Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Et antimikrobielt stof ved hjælp af nano-urteindkapsling af æteriske olier

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/65187
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1School of Engineering Technology and Applied Sciences (SETAS), Centennial College

Summary

Antimikrobielle laboratoriebelægninger forhindrer krydskontaminering af patogenakkumulering og utilsigtet bioudslip. Her beskriver vi protokollen for udvikling af et hudvenligt antimikrobielt stof ved hjælp af nano-urteindkapsling og modificerede standardtests for præcist at evaluere effektiviteten og egnetheden til typisk brug af laboratoriefrakken.

Abstract

Labcoats bruges i vid udstrækning i biohazard laboratorier og sundhedsfaciliteter som beskyttelsesbeklædning for at forhindre direkte eksponering for patogener, spild og forbrændinger. Disse bomuldsbaserede beskyttelseslag giver ideelle betingelser for mikrobiel vækst og fastgørelsessteder på grund af deres porøse natur, fugtholdende kapacitet og tilbageholdelse af varme fra brugerens krop. Flere undersøgelser har vist overlevelsen af patogene bakterier på hospitalsbeklædning og laboratoriefrakker, der fungerer som vektorer for mikrobiel transmission.

En almindelig tilgang til at løse disse problemer er anvendelsen af antimikrobielle midler i tekstilfinish, men der er blevet rejst bekymring på grund af toksiciteten og miljøvirkningerne af mange syntetiske kemikalier. Den igangværende pandemi har også åbnet et vindue for undersøgelse af effektive antimikrobielle stoffer og miljøvenlige og giftfrie formuleringer. Denne undersøgelse bruger to naturlige bioaktive forbindelser, carvacrol og thymol, indkapslet i chitosan nanopartikler, som garanterer effektiv beskyttelse mod fire humane patogener med op til en 4-log reduktion (99,99%). Disse patogener påvises ofte i laboratoriebelægninger, der anvendes i biohazard laboratorier.

De behandlede stoffer modstod også op til 10 vaskecyklusser med 90% mikrobiel reduktion, hvilket er tilstrækkeligt til den tilsigtede anvendelse. Vi har foretaget ændringer af de eksisterende standardstoftests for bedre at repræsentere de typiske scenarier for brug af laboratoriebelægning. Disse forbedringer giver mulighed for en mere nøjagtig evaluering af effektiviteten af antimikrobielle laboratoriebelægninger og for simulering af skæbnen for ethvert utilsigtet mikrobielt spild, der skal neutraliseres inden for kort tid. Yderligere undersøgelser anbefales for at undersøge akkumuleringen af patogener over tid på antimikrobielle laboratoriefrakker sammenlignet med almindelige beskyttelseslag.

Introduction

Den beskyttende hvide frakke er et obligatorisk personligt beskyttelsesudstyr (PPE) i mikrobiologiske laboratorier og sundhedsfaciliteter, og det beskytter mod direkte eksponering for patogener, spild og forbrændinger. Disse bomuldsfrakker fremmer mikrobiel vækst på grund af mange faktorer - det vævede stof giver fastgørelsessteder og beluftning, bomuld og stivelse, der anvendes i fremstillingsprocessen sammen med eksfolierede epitelceller fra brugeren, leverer næringsstoffer, og nærheden til brugeren giver varme og fugt. Akkumuleringen af mikrober på tekstiler kan også forårsage sundhedsmæssige problemer såsom allergier og nosokomiel infektion, ubehagelig lugt og stofforringelse1.

I modsætning til almindeligt tøj vaskes eller desinficeres beskyttelsesfrakker sjældent, som det findes i mange undersøgelser 2,3. Mange undersøgelser viser tegn på, at laboratoriefrakker fungerer som en vektor for mikrobiel transmission og risikoen for nosokomielle infektioner i sundhedsvæsenet2,4, især resistente stammer3 såsom methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA); De giver således anledning til sundhedsmæssige betænkeligheder ved personlige værnemidler, som er beregnet til at beskytte mod mikrobiel kontaminering. Der er ikke nok tværsnitsundersøgelser af laboratoriecoat-associerede infektioner i forbindelse med Biosafety Level 2 (BSL-2) faciliteter eller mikrobiologiske undervisningslaboratorier, men mange regulerende myndigheder begrænser brugen af laboratoriefrakker inden for indeslutningsniveauet. Imidlertid kæmper mange akademiske institutioner i Nordamerika for at opfylde kravene på grund af praktiske begrænsninger, såsom hvidvaskning og opbevaring inde i anlægget, hændelserne med at bære laboratoriefrakker i offentlige områder som cafeterier og biblioteker er almindelige. En praktisk løsning på disse problemer er anvendelsen af antimikrobielle midler i tekstilfinish.

Antimikrobielle stoffer vinder stigende popularitet i sportstøj, aktivt tøj og sokker, primært beregnet til at reducere kropslugt. Imidlertid er brugen af disse stoffer ikke almindelig i PPE-udvikling, bortset fra nogle sølvbelagte bomuldsmasker og sundhedsbeklædning5. Vi rapporterer udviklingen af et antimikrobielt stof til laboratoriefrakker, som hæmmer almindelige patogener, der findes i BSL-2-laboratorier og yder effektiv beskyttelse mod krydskontaminering af almindelige patogener.

I øjeblikket er der en række antimikrobielle stoffer og efterbehandlingsmidler tilgængelige på markedet, men de fleste af disse bruger kolloide tungmetalpartikler (f.eks. sølv, kobber, zink), organometallik eller syntetiske kemikalier såsom triclosan og kvaternære ammoniumforbindelser, som ikke er miljøvenlige1 og kan føre til sundhedsmæssige problemer såsom hudirritation og allergi6. Nogle syntetiske formuleringer giver anledning til bekymring på grund af mikrober uden for målgruppen, såsom normal flora eller inducerende antimikrobiel resistens (AMR). Den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) regulerer kommercielle antimikrobielle stoffer, som skal være ikke-giftige for brugeren og fri for økotoksicitet. Derfor foretrækkes antimikrobielle stoffer baseret på naturlige biocider, der hæmmer et bredt spektrum af mikrober. Æteriske olier (EO'er) anvendes bredt som antimikrobielle og terapeutiske midler, men deres anvendelse i antimikrobiel efterbehandling er begrænset på grund af deres holdbarhed 6,7,8. Baseret på vores viden og markedsundersøgelser om nano-urte efterbehandling8, ingen urtebaserede antimikrobielle stof er kommercielt tilgængelige. Dette skyldes, at syntetiske belægninger er nemme at fremstille og har lang holdbarhed. Et par nano-urtebelagte tekstiler, der kun rapporteres til forskningsformål, omfatter neem7, moringa 9 og karryblade9.

Denne undersøgelse bruger to bioaktive komponenter ekstraheret fra oregano EO'er, carvacrol og thymol, som er effektive mod en bred vifte af bakterielle patogener og vira, men er generelt anerkendt som sikre for mennesker10. Disse bioaktive komponenter er imidlertid flygtige, og derfor er deres antimikrobielle potentiale kortvarigt, hvis de påføres direkte på stoffet. Nano-urteindkapsling er en proces, hvor bioaktive komponenter eller lægemidler indlæses inde i en polymer skal, der beskytter kernen mod miljøforringelse og dermed forbedrer holdbarheden. Derudover forbedrer den lille størrelse af de polymere partikler, som generelt varierer fra 10 nm til 100 nm, effektiviteten af applikationen og bremser frigivelsen af de bioaktive forbindelser på stoffet. Disse bioaktive forbindelser anvendes til forskellige formål, såsom konservering af fødevarer10, men ikke til tekstilbelægning.

Blandt mange polymere indkapslingsmidler er chitosan en attraktiv kandidat på grund af mange af dets egenskaber, såsom ikke-toksicitet, bionedbrydelighed, mucoadhæsivitet og biokompatibilitet11. Det er et naturligt polysaccharid, opnået ved deacetyleringsprocessen fra chitin, som findes i muslingeskaller og svampecellevægge. Det bruges i biokemiske og fødevarekonserverende applikationer såsom lægemiddel- eller proteinafgivelse 11,12,13, kontrolleret frigivelse 14 og antimikrobielle film 10. Chitosan er ikke let opløseligt i vand, men danner en kolloid suspension i sure medier. Bioaktive molekyler indlæses i chitosan nanopartikler (NP'er) ved en simpel to-trins ionisk geleringsmetode14,15,16. I denne proces danner hydrofobe bioaktive forbindelser såsom carvacrol og thymol en olie-i-vand-emulsion, som hjælpes af et overfladeaktivt middel, Tween 80. Derefter anvendes en polyanionforbindelse, pentanatriumtripolyphosphat (TPP), til dannelse af tværbindingerne mellem aminogrupperne langs de polykationiske polymermolekyler og phosphatgrupper af TPP-molekyler for at stabilisere komplekset. Denne kompleksdannelsesproces størkner de bioaktive forbindelser i chitosanmatrixen, som efterfølgende renses og overtrækkes på bomuldsprøver for at producere antimikrobielt stof.

Nanoformuleringerne skal først testes for antimikrobiel effektivitet i emulsionsform, før de påføres stoffet. Dette kan bekvemt evalueres ved en kvalitativ metode, såsom Kirby-Bauer diskdiffusion, brønddiffusion og cylinderpladeanalysen. Imidlertid giver cylinderpladeanalysen17 fleksibiliteten til at indlæse forskellige volumener af formuleringen og sammenligne frigangszonen. I denne metode lægges de antimikrobielle formuleringer i cylindre af rustfrit stål og anbringes på et blødt agarlag, som inokuleres med testmikroorganismen eller patogenet. Diameteren af clearance produceret mod testorganismen er proportional med den antimikrobielle formulerings hæmmende potentiale og kan derfor anvendes som et alternativ til bouillonfortyndingsmetoder. Størrelsen af de klare zoner er imidlertid kun et komparativt eller kvalitativt mål inden for en bestemt plade, medmindre specifikke standarder opretholdes. Antimikrobielle midler virker mod patogenerne enten ved at hæmme deres vækst (biostatisk) eller dræbe cellerne (biocid), som kan kvantificeres ved henholdsvis minimum hæmmende koncentration (MIC) og minimum bakteriedræbende koncentration (MBC). Imidlertid er effektiviteten og adfærden af de bioaktive kemikalier forskellige i deres formuleringer (flydende tilstand) og når de overtrækkes på et substrat såsom et stof18. Dette skyldes, at flere faktorer spiller en rolle i effektiviteten, såsom stabiliteten af de antimikrobielle midlers vedhæftning til stoffet, fugtindhold, substrattype og vedhæftning af mikroberne. Hvis det tilsigtede formål kun er bakteriostatisk aktivitet, kan et kvalitativt assay som "Parallel Streak Method"19 give en relativt hurtig og nem evaluering af diffusibel antimikrobiel formulering. Men hvis de bakteriedræbende virkninger skal bestemmes, kan "Vurdering af antibakterielle overflader på tekstilmaterialer"20 anvendes, hvilket giver logreduktionen af det spikede patogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af nanopartikler

  1. Nano-urte indkapsling
    1. Forbered 50 ml 1% (v/v) eddikesyre.
      FORSIGTIG: Iseddike er irriterende, hvilket kan forårsage alvorlige hudforbrændinger og øjenskader. Brug en laboratoriefrakke i fuld længde, nitrilhandsker og beskyttelsesbriller, og arbejd under en røghætte.
    2. Der fremstilles chitosanopløsning (1,2 % w/v) ved at opløse 0,6 g chitosanflager (medium molekylvægt) i 50 ml 1 % eddikesyre (fremstillet ovenfor). Omrystes natten over (O/N) ved stuetemperatur (R/T) for at opnå en homogen emulsion.
    3. Der tilsættes 0,5 g Tween 80 og omrøres (1.000 o/min.) ved 60 °C i 2 timer for at opnå en homogen opløsning. Bring opløsningen til R / T, før der tilsættes bioaktive forbindelser (carvacrol eller thymol).
    4. Tilsæt 0,75 g carvacrol (eller thymol) dråbevis eller gradvist under omrøring (1.000 o / min) blandingen i 20 minutter ved R / T. Vægtforholdet mellem chitosan og bioaktiv forbindelse er 1:1,25.
    5. Tilsæt 50 ml (0,5% w/v) TPP dråbevis til blandingen under omrøring ved R/T. Fortsæt omrøring i 30 minutter for at få en homogen emulsion.
    6. Forbered en negativ kontrol ved at følge samme procedure, men uden tilsætning af bioaktive forbindelser.
  2. Rensning
    1. Emulsionen centrifugeres ved 10.000 × g i 30 minutter ved 4 °C, og de dannede NP'er (pellet) opsamles efter dekantering af supernatanten. Reservér supernatanten for at teste indkapslingseffektiviteten.
    2. Partiklerne (fra trin 1.2.1) vaskes med vandig Tween 80 (1% v/v) med dobbelt så mange pellets dannet for at fjerne de ubundne eller frie bioaktive forbindelser. Sørg for at forstyrre pelleten ved hvirvelstrøm, indtil der dannes en homogen opløsning i hvert vasketrin.
    3. Partiklerne (fra trin 1.2.2) vaskes med deioniseret vand to gange for at fjerne urenheder.
    4. NP'erne rekonstitueres ved resuspendering af pellet (fra trin 1.2.3) i 30 ml deioniseret vand. NP'erne opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder.
      BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause på dette tidspunkt.
  3. Karakterisering
    1. NP'erne fortyndes i deioniseret vand, indtil de ultravioletsynlige (UV-Vis) aflæsninger på mellem 250 og 400 nm ligger inden for området (absorbans >1).
    2. NP'ernes UV-Vis-absorptionsspektre registreres over bølgelængder fra 250 til 400 nm ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer.
    3. En prøve (1 ml) NP opbevares ved R/T i et interval af varigheder (f.eks. 1 til 6 måneder), og den antimikrobielle effekt testes ved hjælp af cylinderplademetoden sammen med en frisk prøve.
  4. Belægning på stof
    1. Påfør NP'er på et vævet bomuldsstof ved hjælp af en pad-dry-hærdningsmetode 7,21.
      1. Dyp stofprøverne i opløsningen, der indeholder NP'er blandet med et stofbindemiddel, i 3 minutter, indtil de er gennemblødt. Før derefter farveprøverne gennem en laboratoriepude med to ruller for at fjerne overskydende væske.
      2. Ovntør farveprøverne ved 100 °C i 30 minutter og hærd ved 130 °C i 10 minutter.
      3. Til sidst vaskes farveprøverne i et ultralydbad i 15 minutter for at fjerne ubundne NP'er.
        BEMÆRK: Alternativt kan du følge den forenklede metode, der er beskrevet nedenfor.
    2. Skær bomuldsstoffet (eller labcoat-farveprøverne) i firkanter på 10 cm x 10 cm.
    3. Nedsænk de skårne stykker i 2 ml af den syntetiserede NP (10%) i en plastbeholder (12 cm x 12 cm) i 2 minutter ved R/T. Fjern overskydende væske ved lufttørring.
    4. Varmetryk ved 100 °C i 3 minutter for at binde NP'erne.
    5. Ubundne NP'er fjernes ved skylning i vandig Tween 80 (2 % w/v) og tørres i ovnen ved 100 °C i 30 minutter.
      BEMÆRK: Dette antimikrobielle stof kan opbevares i 2 år ved R/T.
  5. Vask holdbarhed
    1. Skær stoffet i 50 mm x 50 mm firkantede farveprøver.
    2. Anbring farveprøverne i 50 ml varmt postevand (40 °C) i en glas-/plastbeholder, og tilsæt to dråber almindeligt vaskemiddel (ikke-antimikrobielt).
    3. Skyl på en gyngeplatformryster eller magnetisk omrører i 30 min.
    4. Lufttørres eller inkuberes ved 60 °C i 2 timer og testes for antimikrobiel virkning.

2. Cylinderpladeanalyse til screening af nanopartikler

  1. Forbered trypticase sojaagar (TSA), trypticase sojabouillon (TSB), antibiotisk baseagar (ABA) og antibiotikafrøagar (ASA) i henhold til producentens anvisninger, og steriliser mediet ved autoklavering ved 121 ° C ved 15 psi i 15 minutter.
  2. Subkultur mikroberne (fra lager) af interesse, mod hvilke effektivitetstestene udføres, på frisklavede TSA-plader (eller ethvert passende medium) ved trevejsstribeplademetoden og inkuberes for at producere renhedsplader. (Anbefalede arter: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa og C. albicans.)
  3. Kulturerne podes fra friske renhedsplader i TSB (10 ml rør) ved 35 °C O/N under moderat omrystning (100-200 omdr./min.).
  4. Alikvote 5,0 ml smeltet ASA i hvert reagensglas. Antallet af rør svarer til antallet af testede mikroorganismer.
  5. Der hældes 20 ml præsteriliseret smeltet ABA aseptisk i hver petriplade (100 mm x 20 mm) for at danne basislaget. Antallet af agarplader svarer til antallet af mikroorganismer, der skal testes. Vent, indtil medierne bliver størknet.
  6. Efter størkning af basislaget podes hver smeltet ASA med en kultur natten over fra trin 2.3 (1,0 ml, forvarmet til 35 °C) og straks overføres indholdet (blanding af ASA og kultur) til overfladen af en ABA-plade. Hvirvl pladen rundt for at fordele det smeltede agarlag jævnt. Sørg for, at frølaget ser glat ud og fri for stød eller bobler.
  7. Anbring op til seks cylindre i rustfrit stål (6 mm x 6 mm x 10 mm; præautoklaveret), jævnt fordelt på et sekskantet mønster, pr. agarplade ved hjælp af en par sterile pincetter (figur 1).
  8. Fyld cylindrene med de syntetiserede NP'er med forskellige volumener (30 μL, 50 μL, 75 μL og 100 μL), der skal screenes for antimikrobielle virkninger. Den negative kontrol er den uden bioaktive forbindelser.
  9. Der inkuberes almindelige bakterielle patogener (f.eks. E. coli, S. aureus, P. aeruginosa) ved 35 °C i 24 timer og svampearter (f.eks. C. albicans) ved R/T i 3 dage.
  10. Mål diameteren af den klare zone og sammenlign effektiviteten af de syntetiserede NP'er.
    BEMÆRK: Denne test kan bruges til at forhåndsscreene de bedste NP'er, der skal belægges på stoffet.

3. Parallel streak metode (ændret fra AATCC 147)

  1. Materiale forberedelse
    1. Skær det NP-behandlede stof i 50 mm x 25 mm farveprøver.
    2. Forbered Mueller-Hinton agar (MHA), TSA og TSB i henhold til producentens anvisninger, og steriliser mediet ved autoklavering ved 121 ° C ved 15 psi i 15 minutter.
    3. Subkultur mikroberne (fra lager) af interesse, mod hvilke effektivitetstestene udføres, på frisklavede TSA-plader (eller ethvert passende medium) ved trevejsstribeplademetoden og inkuberes ved 35 °C i 2 dage for bakteriepletter og ved R/T i 5 dage for svampestammer for at producere renhedsplader. (Anbefalede arter: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa og C. albicans.)
  2. Spiking af mikrobielle kulturer
    1. Kulturerne podes fra friske renhedsplader i TSB (10 ml rør) ved 35 °C O/N under moderat omrystning (100-200 omdr./min.).
    2. Fortynd O/N-kulturerne til 1,5 × 108 kolonidannende enheder (CFU)/ml eller svarende til turbiditeten af 0,5 McFarland-standarden (normalt en 1/10 til 1/20 fortynding for de fleste sunde kulturer).
    3. Den fortyndede kultur ovenfor podes med en 4 mm steril sløjfe på følgende måde. Læg en løkkefuld bouillonkultur og overfør den til overfladen af MHA-agarpladen ved at lave fem parallelle striber, hver 6 cm i længden og 1 cm fra hinanden, i henhold til figur 2. Genopfyld ikke løkken.
    4. Tryk forsigtigt på stofprøven med en steril spatel hen over de fem striber, så stoffet er i midten og berører alle fem streger. Der inkuberes ved 35 °C i 24 timer.
  3. Kvalitativ evaluering af antimikrobiel effekt
    1. Undersøg den inkuberede plade for afbrydelse af væksten langs striberne ud over stoffets kanter (klar zone angiver hæmning af vækst).
    2. Den gennemsnitlige bredde af en hæmningszone langs stritribelinjen (W) på hver side af stofprøven beregnes ved hjælp af ligning (1).
      W = (T - D)/2 (1)
      W = bredden af den klare zone T = den frie zones samlede længde, inklusive farveprøvens bredde D = bredden af stofprøven (25 mm).

4. Kvantitativ logreduktionsmetode (ændret fra AATCC 100)

  1. Eksperimentel forberedelse
    1. Skær stoffet i 50 mm x 50 mm firkantede farveprøver.
    2. Forbered TSA, TSB, Letheen bouillon og fosfatbufret saltvand (PBS) i henhold til producentens anvisninger, og steriliser mediet ved autoklavering.
    3. Opnå O/N-kulturer af relevante mikrober, mod hvilke effektivitetstestene udføres, ved at pode isolerede kolonier fra renhedsplader i steril TSB og inkubere ved 35 °C i 18-24 timer. (Anbefalede arter: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa og C. albicans.)
  2. Spiking af mikrobielle kulturer
    1. Fortynd O/N-kulturerne til 1,5 × 108 CFU/ml eller svarende til turbiditeten på 0,5 McFarland-standarden (normalt en 1/10 til 1/20 fortynding for de fleste sunde kulturer).
    2. Bestem det passende volumen af kulturer til spiking ved at måle stoffets væskekapacitet som følger.
      1. Der tilsættes en række volumener af den fortyndede bouillonkultur (f.eks. 100-500 μL) på stofprøver (i separate petriplader), og vælg volumenet således, at stofprøven absorberer vandet fuldt ud og ikke efterlader nogen resterende/fri væske. Væskeholdekapaciteten adskiller sig fra stoffets type og tykkelse. For almindelige bomuldslaboratoriefrakker er det ca. 200 μL.
      2. Volumenet (væskeholdende kapacitet bestemt ovenfor [f.eks. 200 μL]) af hver kultur hældes på farveprøverne anbragt i sterile petriplader. Antallet af farveprøver svarer til antallet af test (f.eks. stof, der testes umiddelbart og efter vask [og de testede vaskecyklusser]), og de antimikrobielle virkninger, der testes over kontakttiden (efter et bestemt tidspunkt/dag [f.eks. 30 min, 2 timer, dag 1-3]).
        BEMÆRK: Brug en mikropipette med aerosolfilterspidser (for at forhindre kontaminering af pipetten ved efterfølgende brug) til at pode kulturerne på farveprøverne med jævn fordeling.
      3. Til den negative kontrol skal du bruge den samme type ubehandlede stofprøver. Udfør den negative kontrol for hver tilsvarende testmikrobiel art, kontaktperiode, forskellige stoffer og vaskecyklusser.
  3. Genvinding af mikrober ved hjælp af levedygtige kimtal
    1. Lad de podede farveprøver (både behandlede og ubehandlet) lufttørre inde i petripladerne (låg på klem) ved R/T i den eller de krævede kontaktperioder, der skal testes (f.eks. 0 min, 30 min, 60 minutter osv., eller endda dage for langtidsvirkninger). Medtag altid et "0 min" for at repræsentere en øjeblikkelig effekt og neutraliserende effekt.
    2. Farveprøverne overføres aseptisk til separate sterile centrifugeglas (50 ml), og hætterne skrues fast.
    3. Tilsæt Letheen bouillon (eventuelle relevante neutraliserende buffere) for at lave en 1/100 fortynding (f.eks. 19,8 ml til et podning på 200 μL).
    4. Luk centrifugerørene med skruelåg tæt og hvirvel i 1 min ved medium hastighed.
    5. Serialt fortyndes suspensionen med den sterile PBS i efterfølgende 1/10 fortyndinger, således at kolonitællingerne i den "ubehandlede" gruppe bliver for lave til at tælle (TLTC).
    6. Pladerne fortyndingerne (0,1 ml) på passende medieplader, som understøtter væksten af mikroorganismen (f.eks. TSA for bakterier eller Sabouraud dextroseagar [SDA] for svampe) eller ethvert medie, der optimerer væksten og giver god kontrast for at gøre kolonitællingen nøjagtig.
    7. Bakteriepladerne inkuberes ved 35 °C i 2 dage og svampepladerne ved R/T i 5 dage.
    8. Tæl de levedygtige CFU'er direkte ved hjælp af en kolonitæller eller ved hjælp af billedbehandlingssoftware (f.eks. CFU AI).
    9. Beregn den mikrobielle logreduktion (R) på grund af antimikrobielt stof ved hjælp af ligning (2):
      R = Equation 1 × 100 (2)
      A = logaritmisk værdi af antallet af CFU'er, der er genvundet fra ubehandlet stof B = logningsværdi for antallet af CFU'er, der er genvundet fra behandlet stof.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Indledende screening af de syntetiserede NP'er
Efter to-trins olie-i-vand-emulsionsteknik16 blev de bioaktive forbindelser (carvacrol og thymol) med succes indkapslet i chitosan. Dette blev bekræftet af UV-Vis-spektrofotometri for topabsorptionen af de respektive bioaktive forbindelser sammenlignet med kontrollerne, som var chitosan-NP'erne uden bioaktive forbindelser. De konstituerede NP'er var homogene og stabile over 12 måneder ved 4 °C. Den indledende screening af den antimikrobielle effektivitet blev verificeret ved cylinderplademetoden (figur 1). Dette er en kvalitativ metode, da frigangszonen påvirkes af flere faktorer, såsom agartykkelse, inokulumets styrke og koncentrationen af testprøverne. Mange enklere metoder, såsom Kirby-Bauer-diskdiffusionsmetoden og brønddiffusionsmetoden, kan anvendes til dette formål, men cylinderplademetoden giver mulighed for at variere koncentrationerne (figur 1A) ved at fortynde NP'erne, og hver cylinder kan holde prøveprøvevolumenet op til 200 μL. Derudover danner agaroverlejringen med kulturer et glat podemateriale, der muliggør bestemmelse af de klare zoner med bedre præcision17. Resultaterne viste, at de klare zoner står i forhold til de gradvist stigende koncentrationer (figur 1A). Dette tilføjer validitet til dataene og adskiller dem fra eventuelle artefakter eller unormale zoner. Baseret på størrelsen af de klare zoner (normalt over 20 mm) kan den korrekte koncentration af NP'er vælges til belægning. Tidligere karakteriserede eller gamle NP'er, som blev opbevaret korrekt (4 °C), kan også verificeres af de store zoner (figur 1B, C), før de overtrækkes på stoffet.

Kvalitativ screening af de behandlede stofprøver
På trods af den antimikrobielle effektivitet af de indkapslede NP'er bekræftet af store klare zoner, skal de NP-belagte stoffer testes. Dette skyldes, at de antimikrobielle midler kan virke anderledes, når de påføres stoffet sammenlignet med deres oprindelige formuleringer. Mange faktorer, såsom stoffets egenskaber (tykkelse, hydrofobicitet), belægningseffektivitet og nedbrydning af bioaktive forbindelser under belægning, påvirker effektiviteten20. Som sådan blev den parallelle streak-metode brugt til at evaluere de antimikrobielle virkninger af de behandlede stoffer kvalitativt. De negative kontroller (ubehandlede stoffer) viste ingen antimikrobielle virkninger ved den uafbrudte mikrobielle vækst langs alle fem striber (figur 3 A,B). Det behandlede stof viste afbrudt mikrobiel vækst langs striberne (figur 3 C, D), hvilket skyldtes de diffuse bioaktive forbindelser fra stoffet. Den gennemsnitlige bredde af de klare zoner var imidlertid lav (<5 mm), da testprøverne blev udsat for 10 vaskecyklusser før test. Da podekoncentrationerne falder langs de parallelle bøffer fra den første til den femte stribe (figur 2), er de klare zoner fremtrædende i de efterfølgende striber. Hvis den første stribe (høj inokulum) viser en klar zone, er stoffets antimikrobielle potentiale normalt højt. Nogle uregelmæssigheder, såsom den femte linje i figur 3D, kan forekomme på grund af testens kvalitative karakter. Den klare zone (afbrudt vækst) på grund af den bakteriostatiske aktivitet giver en indikation af det antimikrobielle potentiale, men giver ikke en tilstrækkelig følsom retningslinje18, som beregnes ved "logreduktionstesten". Den parallelle streak-metode er imidlertid nyttig til en relativt hurtig og let udført procedure til screening af et stort antal farveprøver 6,7,20, især når der testes for en vaskeholdbarhedstest over mange cyklusser.

Kvantitativ analyse af de behandlede stofprøver
Logreduktionstesten (også kendt som procentreduktionstesten) viste en signifikant (<0,001) reduktion af mikrobielle kulturer ved kontakt med det behandlede stof i 30 minutter (figur 4 og figur 5). De antimikrobielle stofprøver var signifikant effektive (>99%) mod en grampositiv bakterie (S. aureus), gramnegative bakterier (E. coli og P. aeruginosa) og en hudsvampeart (C. albicans). Da det ubehandlede stof (negativ kontrol) ikke havde nogen antimikrobiel aktivitet, var de genvundne CFU'er for talrige til at tælle, indtil de var fortyndet til udryddelse, op til 106 fortyndinger (figur 4). Antallet af CFU'er, der blev genvundet fra de behandlede stoffer ved "0" kontakttid (belagt umiddelbart efter podning og neutralisering) lignede meget det for det ubehandlede stof, og data blev udeladt for nemheds skyld. Den anvendte neutralisator (Letheen bouillon) er effektiv til at neutralisere virkningerne af phenolderivater, såsom carvacrol og thymol. Sammenlignet med carvacrol NP'er viste thymol NP'er lidt højere antimikrobielle virkninger mod alle fire mikrober (figur 5). Både thymol og carvacrol-belagt stof arbejdede lige effektivt mod tre mikrober (S. aureus, E. coli og C. albicans) med over en 4-log reduktion (99,99%), undtagen P. aeruginosa, som varierede fra en 2,8- til en 3,2-log reduktion (99,9). Dette var forventet, da P. aeruginosa er iboende resistent over for en række antimikrobielle stoffer22. Vaskeholdbarhedstesten viste, at det behandlede stof var i stand til at udvise effektiv antimikrobiel resistens (>99%) mod tre arter (S. aureus, E. coli og C. albicans) og moderat resistens over for P. aeruginosa efter 10 vaskecyklusser.

Figure 1
Figur 1: Cylinderpladeanalyse af syntetiserede nanopartikler med en række koncentrationer testet mod bakterier . A) Serielt fortyndede NP'er for thymol til en indledende screening mod E. coli , der viser placeringen af cylindre og klare zoner efter 18 timers inkubation. Gradvist stigende koncentrationer "o" til "r" resulterede i forholdsmæssigt højere zoner. Den klare zone produceret af den højeste koncentration er angivet med en rød cirkel. Den negative kontrol (chitosan-NP'er uden de bioaktive forbindelser) er repræsenteret ved "t", og supernatanten ekstraheret under rensningen er repræsenteret ved "s". (B) To ud af tre koncentrationer af carvacrol NP'er (12 måneder gamle, opbevaret ved 4 °C) screenet for stofbehandling og viser effektive zoner (>20 mm) mod S. aureus. (C) Tre koncentrationer af thymol NP'er (12 måneder gamle, opbevaret ved 4 °C) screenet for stofbehandling, der viser effektive zoner mod S. aureus. Forkortelse: NP = nanopartikel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Parallel streak metode layout. Placering af en stofprøve på Mueller-Hinton agar podet med fem efterfølgende parallelle striber. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Resultater af parallelstribemetoden, der viser klare zoner for de behandlede stofprøver. Farveprøverne blev placeret oven på podningen (nederste række) sammenlignet med ubehandlede (øverste række). (A) Ubehandlet stof mod S. aureus, (B) ubehandlet stof mod C. albicans, (C) thymol NP-belagt stof (efter 10 vaskecyklusser) mod S. aureus, og (D) thymol NP-belagt stof (efter 10 vaskecyklusser) mod C. albicans. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Logreduktionsresultater af antimikrobielt stof belagt med thymolindkapslede chitosannanopartikler testet agaisnt fire patogener. Laktoseagarpladerne i panel B blev doneret af Canadian Food Inspection Agency, som indeholder deres etiketter på bagsiden og ligner farveprøver. Andre agarplader blev fremstillet i laboratoriet uden etiketter. Stofprøver blev ikke placeret oven på agarpladerne, som i eksperimentet vist i figur 3. Snarere blev mikroberne genvundet fra farveprøverne (efter hvirvelstrøm i PBS) og belagt. (A) S. aureus på blodagar, (B) E. coli på lilla lactoseagar, (C) P. aeruginosa på cetrimid agar, (D) C. albicans på SDA. Patogenerne blev spiket på "ubehandlet" (øverste række) og "behandlet" (nederste række) farveprøver i 30 minutter og genvundet ved neutralisering og fortyndingsplettering. Fortyndingsforholdene vises mellem de behandlede og ubehandlede serier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Logreduktion af tre bakterier (S. aureus, E. coli og P. aeruginosa) og en svamp (C. albicans) på grund af kontakt med antimikrobielle stoffer imprægneret med to bioaktive forbindelser (carvacrol og thymol separat). Den antimikrobielle effekt svækkes efter vaskede cyklusser (henholdsvis fem gange og 10 gange) for både carvacrol- og thymolbelagte stoffer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biocidernes antimikrobielle effekt testes konventionelt ved kvantitative assays, såsom minimum hæmmende koncentration (MIC) og minimum bakteriedræbende koncentration (MBC), hvor bakterierne nedsænkes i en antimikrobiel væske i 24 timer. Disse analyser er imidlertid ikke egnede til coatede stoffer, hvor væskegrænsefladen mangler, og biociderne diffunderes langsomt langs stoffibrene. Derfor er der etableret mange standardstoftest, såsom AATCC 147, ISO 20645, AATCC 100 og JIS L 1902. En sammenligningsundersøgelse af disse standarder foretaget af Pinho et al.23 erkender, at der ikke er enighed om den bedst egnede metode. Denne undersøgelse ændrede protokollen lidt for bedre at repræsentere brugen af antimikrobielle laboratoriefrakker i biosikkerhedslaboratorier. De anvendte testmikroorganismer var de arter, der hyppigt blev påvist fra laboratoriebelægningerne i BSL-2-laboratorier, baseret på en tidligere undersøgelse (ikke offentliggjort). De repræsenterer også en bred vifte af patogene mikrober, der almindeligvis anvendes i farmaceutiske tests, for eksempel et gram-positivt humant patogen (S. aureus), en gram-negativ indikatorart (E. coli), en meget resistent art (P. aeruginosa) og en dermal patogen svamp (C. albicans).

Den samlede antimikrobielle effekt, der blev observeret i dette studie (99,99 %), var højere end den effekt, der blev rapporteret i lignende studier 7,9,23,24, som varierede fra 80 % til 99 %. Den måde, hvorpå eksperimenterne blev udført i de andre undersøgelser (ifølge AATCC 100)19, giver imidlertid en begrænsning for at forfine effektiviteten, især når effektiviteten er 100%. Den modificerede protokol med en serie på fem plader (figur 5), der anvendes i denne undersøgelse, gør det muligt at beregne logreduktionen med større nøjagtighed. Efter podning af stofprøverne blev inkubationen udført ved R/T i 30 minutter sammenlignet med standard O/N-inkubation ved 37 °C. Ændringen repræsenterer bedre den typiske brug af laboratoriebelægningen ved R / T og eventuelle utilsigtede mikrobielle spild, der skal neutraliseres inden for kort tid (20-30 min) for at betragte den antimikrobielle laboratoriebelægning som effektiv. Vaskeholdbarhedstestene viser, at den antimikrobielle effekt (>90%) forblev efter 10 vaskecyklusser. Den antimikrobielle tilbageholdelse af stoffet er lidt lavere sammenlignet med nogle undersøgelser7,9, som producerede effektivitet op til 20-30 cyklusser. Imidlertid vaskes beskyttelsesbeklædning såsom laboratoriefrakker, i modsætning til almindeligt tøj, sjældent2,3, og derfor ville 10 vaskecyklusser være tilstrækkelige.

Udvælgelsen af bioaktive forbindelser er altafgørende, da forbindelsen skal være sikker for brugeren. Som sådan er mange giftige kemikalier og irriterende stoffer ikke kompatible. EO'er fra en række urteprodukter blev ekstraheret og screenet for deres egnethed som en ideel kandidat til nano-urteindkapsling i betragtning af effektiviteten mod de fire patogener, pletter produceret på stoffet og et acceptabelt lugtniveau. For eksempel viste granatæbleskalekstrakt signifikante virkninger mod patogenerne, men pletten var ikke acceptabel for en hvid frakke. Imidlertid viste carvacrol og thymol sig at være effektive med et acceptabelt niveau lugt i tekstilfinish. Indkapslingseffekten var optimal, når vægtforholdet mellem chitosan og carvacrol (eller thymol) var 1:1,25, hvilket var i overensstemmelse med tidligere forskningsresultater10,16. Indkapslingen af EO'erne lettes ved tværbinding af polykationiske grupper (NH3+) af chitosanmolekyler og polyanioniske grupper (P3O10, 5-) afTPP-molekyler. Tværbindings-TPP'en stabiliserer NP'erne, men for meget tværbinding kan resultere i klumpede partikler. Indkapslingseffektiviteten (EE) afhænger af mange faktorer, såsom vægtforholdet mellem polymer og EO'er, dispenseringshastigheden for EO'erne og temperaturen. Nogle flygtige bioaktive forbindelser kan indkapsles effektivt under et koldtvandsbad med is10. En nem måde at teste EE på er at teste supernatanten som vist i figur 1A. Hvis supernatanten er stærkt antimikrobiel på grund af de ubundne EO'er, vil EE være lav. Alle ingredienser, der anvendes i processen, er fødevaregodkendte materialer og sikre for brugeren og miljøet. Der findes kun få undersøgelser af urtebaserede NP-belagte stoffer, der bruger EO'er og chitosan eller naturlige polymerer. Denne undersøgelse har især fokuseret på udvikling og test af antimikrobielt stof til laboratoriefrakker og foreslår en effektiv løsning til at reducere mikrobiel kontaminering i biosikkerhedslaboratorier. Yderligere undersøgelser anbefales for at verificere effektiviteten af det antimikrobielle stof i det virkelige liv ved at prøve regelmæssige versus antimikrobielle laboratoriefrakker efter langvarig brug i biohazard laboratorier eller sundhedsfaciliteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev finansieret af "Applied Research, Innovation and Entrepreneurship Services" (ARIES), Centennial College, Canada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Millipore Sigma 64-19-7
Antibiotic base agar BD Difco DF0270-17-4 Also known as Antibiotic Medium 2
Antibiotic seed agar BD Difco DF0263-17-3 Also known as Antibiotic Medium 1
Blood Agar (Nutrient Agar with 5% Sheep Blood) Donated by CFIA
Bromcresol Purple Lactose Agar Donated by CFIA
Candida albicans ATCC The Global Bioresource Center ATTC 10231
Carvacrol Millipore Sigma 282197 (CAS# 499-75-2)
Centrifuge  Allergra X-22R Centrifuge Beckman Coulter Model # X-22R Refrigerated. Wait at least 20 min or until the temperature reach the set low value (e.g., 4 °C) as the refrigeration takes time.
Chitosan Medium Molecular Weight (CS) Millipore Sigma 448877 (CAS # 9012-76-4)
Clamshell Heat Press Intiva IM1200
Escherichia coli (E. coli) ATCC The Global Bioresource Center ATTC 23725
Incubator Thermo Scientific 1205M34
Letheen Broth BD Difco DF0681-17-7 Used to neutralize antimicrobial effects. Product from different manufacturers may require to add Polysorbate 80, which is already added in Difco product.
Milli Q water Millipore Sigma ZR0Q16WW Deionized water
Mueller-Hinton Agar BD Difco DF0252-17-6
Pentasodium tripolyphosphate (TPP) Millipore Sigma 238503 (CAS# 7758-29-4)
Phospahte Buffered Saline (PBS) Thermo Scientific AM9624
Pseudomonas aeruginosa ATCC The Global Bioresource Center ATTC 9027
Sabouraud Dextrose Agar BD Difco DF0109-17-1
Shaking incubator/ Thermo shaker VWR Model# SHKA2000
Staphylococcus aureus ATCC The Global Bioresource Center ATTC 6538
Thymol Millipore Sigma T0501 (CAS# 89-83-8)
Trypticase Soy Agar BD Difco 236950
Trypticase Soy Broth BD Difco 215235
Tween 80 Millipore Sigma STS0204 (CAS # 9005-65-6)
UV-Vis Spectrophometer Thermo Scientific GENESYS 30 (840-277000)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt-Emrich, S., et al. Rapid assay to assess bacterial adhesion on textiles. Materials. 9 (4), 249 (2016).
  2. Qaday, J., et al. Bacterial contamination of medical doctors and students white coats at Kilimanjaro Christian Medical Centre, Moshi, Tanzania. International Journal of Bacteriology. 2015, 507890 (2015).
  3. Treakle, A. M., et al. Bacterial contamination of health care workers' white coats. American Journal of Infection Control. 37 (2), 101-105 (2009).
  4. Wong, D., Nye, K., Hollis, P. Microbial flora on doctors' white coats. BMJ. 303 (6817), 1602-1604 (1991).
  5. Gouveia, I. C. Nanobiotechnology: A new strategy to develop non-toxic antimicrobial textiles for healthcare applications. Journal of Biotechnology. (150), 349 (2010).
  6. Joshi, M., Ali, S. W., Purwar, R., Rajendran, S. Ecofriendly antimicrobial finishing of textiles using bioactive agents based on natural products. Indian Journal of Fibre and Textile Research. 34, 295-304 (2009).
  7. Ahmed, H. A., Rajendran, R., Balakumar, C. Nanoherbal coating of cotton fabric to enhance antimicrobial durability. Elixir Applied Chemistry. 45, 7840-7843 (2012).
  8. Morais, D. S., Guedes, R. M., Lopes, M. A. Antimicrobial approaches for textiles: From research to market. Materials. 9 (6), 498 (2016).
  9. Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Development of advanced textile finishes using nano-emulsions from herbal extracts for organic cotton fabrics. Coatings. 11 (8), 939 (2021).
  10. Martínez-Hernández, G. B., Amodio, M. L., Colelli, G. Carvacrol-loaded chitosan nanoparticles maintain quality of fresh-cut carrots. Innovative Food Science & Emerging Technologies. 41, 56-63 (2017).
  11. Zhang, H. L., Wu, S. H., Tao, Y., Zang, L. Q., Su, Z. Q. Preparation and characterization of water-soluble chitosan nanoparticles as protein delivery system. Journal of Nanomaterials. 2010, 1-5 (2010).
  12. Patel, R., Gajra, B., Parikh, R. H., Patel, G. Ganciclovir loaded chitosan nanoparticles: preparation and characterization. Journal of Nanomedicine & Nanotechnology. 7 (6), 1-8 (2016).
  13. Merodio, M., Arnedo, A., Renedo, M. J., Irache, J. M. Ganciclovir-loaded albumin nanoparticles: characterization and in vitro release properties. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 251-259 (2001).
  14. Hsieh, W. C., Chang, C. P., Gao, Y. L. Controlled release properties of Chitosan encapsulated volatile Citronella Oil microcapsules by thermal treatments. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 53 (2), 209-214 (2006).
  15. Yoksan, R., Jirawutthiwongchai, J., Arpo, K. Encapsulation of ascorbyl palmitate in chitosan nanoparticles by oil-in-water emulsion and ionic gelation processes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 76 (1), 292-297 (2010).
  16. Keawchaoon, L., Yoksan, R. Preparation, characterization and in vitro release study of carvacrol-loaded chitosan nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 84 (1), 163-171 (2011).
  17. Cazedey, E. C. L., Salgado, H. R. N. Development and validation of a microbiological agar assay for determination of orbifloxacin in pharmaceutical preparations. Pharmaceutics. 3 (3), 572-581 (2011).
  18. Jayapriya, S., Bagyalakshmi, G. Textile antimicrobial testing and standards. International Journal of Textile and Fashion Technology. 4 (1), 2250-2378 (2013).
  19. AATCC 100. Antibacterial Finishes on Textile Materials: Assessment of Developed from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 100. , (2004).
  20. AATCC 147. Antimicrobial Activity Assessment of Textile Materials: Parallel Streak Method from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 147. , (2004).
  21. Ortelli, S., Costa, A. L., Dondi, M. TiO2 nanosols applied directly on textiles using different purification treatments. Materials. 8 (11), 7988-7996 (2015).
  22. Poole, K. Pseudomonas aeruginosa: resistance to the max. Frontiers in Microbiology. 2, 65 (2011).
  23. Pinho, E., Magalhães, L., Henriques, M., Oliveira, R. Antimicrobial activity assessment of textiles: standard methods comparison. Annals of Microbiology. 61 (3), 493-498 (2010).
  24. Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Novel antimicrobial finishing of organic cotton fabrics using nano-emulsions derived from Karanja and Gokhru plants. Textile Research Journal. 92 (23-24), 5015-5032 (2022).

Tags

Biologi nr. 194
Et antimikrobielt stof ved hjælp af nano-urteindkapsling af æteriske olier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Subair, S., Singh, N., Maru, M.,… More

Subair, S., Singh, N., Maru, M., Prakash, S., Hasanar, M. An Antimicrobial Fabric Using Nano-Herbal Encapsulation of Essential Oils. J. Vis. Exp. (194), e65187, doi:10.3791/65187 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter