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Biochemistry

स्तनधारियों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने के लिए ऑक्सीजन-स्वतंत्र परख

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65184
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Program in Molecular Medicine, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Cancer Center, University of Massachusetts Chan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम आणविक ऑक्सीजन का उपभोग करने की उनकी क्षमता से स्वतंत्र रूप से स्तनधारी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को सीधे मापने के लिए परख का एक संकलन प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) में इलेक्ट्रॉनों का प्रवाह स्तनधारी कोशिकाओं में बहुमुखी बायोसिंथेटिक, बायोएनर्जेटिक और सिग्नलिंग कार्यों का समर्थन करता है। चूंकि ऑक्सीजन (ओ 2) स्तनधारी ईटीसी के लिए सबसे सर्वव्यापी टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता है, इसलिए ओ2 खपत दर अक्सर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए प्रॉक्सी के रूप में उपयोग की जाती है। हालांकि, उभरते शोध से पता चलता है कि यह पैरामीटर हमेशा माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का संकेत नहीं है, क्योंकि फ्यूमरेट को हाइपोक्सिया में माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों को बनाए रखने के लिए वैकल्पिक इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में नियोजित किया जा सकता है। यह लेख प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला संकलित करता है जो शोधकर्ताओं को ओ2 खपत दर से स्वतंत्र रूप से माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने की अनुमति देता है। हाइपोक्सिक वातावरण में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अध्ययन करते समय ये परख विशेष रूप से उपयोगी होते हैं। विशेष रूप से, हम माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन, डी नोवो पाइरिमिडीन बायोसिंथेसिस, कॉम्प्लेक्स आई द्वारा एनएडीएच ऑक्सीकरण और सुपरऑक्साइड उत्पादन को मापने के तरीकों का वर्णन करते हैं। शास्त्रीय श्वास-मिथुमिति प्रयोगों के संयोजन में, ये ऑर्थोगोनल और किफायती परख शोधकर्ताओं को उनकी रुचि की प्रणाली में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अधिक व्यापक मूल्यांकन प्रदान करेंगे।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन सेलुलर स्वास्थ्य का एक महत्वपूर्ण मीट्रिक है, क्योंकि यहस्तनधारी कोशिकाओं में प्रमुख बायोसिंथेटिक, बायोएनर्जेटिक और सिग्नलिंग कार्यों को बनाए रखता है। माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों के विशाल बहुमत को इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह की आवश्यकता होती है, और ईटीसी में इलेक्ट्रॉन प्रवाह में व्यवधान गंभीर माइटोकॉन्ड्रियल रोग2 का कारण बनता है। ईटीसी में कमी और ऑक्सीकरण (रेडॉक्स) प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला शामिल है जो आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में एम्बेडेड हैं, और ये इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण प्रतिक्रियाएं मुक्त ऊर्जा जारी करती हैं जिन्हें एटीपी संश्लेषण, थर्मोजेनेसिस जैसी शारीरिक प्रक्रियाओं, बायोसिंथेटिक मार्गों जैसे डे नोवो पाइरीमिडीन बायोसिंथेसिस और एनएडीएच जैसे सह-कारकों की रेडॉक्स स्थिति के संतुलन का समर्थन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। ईटीसी कॉम्प्लेक्स I और III प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) 3,4,5 का उत्पादन करते हैं, जो बदले में, HIF, PI3K, NRF2, NF3B, और MAP6 जैसे सिग्नलिंग प्रमुख मार्गों को नियंत्रित करते हैं। नतीजतन, ईटीसी में इलेक्ट्रॉन प्रवाह के मैट्रिक्स को स्तनधारी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए प्रॉक्सी के रूप में शास्त्रीय रूप से उपयोग किया जाता है।

स्तनधारी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने के लिए श्वसनमिति प्रयोगों को अक्सर नियोजित किया जाता है। चूंकि ओ2 स्तनधारी ईटीसी के लिए सबसे सर्वव्यापी टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता है, इसलिए इसकी कमी का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जाता है। हालांकि, उभरते सबूत दर्शाते हैं कि स्तनधारी माइटोकॉन्ड्रिया माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों को बनाए रखने के लिए इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में फ्यूमरेट को नियोजित कर सकते हैं जो ईटीसी पर निर्भर करते हैं, जिसमें डे नोवो पाइरीमिडीन बायोसिंथेसिस 7, एनएडीएच ऑक्सीकरण7, और हाइड्रोजन सल्फाइड8 का विषहरण शामिल है। इस प्रकार, कुछ संदर्भों में, विशेष रूप से हाइपोक्सिक वातावरण में, ओ2 खपत दर (ओसीआर) के माप माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का सटीक या सटीक संकेत प्रदान नहीं करते हैं।

यहां, हम परख की एक श्रृंखला को रेखांकित करते हैं जिसे ओसीआर से स्वतंत्र रूप से माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने के लिए नियोजित किया जा सकता है। हम सीधे जटिल आई-मध्यस्थता एनएडीएच ऑक्सीकरण, डाइहाइड्रोरोटेट डिहाइड्रोजनेज-मध्यस्थता डे नोवो पाइरिमिडीन बायोसिंथेसिस, जटिल वी-निर्भर एटीपी संश्लेषण, सक्सिनेट डिहाइड्रोजनेज (एसडीएच) कॉम्प्लेक्स की शुद्ध दिशात्मकता और माइटोकॉन्ड्रियल-व्युत्पन्न आरओएस को मापने के लिए परख प्रदान करते हैं। ये परख सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं पर किए जाने के लिए हैं, हालांकि कई को विवो में माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख ओसीआर की तुलना में माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों के अधिक प्रत्यक्ष माप हैं। इसके अलावा, वे हाइपोक्सिया में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के माप को सक्षम करते हैं, एक संदर्भ जिसमें ओसीआर एक संकेतक माप नहीं है। एक साथ लिया गया, शास्त्रीय श्वास-मिथुमिति प्रयोगों के संयोजन में ये परख, शोधकर्ताओं को स्तनधारी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अधिक व्यापक मूल्यांकन प्रदान करेंगे।

Protocol

1. कॉम्प्लेक्स आई, डाइहाइड्रोरोटेट डिहाइड्रोजनेज (डीएचओडीएच), और जटिल वी गतिविधियों की गतिविधि को मापने के लिए प्रसार परख।

  1. प्रसार परख के लिए सीडिंग कोशिकाएं।
    नोट: यह प्रोटोकॉल एटीसीसी से व्यावसायिक रूप से खरीदे गए मानव ओस्टियोसारकोमा सेल लाइन 143 बी का उपयोग करता है। इस सेल लाइन का उपयोग हमारे अनुमोदित संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) प्रोटोकॉल के दिशानिर्देशों के तहत किया गया था।
    1. ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर से प्लेटों को हटा दें। प्लेटों से माध्यम को एस्पिरेट करें, और किसी भी बचे हुए माध्यम को हटाने के लिए 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) से धो लें। पीबीएस को एस्पिरेट करें, और प्लेट के नीचे से कोशिकाओं को उठाने के लिए 0.05% -0.25% ट्रिप्सिन के साथ डिश को कवर करें।
    2. प्लेट से कोशिकाओं को छोड़ने के लिए ट्रिप्सिन के लिए 3-5 मिनट प्रतीक्षा करें, और फिर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) युक्त वांछित विकास माध्यम के 10 एमएल के साथ ट्रिप्सिन को बुझाएं।
    3. एक शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. गोली को परेशान किए बिना ट्यूब से माध्यम को एस्पिरेट करें। गोली को पूर्ण माध्यम से पुन: निलंबित करें।
    5. कोशिकाओं की गणना करें, और 6-वेल प्लेट में 10,000 और 25,000 कोशिकाओं के बीच बीज करने के लिए आवश्यक मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: प्रत्येक सेल लाइन को बीज ति की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। प्राप्त आदर्श संगम प्रयोग की शुरुआत में ~ 10% और प्रयोग के अंत में ~ 80% है।
    6. कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट में पिपेट करें, और कुओं में 2 मिलीलीटर पूर्ण माध्यम जोड़ें। प्रयोगात्मक माध्यम स्थितियों में बदलने से पहले 24 घंटे तक बैठने दें।
      नोट: अनुपचारित नियंत्रण स्थिति, अवरोधक-उपचारित नियंत्रण स्थिति, अनुपचारित प्रयोगात्मक स्थिति और अवरोधक-उपचारित प्रयोगात्मक स्थिति का परीक्षण करने के लिए प्रति स्थिति कम से कम तीन प्रतिकृतियां और पर्याप्त कुएं बीजना।
  2. प्रसार द्वारा जटिल वी गतिविधि का आकलन करने के लिए मध्यम परिवर्तन।
    नोट: गैलेक्टोज के साथ एक माध्यम में प्रसार करने वाली कोशिकाएं एटीपी संश्लेषण 9,10 के लिए जटिल वी गतिविधि पर निर्भर हैं। ग्लूकोज के विपरीत, जो ग्लाइकोलाइसिस से शुद्ध दो एटीपी उत्पन्न करता है, गैलेक्टोज कोई उपज नहीं देता है, जिससे कोशिकाओं को एटीपी संश्लेषण के लिए जटिल वी पर निर्भर होने के लिए मजबूर किया जाता है (चित्रा 1)। जटिल वी अवरोधक ऑलिगोमाइसिन का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
    1. 10 mM ग्लूकोज युक्त माध्यम बनाएं ( तालिका 1 देखें)।
    2. 10 mM गैलेक्टोज युक्त माध्यम बनाएं ( तालिका 1 देखें)।
    3. प्रत्येक कुएं में माध्यम को ग्लूकोज युक्त डीएमईएम या गैलेक्टोज युक्त डीएमईएम में बदलें। प्रासंगिक कुओं में 5 μM ऑलिगोमाइसिन (जटिल वी अवरोधक) और अनुपचारित कुओं में डीएमएसओ की समान मात्रा जोड़ें। डीएमएसओ में ऑलिगोमाइसिन स्टॉक 10 एमएम पुन: निलंबित है। प्लेट को 2 दिनों के लिए ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  3. प्रसार द्वारा जटिल I गतिविधि का आकलन करने के लिए मध्यम परिवर्तन।
    नोट: पाइरूवेट मुक्त माध्यम में प्रसार करने वाली कोशिकाएं जटिल आई गतिविधि11,12 पर अधिक निर्भर हैं। पाइरूवेट के बिना, सुसंस्कृत कोशिकाओं को एनएडीएच रीऑक्सीडेशन के बहुमत को एनएडी + (चित्रा 2) में वापस लाने की सुविधा के लिए कॉम्प्लेक्स आई की आवश्यकता होती है। कॉम्प्लेक्स आई इनहिबिटर रोटेनोन का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
    1. पाइरूवेट मुक्त डीएमईएम माध्यम को 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक बनाएं।
    2. पाइरूवेट का 1 एम घोल बनाएं ( तालिका 1 देखें)।
    3. प्रत्येक कुएं में माध्यम को या तो पाइरूवेट मुक्त माध्यम या पाइरूवेट युक्त माध्यम में बदलें। उपचारित कुओं में 2 μM रोटेनोन (जटिल I अवरोधक) और अनुपचारित कुओं में DMSO की समान मात्रा जोड़ें। डीएमएसओ में रोटेनोन स्टॉक 25 एमएम है। प्लेट को 2 दिनों के लिए ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  4. प्रसार द्वारा डीएचओडीएच गतिविधि का आकलन करने के लिए मध्यम परिवर्तन।
    नोट: यूरिडाइन-मुक्त मीडिया में प्रसार करने वाली कोशिकाओं को डाइहाइड्रोरोटेट डिहाइड्रोजनेज (डीएचओडीएच) गतिविधि11,12,13 की आवश्यकता होती है। बहिर्जात यूरिडाइन की अनुपस्थिति में, सुसंस्कृत कोशिकाएं डे नोवो मार्ग के माध्यम से पाइरिमिडाइन को संश्लेषित करती हैं। डीएचओडीएच अवरोधक ब्रेकिनार का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
    1. यूरिडीन-मुक्त डीएमईएम को 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक बनाएं।
    2. 10 मिलीग्राम / एमएल यूरिडीन स्टॉक समाधान बनाएं, और फिर 100 μg / mL यूरिडाइन माध्यम तैयार करें ( तालिका 1 देखें)।
    3. प्रत्येक कुएं में माध्यम को यूरिडीन मुक्त माध्यम या यूरिडीन युक्त माध्यम में बदलें। उपचारित कुओं में 5 μM brequinar (DHODH अवरोधक) और अनुपचारित कुओं में DMSO की समान मात्रा जोड़ें। डीएमएसओ में ब्रेक्विनार स्टॉक 10 एमएम है। प्लेट को 2 दिनों के लिए ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  5. प्रसार परख के लिए कोशिकाओं की गिनती।
    1. सभी प्रयोगों के लिए, हर 2 दिनों में माध्यम को फिर से भरें। यदि माध्यम पीले रंग का हो जाता है, तो माध्यम की आवृत्ति में वृद्धि होती है। कोशिकाओं को 7 दिनों तक प्रसार करने की अनुमति दें, और यदि कोई भी कुआं अतिविकसित दिखने लगे तो प्रयोग को रोक दें। जब संगम 80% से अधिक हो जाता है तो कुओं को अतिविकसित माना जाता है।
    2. माध्यम को एस्पिरेट करें, 1x पीबीएस से धोएं, और 0.25% ट्रिप्सिन (6-वेल डिश के लिए 500 μL) के साथ कुएं के तल को कवर करें।
    3. 5 मिनट प्रतीक्षा करें जब तक कि कोशिकाएं पकवान से उठ न जाएं। माइक्रोस्कोप के तहत इसकी जांच करें।
    4. ट्रिप्सिन को 10% एफबीएस युक्त पूर्ण डीएमईएम के 1 एमएल के साथ बुझाएं।
    5. सेल के झुरमुट को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट।
    6. 10 मिलीलीटर आइसोटोन बफर (एक कप प्रति कुआं) के साथ भरकर कूल्टर काउंटर कप तैयार करें। सेल काउंटर पर कक्षों की गणना करें, और डेटा रिकॉर्ड करें। यदि रीडआउट प्रति मिलीलीटर (कोशिकाओं / एमएल) कोशिकाओं है, तो प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए रिकॉर्ड किए गए मान को 1.5 से गुणा करें।
      नोट: हेमोसाइटोमीटर जैसे अन्य सेल गिनती विधियां पर्याप्त होंगी यदि प्रयोगशाला में कूल्टर काउंटर नहीं है।

2. डीएचओडीएच गतिविधि को मापने के लिए 13सी 4-एस्पार्टेट स्थिर आइसोटोप अनुरेखण और एलसी-एमएस विश्लेषण।

  1. 13अनुगामी कोशिकाओं में सी 4-एस्पार्टेट स्थिर आइसोटोप अनुरेखण।
    नोट: 13 सी 4-एस्पार्टेट को 13सी 3-यूएमपी में शामिल करके डीएचओडीएच गतिविधि की सीधे निगरानी की जा सकती है। ब्रेक्विनार का उपयोग डीएचओडीएच गतिविधि (चित्रा 3) के लिए नियंत्रण के रूप में किया जाता है। 13सी 3-यूएमपी के परिणामी स्तर डीएचओडीएच गतिविधि का एक उपाय हैं।
    1. अगले दिन 75% संगम प्राप्त करने के लिए 6-वेल डिश में 250,000 और 500,000 कोशिकाओं के बीच बीज डालें।
    2. 250 mM 13 C 4-aspartate और 10 mM 13C 4-aspartate माध्यम का स्टॉक समाधान तैयार करें (तालिका 1 देखें)।
    3. प्रत्येक कुएं में माध्यम को 10 mM 13C 4-aspartate वाले माध्यम में बदलें। रुचि की कोशिकाओं को लेबल करने के लिए एक स्थिर स्थिति प्राप्त करने के लिए उचित संख्या में घंटों के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: स्थिर अवस्था को उस समय सीमा के रूप में परिभाषित किया गया है जिसमें समय14 के साथ प्रतिशत लेबल मेटाबोलाइट पठार होता है। 143 बी ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के लिए, 13सी 4-एस्पार्टेट 8 घंटे तक स्थिर स्थिति प्राप्त करता है। रुचि के स्थिर आइसोटोप के साथ एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग करके प्रयोग से पहले इस समय सीमा को निर्धारित करना सबसे अच्छा अभ्यास है।
  2. अनुयायी कोशिकाओं से मेटाबोलाइट अलगाव।
    1. शुरू करने से पहले, सूखी बर्फ की एक बाल्टी तैयार करें, और एचपीएलसी-ग्रेड पानी में 80% एचपीएलसी-ग्रेड एमईओएच तैयार करें। इस बफर को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ठंडा करें या इसे सीधे सूखी बर्फ पर रखें।
    2. इनक्यूबेटर से एक बार में एक प्लेट निकालते हुए, माध्यम को कुओं से अलग करें, और 1x PBS के साथ 2x धो लें। अगले चरण पर जाने से पहले कुओं से सभी अवशिष्ट पीबीएस को हटा दें।
      नोट: आकांक्षा के दौरान प्लेट को झुकाना सुनिश्चित करें और अनुयायी कोशिकाओं के विघटन को रोकने के लिए पकवान की दीवार के खिलाफ पिपेट करें।
    3. प्लेट को सूखी बर्फ पर रखें, और तुरंत प्रत्येक कुएं में 20% एलसीएमएस-ग्रेड पानी में 80% एलसीएमएस-ग्रेड एमईओएच के 800 μL जोड़ें।
    4. सेल लाइसिस की सुविधा के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कम से कम 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस बिंदु पर, अगली प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकाला जा सकता है और चरण 2.2.1-2.2.4 दोहराया जा सकता है। इसे तब तक जारी रखें जब तक कि सभी प्लेटें -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में प्रवेश न कर लें।
    5. फ्रीजर से एक प्लेट को एक बार में बाहर निकालते हुए, सेल लिफ्टर का उपयोग करके सूखी बर्फ पर प्रत्येक अच्छी तरह से खुरच ें, और लाइसेट को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को अगले चरण तक सूखी बर्फ पर रखें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सभी ट्यूबों को भंवर करें, और फिर अधिकतम गति (कम से कम 17,000 × ग्राम) पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    7. सतह पर तैरनेवाला को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और लगभग 6 घंटे के लिए उच्च वैक्यूम सेटिंग पर -105 डिग्री सेल्सियस ठंडे जाल से लैस 4 डिग्री सेल्सियस वैक्यूम कंसंट्रेटर में लगभग 6 घंटे के लिए या जब तक नमूने वाष्पित न हो जाएं। एक बार लाइसेट सूख जाने के बाद, मेटाबोलाइट छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि उन्हें मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसीएमएस) के साथ जोड़े गए तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए तैयार करने के लिए तैयार न किया जाए।
  3. ध्रुवीय चयापचयों का तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) माप
    नोट: कोई भी क्रोमैटोग्राफिक और मास स्पेक्ट्रोमेट्री वर्कफ़्लो जो एस्पार्टेट का पता लगाने की अनुमति देता है, डे नोवो पाइरीमिडीन बायोसिंथेसिस में मध्यवर्ती, और यूएमपी पर्याप्तहोगा।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सूखे छर्रों और भंवर में 100 μL HPLC ग्रेड पानी जोड़कर बर्फ पर LCMS के लिए नमूने तैयार करें।
    2. अधिकतम गति (कम से कम 17,000 × ग्राम) पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें और प्रत्येक एलसी-एमएस शीशी में 25 μL स्थानांतरित करें।
    3. एलसी-एमएस सिस्टम में लाइसेट के 2 μL इंजेक्ट करें। आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली पद्धति नीचे दी गई है:
      1. मोबाइल चरण ए तैयार करें जिसमें एलसी-एमएस ग्रेड पानी में घुलने वाले 20 एमएम अमोनियम कार्बोनेट (एलसी-एमएस ग्रेड) और 0.1% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (एलसी-एमएस ग्रेड) शामिल हैं।
      2. मोबाइल चरण बी के रूप में 100% एसिटोनिट्राइल (एलसी-एमएस ग्रेड) चुनें।
      3. क्रोमैटोग्राफी के लिए, हाइड्रोफिलिक यौगिकों के लिए 2.1 मिमी x 20 मिमी गार्ड कॉलम से लैस 5 μm, 150 मिमी x 2.1 मिमी विश्लेषणात्मक कॉलम चुनें ( सामग्री की तालिका देखें)। कॉलम ओवन को 25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
      4. निम्नलिखित तरल क्रोमैटोग्राफी सेटिंग्स का उपयोग करें: 0.15 एमएल / मिनट की निरंतर प्रवाह दर; 20 मिनट के लिए 80% से 20% तक एक रैखिक ढाल मोबाइल चरण बी, इसके बाद 0.5 मिनट के लिए 20% से 80% मोबाइल चरण बी तक रैखिक ढाल, इसके बाद 7.5 मिनट के लिए 80% मोबाइल चरण बी पर पकड़ है।
      5. निम्नलिखित मास स्पेक्ट्रोमीटर सेटिंग्स चुनें: एम / जेड 70 डीए और 1,000 डीए के बीच एक पूर्ण स्कैन; 70,000 का संकल्प; 1 × 106 का एजीसी लक्ष्य; और 20 एमएस का अधिकतम इंजेक्शन समय। स्रोत को ध्रुवीयता स्विचिंग मोड में संचालित करें। स्प्रे वोल्टेज को 3.0 केवी पर सेट करें, गर्म केशिका 275 डिग्री सेल्सियस पर, एचईएसआई जांच 350 डिग्री सेल्सियस पर, शीथ गैस प्रवाह 40 इकाइयों पर, सहायक गैस प्रवाह 15 इकाइयों पर, और स्वीप गैस प्रवाह 1 इकाई पर।
    4. LCMS वर्कफ़्लो के साथ इंटरफ़ेस करने वाले किसी भी सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण करें.
      नोट: उपरोक्त वर्कफ़्लो के साथ उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर XCalibur (थर्मो) और ट्रेसफाइंडर (थर्मो) हैं। डेटा विश्लेषण के लिए मुख्य विचार नीचे उल्लिखित हैं:
      1. अपेक्षित अवधारण समय: प्रयोग से पहले क्रोमैटोग्राफिक विधि का उपयोग करके रुचि के प्रत्येक मेटाबोलाइट के लिए मानकों को चलाकर प्रत्येक मेटाबोलाइट के प्रतिधारण समय का निर्धारण करें।
        नोट: 13सी 3-यूएमपी सहित यूएमपी और इसके आइसोटोपोलॉग ्स का प्रतिधारण समय बिल्कुल समान है।
      2. मेटाबोलाइट्स के लिए अपेक्षित एम / जेड: यदि एक मेटाबोलाइट नकारात्मक आयन मोड (जैसे यूएमपी) में आयनित होता है, तो यूएमपी माइनस एक प्रोटॉन [सी 9 एच14एन2ओ9पी] के आणविक सूत्र का उपयोग करके अपेक्षितसटीक द्रव्यमान की गणना करें। मेटाबोलाइट्स के लिए जो सकारात्मक आयन मोड में आयनित होते हैं, आणविक सूत्र प्लस एक प्रोटॉन का उपयोग करके सटीक द्रव्यमान की गणना करें।
      3. बड़े पैमाने पर सटीकता: ऑर्बिटरैप मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करते समय, रुचि के मेटाबोलाइट और इसके आइसोटोपोलॉग में द्रव्यमान सटीकता ±5 एमयू होने की उम्मीद है। इसकी गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, अपेक्षित एम / जेड और वास्तविक पता लगाए गए एम / जेड के लिए लेखांकन।
      4. प्राकृतिक बहुतायत सुधार: सभी अनुरेखण डेटा को प्रकृति 15 में ~ 1% 13सी और ~ 0.5% 15एन-आइसोटोप के लिए प्राकृतिक बहुतायत सुधार से गुजरने की उम्मीद है।

3. एसडीएचगतिविधि को मापने के लिए 13 सी 5-ग्लूटामाइन स्थिर आइसोटोप अनुरेखण।

  1. 13सी 5-ग्लूटामाइन स्थिर आइसोटोप अनुरेखण अनुगामी कोशिकाओं में
    नोट: एसडीएच गतिविधि को सीधे 13सी 5-ग्लूटामाइन ट्रेसिंग 7,16,17 पर फ्यूमरेट और सक्सिनेट के कुछ आइसोटोपोलॉग ्स के इंटरकन्वर्जन को मापकर निगरानी की जा सकती है। जटिल III अवरोधक एंटीमाइसिन का उपयोग एसडीएच कॉम्प्लेक्स (चित्रा 4) की शुद्ध दिशात्मकता को बदलने के लिए एक नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
    1. अगले दिन 75% संगम प्राप्त करने के लिए 6-वेल डिश में 250,000 और 500,000 कोशिकाओं के बीच बीज डालें।
    2. 50 mM 13C 5-ग्लूटामाइन का स्टॉक तैयार करें (तालिका 1 देखें)।
    3. 2 एमएम 13सी 5-ग्लूटामाइन युक्त अनुरेखण माध्यम तैयार करें (तालिका 1 देखें)।
    4. प्रत्येक कुएं में माध्यम को 2 mM 13C 5-ग्लूटामाइन युक्त माध्यम में बदलें। रुचि के कक्षों को लेबल करने की एक स्थिर स्थिति प्राप्त करने के लिए उचित संख्या में घंटों के लिए इनक्यूबेट करें (चरण 2.1.3 में नोट देखें)।
    5. चरण 2.2 में प्रोटोकॉल का पालन करते हुए मेटाबोलाइट्स को अलग करें।
    6. चरण 2.3 में वर्णित वर्कफ़्लो के बाद LC-MS पर नमूने का विश्लेषण करें।
  2. लेबलिंग पैटर्न के आधार पर एसडीएच गतिविधि का विश्लेषण
    नोट: एसडीएच कॉम्प्लेक्स की सक्सिनेट ऑक्सीकरण गतिविधि की निगरानी 13सी 5-ग्लूटामाइन ट्रेसिंग पर 13 सी 4-फ्यूमरेट से 13सी4-सक्सिनेट के अनुपात का आकलन करके की जा सकती है। एसडीएच कॉम्प्लेक्स की फ्यूमरेट कमी गतिविधि की निगरानी 13सी5-ग्लूटामाइन ट्रेसिंग पर 13 सी 3-सक्सिनेट से 13सी 3-फ्यूमरेट के अनुपात का आकलन करके की जा सकती है।
    1. 13सी 3-फ्यूमरेट, 13 सी 4-फ्यूमरेट, 13 सी3-सक्सिनेट और 13सी 4-सक्सिनेट के प्रतिशत लेबलिंग की गणना करें। उदाहरण के लिए, 13 सी 3-फ्यूमरेट का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए, फ्यूमरेट आइसोटोपोलोग्स (अनलेबल फ्यूमरेट, 13 सी 1-फ्यूमरेट, 13 सी 2-फ्यूमरेट, 13 सी3-फ्यूमरेट, और 13 सी 4-फ्यूमरेट) के लिए सभी एकीकृत शिखर क्षेत्रों को मिलाएं, और कुल आइसोटोपोलॉग क्षेत्र से 13सी 3-फ्यूमरेट के लिए शिखर क्षेत्र को विभाजित करें। 100 से गुणा करें।
    2. सक्सिनेट ऑक्सीकरण की गणना करने के लिए, प्रतिशत 13 सी 4-फ्यूमरेट को प्रतिशत 13सी 4-सक्सिनेट से विभाजित करें।
    3. फ्यूमरेट कमी की गणना करने के लिए, प्रतिशत 13 सी 3-सक्सिनेट को प्रतिशत 13सी 3-फ्यूमरेट से विभाजित करें।

4. प्रत्यक्ष जटिल मैं गतिविधि परख

नोट: डीसीपीआईपी एक कृत्रिम इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता है; यूबिक्विनोल से इलेक्ट्रॉनों को स्वीकार करते समय यह अपने कम रूप में बदल जाता है। इस परख में, यूबिक्विनोन को एनएडीएच के जटिल आई-मध्यस्थता ऑक्सीकरण के माध्यम से यूबिक्विनोल में कम किया जाता है। इस प्रकार, इस सेल-मुक्त परख में ऑक्सीकृत डीसीपीआईपी के कारोबार को मापना जटिल आई गतिविधि 7,18 के लिए एक प्रॉक्सी है।

  1. कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया को शुद्ध करना और मात्रा निर्धारित करना
    नोट: इस परख19 के लिए किसी भी माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धिकरण प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है।
    1. कोशिकाओं का विस्तार तब तक करें जब तक कि 25-100 मिलियन कोशिकाएं प्राप्त न हो जाएं। व्यंजन ों से माध्यम को एस्पिरेट करें, 1x पीबीएस से धोएं, पीबीएस को एस्पिरेट करें, और 0.25% ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं को ट्राइस्पिनाइज करें। कल्चर माध्यम के साथ ट्रिप्सिन बुझाएं, और 5 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर कोशिकाओं को पेलेट करें।
    2. सेल छर्रों को 1x PBS के 5 मिलीलीटर में 2x धोएं, और कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 1,000 × g पर सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं। माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धिकरण तक धुले हुए छर्रों को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
      नोट: सेल छर्रों को एक से अधिक बार फ्रीज-पिघलाएं नहीं।
    3. माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव बफर तैयार करें ( तालिका 1 देखें)।
      नोट: सोडियम युक्त अभिकर्मकों जैसे कि एनएओएच का उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव बफर तैयार करने के लिए नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि सोडियम माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता20 को धूमिल करता है और माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम होमियोस्टेसिस21 को बाधित करता है।
    4. कोशिका छर्रों को माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव बफर के प्रति 1 एमएल प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में पुन: निलंबित करें। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव बफर के 10 एमएल में 100 मिलियन पेलेट कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      नोट: बफर में बुलबुले पेश किए बिना सेल क्लंप को बाधित करना सुनिश्चित करें।
    5. सेल सस्पेंशन के 2 एमएल को 3-8 एमएल की कामकाजी मात्रा के साथ प्रीकूल्ड ग्लास होमोजिनाइज़र में स्थानांतरित करें जो पॉटर-एल्वेहजेम पीटीएफई पेस्टल के साथ संगत है। 10-20 स्ट्रोक के साथ कोशिकाओं को समरूप करें, होमोजेनाइजेशन प्रक्रिया के दौरान सेल लाइसिस की पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की निगरानी करें। कुशल सेल लाइसिस सुनिश्चित करने के लिए यदि आवश्यक हो तो स्ट्रोक की संख्या बढ़ाएं।
      नोट: यदि उपरोक्त विधि के साथ कोशिकाओं को समरूप करना कोशिकाओं को लाइज़ करने के लिए प्रभावी नहीं है, तो सिरिंज लाइसिस विधि22 पर स्विच करें।
    6. सेल लाइसेट के 2 एमएल को बर्फ पर एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और उपरोक्त चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि पूरे सेल निलंबन को समरूप न किया जाए।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस सेंट्रीफ्यूज में 10 मिनट के लिए 650 × ग्राम पर नाभिक और सेल मलबे को गोली दें।
    8. सतह पर तैरनेवाला को एक नई 2.0 एमएल ट्यूब में ले जाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 650 × ग्राम पर उपरोक्त सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं।
    9. सतह पर तैरनेवाला को एक नई 2.0 एमएल ट्यूब में ले जाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस सेंट्रीफ्यूज में 10 मिनट के लिए 7,000 × ग्राम पर कच्चे माइटोकॉन्ड्रिया को पेलेट करें।
    10. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव बफर के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए 50 μL को एक नई ट्यूब में ले जाएं। नमूने के दो एलिकोट (50 μL नमूना और शेष ~ 950 μL) पर उपरोक्त सेंट्रीफ्यूजेशन चरण दोहराएं।
    11. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और छर्रों को उपयोग के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
    12. प्रोटीन निकालने के लिए 50 μL एलिकोट से छर्रों में 200 μL RIPA बफर जोड़ें, 10 मिनट के लिए भंवर, और प्रोटीन को अलग करने के लिए 21,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। 50 μL एलिकोट में प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें, और 950 μL नमूने में शेष प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस संख्या का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, यदि 50 μL एलिकोट के लिए प्रोटीन परिमाणीकरण 1 μg / μL है, तो शेष माइटोकॉन्ड्रियल गोली में कुल प्रोटीन 950 μg (1 μg / μL × 950 μL) है।
  2. जटिल आई गतिविधि परख का प्रदर्शन
    नोट: इस परख के लिए 143 बी ओस्टियोसारकोमा सेल लाइन का उपयोग किया गया था, लेकिन प्रोटोकॉल को किसी भी सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
    1. माइटोकॉन्ड्रिया रिसस्पेंशन बफर ( तालिका 1 देखें) में शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को 5 मिलीग्राम प्रोटीन / एमएल की अंतिम एकाग्रता में पुन: निलंबित करें।
    2. माइटोकॉन्ड्रिया को स्थिर करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पांच फ्रीज / पिघलना चक्र करें।
    3. जटिल आई गतिविधि परख बफर बनाएं ( तालिका 1 देखें)।
    4. 5 मिलीग्राम / एमएल माइटोकॉन्ड्रिया स्टॉक के 50 यूजी को 90 μL कॉम्प्लेक्स आई गतिविधि बफर के साथ मिलाएं। जटिल I गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए पांच अनुपचारित प्रतिकृतियां और पांच रोटेनोन-उपचारित (5 μM) प्रतिकृतियां तैयार करें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए प्लेट रीडर में 600 एनएम पर बेसलाइन अवशोषण पढ़ें।
    6. एनएडीएच को 2 एमएम की अंतिम एकाग्रता में जोड़कर प्रतिक्रिया शुरू करें, और 1 घंटे की अवधि में अवशोषण (600 एनएम) को ट्रैक करें, कम से कम हर 2 मिनट को मापें। अवशोषण में कमी जटिल आई गतिविधि के माध्यम से डीसीपीआईपी की कमी का संकेत है।
      नोट: एनएडीएच को मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके जोड़ा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी नमूने एक ही समय में शुरू किए गए हैं।

5. सुपरऑक्साइड के स्तर को मापने के लिए एलसी-एमएस-आधारित परख

नोट: माइटोसॉक्स रेड के प्रतिदीप्ति गुण सुपरऑक्साइड23 के साथ अपनी प्रतिक्रिया से स्वतंत्र रूप से बदल सकते हैं। यह एलसी-एमएस-आधारित परख सीधे माइटोसॉक्स रेड के साथ प्रतिक्रिया करने वाले सुपरऑक्साइड से उत्पाद को मापता है। निम्नलिखित परख को जिओ एट अल .24 से थोड़ा संशोधित किया गया है। 2-हाइड्रॉक्सी-माइटोएथिडियम (2-ओएच मिटोई 2 +) सुपरऑक्साइड प्रतिक्रिया का उत्पाद है (चित्रा 5)। इस परख के लिए कैकी 1 सेल लाइन का उपयोग किया गया था, लेकिन प्रोटोकॉल को किसी भी सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. माइटोसॉक्स रेड के साथ अनुयायी कोशिकाओं का इलाज
    1. अगले दिन 75% संगम प्राप्त करने के लिए 6-वेल डिश में 250,000 और 500,000 कोशिकाओं के बीच बीज डालें। एलसी-एमएस परख के लिए प्लेटों का एक सेट और सेल काउंट सामान्यीकरण के लिए प्लेटों का डुप्लिकेट सेट बीज करना सुनिश्चित करें।
    2. डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम में 10% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त पूर्ण डीएमईएम तैयार करें।
    3. पूर्ण डीएमईएम के 2 एमएल के साथ सभी स्थितियों के लिए सभी कुओं में माध्यम को ताज़ा करें। इस बिंदु पर किसी भी दवा या रुचि के उपचार में जोड़ना सुनिश्चित करें।
    4. 1 घंटे के लिए एक ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    5. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण तैयार करें। पीबीएस में पतला टर्ट-ब्यूटाइल हाइड्रोपरॉक्साइड का 50 एमएम स्टॉक और डीएमएसओ में पतला एन-एसिटाइल सिस्टीन (एनएसी) का 250 एमएम स्टॉक तैयार करें ( तालिका 1 देखें)।
      नोट: Tertbutyl hydroperoxide (tBuOH) एक शक्तिशाली प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति है जो एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करेगी और 2-OH MitoE2+ की मात्रा को बढ़ाती है। एनएसी एक शक्तिशाली एंटीऑक्सिडेंट है जो एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करेगा और टीब्यूओओएच के कारण सुपरऑक्साइड उत्पादन को बेअसर करेगा।
    6. सकारात्मक नियंत्रण कुओं में 1 μL tBuOOH और नकारात्मक नियंत्रण कुओं में 1 μL tBuOOH + 100 μL NAC जोड़ें।
      नोट: एक पी 2 पिपेट (0.1-2 μL रेंज) का उपयोग करना 1 μL स्थानांतरित करने का इष्टतम तरीका है।
    7. एक ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. 1 mM MitoSox Red Stock तैयार करें (तालिका 1 देखें), और 1 μM की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कुएं में 1 mM MitoSox Red के 2 μL जोड़ें। एक ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    9. इस अंतिम इनक्यूबेशन के दौरान, अंतिम एलसी-एमएस डेटा को सामान्य करने के लिए सेल गणना प्राप्त करने के लिए डुप्लिकेट प्लेटों में से एक की गणना करें।
  2. अनुगामी कोशिकाओं से ऑक्सीकृत माइटोसॉक्स लाल उत्पाद का अलगाव।
    1. सूखी बर्फ की एक बाल्टी प्राप्त करें, और अलगाव शुरू करने से पहले सूखी बर्फ पर ठंडा एचपीएलसी-ग्रेड आइसोप्रोपेनोल रखें।
    2. एक बार में एक प्लेट निकालते हुए, माध्यम को कुओं से अलग करें, और 1 x PBS के 1 मिलीलीटर के साथ 2x धो लें। अगले चरण पर जाने से पहले कुओं से सभी अवशिष्ट पीबीएस को हटा दें।
      नोट: आकांक्षा के दौरान प्लेट को झुकाना सुनिश्चित करें और अनुयायी कोशिकाओं के विघटन को रोकने के लिए पकवान की दीवार के खिलाफ पिपेट करें।
    3. प्लेट को सूखी बर्फ पर रखें, और प्रत्येक कुएं में एचपीएलसी-ग्रेड आइसोप्रोपेनोल के 800 μL जोड़ें।
    4. सेल लाइसिस की सुविधा के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कम से कम 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस बिंदु पर, अगली प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकाला जा सकता है और चरण 5.2.1-5.2.4 दोहराया जा सकता है। इसे तब तक जारी रखें जब तक कि सभी प्लेटें -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में प्रवेश न कर लें।
    5. फ्रीजर से एक बार में एक प्लेट निकालते हुए, सेल लिफ्टर का उपयोग करके सूखी बर्फ पर प्रत्येक अच्छी तरह से खुरचते हैं, और लाइसेट को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करते हैं। ट्यूब को अगले चरण तक सूखी बर्फ पर रखें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सभी ट्यूबों को भंवर करें, और फिर अधिकतम गति (कम से कम 17,000 × ग्राम) पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    7. सुपरनैटेंट को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और वैक्यूम कंसंट्रेटर में सुखाएं। एक बार लाइसेट सूख जाने के बाद, मेटाबोलाइट छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर एलसी-एमएस के लिए तैयार होने तक स्टोर करें।
  3. माइटोसॉक्स रेड और 2-हाइड्रॉक्सी-माइटोएथिडियम (2-ओएच मिटोई 2 +) का एलसी-एमएस माप।
    1. एचपीएलसी-ग्रेड एमईओएच: क्लोरोफॉर्म: पानी के 3: 3: 1 मिश्रण के 100 μL जोड़कर बर्फ पर एलसीएमएस के लिए नमूने तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए भंवर।
    2. प्रत्येक एलसी-एमएस शीशी में 25 μL ले जाएं। शेष नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
    3. निम्नलिखित तरल क्रोमैटोग्राफी बफर तैयार करें: i) बफर ए: 0.1% फॉर्मिक एसिड के साथ एचपीएलसी ग्रेड पानी; बफर बी: 0.1% फॉर्मिक एसिड के साथ एचपीएलसी ग्रेड एसिटोनिट्राइल।
    4. विधि विकसित करना शुरू करने के लिए थर्मो एक्सकैलिबर इंस्ट्रूमेंट सेटअप ऐप खोलें।
    5. इस खिड़की के बाएं साइडबार पर दो बक्से देखें-पहला बॉक्स क्रोमैटोग्राफी विधि के विकास की अनुमति देता है, और दूसरा बॉक्स मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि विकास की अनुमति देता है।
    6. तरल क्रोमैटोग्राफी विधि विकास:
      1. 0.25 एमएल / मिनट की प्रवाह दर निर्धारित करें, और विधि को 20% बी पर शुरू करें, 12 मिनट की अवधि में 95% बी तक बढ़ जाएं। अगले मिनट में, बफर बी को वापस 20% बी तक गिरा दें, और अगले 2 मिनट के लिए उस स्तर को बनाए रखें।
        नोट: 20% बी पर अंतिम 2 मिनट का प्रवाह कॉलम दबाव को प्रारंभिक दबाव में वापस लाने और कॉलम को उपयुक्त बफर अनुपात के साथ बराबर करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस संतुलन चरण को शामिल नहीं करने से बाद में चलाए गए सभी नमूनों के लिए अवधारण समय बदल जाएगा।
    7. निम्न पैरामीटर के साथ एक ट्यून फ़ाइल बनाएँ :
      1. ट्यून ऐप खोलें, और एक नई ट्यून फ़ाइल बनाएं।
      2. विधि सेटअप मॉड्यूल (चरण 5.3.9.3 देखें) से किसी भी अतिव्यापी सेटिंग्स को इस ट्यून फ़ाइल पर भी लागू करें, जिसमें स्कैन रेंज, रिज़ॉल्यूशन, ध्रुवीयता, एजीसी लक्ष्य और अधिकतम आईटी शामिल हैं।
      3. शीथ गैस को 30, ऑक्स गैस को 3 और स्वीप गैस को 3 पर सेट करें। स्प्रे वोल्टेज को 3 केवी, केशिका टेम्प को 300 और एस-लेंस आरएफ स्तर को 60 पर सेट करें।
    8. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि विकास:
      1. संभावित स्कैन की नीचे बाईं सूची से, विंडो के केंद्र में पूर्ण एमएस को खींचें और छोड़ें। सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए ड्रॉप के बाद पूर्ण एमएस स्क्वायर पर क्लिक करना सुनिश्चित करें। कुल एमएस विधि की अवधि 13 मिनट है।
        नोट: एलसी विधि एमएस विधि से लंबी है क्योंकि अंतिम 2 मिनट कॉलम रीकंडीशनिंग के लिए हैं और मेटाबोलाइट परिमाणीकरण नहीं हैं।
      2. मॉड्यूल के दाईं ओर, विधि के गुण के अंतर्गत, सुनिश्चित करें कि विधि अवधि और रन टाइम 13.00 मिनट पर सेट हैं।
      3. इस पूर्ण स्कैन को 70,000 के रिज़ॉल्यूशन और 1 × 106 के एजीसी लक्ष्य पर सकारात्मक मोड में चलाएं। अधिकतम आईटी को 100 एमएस पर सेट करें और स्कैन रेंज 300 मीटर / जेड से 700 मीटर / जेड तक है।
      4. मॉड्यूल के शीर्ष की ओर ट्यून फ़ाइल्स के तहत, देखें कि अभी-अभी बनाई गई ट्यून फ़ाइल इस विधि से जुड़ी हुई है।
    9. 2 μL नमूना इंजेक्शन के साथ MitoSox रेड डिटेक्शन के लिए विधि चलाएं।

Representative Results

डीएचओडीएच, कॉम्प्लेक्स आई, और कॉम्प्लेक्स वी की गतिविधियों का मूल्यांकन प्रसार परख का उपयोग करके किया जा सकता है। संस्कृति माध्यम से यूरिडीन के अभाव पर, कोशिकाएं पाइरीमिडीन जैवसंश्लेषण के लिए डे नोवो मार्ग पर अधिक निर्भर हो जाती हैं। इस प्रकार, जब कोशिकाओं को यूरिडीन-मुक्त माध्यम में प्रसार करने के लिए चुनौती दी गई थी, तो वे यूरिडीन युक्त माध्यम में सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में ब्रेकिनार द्वारा डीएचओडीएच गतिविधि के निषेध के प्रति अधिक संवेदनशील थे (चित्रा 6 ए)। इसी तरह, संस्कृति माध्यम से पाइरूवेट का अभाव कोशिकाओं को प्रसार के लिए जटिल आई गतिविधि पर अधिक निर्भर बनाता है। इस प्रकार, जब कोशिकाओं को पाइरूवेट मुक्त माध्यम में प्रसार करने के लिए चुनौती दी गई थी, तो वे पाइरूवेट युक्त माध्यम में सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में रोटेनोन द्वारा जटिल आई गतिविधि के निषेध के प्रति अधिक संवेदनशील थे (चित्रा 6 बी)। जटिल वी गतिविधि का आकलन चुनौतीपूर्ण कोशिकाओं द्वारा ग्लूकोज के बजाय गैलेक्टोज युक्त माध्यम में प्रसार करने के लिए किया जा सकता है। चूंकि गैलेक्टोज ग्लाइकोलाइसिस में शुद्ध शून्य एटीपी उत्पन्न करता है, इस ईंधन में बढ़ने वाली कोशिकाएं जटिल वी गतिविधि के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी संश्लेषण पर अधिक निर्भर होती हैं। इस प्रकार, गैलेक्टोज युक्त माध्यम में प्रसार करने वाली कोशिकाएं ग्लूकोज युक्त माध्यम (चित्रा 6 सी) में प्रसार करने वाली कोशिकाओं की तुलना में ऑलिगोमाइसिन द्वारा जटिल वी निषेध के प्रति अधिक संवेदनशील थीं।

एसडीएच गतिविधि को 13सी 5-ग्लूटामाइन ट्रेसिंग का उपयोग करके और फ्यूमरेट और सक्सिनेट आइसोटोपोलॉग में इसके समावेश की निगरानी करके मापा जा सकता है। वाहन-उपचारित स्थितियों में, एसडीएच कॉम्प्लेक्स ने आगे की गतिविधि का पक्ष लिया, और 13सी 4-फ्यूमरेट में 13 सी4-सक्सिनेट का समावेश 13 सी 3-सक्सीनेट में 13सी 3-फ्यूमरेट के समावेश से अधिक था (चित्रा 7)। एंटीमाइसिन-उपचारित स्थितियों में, एसडीएच कॉम्प्लेक्स ने रिवर्स गतिविधि का पक्ष लिया, और 13 सी3-सक्सीनेट में 13 सी 3-फ्यूमरेट का समावेश 13सी4-सक्सिनेट को 13सी4-फ्यूमरेट में शामिल करने से अधिक था (चित्रा 7)।

माइटोकॉन्ड्रिया के अंदर सुपरऑक्साइड उत्पादन को फ्लोरोसेंट रिपोर्टर मिटोसॉक्स का उपयोग करके मापा जा सकता है, जो सुपरऑक्साइड के साथ प्रतिक्रिया पर 2-हाइड्रॉक्सी-माइटोएथिडियम उत्पन्न करता है। इस अध्ययन में, टर्टब्यूटाइल हाइड्रोजन पेरोक्साइड की उपस्थिति में माइटोसॉक्स के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में 2-हाइड्रॉक्सी-माइटोएथिडियम का उच्च स्तर था, जिसे एनएसी के अलावा दबा दिया गया था, एक एंटीऑक्सिडेंट जो सेलुलर आरओएस बुझाता है (चित्रा 8)।

Figure 1
चित्रा 1: जटिल वी प्रसार परख के लिए यंत्रवत आधार। ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से ग्लूकोज और गैलेक्टोज का ऑक्सीकरण। ग्लूकोज ग्लाइकोलाइसिस से शुद्ध दो एटीपी उत्पन्न करता है, जबकि गैलेक्टोज शुद्ध शून्य एटीपी उत्पन्न करता है क्योंकि यूडीपी-गैलेक्टोज के लिए यूटीपी संश्लेषण की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, ग्लाइकोलाइसिस से उत्पादित एटीपी की कमी के कारण गैलेक्टोज में विकसित कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी संश्लेषण पर अधिक निर्भर होती हैं। संक्षेप: GALK = गैलेक्टोकाइनेज; जीएएलटी = गैलेक्टोज -1-फॉस्फेट यूरिडिलट्रांसफेरेज़; पीजीएम 1 = फॉस्फोग्लूकोम्यूटेस 1; जीपीआई = ग्लूकोज -6-फॉस्फेट आइसोमेरेस, यूजीपी = यूडीपी-ग्लूकोज पाइरोफॉस्फोराइलेज; गेल = यूडीपी-गैलेक्टोज -4-एपिमेरेस; एनडीके = न्यूक्लियोटाइड डाइफॉस्फेट काइनेज; यूएमपीके = यूरिडीन मोनोफॉस्फेट काइनेज; एचके = हेक्सोकाइनेज; पीएफके = फॉस्फोफ्रुक्टोकाइनेज; ALDO = एल्डोलेज; टीपीआई = ट्रायोसफॉस्फेट आइसोमेरेस; जीएपीडीएच = ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज; पीजीके = फॉस्फोग्लिसरेट किनेज; पीजीएम = फॉस्फोग्लूकोम्यूटेज; ईएनओ = एनोलास; पीके = पाइरूवेट काइनेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: जटिल आई प्रसार परख के लिए यांत्रिक आधार। चयापचय मार्गों का योजनाबद्ध जो जटिल I गतिविधि के निषेध पर बदल जाते हैं। उच्च-पाइरूवेट मीडिया में, एलडीएच-मध्यस्थता एनएडीएच ऑक्सीकरण के माध्यम से जटिल आई अवरोध को दरकिनार कर दिया जाता है। कम-पाइरूवेट मीडिया में, यह अनुकूलन कम संभव है, जिससे कोशिकाएं एनएडीएच को पुन: ऑक्सीकरण करने के लिए जटिल आई गतिविधि पर अधिक निर्भर हो जाती हैं। संक्षेप: एलडीएच = लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज; टीसीए चक्र = ट्राइकारबॉक्सिलिक एसिड चक्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: 13सी 4-एस्पार्टेट ट्रेसिंग पर डीएचओडीएच प्रतिक्रिया का योजनाबद्ध। ब्रेकिनार डाइहाइड्रोरोटेट ऑक्सीकरण को ओरोटेट करने से रोकता है, इस प्रकार यूएमपी के डाउनस्ट्रीम संश्लेषण को रोकता है। 13सी 4-एस्पार्टेट को डीएचओडीएच गतिविधि के माध्यम से 13सी3-यूएमपी में शामिल किया गया है। संक्षेप: ओएमएम = बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली; आईएमएम = आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली; डीएचओडीएच = डाइहाइड्रोरोटेट डिहाइड्रोजनेज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: 13सी 5-ग्लूटामाइन ट्रेसिंग के माध्यम से आगे और रिवर्स कॉम्प्लेक्स II गतिविधि को मापना। फॉरवर्ड कॉम्प्लेक्स II गतिविधि (बाएं) को मापने के लिए, 13 सी 5-ग्लूटामाइन को 13 सी 4-सक्सिनेट और 13सी 4-फ्यूमरेट में शामिल करने की निगरानी की जाती है। रिवर्स कॉम्प्लेक्स II गतिविधि (दाएं) को मापने के लिए, 13 सी 5-ग्लूटामाइन को 13 सी 3-सक्सिनेट और 13सी 3-फ्यूमरेट में शामिल करने की निगरानी की जाती है। संक्षेप: एसडीएच = सक्सिनेट डिहाइड्रोजनेज; CytC = साइटोक्रोम C. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: सुपरऑक्साइड के साथ माइटोसॉक्स लाल प्रतिक्रिया। माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड के साथ माइटोसॉक्स की प्रतिक्रिया 2-ओएच-माइटोई 2 + बनाने के लिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन (ए) को मापने के लिए प्रसार-आधारित परख 143 बी ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं का प्रसार 5 यूएम ब्रेक्विनर, एक डीएचओडीएच अवरोधक के साथ इलाज किया जाता है, जो ±100 यूजी / एमएल यूरिडीन के साथ मध्यम में होता है। डेटा एसईएम ± मतलब हैं; N = 3 प्रति शर्त। (बी) 143 बी ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं का प्रसार 2 यूएम रोटेनोन के साथ इलाज किया जाता है, एक जटिल आई अवरोधक, ±5 एमएम पाइरूवेट के साथ माध्यम में। डेटा एसईएम ± मतलब हैं; N = 3 प्रति शर्त। (सी) 143 बी ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं का प्रसार 5 यूएम ऑलिगोमाइसिन, एक जटिल वी अवरोधक के साथ मध्यम में या तो 10 एमएम ग्लूकोज या 10 एमएम गैलेक्टोज के साथ एकमात्र केंद्रीय कार्बन स्रोत के रूप में किया जाता है। डेटा एसईएम ± मतलब हैं; N = 3 प्रति शर्त। * ग्राफपैड प्रिज्म में एक-तरफ़ा एनोवा परीक्षण का उपयोग करके पी < 0.05 इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: जटिल II गतिविधि को मापने के लिए 13सी 5-ग्लूटामाइन अनुरेखण। डीएमएसओ में सक्सिनेट ऑक्सीकरण और फ्यूमरेट कमी (एसडीएच रिवर्स) और 500 एनएम एंटीमाइसिन ए-उपचारित कैकी 1 और डीएलडी 1 कोशिकाएं। डेटा एसईएम ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है; N = 3 प्रति शर्त। ग्राफपैड प्रिज्म में एक अप्रकाशित टी-टेस्ट का उपयोग करके पी < 0.05 इंगित करता है। संक्षेप: एसडीएच = सक्सिनेट ऑक्सीकरण; एसडीएच रिवर्स = फ्यूमरेट कमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: सुपरऑक्साइड का पता लगाने के लिए एलसीएमएस-आधारित माइटोसॉक्स परख। 2-ओएच-मिटो ई 2 + के आयन क्रोमैटोग्राम को काकी 1 कोशिकाओं से अलग किया गया और टीबीयूओओएच ± एनएसी की उपस्थिति में 30 मिनट के लिए माइटोसॉक्स के साथ इलाज किया गया। संक्षेप: एलसीएमएस = तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री; एनएसी = एन-एसिटाइल सिस्टीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों, बफर और मीडिया की संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

जैसा कि उभरते शोध से पता चलता है कि स्तनधारी माइटोकॉन्ड्रिया आणविक ऑक्सीजन का उपभोग किए बिना कार्य कर सकते हैं, शोधकर्ताओं के लिए माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए ओसीआर माप से परे ऑर्थोगोनल परख को नियोजित करना अत्यंत महत्वपूर्ण है। यहां, हमने परख ों की एक श्रृंखला संकलित की है जिसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल एनएडी + / एनएडीएच संतुलन, अनुकूली टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के उपयोग, एटीपी के उत्पादन, डी नोवो पाइरीमिडीन बायोसिंथेसिस और माइटोकॉन्ड्रियल-व्युत्पन्न आरओएस को मापकर कॉम्प्लेक्स I, कॉम्प्लेक्स II, कॉम्प्लेक्स वी और डीएचओडीएच की गतिविधियों का सीधे आकलन करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, ये परख ओसीआर माप की तुलना में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को अधिक सीधे मापते हैं। इसके अलावा, ये परख शोधकर्ताओं को हाइपोक्सिया के दौरान माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को निर्धारित करने के लिए वापस लेने योग्य तरीके प्रदान करते हैं, जिसके लिए ओसीआर माप पसंदीदा टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में उपयोग किए जाने वाले फ्यूमरेट के कारण काफी हद तक अप्रासंगिक हैं। अंत में, यहां वर्णित प्रसार-आधारित विधियां शास्त्रीय श्वास-मिथुमिति प्रयोगों की तुलना में अधिक लागत प्रभावी हैं, इस प्रकार स्तनधारी प्रणालियों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से सुलभ तरीका प्रदान करती हैं।

सुसंस्कृत कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने के लिए इन परखों का उपयोग करते समय महत्वपूर्ण विचार हैं। प्रसार परख के संबंध में, प्रत्येक सेल लाइन की दोगुनी दर के लिए बीज ति कोशिकाओं की संख्या को समायोजित करना महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं को कम से कम 10% संगम के लिए बीज दिया जाना चाहिए और तीन से चार दोहरीकरण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त जगह के साथ ताकि प्रसार में अंतर को निर्धारित किया जा सके। प्रत्येक परख के लिए एक और विचार प्रत्येक ईटीसी कॉम्प्लेक्स की गतिविधियों के लिए नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले छोटे अणुओं की एकाग्रता है। चूंकि विभिन्न सेल लाइनें इन अवरोधकों के लिए अलग-अलग संवेदनशीलता प्रदर्शित कर सकती हैं, इसलिए इष्टतम एकाग्रता की पहचान करने के लिए इन छोटे अणुओं की खुराक का परीक्षण करना महत्वपूर्ण है।

ओसीआर माप और यहां वर्णित सभी परखों सहित विट्रो में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अध्ययन करने वाले परख ों की एक सार्वभौमिक सीमा, संस्कृति माध्यम की चयापचय संरचना है। मानक सेल कल्चर माध्यम माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के सतही रूप से उच्च स्तर में सिस्टम को पूर्वाग्रह ति करता है। उदाहरण के लिए, सुप्राफिजियोलॉजिकल ग्लूटामाइन का स्तर टीसीए चक्र25 के अपने एनाप्लेरोसिस को बढ़ाता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल एनएडीएच संश्लेषण को ईंधन देता है और परिणामस्वरूप, ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन को बढ़ाता है। इसी तरह, स्तनधारी ऊतकों में ऑक्सीजन का आंशिक दबाव 3 mmHg और 100 mmHg (लगभग 0.1% -13%O2) के बीच होता है, लेकिन विट्रो26,27 में वायुमंडलीय (140 mmHg, लगभग 21%) है। यह अतिरिक्त ओ2 माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता और सुपरऑक्साइड उत्पादन28 को अधिकतम करता है। हाल ही में, संस्कृति मीडिया को अधिक शारीरिक29,30 बनाने के लिए प्रयास किए गए हैं। विशेष रूप से, मानव प्लाज्मा जैसे मीडिया में कोशिकाओं की खेती कुछ कैंसर सेल लाइनों30 में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को कम करती है, टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस31, और कैंसर चिकित्सीय32 में माइटोकॉन्ड्रियल अनुकूलन। इस प्रकार, उपयोग किए जा रहे संस्कृति मीडिया की संरचना के प्रति सावधान रहना और समझना महत्वपूर्ण है कि यह माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को कैसे प्रभावित कर सकता है।

माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन की व्याख्या में एक और महत्वपूर्ण और सार्वभौमिक सीमा माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या में अंतर की संभावना है। इसलिए, एमटीडीएनए33 की मात्रा का परिमाणन, झिल्ली संभावित-असंवेदनशील रंजक34 के साथ माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान का माप, या माइटोकॉन्ड्रियल मार्करों के पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री को मापना महत्वपूर्ण है। यह एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है ताकि माइटोकॉन्ड्रिया की संख्या में कमी को माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में कमी के लिए गलत न माना जाए।

विशिष्ट सीमाएं और समस्या निवारण भी हैं जो यहां वर्णित परखों पर लागू होते हैं। सबसे पहले, यह देखते हुए कि विभेदित कोशिकाएं प्रसार नहीं करती हैं, प्रसार-आधारित परख इस संदर्भ में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए उपयोगी नहीं होगी। डीएचओडीएच गतिविधि को मापने के लिए 13सी 4-एस्पार्टेट ट्रेसिंग प्रोटोकॉल की एक प्रमुख सीमा यह है कि कोशिकाओं में एस्पार्टेट अपटेकबेहद अक्षम हो सकता है। इस संभावित सीमा को दूर करने के लिए, शोधकर्ता 13सी 4-एस्पार्टेट अपटेक35 की सुविधा के लिए एस्पार्टेट ट्रांसपोर्टर, एसएलसी 1 ए 3 को ओवरएक्सप्रेस कर सकते हैं।

एसडीएच गतिविधि को मापने के लिए 13सी 5-ग्लूटामाइन ट्रेसिंग का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि इस परख को रिवर्स गतिविधि को मापने के लिए एम + 3 आइसोटोपोलॉग को समृद्ध करने के लिए कोशिकाओं को रिडक्टिव कार्बोक्सिलेशन मार्ग का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। कुछ सेल लाइनें कम एटीपी साइट्रेट लाइज़ अभिव्यक्ति36, अपर्याप्त एचआईएफ स्थिरीकरण 37, या α-केजी: साइट्रेट अनुपात के कारण रिडक्टिव कार्बोक्सिलेशन फ्लक्स में असमर्थ हैं जो बहुत कम38 है। इस सीमा को दूर करने के लिए, कोई एसडीएच आगे औररिवर्स गतिविधियों को मापने के लिए 13सी 4-एस्पार्टेट ट्रेसिंग का उपयोग कर सकता है। इस परख में, एसडीएच फॉरवर्ड गतिविधि को फ्यूमरेट एम + 2: सक्सिनेट एम + 2 के अनुपात और सक्सिनेट एम + 4: फ्यूमरेट एम + 4 द्वारा रिवर्स प्रतिक्रिया द्वारा मापा जा सकता है। विशेष रूप से, यह अनुरेखण रिडक्टिव कार्बोक्सिलेशन मार्ग में अधिकांश एंजाइमों को दरकिनार करता है।

रीडआउट के रूप में डीसीपीआईपी कमी का उपयोग करके जटिल आई गतिविधि परख की एक सीमा यह है कि माइटोकॉन्ड्रिया संरचनात्मक रूप से बरकरार नहीं हैं। परख के लिए उनके एनएडीएच अपटेक को सक्षम करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया को फ्रीज-पिघलाने की प्रक्रिया निश्चित रूप से माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली39 की संरचनात्मक अखंडता को धूमिल कर सकती है। इस परख को जटिल आई प्रसार परख जैसे परखों के समानांतर किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि जटिल आई गतिविधि में परिवर्तन बरकरार कोशिकाओं के साथ भी सच हैं।

भविष्य के अध्ययनों में, इनमें से कुछ तकनीकों को चूहों और केनोरहाब्डिस एलिगेंस जैसे मॉडल जीवों का उपयोग करके विवो में माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।विवो में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली वर्तमान विधियां जीव-स्तर ओसीआर पर केंद्रित हैं, विशेष रूप से माउस मॉडल का उपयोग करते समय श्वसन विनिमय दर। इस विधि की एक स्पष्ट सीमा यह है कि ऑक्सीजन माइटोकॉन्ड्रियल ईटीसी में सर्वव्यापी टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता के रूप में अपनी भूमिका से परे कई जैव रासायनिक और सिग्नलिंग कार्यों को पूरा करता है। उदाहरण के लिए, डाइऑक्सीजेनेस परिवार में एंजाइमों की उत्प्रेरक गतिविधि द्वारा ऑक्सीजन का "खपत" किया जाता है। यद्यपि ये एंजाइम सेलुलर ऑक्सीजन खपत दर में योगदान करते हैं, वे माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में भाग नहीं लेते हैं, विनियमित करते हैं या प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। विट्रो में शास्त्रीय श्वसन-मिथुमेट्री प्रयोग आमतौर पर "गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर" के लिए नियंत्रण करते हैं, जबकि जीव श्वसन विनिमय अनुपात (आरईआर) प्रयोग इसके लिए नियंत्रित नहीं कर सकते हैं, विवो में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए एक मीट्रिक के रूप में आरईआर की व्याख्या को सीमित करते हैं। हालांकि, विवो में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने के लिए 13 सी 4-एस्पार्टेट ट्रेसिंग के माध्यम से डीएचओडीएच गतिविधि को मापने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना संभव है, 13सी5-ग्लूटामाइन ट्रेसिंग के माध्यम से जटिल द्वितीय गतिविधि, ऊतकों से शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया पर जटिल आई गतिविधि, और एलसी-एमएस अनुकूल यौगिकों जैसे कि माइटोबी का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस।. शास्त्रीय श्वसनमिति प्रयोगों के संयोजन में माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों से पूछताछ करने के लिए ये प्रत्यक्ष परख, शोधकर्ताओं को स्तनधारी कोशिकाओं और ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का अधिक व्यापक और सटीक मूल्यांकन प्रदान करते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास रिपोर्ट करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि में उत्पादित आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे। हम इस लेख पर प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए एमी वॉकर के आभारी हैं। जेबीएस को बायोमेडिकल रिसर्च ग्रांट के लिए वॉर्सेस्टर फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 1.5 mL tube Cell Treat 667443
2.0 mL tube Cell Treat 229446
6-well plate Cell Treat 229106
12-well plate Cell Treat 229112
13C4-aspartate Sigma-Aldrich 604852
13C5-Glutamine Cambridge Isotope Laboratories 285978-14-5
15 mL centrifuge tube Cell Treat 667411
50 mL centrifuge tube Cell Treat 667421
150 mm tissue culture dish Cell Treat 229651
1x Phosphate-buffered saline Gibco 10010049
2,6-dichlorophenolindophenol Honeywell 33125
Ammonium Carbonate Sigma-Aldrich 37999
Antimycin Sigma-Aldrich A8674
Ascentis Express C18 Sigma-Aldrich 53825-U
Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter Cell Treat 229717
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3294
Brequinar Sigma-Aldrich SML0113
Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade Cell Treat 229305
CentriVap -105 Cold Trap Labconco 7385020
Complete Protease Inhibitor Tablets Sigma-Aldrich  4693116001
Coulter Counter Cups Fisher Scientific 07-000-694
Decylubiquinone Sigma-Aldrich D7911
DMSO Invitrogen D12345
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11995-065
EDTA Sigma-Aldrich E6758
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Eppendorf Centrifuge 5425R Eppendorf 2231000908
Eppendorf Centrifuge 5910 Ri Eppendorf 5943000343
Galactose Sigma-Aldrich G5388
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glucose-free DMEM Gibco 11966025
Glutamine-free DMEM Thermo Fisher 11960044
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135
Hepes Sigma-Aldrich H3375
HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide Thermo Scientific 460801000
HPLC-grade Acetonitrile Sigma-Aldrich 900667
HPLC-grade Chloroform Sigma-Aldrich 366927
HPLC-grade formic acid Thermo Scientific 28905
HPLC-grade Isopropanol Sigma-Aldrich 563935
HPLC-grade MeOH Sigma-Aldrich 900688
HPLC-grade Water Sigma-Aldrich 270733
Human Osteosarcome Cell Line 143B ATCC CRL-8303
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331-500ML
Isotone buffer Beckman Coulter 8546719
K2HPO4 Sigma-Aldrich P2222
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
MitoSox Red Invitrogen M36008
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351-5MG
Pencillin Streptomycin Gibco 15140-122
Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 Kimble 885502-0021
Pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Pyruvate-free DMEM media Gibco 11965175
Q Exactive Plus Mass Spectrometer Thermo Scientific 726030
ReCO2ver Incubator Baker
Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator Labconco 7310020
RIPA Buffer Millipore Sigma 20188
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column Sigma-Aldrich 1.50460.0001
SeQuant ZIC-pHILIC guard kit Millipore Sigma 1.50438.0001
Sodium Hydroxide, Pellets Millipore Sigma 567530-250GM
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 Thermo Scientific OPTON-31001
Tert-butyl hydroperoxide solution Sigma-Aldrich 458139
Tris Sigma-Aldrich 93352
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25-200-114
Uridine Sigma-Aldrich U3003
VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC Thermo Scientific VF-S01-A-02
Z2 Coulter Particle count and size analyzer Beckman Coulter BZ10131270

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References

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Tseyang, T., Valeros, J., Vo, P., Spinelli, J. B. Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals. J. Vis. Exp. (195), e65184, doi:10.3791/65184 (2023).

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