ler) yüksek çözünürlüklü birikimini kolaylaştırdığı gösterilmiştir. SHAPE destek banyosunun içine gömülü 3D baskı, çok yönlü bir platform sağlarken, sinir dokusu biyofabrikasyonu için geleneksel tekniklerle ilgili bazı önemli sınırlamaların üstesinden gelir.
Bu çalışma, SHAPE desteğinin içindeki hNSC'lerin gömülü 3D baskısı ve daha sonra fonksiyonel nöronlara farklılaşması için adımları detaylandırmaktadır (Şekil 1). İlk olarak, aljinat mikropartikülleri iç jelasyon sırasında kesme yoluyla üretilir. Bu yaklaşım, özel ekipmanlara ve sitotoksik reaktiflere ihtiyaç duymadan büyük hacimli mikropartiküllerin kolayca üretilmesini sağlar. Ayrıca, aljinat, çeşitli hücre tipleri için biyouyumlu hidrojel substratlarının oluşumu için yaygın olarak bulunan ve ekonomik bir malzeme kaynağıdır. Üretilen aljinat mikropartikülleri, SHAPE kompozit destek malzemesini oluşturmak için bir kollajen çözeltisi ile birleştirilir. Daha sonra, hNSC'ler toplanır ve 3D baskı için hücresel bir biyomürekkep olarak bir şırıngaya yüklenir. SHAPE kompozitinin içindeki hNSC'lerin ekstrüzyon tabanlı gömülü baskısı için bir 3D biyoyazıcı kullanılır. 3D baskılı hücreler, mekansal olarak tanımlanmış ve işlevsel insan sinir yapılarına yol açmak için nöronlara farklılaştırılır. Son olarak, protokol, üretilen doku yapılarının canlı hücre görüntüleme ve immünositokimya kullanılarak nasıl karakterize edilebileceğini açıklar. Ayrıca, optimizasyon ve sorun giderme için ipuçları sağlanmaktadır. Özellikle, granüler ve sürekli fazların hem bileşenleri, nöral uygulamaların ötesindeki diğer hücre ve doku tiplerinin gerektirdiği gibi, farklı biyofonksiyonel moieties, mekanik özellikler ve çapraz bağlama mekanizmalarını barındırmak için diğer hidrojel formülasyonları ile değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
- DMEM / F12'ye L-alanil-L-glutamin dipeptid ile aşağıdaki takviyeleri ekleyerek hücre büyüme ortamını hazırlayın: 30 mM glikoz, 5 μM HEPES,% 0.5 w / v lipid bakımından zengin sığır serum albümini, 40 μM L-alanin, 40 μM L-asparagin monohidrat, 40 μM L-aspartik asit, 40 μM L-glutamik asit, 40 μM L-prolin,% 1 N2 takviyesi,% 1 penisilin-streptomisin ve epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörünün (FGF) her biri 20 ng / L. Bu adımları laminer hava akışı (LAF) tezgahında gerçekleştirin.
- 60 ° C'de 4 saat boyunca kuvvetlice karıştırarak ultra saf suda% 1 w / v aljinat çözeltisi hazırlayın. Bir LAF tezgahında çözünmüş, sıcak aljinat çözeltisini 0,45 μm gözenek boyutunda bir filtre ile steril filtreleyin. 4 °C'de saklayın.
NOT: Aljinat çözeltisinin sıcaklığı 60 ° C'nin altındaysa, filtreden geçirilmesi mümkün olmayacaktır. - Ultra saf suda 37 g/L NaHCO3 çözeltisi hazırlayın. NaOH kullanarak çözeltinin pH'ını 9,5'e ayarlayın ve bir LAF tezgahında filtre sterilizasyonu yapın. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
2. SHAPE kompozit malzeme hazırlama
- Aljinat mikropartikül üretimi
- Steril bir beherde ultra saf suda 2 mg/mL CaCO3 çözeltisi hazırlayın. Aljinat çözeltisi ile 1: 1 karıştırın ve manyetik bir karıştırıcı kullanarak oda sıcaklığında 1 saat karıştırın.
- Asetik asidi 1:500 oranında ekleyin ve gece boyunca 650 rpm'de karıştırmaya bırakın.
NOT: Aljinat çözeltisi hemen jelleşmeye başlayacaktır. Şekillendirme jelinin optimum ve homojen bir şekilde karıştırılmasını sağlamak için kullanılan cam eşyaların çapıyla aynı uzunlukta bir karıştırma mıknatısı kullandığınızdan emin olun. Ertesi gün, jelasyon sırasında karıştırılarak üretilen çözelti viskoz görünecektir (Şekil 2A). - Jelleşmiş aljinat çözeltisini, bir LAF tezgahına yerleştirilmiş bir homojenizatör ile 10 dakika boyunca 15.000 rpm'de homojenize ederek mekanik olarak mikropartiküllere ayırın (Şekil 2B).
- Mikropartikülleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 18.500 × g'da santrifüj edin (Şekil 2C).
- Süpernatantı LAF tezgahının içine dikkatlice atın, 2 mM NaOH ve% 1 P / S içeren DDEM'deki parçacıkları yeniden askıya alın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (Şekil 2D).
NOT: Süspansiyonun rengi kırmızıya geri dönmelidir. Süspansiyon sarı kalırsa, NaOH'yi damla damla ekleyin ve kırmızıya dönene kadar karıştırın (Şekil 2E). - Partikülleri 3 dakika boyunca 15.000 rpm'de homojenize edin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 18.500 × g'da santrifüjleyin.
- Pelet gözlemleyin (Şekil 2F) ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.
NOT: Sıkıca paketlenmiş aljinat mikropartiküllerinin peletleri, bir sonraki kullanıma kadar 4 ° C'de saklanabilir. Aljinat çözeltisi filtreyle sterilize edilmediyse, mikropartiküller 1 hafta içinde kullanılmalıdır.
- SHAPE kompozit formülasyonu
- Baskıdan bir gün önce, aljinat mikropartikül peletini bir LAF tezgahında% 4 HEPES (1 M stok) ve% 4 NaHCO3 çözeltisi içeren büyüme ortamının iki katı hacminde yeniden askıya alın ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Mikrojel süspansiyonunu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 18.500 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı atın.
- Bir LAF tezgahındaki aljinat mikropartikülleri ile karıştırılacak kollajeni nötralize edin. 1 mg / mL'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için kollajen stok çözeltisini seyreltin ve% 4 HEPES ve% 4 NaHCO3 ekleyerek nötralize edin. Örneğin, 3 mL SHAPE kompoziti için, 2 mL aljinat mikropartikülünü 1 mL nötralize kollajen (0.12 mL HEPES, 0.12 mL NaHCO3, 0.16 mL büyüme ortamı ve 0.6 mL kollajen) ile karıştırın.
NOT: Kollajen polimerizasyonunu önlemek için kollajen ile karıştırılan tüm malzemelerin buz üzerinde işlenmesi gerekir. Kollajen nötralize edilir edilmez, polimerizasyon yavaşça başlayacaktır. - Aljinat mikropartikül peletini seyreltilmiş ve nötralize edilmiş kollajen ile 2: 1 oranında karıştırarak SHAPE kompozitini oluşturun. Bir LAF tezgahında buz üzerinde yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek jeli iyice karıştırın.
NOT: Vorteks yapmayın, çünkü bu destek malzemesine kabarcıklar sokacaktır. - Bir LAF tezgahında, üretilen kompozit malzemeyi soğutulmuş bir mikro kuyu plakasına veya uygun bir baskı kabına aktarın ve 30 dakika içinde kullanın (Şekil 3E, F).
3. hNSC kültürü ve biyomürekkep hazırlama
- Büyüme ortamında bazal membran ekstrakt kaplı T75 şişesindeki hücreleri kültürleyin. Hücreleri bir 3D baskı deneyi için kullanmadan önce çözüldükten sonra en az iki kez geçirin.
- Yazdırmadan önce, 37 ° C'de 5 dakika boyunca% 0.025'lik bir tripsin çözeltisi kullanarak hücreleri enzimatik olarak ayırın, tripsini büyüme ortamı ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj edin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı aspire edin ve peletleri 2-3 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın.
- Bir hücre sayımı yapın, hücreleri 400 × g'da santrifüj edin ve peleti% 0.1 ksantan zamkı ile desteklenmiş büyüme ortamında (hücrelerin çökelmesini önlemek için) 9 × 106 hücre / mL'lik bir konsantrasyonda yeniden askıya alın.
- 100 μL sıkıca paketlenmiş aljinat mikropartiküllerini bir şırıngaya yüklemek için 21 G künt metal iğne kullanın (Şekil 3A).
NOT: Aljinat mikropartikülleri ile bir tıkaç oluşturmak iki amaca hizmet eder: baskı sırasında ekstrüzyon stabilitesinin korunmasına yardımcı olur ve yüklenen hücresel mürekkebin tamamen ekstrüzyonuna izin verir (ölü hacim yok). - Aynı iğneyi kullanarak, hazırlanan hücre süspansiyonunu şırıngaya yükleyin (Şekil 3B).
NOT: Şırınga yükleme adımları sırasında herhangi bir hava kabarcığı girmemeye dikkat edin. Hava kabarcıkları baskı sırasında kararsızlıklara neden olur. - Yükleme iğnesini, baskı için kullanılacak 27 G künt metal iğne ile değiştirin (Şekil 3C).
4. Gömülü 3D baskı
- Başvurulan yazılımı kullanarak yazdırmak için bir yapı tasarlayın ( bkz.
NOT: Yazdırılan yapının başlangıç yüksekliğini SHAPE kompozit desteğinin derinliğine ayarladığınızdan emin olun. Tasarım önerileri Şekil 4A'da bulunabilir (spiral ve ahşap yığını tasarımları). - Oluştur'a tıklayarak bir G Kodu oluşturun.
- Hücre yüklü cam şırıngayı ekstrüzyon bazlı bir biyoyazıcı üzerindeki hacimsel ekstrüzyon kafasına yerleştirin (Şekil 3D).
- İğne Uzunluğu Ölçümü'ne tıklayarak hücre yüklü cam şırınganın iğne uzunluğunu ölçün.
- SHAPE kompoziti yüklü mikro kuyu plakasını veya kabını yazıcının üzerine yerleştirin.
NOT: Desteğin erken çapraz bağlanmasını önlemek için hücre plakasını veya kabı yazdırana kadar 4 °C'de tutun. - SHM'ye (yüzey yüksekliği ölçümü) tıklayarak SHAPE jelinin yüklendiği aynı mikro kuyucuk plakası veya kabı içindeki boş bir kuyucuğun yüzey yüksekliğini ölçün.
NOT: Alternatif olarak, kuyunun yüksekliğini iğne ile ölçerek yüzey yüksekliğini manuel olarak belirleyin. - Ekstrüzyon hızını 3,6 μL/dak'ya ve besleme hızını 0,3 mm/sn'ye ayarlayın.
NOT: Yazdırmadan önce ekstrüzyonu test ettiğinizden emin olun. Hücre çökelmesi nozul tıkanmasına neden olabilir ve gerçek gömülü baskıdan önce küçük bir hacmin önceden ekstrüzyonu yapılarak veya hacimsel şırıngaya bir geri çekme hacmi eklenerek önlenebilir. Bazı durumlarda, mürekkebin sürüklenmesini önlemek için iğne SHAPE jelinin içine sokulduğunda veya SHAPE jelinden çıkarken besleme hızının 0,5 mm/sn altında tutulması gerekir. - G-Code'u yazıcının kullanıcı arayüzüne yükleyin.
NOT: Tasarlanan yapıda her değişiklik yapıldığında yeni bir G Kodu oluşturulmalıdır. - Çalıştır'a tıklayarak yazdırma prosedürünü başlatın (Şekil 3G).
- Baskıdan hemen sonra, SHAPE jelini tavlama için 30 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de yerleştirin.
- Tavlanmış SHAPE jel desteğinin üzerine büyüme ortamını nazikçe ekleyin.
- Ertesi gün, büyüme ortamını aşağıdaki gibi formüle edilmiş farklılaşma ortamı ile değiştirin: DMEM / F12, 30 mM glikoz ile L-alanil-L-glutamin dipeptid, 5 μM HEPES,% 0.5 lipid bakımından zengin sığır serum albümini, 40 μM L-alanin, 40 μM L-asparagin monohidrat, 40 μM L-aspartik asit, 40 μM L-glutamik asit, 40 μM L-prolin,% 1 N2 takviyesi,% 1 penisilin-streptomisin,% 100 μM dibütiril-siklik adenozin monofosfat (dibütiril-cAMP), ve 2 ng/mL glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF).
NOT: Ortam değişimleri sırasında hidrojele zarar vermediğinizden emin olun. Plakayı eğin ve eski ortamı yavaşça çıkarın. Doğrudan jelin üzerine değil, jeli içeren kuyucuğun duvarına damla damla taze ortam ekleyin. Ortamı çıkarmak için aspiratör kullanmayın. - Farklılaştırma ortamını deneysel uç noktaya kadar her 2 günde bir yenileyin.
5. Canlı hücre floresan görüntüleme
- Fazla ortamı jelden çıkarın.
- Destek jelinin hacmine eşit miktarda 20 μM Calcein (stok çözeltisinden farklılaşma ortamında seyreltilmiş) ekleyin.
- 37 ° C'de 40 dakika inkübe edin.
- Calcein çözeltisini çıkarın ve uygun miktarda taze farklılaşma ortamı ekleyin.
- Görüntüleme için plakayı mikroskopa aktarın.
6. İmmünositokimya
- Fazla ortamı jelden çıkarın.
- Küçük bir spatula kullanarak, jeli DPBS içeren daha büyük bir kaba aktarın.
- DPBS ile her seferinde 20 dakika boyunca üç kez yıkayın ve plakayı bir duman davlumbazına aktarın.
- DPBS'yi çıkarın, jeli örtmek için yeterli% 4 formaldehit çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Her seferinde 20 dakika boyunca DPBS ile üç kez yıkayın.
- DPBS'de %5 eşek serumu, %0,25 deterjan ve %0,02 sodyum azidden oluşan bloke edici çözelti hazırlayın.
NOT: Jeli örtmek için gereken hacmin üç katını hazırlayın; Daha sonra birincil ve ikincil antikor çözeltilerinin temeli olarak kullanılacaktır. - DPBS ile yıkadıktan sonra, blokaj çözeltisini jele ekleyin ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için oda sıcaklığında 6 saat inkübe edin. Tabağı yavaşça sallayın.
- TUBB3 antikorunu bloke edici çözeltide 1: 1.000 oranında seyrelterek birincil antikor çözeltisini hazırlayın.
- Bloke edici çözeltiyi jelden çıkarın, birincil antikor çözeltisini ekleyin ve 4 ° C'de 48 saat boyunca inkübe edin. Tabağı yavaşça sallayın.
- Her seferinde 20 dakika boyunca DPBS ile üç kez yıkayın.
- Sekonder antikor solüsyonunu, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:1,000) ve sekonder antikoru (1:200) bloke edici çözelti içinde seyrelterek hazırlayın.
- DPBS ile yıkadıktan sonra, jeli sekonder antikor çözeltisinde 4 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Tabağı yavaşça sallayın.
- DPBS ile her seferinde 20 dakika boyunca üç kez yıkayın ve görüntülemeye kadar 4 ° C'de saklayın.
- Görüntülemeden önce, lekeli jeli bir spatula ile bir tabağa veya ince bir görüntüleme tabanına sahip bir kuyu plakasına aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İç jelasyon sırasında kesme inceltme yoluyla aljinat mikrojel preparasyonu ve ardından mekanik parçalanma, Şekil 2G'de görüldüğü gibi boyut olarak polidağılmış ve pul benzeri şekilli aljinat mikrojelleri verir. Bu düzensiz parçacıkların boyutu 1 μm'den az ila yaklaşık 40 μm çap arasında değişmektedir. Sıkıca paketlendiğinde, mikropartiküller, karşılık gelen hücre kültürü ortamından sadece biraz daha opak olan şeffaf bir dökme malzeme oluşturur (Şekil 2F). Destek malzemesinin şeffaflığı, kültürleme döneminde basılı yapıların görselleştirilmesine ve hem canlı hücre boyaları hem de immünositokimya yoluyla etiketlenmiş yapıların yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopisine izin verdiği için platformun önemli bir yönüdür. Tamponlanmış hücre kültürü ortamına batırıldığında, elde edilen pH ayarlı jel, fizyolojik koşulları gösteren kırmızı bir renge sahip olmalıdır (Şekil 2F). Aljinat mikropartiküllerinin pH'ını iki nedenden dolayı nötralize etmek önemlidir. Asidik mikropartiküller hücrelere doğrudan zarar verebilir. Ayrıca, asidik bir ortam, kollajen polimerizasyonuna müdahale edeceği için SHAPE kompozit desteğinin başarılı bir şekilde tavlanmasını önleyecektir.
Yukarıda açıklanan parametreleri kullanarak hNSC mürekkebinin basılması, ~ 200 μm çapında bir hücre filamenti verir (Şekil 4A). Programlanan geometri hem bir düzlemde baskı yaparken hem de yapıları birbiri üzerine yazdırırken korunur. Çok katmanlı baskı durumunda, yazdırılan yapılar minimum katmandan katmana mesafe 200 μm13 ile bozulmadan kalır. Hücrelerin canlılığı, mürekkep hazırlama ve ekstrüzyon sırasında önemli ölçüde etkilenmemelidir. Basılı iplikçikler, yuvarlak morfolojiye sahip canlı hücreler bakımından zengindir (Şekil 4B, solda). Baskıdaki ipliklerdeki boşluklar, fabrikasyon yapı baskıdan hemen sonra herhangi bir deformasyon göstermese bile, baskıdan sonraki gün ortaya çıkabilir. Bu büyük olasılıkla desteğin homojen olmayan bir şekilde karıştırılmasının sonucudur. Hücreler aljinat mikropartikülleri ile etkileşime girmediğinden, aljinat bakımından zengin alanlardan kollajen ve hücre bakımından zengin alanlara doğru göç ederler, böylece basılı iplikçiklerde kırılmalara neden olurlar. Ayrıca, hava cepleri baskı doğruluğuna müdahale edebileceğinden SHAPE desteği kabarcıksız olmalıdır.
hNSC'lerin başarılı bir şekilde farklılaşması, baskıdan 30 gün sonra nöron bakımından zengin yapılar sağlamalı, hücreler küçük hücre gövdeleri ve uzun ince süreçlerle nöronal morfoloji sergilemelidir (Şekil 4B, sağda). Ayrıca, dikdörtgen bir hücre tabakası gibi yoğun desenler basılırsa, farklılaşma sırasında oluşan görünür boşluklar veya agregalar olmamalıdır, bunun yerine sürekli bir hücre tabakası bozulmadan kalmalıdır (Şekil 4C). Bu protokolde, 3D baskılı numunelerin floresan immünositokimyası için bir prosedür açıklanmaktadır. Sitoplazmik bir nöronal belirteç olan TUBB3 için boyama, üretilen nöronal ağların doğrudan görselleştirilmesine izin verir. Farklılaştırılmış baskıların floresan mikroskopisi, TUBB3 bakımından zengin ve geometrisi korunmuş yapıları ortaya çıkarmalıdır (Şekil 4D, solda). Farklılaşma işlemi sırasında, hücreler DAPI ile hücre çekirdekleri için boyanarak gözlemlenebileceği gibi, basılı iplikçiklerden dışarı göç etmezler (Şekil 4D, orta). Sonuç olarak, nöronal cisimler, baskılı geometrinin sınırları içinde, yapıyı çevreleyen SHAPE desteğine yüzlerce mikrometre yayan aksonal projeksiyonlarla gözlenir. Çevreleyen hacmin aksonal keşfi, SHAPE desteğinin aksonal yol bulmaya izin veren biyofonksiyonel ipuçları sağladığını gösterir. İmmünositokimyada, üretilen nöronal popülasyonları daha da karakterize etmek için daha olgun nöronal belirteçler veya alt tipe özgü belirteçler kullanılabilir. Ayrıca, basılı nöronal yapı RT-qPCR veya elektrofizyoloji13 kullanılarak karakterize edilebilir. Bununla birlikte, her iki yaklaşım da, hidrojel tabakası hem RNA ekstraksiyonunu hem de bir mikropipet ile hücrelere fiziksel erişimi engellediğinden, kollajenin kollajenaz kullanılarak çıkarılmasını gerektirecektir.
Şekil 1: SHAPE gömülü baskı yaklaşımının kavramsal gösterimi. Bir kollajen çözeltisi, SHAPE kompozitini oluşturmak için aljinat mikropartikülleri ile karıştırılır; SHAPE kompoziti, tavlanmış desteğin içindeki nöronlara farklılaşan hNSC'lerin gömülü 3D baskısı için bir destek malzemesi olarak kullanılır. SHAPE kompozitinin biyofonksiyonel özellikleri, nöronların projeksiyonları genişletmesine ve desteğin boş kısmını aksonal projeksiyonlarıyla doldurmasına izin verir. Bu rakam Kajtez ve ark.13'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: SHAPE = kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris; hNSC'ler = insan nöral kök hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Aljinat mikropartiküllerinin hazırlanması . (A) Gece boyunca jelasyondan sonra aljinat çözeltisi. (B) Homojenizasyon ile üretilen aljinat mikropartikülleri. (C) Santrifüjlemeden sonra partikül pelet. (D) pH ayarından önce ve pH ayarından sonra DMEM (E)'de yeniden askıya alınan pelet. (F) Gece boyunca ortamda inkübasyondan ve santrifüjlemeden sonra mikropartiküller. (G) Fabrikasyon aljinat mikropartiküllerinin parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 3D baskı işlemine hazırlık. (A) Şırıngaya bir bulamaç tapası (~ 100 μL) yüklenir ve ardından (B) hücresel biyomürekkebin yüklenmesi (burada görselleştirme amacıyla renkli boncuklarla desteklenir). (C) Mürekkep yükleme için kullanılan konik plastik uç (21 G), 27 G künt metal iğne ucu ile değiştirilir. (D) Şırınga, 3D baskı kafasına yerleştirilir. (E,F) SHAPE kompozit, 48 delikli bir plakadan oluşan bir kuyuya pipetlenir. SHAPE kompozitli tüp, kullanılmadığında buz üzerinde tutulur. (G) Baskı iğnesi ucu SHAPE desteğine yerleştirilir ve bilgisayar tasarımı tarafından tanımlanan yolun yazdırılmasına başlanır (burada, bir spiralin baskısı tasvir edilmiştir). Kısaltma: SHAPE = kendi kendini iyileştiren tavlanabilir parçacık-hücre dışı matris. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: SHAPE kompozit desteğinin içindeki 3D baskılı nöral yapılar. (A) Destek hidrojeli içindeki basılı hNSC'lerin parlak alan görüntüleri. Spiral (solda) ve odun yığını (sağda) yapı tasarımları görüntülenir. (B) 3D baskılı bir yapının canlı hücre görüntülemesi, baskıdan sonraki gün (solda) ve nöronal farklılaşmadan sonra (sağda). (C) Bir spatula ile bir kültür kuyusundan çıkarılan 3D baskılı kare bir yapı, yapısal bütünlüğü gösterir. (D) Bir nöronal belirteç (TUBB3) için immün etiketli ve karşı boyanmış çekirdeklerle (DAPI) aynı kare yapının floresan konfokal görüntüleri, 3D baskılı yapılar içindeki hNSC'lerin başarılı bir şekilde farklılaşmasını doğrulamaktadır. Ölçek çubukları = 500 μm (A, sağ); 100 μm (B,D). Bu şekildeki C ve D panelleri Kajtez ve ark.13'ten modifiye edilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SHAPE kompozit malzeme yaklaşımı, hücresel mürekkeplerin gömülü 3D baskısı için tavlanabilir ve biyofonksiyonel destek banyolarının formülasyonu için çok yönlü bir yol sağlar. Bu protokol, nöral yapıların 3D baskısına bir örnek sunarken, SHAPE araç kutusu, bir dizi hedef doku tipinin hassas mühendisliği için diğer hücre kaynaklarıyla biyofabrikasyona kolayca uyarlanabilir. Baskı yaklaşımı ayrıca, etkileşimlerini incelemek veya hücresel bölmelerin (örneğin, nöronlar ve glial hücreler) tanımlanmış bir mekansal düzenlemesiyle dokuları mühendislik yapmak için çoklu hücre tiplerinin hassas bir şekilde modellenmesine izin verecektir. Geleneksel granüler jellerin aksine, SHAPE kompoziti genişletilmiş bir interstisyel boşluk içerir (bu protokolde sunulan formülasyon için ~% 30 hacim fraksiyonu). Granüler bileşen, kompozitin yüksek çözünürlüklü gömülü baskı için uygun malzeme özellikleri sağlayan reolojik bir değiştirici görevi görür. Bu, aynı granüler bileşeni korurken sürekli bileşenin formülasyonunu değiştirerek hücresel mikro çevrenin rasyonel tasarımına doğru bir yol açar. Örneğin, destek banyosuna diğer fonksiyonel ECM molekülleri sokulabilir (örneğin, hyaluronik asit, lamininler, fibronektin) veya farklı çapraz bağlama mekanizmalarından yararlanılabilir (örneğin, enzimatik, ışık bazlı)13. Ayrıca, granüler bileşendeki aljinat, farklı hidrojel malzemelerden (örneğin, jelatin8, polietilen glikol14,15, agaroz 16) mikropartiküllerle değiştirilebilir veya farklı doku mühendisliği veya hastalık modelleme uygulamalarının ihtiyaçları doğrultusunda farklı boyut ve şekillerde yapılabilir. Granüler ve sürekli faz arasındaki oran, bireysel 3D baskı projelerinin ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir, ancak sürekli fazı% 30'un üzerine çıkarmak, baskı doğruluğunu ve çözünürlüğünü tehlikeye atabilir.
Mikrojel üretim adımları sırasında, asetik asit ilavesinden sonra aljinat çözeltisinin karıştırılmasının, jelleşme çözeltisinin hacmi boyunca etkili olması kritik öneme sahiptir. Karıştırma hızı çok düşükse veya manyetik karıştırıcı çok küçükse, karıştırma çözeltinin üst katmanlarına ulaşmayabilir, bu da alt katmanlar kesilirken büyük miktarda çapraz bağlı dökme hidrojele dönüşür. Tutarsız bir şekilde kesilmiş bir aljinat hidrojelinin homojenizasyonu, 3D baskı uygulamaları için yetersiz olan aljinat mikropartiküllerinin üretilmesine neden olacaktır. Ayrıca, aljinat mikropartiküllerinin kollajen çözeltisi ile iyice karıştırılması gerekir, çünkü homojen olmayan bir karışım, kollajen içermeyen destek malzemesinin yamalarına neden olur; Bu yamalar tavlanmayacak ve bu nedenle hücre etkileşimli özelliklerden yoksun olacaktır. Aljinat mikropartiküllerinden yoksun olan ve bu nedenle baskıyı desteklemeyen yamalar da olabilir. Bu nedenle, homojen olmayan bir şekilde karıştırılmış bir baskı desteği, yüksek doğrulukta baskıyı destekleyemez ve hacmi boyunca tavlanmayacağı için yapısal olarak tehlikeye girer. Kabarcıklardan, hücreler için zararlı olabileceğinden değil, hava ceplerinin baskı sırasında deformasyonlara neden olabileceğinden ve yapıların görüntülenmesine müdahale edebileceğinden kaçınılmalıdır. İki yaygın kabarcık kaynağı vorteksleme (37 ° C'de destek tavlaması sırasında genişleyen soğuk destekteki mikro kabarcıklar) ve kuvvetli pipetlemedir.
Bu çalışmadaki SHAPE kompozit desteği, baskı sonrası çıkarılacak kurban malzemesi olarak değil, hem kök hücre farklılaşması hem de nöronal büyüme ve fonksiyonel olgunlaşma için uzun vadeli biyofonksiyonel bir destek olarak formüle edilmiştir. Baskı sonrası tavlanmamış granül jellere kıyasla, tavlanmış SHAPE kompozit malzemenin yapısal stabilitesi ve şeffaflığı, fiksasyon ve immün etiketleme işlemi sırasında hassas nöronal özellikler için koruyucu bir ortam sağlar ve bu nedenle, bu malzeme antijenlerin görselleştirilmesi yoluyla morfolojik karakterizasyonu kolaylaştırır. Floresan muhabirleri, zaman içinde hücresel morfolojideki değişiklikleri izlemek ve tavlanmış baskı desteği içindeki hücresel çoğalmayı ve göçü izlemek için de kullanılabilir. Ayrıca, kalsiyum görüntüleme yaklaşımları spontan hücresel aktivite hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilir (örneğin, nöronlardaki aksiyon potansiyellerinin ateşlenmesi veya hatta senkronize nöronal ağ aktivitesi). Bununla birlikte, mühendislik hücresel yapılarının kimyasal stimülasyonu (örneğin, KCl kullanarak nöronal stimülasyon), difüzyonu yavaşlatan ve hücresel mikro ortamın anlık modülasyonunu önleyen hücreleri çevreleyen hidrojel tabakası nedeniyle zor olabilir. Optogenetik stimülasyon, hücresel aktivitenin kontrolü için daha iyi bir seçenek sunar, çünkü SHAPE hidrojelleri hücrelere optik erişimi engellemez.
Oksijene duyarlı boncuklar, yüksek hassasiyetle basılı yapıların içindeki ve çevresindeki oksijen gerilim seviyelerinin canlı uzamsal ve zamansal haritalandırılmasını sağlamak için biyomürekkebe veya destek malzemesine (kompozit hazırlama sırasında doğrudan baskı veya dağılım yoluyla ) dahil edilebilir13. Fosforesans ömür boyu ölçümlerine dayanan bu noninvaziv 3D oksijen haritalama yaklaşımı, gelişmiş oksijenasyon ve muhtemelen gelişmiş besin arzı ile mühendislik dokusu yapılarına doğru bir yol sağlar. Zayıf oksijenasyon, basılı yapılar içinde nekrotik bölgelerin oluşumuna yol açabilir, kök hücre farklılaşmasına müdahale edebilir ve nöronal metabolizmayı etkileyebilir. Oksijen haritalama, yapı boyunca düzgün oksijenasyonu, oksijen seviyelerinin fizyolojik koşullara uyacak şekilde ince ayarlanmasını veya oksijen gradyanlarının oluşturulmasını kolaylaştırmak için 3D baskı tasarımının değiştirilebileceği bir okuma sağlar.
Mühendislik kanalları, soğuk destek banyosunun içinde katılaşan, ancak 37° C'de kolayca tahliye edilebilen jelatin gibi kurban edilmiş bir mürekkep basılarak tavlanabilir baskı desteğinin içine de dahil edilebilir 4,13. Tasarım tabanlı oksijen gerilimi manipülasyon yaklaşımının yeteneklerini aşan yüksek hücre yoğunluğuna veya boyutlarına sahip doku yapılarına besin ve oksijen sağlamak için kanallar gerekecektir. Ek olarak, hücresel kimliğin modellenmesini yönlendiren, hücresel aktiviteyi modüle eden veya kemotaksislere rehberlik eden küçük moleküllerin gradyanlarını oluşturmak için vasküler benzeri kanallardan yararlanılabilir.
Özetle, SHAPE kompozitinin içine gömülü 3D baskı, kolayca uyarlanabilen ve mekanik olarak hassas dokuların fonksiyonel modellemesi için çok yönlü potansiyele sahip modüler bir malzeme platformu sunar. Burada sunulan protokol, destek malzemesini oluşturmak ve hücresel mürekkebi yüksek doğrulukla yazdırmak için gerekli adımların ve temel ilkelerin ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Yaklaşım, uygun fiyatlı malzemelerden ve erişilebilir ekipmanlardan yararlanırken, yaklaşımın bireysel araştırmacıların ihtiyaçlarına ve uygulamalarına göre kişiselleştirilmesi için yer sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Araştırma öncelikle Marie Skłodowska-Curie İlk Eğitim Ağı ve 676408 No'lu Hibe Anlaşması kapsamında BrainMatTrain Avrupa Birliği Horizon 2020 Programı (No. H2020-MSCA-ITN-2015) tarafından finanse edildi. C.R. ve J.U.L., destekleri için Lundbeck Vakfı'na (R250-2017-1425) ve Danimarka Bağımsız Araştırma Fonu'na (8048-00050) minnetle teşekkür eder. OpenMIND'101047177 HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 Projesi için sağlanan finansmanı minnetle kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Bhattacharjee, T., et al.
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Skylar-Scott, M. A., et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- LeBlanc, K. J., et al. Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).
- Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths. Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).
- Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures. Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).
- McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
- Kajtez, J., et al. Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs. Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).
- Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods. Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs. 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).
