Summary
Her præsenterer vi en samling af assays til direkte måling af mitokondriefunktion i pattedyrceller uafhængigt af deres evne til at forbruge molekylært ilt.
Abstract
Strømmen af elektroner i mitokondrieelektrontransportkæden (ETC) understøtter mangesidede biosyntetiske, bioenergetiske og signalfunktioner i pattedyrceller. Da ilt (O2) er den mest allestedsnærværende terminalelektronacceptor for pattedyrets ETC, anvendesO2-forbrugshastigheden ofte som en proxy for mitokondriefunktion. Ny forskning viser imidlertid, at denne parameter ikke altid er vejledende for mitokondriefunktion, da fumarat kan anvendes som en alternativ elektronacceptor til at opretholde mitokondriefunktioner i hypoxi. Denne artikel kompilerer en række protokoller, der gør det muligt for forskere at måle mitokondriefunktion uafhængigt af O2-forbrugshastigheden. Disse analyser er særligt nyttige, når man studerer mitokondriefunktion i hypoxiske miljøer. Specifikt beskriver vi metoder til måling af mitokondriel ATP-produktion, de novo pyrimidinbiosyntese, NADH-oxidation ved kompleks I og superoxidproduktion. I kombination med klassiske respirometrieksperimenter vil disse ortogonale og økonomiske assays give forskere en mere omfattende vurdering af mitokondriefunktionen i deres interessesystem.
Introduction
Mitokondriefunktion er en kritisk måling af cellulær sundhed, da den opretholder vigtige biosyntetiske, bioenergetiske og signalfunktioner i pattedyrceller1. Langt de fleste mitokondriefunktioner kræver elektronstrøm gennem elektrontransportkæden (ETC), og forstyrrelser i elektronstrømmen i ETC forårsager alvorlig mitokondriesygdom2. ETC består af en række reduktions- og oxidationsreaktioner (redox), der er indlejret i den indre mitokondriemembran, og disse elektronoverførselsreaktioner frigiver fri energi, der kan udnyttes til at understøtte ATP-syntese, fysiologiske processer såsom termogenese, biosyntetiske veje såsom de novo pyrimidinbiosyntese og balancen mellem redoxstatus for co-faktorer såsom NADH. ETC-kompleks I og III producerer reaktive iltarter (ROS)3,4,5, som igen regulerer signalnøgleveje som HIF, PI3K, NRF2, NFκB og MAPK 6. Derfor anvendes målinger af elektronstrøm i ETC klassisk som en proxy for mitokondriefunktion i pattedyrceller.
Respirometri eksperimenter anvendes ofte til at måle mitokondrie funktion i pattedyr celler. DaO2 er den mest allestedsnærværende terminalelektronacceptor for pattedyrets ETC, anvendes dens reduktion som en proxy for mitokondriefunktion. Nye beviser viser imidlertid, at pattedyrs mitokondrier kan anvende fumarat som elektronacceptor til at opretholde mitokondriefunktioner, der afhænger af ETC, herunder de novo pyrimidinbiosyntese 7, NADH-oxidation7 og afgiftning af hydrogensulfid8. I visse sammenhænge, især i hypoxiske miljøer, giver målinger afO2-forbrugshastigheden (OCR) således ikke en præcis eller nøjagtig indikation af mitokondriefunktionen.
Her skitserer vi en række assays, der kan anvendes til at måle mitokondriefunktionen uafhængigt af OCR. Vi leverer analyser til direkte måling af kompleks I-medieret NADH-oxidation, dihydroorotat dehydrogenase-medieret de novo pyrimidinbiosyntese, kompleks V-afhængig ATP-syntese, nettoretningen af succinatdehydrogenasekomplekset (SDH) og mitokondrieafledt ROS. Disse analyser er beregnet til at blive udført på dyrkede pattedyrceller, selvom mange kan tilpasses til at studere mitokondriefunktioner in vivo. Især er analyserne beskrevet i denne protokol mere direkte målinger af mitokondriefunktioner end OCR. Desuden muliggør de måling af mitokondriefunktion i hypoxi, en sammenhæng, hvor OCR ikke er en vejledende måling. Samlet set vil disse analyser i kombination med klassiske respirometrieksperimenter give forskere en mere omfattende vurdering af mitokondriefunktionen i pattedyrceller.
Protocol
1. Proliferationsanalyser til måling af aktiviteten af komplekse I-, dihydroorotat-dehydrogenase- (DHODH) og komplekse V-aktiviteter
- Seedceller til proliferationsassays
BEMÆRK: Denne protokol bruger den humane osteosarkomcellelinje 143B købt kommercielt fra ATCC. Denne cellelinje blev brugt i henhold til retningslinjerne i vores godkendte IBC-protokol (Institutional Biosafety Committee).- Fjern pladerne fra vævskulturinkubatoren. Opsug mediet fra pladerne, og vask med 1x fosfatbufret saltvand (PBS) for at fjerne eventuelt resterende medium. Opsug PBS, og dæk skålen med 0,05% -0,25% trypsin for at løfte cellerne fra bunden af pladen.
- Vent 3-5 minutter på, at trypsinet frigiver cellerne fra pladen, og sluk derefter trypsinet med 10 ml af det ønskede vækstmedium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS).
- Saml cellerne i et konisk rør, og centrifuger ved 1.000 × g i 5 minutter for at pelletere cellerne.
- Opsug mediet fra røret uden at forstyrre pelleten. Resuspender pellet med komplet medium.
- Tæl cellerne, og kvantificer det volumen, der er nødvendigt for at frø mellem 10.000 og 25.000 celler i en 6-brønds plade.
BEMÆRK: Hver cellelinje skal optimeres til antallet af celler, der skal podes. Den ideelle sammenløb opnået er ~ 10% i begyndelsen af eksperimentet og ~ 80% i slutningen af eksperimentet. - Pipette cellerne i en 6-brønds plade, og tilsæt 2 ml komplet medium til hullerne. Lad sidde i 24 timer, før du skifter til de eksperimentelle mediebetingelser.
BEMÆRK: Frø mindst tre replikater pr. tilstand og nok brønde til at teste den ubehandlede kontroltilstand, inhibitorbehandlede kontroltilstand, ubehandlede eksperimentelle tilstand og inhibitorbehandlede eksperimentelle tilstand.
- Middel ændring til vurdering af kompleks V-aktivitet ved spredning
BEMÆRK: Celler, der formerer sig i et medium med galactose, er afhængige af kompleks V-aktivitet for ATP-syntese 9,10. I modsætning til glucose, som giver netto to ATP fra glykolyse, giver galactose ingen, hvilket tvinger cellerne til at være afhængige af kompleks V til ATP-syntese (figur 1). Den komplekse V-hæmmer oligomycin anvendes som kontrol.- Der fremstilles 10 mM glucoseholdigt medium (se tabel 1).
- Der fremstilles 10 mM galactoseholdigt medium (se tabel 1).
- Skift substratet i hvert hul til enten glucoseholdigt DMEM eller galactoseholdigt DMEM. Der tilsættes 5 μM oligomycin (den komplekse V-hæmmer) til de relevante huller og samme volumen DMSO til de ubehandlede huller. Oligomycinbestanden er 10 mM resuspenderet i DMSO. Sæt pladen tilbage i vævskulturinkubatoren i 2 dage.
- Middel ændring til vurdering af kompleks I-aktivitet ved spredning
BEMÆRK: Celler, der formerer sig i et pyruvatfrit medium, er mere afhængige af kompleks I-aktivitet11,12. Uden pyruvat kræver de dyrkede celler kompleks I for at lette størstedelen af NADH-reoxidering tilbage til NAD + (figur 2). Den komplekse I-hæmmer rotenon anvendes som kontrol.- Lav pyruvatfrit DMEM-medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Der fremstilles en 1 M opløsning af pyruvat (se tabel 1).
- Skift substratet i hvert hul til enten pyruvatfrit medium eller pyruvatholdigt medium. Der tilsættes 2 μM rotenon (kompleks I-hæmmeren) til de behandlede brønde og det samme volumen DMSO til de ubehandlede huller. Rotenonbestanden er 25 mM resuspenderet i DMSO. Sæt pladen tilbage i vævskulturinkubatoren i 2 dage.
- Medium ændring til vurdering af DHODH-aktivitet ved spredning
BEMÆRK: Celler, der formerer sig i et uridinfrit medie, kræver dihydroorotat dehydrogenase (DHODH) aktivitet11,12,13. I fravær af eksogen uridin syntetiserer de dyrkede celler pyrimidiner gennem de novo-vejen. DHODH-hæmmeren brequinar anvendes som kontrol.- Lav uridinfri DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Der fremstilles en 10 mg/ml uridinstamopløsning, og derefter fremstilles et 100 μg/ml uridinmedium (se tabel 1).
- Skift substratet i hvert hul til uridinfrit medium eller uridinholdigt medium. Der tilsættes 5 μM brequinar (DHODH-hæmmeren) til de behandlede brønde og samme volumen DMSO til de ubehandlede huller. Brequinarbestanden er 10 mM resuspenderet i DMSO. Sæt pladen tilbage i vævskulturinkubatoren i 2 dage.
- Tælling af cellerne til proliferationsassays
- For alle eksperimenterne skal du genopfylde mediet hver 2. dag. Hvis mediet bliver gult i farve, skal du øge hyppigheden af medieændringerne. Lad cellerne sprede sig i op til 7 dage, og stop eksperimentet, hvis nogen af brøndene begynder at se overgroede ud. Brønde betragtes som overgroede, når sammenflugten overstiger 80%.
- Opsug mediet, vask med 1x PBS, og dæk bunden af brønden med 0,25% trypsin (500 μL til en 6-brønds skål).
- Vent 5 minutter, indtil cellerne har løftet fadet. Tjek dette under et mikroskop.
- Sluk trypsinet med 1 ml komplet DMEM indeholdende 10% FBS.
- Pipette op og ned for at nedbryde celleklumperne.
- Forbered Coulter tællerkopper ved at fylde hver med 10 ml isoton buffer (en kop pr. Brønd). Tæl cellerne på en celletæller, og registrer dataene. Hvis aflæsningen er celler pr. milliliter (celler / ml), multipliceres den registrerede værdi med 1,5 for at få det samlede antal celler pr. Brønd.
BEMÆRK: Andre celletællingsmetoder såsom et hæmocytometer er tilstrækkelige, hvis laboratoriet ikke har en Coulter-tæller.
2. 13C 4-Aspartat stabil isotopsporing og LC-MS analyse til måling af DHODH aktivitet
- 13C4-aspartat stabil isotopsporing i vedhængende celler
BEMÆRK: DHODH-aktivitet kan overvåges direkte ved at måle inkorporeringen af 13 C 4-aspartat i 13C3-UMP. Brequinar anvendes som kontrol for DHODH-aktivitet (figur 3). De resulterende niveauer af 13C3-UMP er et mål for DHODH aktivitet.- Frø mellem 250.000 og 500.000 celler i en 6-brønds skål for at opnå 75% sammenløb den næste dag.
- Der fremstilles en stamopløsning af 250 mM 13 C 4-aspartat og 10 mM 13C4-aspartatsubstrat (se tabel 1).
- Substratet i hvert hul ændres til medium, der indeholder 10 mM 13C 4-aspartat. Inkuber i det passende antal timer for at opnå en stabil tilstand til mærkning af cellerne af interesse.
BEMÆRK: Steady state defineres som den tidsramme, hvor den procentmærkede metabolit plateauer over tid14. For 143B osteosarkomceller opnår 13C 4-aspartat en stabil tilstand med 8 timer. Det er bedste praksis at bestemme denne tidsramme forud for eksperimenteringen ved at udføre et tidsforløbseksperiment med den stabile isotop af interesse.
- Metabolitisolering fra de vedhængende celler
- Før du begynder, skal du forberede en spand tøris og forberede 80% HPLC-kvalitet MeOH i HPLC-kvalitet vand. Afkøl denne buffer i en -80 °C fryser natten over eller læg den direkte på tøris.
- Tag en plade ud ad gangen fra inkubatoren, aspirer mediet fra brøndene og vask 2x med 1x PBS. Fjern al resterende PBS fra brøndene, inden du går videre til næste trin.
BEMÆRK: Sørg for at vippe pladen under aspirationen og pipetten mod skålens væg for at forhindre forstyrrelse af de klæbende celler. - Pladen anbringes på tøris, og der tilsættes straks 800 μL 80 % LCMS-grade MeOH i 20 % LCMS-vand til hvert hul.
- Inkuber pladen i mindst 15 minutter i en -80 °C fryser for at lette cellelyse.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan den næste plade tages ud af inkubatoren, og trin 2.2.1-2.2.4 gentages. Fortsæt dette, indtil alle pladerne inkuberes i -80 °C fryseren. - Tag en plade ud ad gangen fra fryseren, skrab hver brønd på tøris ved hjælp af en celleløfter, og overfør lysatet til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Hold røret på tøris indtil næste trin.
- Vortex alle rørene i 10 minutter ved 4 °C og centrifugeres derefter ved 4 °C i 10 minutter ved maksimal hastighed (mindst 17.000 × g).
- Supernatanten overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugeglas, og den tørres ned i en 4 °C vakuumkoncentrator udstyret med en -105 °C kuldefælde ved høj vakuumindstilling i ca. 6 timer, eller indtil prøverne er fordampet. Når lysatet er tørret ned, opbevares metabolitpellets ved -80 °C, indtil de er klar til at forberede dem til væskekromatografi parret med massespektrometri (LCMS).
- Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) måling af polære metabolitter
BEMÆRK: Enhver kromatografisk arbejdsgang og massespektrometriarbejdsgang, der muliggør påvisning af aspartat, mellemprodukterne i de novo pyrimidinbiosyntese og UMP er tilstrækkelig14.- Prøverne fremstilles til LCMS på is ved at tilsætte 100 μL vand af HPLC-kvalitet til de tørrede pellets og hvirvler i 10 minutter ved 4 °C.
- Centrifuger prøverne ved 4 °C i 10 minutter ved maksimal hastighed (mindst 17.000 × g), og flyt 25 μL ind i hvert LC-MS hætteglas.
- Injicer 2 μL lysat i LC-MS-systemet. En almindeligt anvendt metode er angivet nedenfor:
- Der fremstilles mobil fase A bestående af 20 mM ammoniumcarbonat (LC-MS-kvalitet) og 0,1 % ammoniumhydroxid (LC-MS-kvalitet) opløst i vand af LC-MS-kvalitet.
- Vælg 100% acetonitril (LC-MS Grade) som mobil fase B.
- Til kromatografien skal du vælge en 5 μm, 150 mm x 2,1 mm analytisk søjle udstyret med en 2,1 mm x 20 mm beskyttelsessøjle for hydrofile forbindelser (se materialetabellen). Indstil søjleovnen til 25 °C.
- Brug følgende væskekromatografiindstillinger: en konstant strømningshastighed på 0,15 ml / min; en lineær gradient fra 80 % til 20 % mobil fase B i 20 min, efterfulgt af en lineær gradient fra 20 % til 80 % mobil fase B i 0,5 min, efterfulgt af et hold på 80 % mobil fase B i 7,5 min.
- Vælg følgende massespektrometerindstillinger: en fuld scanning mellem m/z 70 Da og 1.000 Da; en resolution på 70.000; et AGC-mål på 1 × 106 og en maksimal injektionstid på 20 ms. Betjen kilden i polaritetsskiftetilstand. Indstil sprøjtespændingen til 3,0 kV, den opvarmede kapillær til 275 °C, HESI-sonden ved 350 °C, kappegasstrømmen ved 40 enheder, hjælpegasstrømmen ved 15 enheder og fejegasstrømmen ved 1 enhed.
- Udfør dataanalysen ved hjælp af software, der grænseflader med LCMS-arbejdsgangen.
BEMÆRK: Den software, der bruges med ovenstående arbejdsgang, er XCalibur (Thermo) og TraceFinder (Thermo). De vigtigste overvejelser i forbindelse med dataanalyse er beskrevet nedenfor:- Forventede opbevaringstider: Retentionstiden for hver metabolit bestemmes ved at køre standarderne for hver metabolit af interesse ved hjælp af den kromatografiske metode før forsøget.
BEMÆRK: Retentionstiderne for UMP og dets isotopologer, herunder 13C3-UMP, er nøjagtig de samme. - Forventet M/Z for metabolitter: Hvis en metabolit ioniserer i negativ iontilstand (såsom UMP), beregnes den forventede nøjagtige masse ved hjælp af molekylformlen for UMP minus en proton [C9H14N2O9P]. For metabolitter, der ioniserer i positiv iontilstand, beregnes den nøjagtige masse ved hjælp af molekylformlen plus en proton.
- Masse nøjagtighed: Ved anvendelse af et orbitrap-massespektrometer forventes den pågældende metabolit og dens isotopologer at have en massenøjagtighed ±5 mmu. Brug software til at beregne dette, idet du tager højde for den forventede M / Z og den faktiske detekterede M / Z.
- Korrektion af naturlig overflod: Alle sporingsdata forventes at gennemgå naturlig tæthedskorrektion for at tage højde for ~ 1% 13C og ~ 0,5% 15 N-isotoper i naturen 15.
- Forventede opbevaringstider: Retentionstiden for hver metabolit bestemmes ved at køre standarderne for hver metabolit af interesse ved hjælp af den kromatografiske metode før forsøget.
3. 13C 5-glutamin stabil isotopsporing til måling af SDH-aktivitet
- 13C 5-glutamin stabil isotopsporing i klæbende celler
BEMÆRK: SDH-aktivitet kan overvåges direkte ved at måle omdannelsen af visse isotopologer af fumarat og succinat ved 13C 5-glutaminsporing 7,16,17. Den komplekse III-hæmmer antimycin anvendes som en kontrol til at ændre SDH-kompleksets netretning (figur 4).- Frø mellem 250.000 og 500.000 celler i en 6-brønds skål for at opnå 75% sammenløb den næste dag.
- Der fremstilles en bestand på 50 mM 13C 5-glutamin (se tabel 1).
- Der fremstilles et sporingsmedium indeholdende 2 mM 13C 5-glutamin (se tabel 1).
- Substratet i hvert hul ændres til medium, der indeholder 2 mM 13C 5-glutamin. Der inkuberes i et passende antal timer for at opnå en stabil tilstand af mærkning af de relevante celler (se bemærkningen i trin 2.1.3).
- Metabolitterne isoleres i henhold til protokollen i trin 2.2.
- Analysér prøverne på LC-MS ved at følge arbejdsgangen beskrevet i trin 2.3.
- Analyse af SDH-aktiviteten baseret på mærkningsmønstre
BEMÆRK: SDH-kompleksets succinatoxidationsaktivitet kan overvåges ved at vurdere forholdet mellem 13 C 4-fumarat og 13 C4-succinat ved 13C 5-glutaminsporing. SDH-kompleksets fumaratreduktionsaktivitet kan overvåges ved at vurdere forholdet mellem 13 C 3-succinat og 13 C3-fumarat ved 13C 5-glutaminsporing.- Beregn den procentvise mærkning af 13 C 3-fumarat, 13 C 4-fumarat, 13 C3-succinat og 13 C4-succinat. For eksempel, for at bestemme procentdelen af 13 C 3-fumarat, opsummere alle de integrerede topområder for fumaratisotopologerne (umærket fumarat, 13 C 1-fumarat, 13 C2-fumarat, 13 C 3-fumarat og 13 C4-fumarat) og divider toparealet for 13C 3-fumarat med det samlede isotopologareal. Multiplicer med 100.
- For at beregne succinatoxidationen divideres procentdelen 13 C 4-fumarat med procentdelen 13C4-succinat.
- For at beregne fumaratreduktionen divideres procentdelen 13 C 3-succinat med procentdelen 13C 3-fumarat.
4. Direkte kompleks I-aktivitetsanalyse
BEMÆRK: DCPIP er en kunstig elektronacceptor; Det ændrer sig til sin reducerede form, når man accepterer elektroner fra ubiquinol. I dette assay reduceres ubiquinon til ubiquinol via den komplekse I-medierede oxidation af NADH til NAD+. Således er måling af omsætningen af oxideret DCPIP i dette cellefrie assay en proxy for kompleks I-aktivitet 7,18.
- Oprensning og kvantificering af mitokondrier fra celler
BEMÆRK: Enhver mitokondriel rensningsprotokol kan bruges til dette assay19.- Udvid cellerne, indtil der opnås 25-100 millioner celler. Opsug mediet fra opvasken, vask med 1x PBS, aspirer PBS og tryspinize cellerne med 0,25% trypsin. Sluk trypsinet med dyrkningsmedium, og pellet cellerne ved 1.000 × g i 5 min.
- Cellepillerne vaskes 2x i 5 ml 1x PBS, og centrifugeringen gentages ved 1.000 × g i 5 minutter for at pelletere cellerne. Opbevar de vaskede pellets i en -20 °C fryser indtil mitokondrierensning.
BEMÆRK: Nedtø ikke cellepillerne mere end én gang. - Forbered mitokondrieisolationsbuffer (se tabel 1).
BEMÆRK: Natriumholdige reagenser såsom NaOH bør ikke anvendes til fremstilling af mitokondrieisolationsbuffere, da natrium pletter mitokondriemembranpotentialet20 og forstyrrer mitokondriel calciumhomeostase21. - Resuspender cellepillerne til 10 millioner celler pr. 1 ml mitokondrieisolationsbuffer. For eksempel resuspenderes 100 millioner pelleterede celler i 10 ml mitokondrieisolationsbuffer.
BEMÆRK: Sørg for at forstyrre celleklumperne uden at indføre bobler i bufferen. - Flyt 2 ml cellesuspension til en forkølet glashomogenisator med et arbejdsvolumen på 3-8 ml, der er kompatibelt med en Potter-Elvehjem PTFE-støder. Homogeniser cellerne med 10-20 slag, overvåg cellerne under et mikroskop for at bekræfte cellelyse gennem homogeniseringsprocessen. Forøg antallet af slag, hvis det er nødvendigt for at sikre effektiv cellelyse.
BEMÆRK: Hvis homogenisering af cellerne med ovenstående metode ikke er effektiv til lysering af cellerne, skal du skifte til en sprøjtelysemetode22. - 2 ml af cellelysatet overføres til et mikrocentrifugerør på is, og ovenstående trin gentages, indtil hele cellesuspensionen er homogeniseret.
- Pellet kernerne og celleresterne ved 650 × g i 10 minutter i en 4 °C centrifuge.
- Supernatanten flyttes til et nyt 2,0 ml glas, og ovennævnte centrifugering gentages ved 650 × g i 10 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten flyttes til et nyt 2,0 ml glas, og de rå mitokondrier pelleteres ved 7.000 × g i 10 minutter i en 4 °C centrifuge.
- Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 1 ml mitokondrieisolationsbuffer. Flyt 50 μL ind i et nyt rør til proteinkvantificering. Ovenstående centrifugeringstrin gentages på prøvens to delprøver (50 μL-prøven og den resterende ~950 μL).
- Supernatanten kasseres, og pellets opbevares i en -80 °C fryser, indtil de er klar til brug.
- Tilsæt 200 μL RIPA buffer til pellets fra 50 μL alikvoten for at ekstrahere proteinet, hvirvlen i 10 minutter og centrifuger ved 21.000 × g for at isolere proteinet. Kvantificer mængden af protein i 50 μL alikvoten, og brug dette tal til at kvantificere det resterende protein i 950 μL prøven. For eksempel, hvis proteinkvantificeringen for 50 μL alikvoten er 1 μg / μL, er det samlede protein i den resterende mitokondriepellet 950 μg (1 μg / μL × 950 μL).
- Udførelse af den komplekse I-aktivitetsanalyse
BEMÆRK: 143B osteosarkomcellelinjen blev brugt til dette assay, men protokollen kan tilpasses til alle dyrkede celler.- Opslæmmede oprensede mitokondrier i mitokondriernes resuspensionsbuffer (se tabel 1) til en slutkoncentration på 5 mg protein/ml.
- Udfør fem fryse-/optøningscyklusser i en -20 °C fryser for at permeabilisere mitokondrierne.
- Lav den komplekse I-aktivitetsassaybuffer (se tabel 1).
- 50 mg af 5 mg/ml mitokondriestammen blandes med 90 μL kompleks I-aktivitetsbuffer. Forbered fem ubehandlede replikater og fem rotenonbehandlede (5 μM) replikater til kontrol for kompleks I-aktivitet.
- Baselineabsorbansen ved 600 nm aflæses i en pladelæser indstillet til 37 °C.
- Start reaktionen ved at tilsætte NADH til en slutkoncentration på 2 mM, og spor absorbansen (600 nm) over et tidsrum på 1 time, mål mindst hvert 2. minut hele vejen igennem. Faldet i absorbans er tegn på en reduktion af DCPIP via kompleks I-aktivitet.
BEMÆRK: NADH skal tilsættes ved hjælp af en multikanalpipette for at sikre, at alle prøverne startes på samme tid.
5. LC-MS-baseret assay til måling af superoxidniveauerne
BEMÆRK: MitoSox Reds fluorescensegenskaber kan ændre sig uafhængigt af dets reaktion med superoxid23. Denne LC-MS-baserede analyse måler direkte produktet fra superoxid, der reagerer med MitoSox Red. Følgende analyse er let modificeret fra Xiao et al.24. 2-hydroxy-mitoethidium (2-OH MitoE2+) er produktet af superoxidreaktionen (figur 5). Caki1-cellelinjen blev brugt til dette assay, men protokollen kan tilpasses til alle dyrkede celler.
- Behandling af klæbende celler med MitoSox Red
- Frø mellem 250.000 og 500.000 celler i en 6-brønds skål for at opnå 75% sammenløb den næste dag. Sørg for at frø et sæt plader til LC-MS-analysen og et duplikatsæt plader til normalisering af celletælling.
- Forbered komplet DMEM indeholdende 10% varmeinaktiveret FBS og 1% penicillin-streptomycin i Dulbeccos modificerede Eagle-medium.
- Opdater mediet i alle hullerne til alle forhold med 2 ml komplet DMEM. Sørg for at tilføje medicin eller behandlinger af interesse på dette tidspunkt.
- Inkuber cellerne i en vævskulturinkubator i 1 time.
- Forbered positive og negative kontroller. Der fremstilles en 50 mM bestand tert-butylhydroperoxid fortyndet i PBS og en 250 mM bestand N-acetylcystein (NAC) fortyndet i DMSO (se tabel 1).
BEMÆRK: Tertbutylhydroperoxid (tBuOOH) er en potent reaktiv iltart, der vil fungere som en positiv kontrol og øger mængden af 2-OH MitoE2+. NAC er en potent antioxidant, der vil fungere som en negativ kontrol og neutralisere superoxidproduktionen forårsaget af tBuOOH. - Der tilsættes 1 μL tBuOOH til de positive kontrolhuller og 1 μL tBuOOH + 100 μL NAC til de negative kontrolhuller.
BEMÆRK: Brug af en P2-pipette (0,1-2 μL-område) er den optimale måde at overføre 1 μL på. - Inkuber i 1 time i en vævskultur inkubator.
- Forbered 1 mM MitoSox Red stock (se tabel 1), og tilsæt 2 μL 1 mM MitoSox Red til hvert hul for at opnå en slutkoncentration på 1 μM. Inkuber i 30 minutter i en vævskulturinkubator.
- Under denne endelige inkubation tælles en af duplikatpladerne for at erhverve celletællingerne for at normalisere de endelige LC-MS-data.
- Isolering af det oxiderede Mitosox Red-produkt fra de klæbende celler
- Få en spand tøris, og læg kølig HPLC-grade isopropanol på tørisen, inden du begynder isoleringen.
- Tag en plade ud ad gangen, aspirer mediet fra brøndene, og vask 2x med 1 ml 1x PBS. Opsug al den resterende PBS fra brøndene, inden du går videre til næste trin.
BEMÆRK: Sørg for at vippe pladen under aspirationen og pipette mod skålens væg for at forhindre forstyrrelse af de klæbende celler. - Pladen anbringes på tøris, og der tilsættes 800 μL HPLC-isopropanol til hvert hul.
- Inkuber pladen i mindst 15 minutter i en -80 °C fryser for at lette cellelyse.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan den næste plade tages ud af inkubatoren, og trin 5.2.1-5.2.4 gentages. Fortsæt dette, indtil alle pladerne inkuberes i -80 °C fryseren. - Tag en plade ud ad gangen fra fryseren, skrab hver brønd på tøris ved hjælp af en celleløfter, og overfør lysatet til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Hold røret på tøris indtil næste trin.
- Vortex alle rørene i 10 minutter ved 4 °C og centrifugeres derefter ved 4 °C i 10 minutter ved maksimal hastighed (mindst 17.000 × g).
- Supernatanten overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugeglas, og det tørres ud i en vakuumkoncentrator. Når lysatet er tørret ned, opbevares metabolitpellets ved -80 °C, indtil de er klar til LC-MS.
- LC-MS-måling af MitoSox Red og 2-hydroxy-mitoethidium (2-OH MitoE2+)
- Prøverne fremstilles til LCMS på is ved at tilsætte 100 μL af en 3:3:1-blanding af MeOH:chloroform:water af HPLC-kvalitet. Vortex i 10 minutter ved 4 °C.
- Flyt 25 μL ind i hvert LC-MS hætteglas. Opbevar den resterende prøve i fryseren til -80 °C.
- Følgende væskekromatografibuffere fremstilles: i) buffer A: vand af HPLC-kvalitet med 0,1% myresyre; ii) buffer B: HPLC-acetonitril med 0,1% myresyre.
- Åbn appen Thermo XCalibur Instrument Setup for at begynde at udvikle metoden.
- Se efter to kasser i venstre sidebjælke i dette vindue - den første boks tillader udvikling af kromatografimetode, og den anden boks tillader udvikling af massespektrometrimetode.
- Udvikling af væskekromatografimetode:
- Indstil en strømningshastighed på 0,25 ml / min, og start metoden ved 20% B, stigende til 95% B i løbet af 12 min. I løbet af det næste minut skal du sænke buffer B tilbage til 20% B og opretholde dette niveau i de næste 2 minutter.
BEMÆRK: De sidste 2 minutters flow ved 20% B er afgørende for, at søjletrykket falder tilbage til starttrykket og for at afbalancere søjlen med de passende bufferforhold. Hvis dette ligevægtstrin ikke medtages, forskydes retentionstiderne for alle de efterfølgende kørselsprøver.
- Indstil en strømningshastighed på 0,25 ml / min, og start metoden ved 20% B, stigende til 95% B i løbet af 12 min. I løbet af det næste minut skal du sænke buffer B tilbage til 20% B og opretholde dette niveau i de næste 2 minutter.
- Opret en Tune-fil med følgende parametre:
- Åbn Tune-appen, og opret en ny melodifil.
- Anvend også overlappende indstillinger fra modulet Metodeopsætning (se trin 5.3.9.3) på denne indstillingsfil, herunder scanningsområde, opløsning, polaritet, AGC-mål og maksimal IT.
- Indstil kappegassen til 30, aux-gassen til 3 og fejegassen til 3 også. Indstil sprøjtespændingen til 3 kV, kapillærtemperaturen til 300 og S-objektivets RF-niveau til 60.
- Udvikling af massespektrometrimetode:
- Fra listen nederst til venstre over potentielle scanninger skal du trække og slippe Full MS til midten af vinduet. Sørg for at klikke på den fulde MS-firkant efter faldet for at justere indstillingerne. Den samlede MS-metodevarighed er 13 min.
BEMÆRK: LC-metoden er længere end MS-metoden, fordi de sidste 2 minutter er til kolonnerekonditionering og ikke metabolitkvantificering. - I højre side af modulet under Egenskaber for metoden skal du sørge for, at Metodens varighed og Kørselstid er indstillet til 13,00 min.
- Kør denne fulde scanning i positiv tilstand med en opløsning på 70.000 og et AGC-mål på 1 × 106. Indstil Maksimal IT til 100 ms, og scanningsområdet fra 300 m/z til 700 m/z.
- Under Tune Files øverst i modulet skal du bemærke, at den melodifil, der lige er oprettet, er knyttet til denne metode.
- Fra listen nederst til venstre over potentielle scanninger skal du trække og slippe Full MS til midten af vinduet. Sørg for at klikke på den fulde MS-firkant efter faldet for at justere indstillingerne. Den samlede MS-metodevarighed er 13 min.
- Kør metoden til MitoSox Red-detektion med 2 μL prøveinjektioner.
Representative Results
Aktiviteterne i DHODH, kompleks I og kompleks V kan alle vurderes ved hjælp af proliferationsassays. Ved berøvelse af uridin fra dyrkningsmediet bliver cellerne mere afhængige af de novo-vejen for pyrimidinbiosyntese. Når celler blev udfordret til at proliferere i et uridinfrit medium, var de således mere følsomme over for brequinars hæmning af DHODH-aktivitet end celler dyrket i et medium indeholdende uridin (figur 6A). På samme måde gør berøvelsen af pyruvat fra dyrkningsmediet cellerne mere afhængige af kompleks I-aktivitet for spredning. Når celler blev udfordret til at proliferere i et pyruvatfrit medium, var de således mere følsomme over for rotenons hæmning af kompleks I-aktivitet end celler dyrket i et pyruvatholdigt medium (figur 6B). Kompleks V-aktivitet kan vurderes ved at udfordre celler til at formere sig i et medium indeholdende galactose i stedet for glucose. Da galactose giver netto nul ATP i glykolyse, er celler, der vokser i dette brændstof, mere afhængige af mitokondriel ATP-syntese via kompleks V-aktivitet. Således var celler, der prolifererede i et galactoseholdigt medium, mere følsomme over for kompleks V-hæmning af oligomycin end celler, der prolifererede i et glucoseholdigt medium (figur 6C).
SDH-aktivitet kan måles ved hjælp af 13C 5-glutaminsporing og ved at overvåge dets inkorporering i fumarat og succinatisotopologer. Under køretøjsbehandlede forhold favoriserede SDH-komplekset den fremadrettede aktivitet, og inkorporeringen af 13 C 4-succinat i 13 C 4-fumarat var højere end inkorporeringen af 13 C 3-fumarat i 13C 3-succinat (figur 7). Under antimycinbehandlede tilstande favoriserede SDH-komplekset den omvendte aktivitet, og inkorporeringen af 13 C 3-fumarat i 13 C3-succinat var større end inkorporeringen af 13 C 4-succinat i 13C4-fumarat (figur 7).
Superoxidproduktion inde i mitokondrierne kan måles ved hjælp af fluorescerende reporter MitoSox, som genererer 2-hydroxy-mitoethidium ved reaktion med superoxid. I denne undersøgelse havde celler behandlet med MitoSox i nærvær af tertbutylhydrogenperoxid højere niveauer af 2-hydroxy-mitoethidium på en måde, der blev undertrykt ved tilsætning af NAC, en antioxidant, der slukker cellulær ROS (figur 8).
Figur 1: Mekanistisk grundlag for det komplekse V-spredningsassay. Oxidation af glucose og galactose via glykolyse. Glukose giver netto to ATP fra glykolyse, mens galactose giver netto nul ATP, fordi UTP-syntese er nødvendig for UDP-galactose. Således er celler dyrket i galactose mere afhængige af mitokondriel ATP-syntese på grund af mangel på ATP produceret ved glykolyse. Forkortelser: GALK = galactokinase; GALT = galactose-1-phosphat uridylyltransferase; PGM1 = phosphoglucomutase 1; GPI = glucose-6-phosphatisomerase, UGP = UDP-glucosepyrophosphorylase; GALE = UDP-galactose-4-epimerase; NDK = nukleotiddiphosphatkinase; UMPK = uridinmonophosphatkinase; HK = hexokinase; PFK = phosphofructokinase; ALDO = aldolase; TPI = triosephosphatisomerase; GAPDH = glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase; PGK = phosphoglyceratkinase; PGM = phosphoglucomutase; ENO = enolase; PK = pyruvatkinase. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mekanistisk grundlag for det komplekse I-spredningsassay. Skematisk over de metaboliske veje, der ændres ved hæmning af kompleks I-aktivitet. I medier med høj pyruvat omgås kompleks I-hæmning via LDH-medieret NADH-oxidation. I medier med lavt pyruvat er denne tilpasning mindre gennemførlig, hvilket gør celler mere afhængige af kompleks I-aktivitet for at reoxidere NADH. Forkortelser: LDH = lactat dehydrogenase; TCA-cyklus = tricarboxylsyrecyklus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skematisk oversigt over DHODH-reaktionen ved 13C 4-aspartatsporing. Brequinar hæmmer dihydroorotat oxidation til orotat og forhindrer således nedstrøms syntese af UMP. 13C 4-aspartat inkorporeres i 13C3-UMP via DHODH-aktivitet. Forkortelser: OMM = ydre mitokondriemembran; IMM = indre mitokondriemembran; DHODH = dihydroorotat dehydrogenase. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Måling af fremadrettet og omvendt kompleks II-aktivitet via 13C 5-glutaminsporing. For at måle fremadrettet kompleks II-aktivitet (venstre) overvåges inkorporeringen af 13 C 5-glutamin i 13 C 4-succinat og 13C 4-fumarat. For at måle omvendt kompleks II-aktivitet (højre) overvåges inkorporeringen af 13 C 5-glutamin i 13 C 3-succinat og 13C 3-fumarat. Forkortelser: SDH = succinat dehydrogenase; CytC = cytokrom C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: MitoSox rød reaktion med superoxid. MitoSox reagerer med mitokondrie superoxider til dannelse af 2-OH-MitoE2+. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Proliferationsbaserede assays til måling af mitokondriefunktion (A) Proliferation af 143B osteosarkomceller behandlet med 5 uM brequinar, en DHODH-hæmmer, i medium med ±100 ug / ml uridin. Data er gennemsnitlige ± SEM; N = 3 pr. betingelse. (B) Proliferation af 143B osteosarkomceller behandlet med 2 uM rotenon, en kompleks I-hæmmer, i medium med ±5 mM pyruvat. Data er gennemsnitlige ± SEM; N = 3 pr. betingelse. (C) Proliferation af 143B osteosarkomceller behandlet med 5 uM oligomycin, en kompleks V-hæmmer, i medium med enten 10 mM glucose eller 10 mM galactose som den eneste centrale kulstofkilde. Data er gennemsnitlige ± SEM; N = 3 pr. betingelse. * angiver p < 0,05 ved hjælp af en envejs ANOVA test i Graphpad Prisme. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: 13C 5-glutaminsporing til måling af kompleks II-aktivitet. Succinatoxidation og fumaratreduktion (SDH omvendt) i DMSO og 500 nM antimycin A-behandlede Caki1- og DLD1-celler. Data repræsenterer gennemsnitlig ± SEM; N = 3 pr. betingelse. angiver p < 0,05 ved hjælp af en uparret t-test i GraphPad Prisme. Forkortelser: SDH = succinatoxidation; SDH omvendt = fumaratreduktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: LCMS-baseret MitoSox-assay til påvisning af superoxid. Ekstraheret ionkromatogram af 2-OH-Mito E2+ isoleret fra Caki1-celler behandlet med MitoSox i 30 minutter under tilstedeværelse af tBuOOH ± NAC. Forkortelser: LCMS = væskekromatografi-massespektrometri; NAC = N-acetylcystein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Sammensætning af reagenser, buffere og medier, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Da ny forskning viser, at pattedyrs mitokondrier kan fungere uden at indtage molekylær ilt, er det yderst vigtigt for forskere at anvende ortogonale assays ud over OCR-målinger for nøjagtigt at kvantificere mitokondriefunktionen. Her udarbejdede vi en række assays, der kan bruges til direkte at vurdere aktiviteterne i kompleks I, kompleks II, kompleks V og DHODH ved at måle mitokondrie-NAD+/NADH-balancen, brugen af adaptive terminalelektronacceptorer, produktionen af ATP, de novo pyrimidinbiosyntese og mitokondrieafledt ROS. Især måler disse analyser mere direkte mitokondriefunktion end OCR-målinger. Desuden giver disse analyser forskere brugbare måder at kvantificere mitokondriefunktion under hypoxi, for hvilke OCR-målinger stort set er irrelevante på grund af fumarat, der anvendes som den foretrukne terminale elektronacceptor. Endelig er de spredningsbaserede metoder, der er beskrevet her, mere omkostningseffektive end klassiske respirometrieksperimenter, hvilket giver en bredt tilgængelig måde at studere mitokondriefunktion i pattedyrsystemer.
Der er vigtige overvejelser, når man bruger disse assays til at måle mitokondriefunktion i dyrkede celler. Med hensyn til proliferationsanalyserne er det vigtigt at justere antallet af celler, der er podet til fordoblingshastigheden for hver cellelinje. Cellerne skal podes til mindst 10% sammenløb og med tilstrækkelig plads til at tillade tre til fire fordoblinger, så forskelle i spredning kan kvantificeres. En anden overvejelse for hvert assay er koncentrationen af de små molekyler, der anvendes som kontroller for aktiviteterne i hvert ETC-kompleks. Da forskellige cellelinjer kan udvise forskellig følsomhed over for disse hæmmere, er det afgørende at teste dosis af disse små molekyler for at identificere den optimale koncentration.
En universel begrænsning af assays, der studerer mitokondriefunktion in vitro, herunder OCR-målinger og alle de analyser, der er beskrevet her, er dyrkningsmediets metaboliske sammensætning. Standard cellekulturmedium har tendens til at bias systemer til overfladisk høje niveauer af mitokondriefunktion. For eksempel øger suprafysiologiske glutaminniveauer dets anaplerose af TCA-cyklussen25, hvilket brænder mitokondriel NADH-syntese og følgelig øger oxidativ phosphorylering. Tilsvarende varierer partialtrykket af ilt mellem 3 mmHg og 100 mmHg (ca. 0,1% -13%O2) i pattedyrvæv, men er atmosfærisk (140 mmHg, ca. 21%) in vitro26,27. Dette overskudO2 maksimerer mitokondriel åndedrætskapacitet og superoxidproduktion28. For nylig er der gjort en indsats for at designe kulturmedier til at være mere fysiologiske29,30. Især reducerer dyrkning af celler i humane plasmalignende medier mitokondriel respiration i nogle kræftcellelinjer30, mitokondriel ROS i T-celler 31 og mitokondrietilpasninger til kræftterapi32. Det er derfor afgørende at være opmærksom på sammensætningen af de kulturmedier, der bruges, og forstå, hvordan det kan påvirke mitokondriefunktionen.
En anden vigtig og universel begrænsning i fortolkningen af mitokondriefunktionen er potentialet for forskelle i antallet af mitokondrier. Det er derfor afgørende at måle mitokondrieindholdet gennem enten kvantificering af mtDNA33, måling af mitokondriemasse med membranpotentiale-ufølsomme farvestoffer34 eller western blotting af mitokondriemarkører. Dette er en kritisk kontrol, så et fald i antallet af mitokondrier ikke forveksles med et fald i mitokondriefunktionen.
Der er også specifikke begrænsninger og fejlfinding, der gælder for de analyser, der er beskrevet her. For det første, da differentierede celler ikke formerer sig, vil de proliferationsbaserede assays ikke være nyttige til vurdering af mitokondriefunktion i denne sammenhæng. En vigtig begrænsning af 13C 4-aspartatsporingsprotokollen til måling af DHODH-aktivitet er, at aspartatoptagelse i celler kan være ekstremt ineffektiv35. For at overvinde denne potentielle begrænsning kan forskere overudtrykke aspartattransportøren, SLC1A3, for at lette 13C 4-aspartatoptagelse35.
En begrænsning af protokollen, der bruger 13C 5-glutaminsporing til måling af SDH-aktivitet, er, at dette assay kræver, at celler bruger den reduktive carboxyleringsvej til at berige M + 3-isotopologerne for at måle den omvendte aktivitet. Nogle cellelinjer er ude af stand til reduktiv carboxyleringsflux på grund af lav ATP-citratlyaseekspression36, utilstrækkelig HIF-stabilisering 37 eller et α-KG: citratforhold, der er for lavt38. For at overvinde denne begrænsning kunne man bruge 13C 4-aspartat sporing til at måle SDH fremad og tilbageaktiviteter 7. I dette assay kan SDH-fremadgående aktivitet måles ved forholdet mellem fumarat M+2:succinat M+2 og den omvendte reaktion ved succinat M+4:fumarat M+4. Især omgår denne sporing de fleste enzymer i den reduktive carboxyleringsvej.
En begrænsning af det komplekse I-aktivitetsassay ved hjælp af DCPIP-reduktion som aflæsning er, at mitokondrierne ikke er strukturelt intakte. Processen med at fryse-optø mitokondrierne for at muliggøre deres NADH-optagelse til analysen kan helt sikkert plette mitokondriemembranens strukturelle integritet39. Dette assay bør udføres parallelt med assays såsom det komplekse I-proliferationsassay for at sikre, at de observerede ændringer i kompleks I-aktivitet også gælder for intakte celler.
I fremtidige undersøgelser kan nogle af disse teknikker tilpasses til måling af mitokondriefunktioner in vivo ved hjælp af modelorganismer som mus og Caenorhabditis elegans. De nuværende metoder, der anvendes til at måle mitokondriefunktionen in vivo, er centreret om OCR på organismeniveau, specifikt respirationsudvekslingshastigheden ved brug af musemodeller. En klar begrænsning af denne metode er, at ilt tjener mange biokemiske og signalfunktioner ud over sin rolle som en allestedsnærværende terminal elektronacceptor i mitokondriet ETC. For eksempel "forbruges" ilt af den katalytiske aktivitet af enzymer i dioxygenasefamilien. Selvom disse enzymer bidrager til den cellulære iltforbrugshastighed, deltager de ikke i, regulerer eller afspejler mitokondriefunktionen. Klassiske respirometriforsøg in vitro kontrollerer typisk for "ikke-mitokondriel OCR", mens organismal respiratory exchange ratio (RER) eksperimenter ikke kan kontrollere for dette, hvilket begrænser fortolkningen af RER som en metrisk for mitokondriefunktion in vivo. Det er dog muligt at tilpasse protokollerne til at måle DHODH-aktivitet via 13 C 4-aspartatsporing, kompleks II-aktivitet via 13C5-glutaminsporing, kompleks I-aktivitet på mitokondrier renset fra væv og mitokondriel ROS ved hjælp af LC-MS-venlige forbindelser såsom MitoB for at måle mitokondriefunktion in vivo . Disse direkte analyser til at forhøre mitokondriefunktioner i kombination med klassiske respirometrieksperimenter giver forskere en mere omfattende og nøjagtig vurdering af mitokondriefunktionen i pattedyrceller og væv.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at rapportere.
Acknowledgments
Figurerne produceret i dette manuskript blev skabt med BioRender.com. Vi er taknemmelige for, at Amy Walker giver feedback på denne artikel. J.B.S. blev støttet af Worcester Foundation for Biomedical Research Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | Cell Treat | 667443 | |
| 2.0 mL tube | Cell Treat | 229446 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229106 | |
| 12-well plate | Cell Treat | 229112 | |
| 13C4-aspartate | Sigma-Aldrich | 604852 | |
| 13C5-Glutamine | Cambridge Isotope Laboratories | 285978-14-5 | |
| 15 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667411 | |
| 50 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667421 | |
| 150 mm tissue culture dish | Cell Treat | 229651 | |
| 1x Phosphate-buffered saline | Gibco | 10010049 | |
| 2,6-dichlorophenolindophenol | Honeywell | 33125 | |
| Ammonium Carbonate | Sigma-Aldrich | 37999 | |
| Antimycin | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascentis Express C18 | Sigma-Aldrich | 53825-U | |
| Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter | Cell Treat | 229717 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Brequinar | Sigma-Aldrich | SML0113 | |
| Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade | Cell Treat | 229305 | |
| CentriVap -105 Cold Trap | Labconco | 7385020 | |
| Complete Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Coulter Counter Cups | Fisher Scientific | 07-000-694 | |
| Decylubiquinone | Sigma-Aldrich | D7911 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Eppendorf Centrifuge 5425R | Eppendorf | 2231000908 | |
| Eppendorf Centrifuge 5910 Ri | Eppendorf | 5943000343 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Glucose-free DMEM | Gibco | 11966025 | |
| Glutamine-free DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide | Thermo Scientific | 460801000 | |
| HPLC-grade Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 900667 | |
| HPLC-grade Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | |
| HPLC-grade formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| HPLC-grade Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | |
| HPLC-grade MeOH | Sigma-Aldrich | 900688 | |
| HPLC-grade Water | Sigma-Aldrich | 270733 | |
| Human Osteosarcome Cell Line 143B | ATCC | CRL-8303 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | |
| Isotone buffer | Beckman Coulter | 8546719 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| MitoSox Red | Invitrogen | M36008 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| Pencillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 | Kimble | 885502-0021 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Pyruvate-free DMEM media | Gibco | 11965175 | |
| Q Exactive Plus Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 726030 | |
| ReCO2ver Incubator | Baker | ||
| Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7310020 | |
| RIPA Buffer | Millipore Sigma | 20188 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column | Sigma-Aldrich | 1.50460.0001 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC guard kit | Millipore Sigma | 1.50438.0001 | |
| Sodium Hydroxide, Pellets | Millipore Sigma | 567530-250GM | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 | Thermo Scientific | OPTON-31001 | |
| Tert-butyl hydroperoxide solution | Sigma-Aldrich | 458139 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25-200-114 | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC | Thermo Scientific | VF-S01-A-02 | |
| Z2 Coulter Particle count and size analyzer | Beckman Coulter | BZ10131270 |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Gorman, G. S., et al.
- Chandel, N. S., et al. Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing. Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).
- Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria. Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
- Kumar, R., et al. A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation. Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435 (2022).
- Warburg, O., Geissler, A. W., Lorenz, S. On growth of cancer cells in media in which glucose is replaced by galactose. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 348 (12), 1686-1687 (1967).
- Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).
- Attardi, G., King, M. P. Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bodnar, A. G., Cooper, M., Leonard, J. V., Schapira, A. H. Respiratory-deficient human fibroblasts exhibiting defective mitochondrial DNA replication. Biochemical Journal. 305, 817-822 (1995).
- Gregoire, M., Morais, R., Quilliam, M. A., Gravel, D. On auxotrophy for pyrimidines of respiration-deficient chick embryo cells. European Journal of Biochemistry. 142 (1), 49-55 (1984).
- Mackay, G. M., Zheng, L., vanden Broek, N. J., Gottlieb, E. Analysis of cell metabolism using LC-MS and isotope tracers. Methods in Enzymology. 561, 171-196 (2015).
- Heinrich, P., et al. Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR. Scientific Reports. 8 (1), 17910 (2018).
- Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).
- Bisbach, C. M., et al. Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium. Cell Reports. 31 (2), 107606 (2020).
- Angebault, C., et al. Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration. BMC Research Notes. 4, 557 (2011).
- Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).
- Iwai, T., et al. Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts. Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).
- Murphy, E., Eisner, D. A. Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease. Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).
- Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. Journal of Visualized Experiments. (97), e52076 (2015).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
- Xiao, Y., Meierhofer, D. Are hydroethidine-based probes reliable for reactive oxygen species detection. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (4), 359-367 (2019).
- DeBerardinis, R. J., et al. Beyond aerobic glycolysis: Transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19345-19350 (2007).
- Keeley, T. P., Mann, G. E. Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans. Physiological Reviews. 99 (1), 161-234 (2019).
- Ast, T., Mootha, V. K. Oxygen and mammalian cell culture: Are we repeating the experiment of Dr. Ox. Nature Metabolism. 1 (9), 858-860 (2019).
- Gu, C., Jun, J. C. Does hypoxia decrease the metabolic rate. Frontiers in Endocrinology. 9, 668 (2018).
- Voorde, J., et al. Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium. Scientific Advances. 5 (1), 7314 (2019).
- Cantor, J. R., et al. Physiologic medium rewires cellular metabolism and reveals uric acid as an endogenous inhibitor of UMP synthase. Cell. 169 (2), 258-272 (2017).
- MacPherson, S., et al. Clinically relevant T cell expansion media activate distinct metabolic programs uncoupled from cellular function. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 24, 380-393 (2022).
- Torres-Quesada, O., Doerrier, C., Strich, S., Gnaiger, E., Stefan, E. Physiological cell culture media tune mitochondrial bioenergetics and drug sensitivity in cancer cell models. Cancers. 14 (16), 3917 (2022).
- Chan, S. W., Chen, J. Z. Measuring mtDNA damage using a supercoiling-sensitive qPCR approach. Methods in Molecular Biology. 554, 183-197 (2009).
- Doherty, E., Perl, A. Measurement of mitochondrial mass by flow cytometry during oxidative stress. Reactive Oxygen Species. 4 (10), 275-283 (2017).
- Birsoy, K., et al. An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis. Cell. 162 (3), 540-551 (2015).
- Beigneux, A. P., et al.
- Gameiro, P. A., et al. In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation. Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).
- Fendt, S. M., et al. Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells. Nature Communications. 4, 2236 (2013).
- Lee, C. P. Biochemical studies of isolated mitochondria from normal and diseased tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1271 (1), 21-28 (1995).
