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Biology

Um tecido antimicrobiano usando encapsulação nano-herbal de óleos essenciais

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/65187
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1School of Engineering Technology and Applied Sciences (SETAS), Centennial College

Summary

Os jalecos antimicrobianos previnem a contaminação cruzada do acúmulo de patógenos e os derramamentos acidentais de bionutrientes. Aqui, descrevemos o protocolo para o desenvolvimento de um tecido antimicrobiano amigável à pele usando encapsulamento nano-herbal e testes padrão modificados para avaliar precisamente a eficácia e adequação para o uso típico do jaleco.

Abstract

Os jalecos são amplamente utilizados em laboratórios de risco biológico e instalações de saúde como roupas de proteção para evitar a exposição direta a patógenos, derramamentos e queimaduras. Estes casacos protetores à base de algodão fornecem condições ideais para o crescimento microbiano e locais de fixação devido à sua natureza porosa, capacidade de retenção de umidade e retenção de calor do corpo do usuário. Diversos estudos têm demonstrado a sobrevivência de bactérias patogênicas em vestimentas hospitalares e jalecos, atuando como vetores de transmissão microbiana.

Uma abordagem comum para corrigir esses problemas é a aplicação de agentes antimicrobianos no acabamento têxtil, mas preocupações têm sido levantadas devido à toxicidade e aos efeitos ambientais de muitos produtos químicos sintéticos. A pandemia em curso também abriu uma janela para a investigação de antimicrobianos eficazes e formulações ecológicas e livres de tóxicos. Este estudo utiliza dois compostos bioativos naturais, carvacrol e timol, encapsulados em nanopartículas de quitosana, que garantem proteção efetiva contra quatro patógenos humanos com redução de até 4 log (99,99%). Esses patógenos são frequentemente detectados em jalecos usados em laboratórios de risco biológico.

Os tecidos tratados também resistiram a até 10 ciclos de lavagem com 90% de redução microbiana, o que é suficiente para o uso pretendido. Fizemos modificações nos testes de tecido padrão existentes para representar melhor os cenários típicos de uso de jaleco de laboratório. Esses refinamentos permitem uma avaliação mais precisa da eficácia dos jalecos antimicrobianos e a simulação do destino de eventuais vazamentos microbianos acidentais que devam ser neutralizados em um curto espaço de tempo. Mais estudos são recomendados para investigar o acúmulo de patógenos ao longo do tempo em jalecos antimicrobianos em comparação com jalecos protetores comuns.

Introduction

O jaleco branco de proteção é um item obrigatório de equipamento de proteção individual (EPIs) em laboratórios de microbiologia e unidades de saúde, e protege da exposição direta a patógenos, derramamentos e queimaduras. Estes casacos de algodão promovem o crescimento microbiano devido a muitos fatores - o tecido fornece locais de fixação e aeração, algodão e amido usados no processo de fabricação, juntamente com células epiteliais esfoliadas do usuário fornecem nutrientes, e a proximidade com o usuário dá calor e umidade. O acúmulo de micróbios nos têxteis também pode causar problemas de saúde, como alergias e infecções nosocomiais, odores desagradáveis e deterioração do tecido1.

Ao contrário das roupas comuns, os jalecos protetores são pouco lavados ou desinfetados, como encontrado em muitos inquéritos 2,3. Muitos estudos mostram evidências de que o jaleco atua como vetor de transmissão microbiana e o risco de infecções hospitalares no ambiente de assistência à saúde2,4, particularmente cepas resistentes3 como Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA); assim, levantam preocupações sanitárias com os EPIs, que se destinam a proteger da contaminação microbiana. Não há estudos transversais suficientes sobre infecções associadas ao jaleco no contexto de instalações de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2) ou laboratórios de ensino de microbiologia, mas muitas autoridades regulatórias restringem o uso de jalecos dentro do nível de contenção. No entanto, muitas instituições acadêmicas na América do Norte lutam para atender aos requisitos devido a restrições práticas, como lavagem e armazenamento dentro das instalações, os incidentes de uso de jalecos em áreas públicas, como lanchonetes e bibliotecas, são comuns. Uma solução prática para essas questões é a aplicação de antimicrobianos no acabamento têxtil.

Os tecidos antimicrobianos estão ganhando cada vez mais popularidade em roupas esportivas, roupas ativas e meias, principalmente destinadas a reduzir o odor corporal. No entanto, o uso desses tecidos não é comum no desenvolvimento de EPIs, exceto para algumas máscaras de algodão revestidas de prata e roupas de saúde5. Relatamos o desenvolvimento de um tecido antimicrobiano para jalecos, que inibe patógenos comuns encontrados em laboratórios BSL-2 e fornece proteção eficaz contra a contaminação cruzada de patógenos comuns.

Atualmente, uma variedade de tecidos e acabamentos antimicrobianos está disponível no mercado, mas a maioria deles utiliza partículas coloidais de metais pesados (por exemplo, prata, cobre, zinco), organometálicos ou produtos químicos sintéticos, como triclosan e compostos de amônio quaternário, que não são ecologicamente corretos1 e podem levar a problemas de saúde, como irritação da pele e alergias6. Algumas formulações sintéticas apresentam preocupações devido a micróbios não alvo, como flora normal ou indução de resistência antimicrobiana (RAM). A Food and Drug Administration (FDA) dos EUA regulamenta os tecidos antimicrobianos comerciais, que devem ser atóxicos para o usuário e livres de ecotoxicidade. Portanto, tecidos antimicrobianos à base de biocidas naturais que inibem um amplo espectro de micróbios são preferíveis. Os óleos essenciais (OEs) são amplamente utilizados como agentes antimicrobianos e terapêuticos, mas seu uso no acabamento antimicrobiano é limitado devido à sua durabilidade 6,7,8. Com base em nosso conhecimento e pesquisa de mercado sobre acabamento nano-herbal8, nenhum tecido antimicrobiano à base de ervas está comercialmente disponível. Isso porque os revestimentos sintéticos são fáceis de fabricar e possuem longa durabilidade. Alguns tecidos nano-revestidos com ervas relatados apenas para fins de pesquisa incluem nim7, moringa 9 e folhas de curry9.

O presente estudo utiliza dois componentes bioativos extraídos dos OEs orégano, o carvacrol e o timol, que são eficazes contra uma ampla gama de patógenos bacterianos e vírus, mas geralmente reconhecidos como seguros para humanos10. No entanto, esses componentes bioativos são voláteis e, portanto, seu potencial antimicrobiano é de curta duração se aplicado diretamente no tecido. O encapsulamento nano-herbal é um processo no qual componentes bioativos ou fármacos são carregados dentro de uma casca polimérica que protege o núcleo da degradação ambiental e, assim, aumenta a vida útil. Além disso, o pequeno tamanho das partículas poliméricas, que geralmente variam de 10 nm a 100 nm, aumenta a eficácia da aplicação e retarda a liberação dos compostos bioativos no tecido. Esses compostos bioativos são utilizados para diversos fins, como conservação de alimentos10, mas não para revestimento têxtil.

Dentre os muitos encapsulantes poliméricos, a quitosana é uma candidata atraente devido a muitos de seus atributos, como não toxicidade, biodegradabilidade, mucoadesividade e biocompatibilidade11. É um polissacarídeo natural, obtido pelo processo de desacetilação da quitina, que é encontrada em conchas marinhas e paredes celulares de fungos. É utilizado em aplicações bioquímicas e de conservação de alimentos, como liberação de fármacos ou proteínas 11,12,13, liberação controlada 14 e filmes antimicrobianos 10. A quitosana não é facilmente solúvel em água, mas forma uma suspensão coloidal em meios ácidos. Moléculas bioativas são carregadas em nanopartículas de quitosana (NPs) por um método simples de gelificação iônica em duas etapas14,15,16. Nesse processo, compostos bioativos hidrofóbicos, como carvacrol e timol, formam uma emulsão óleo-em-água, que é auxiliada por um surfactante, o Tween 80. Posteriormente, um composto polianiônico, tripolifosfato pentassódico (TPP), é usado para formar as ligações cruzadas entre os grupos amino ao longo das moléculas policatiônicas de polímero e grupos fosfato de moléculas de TPP para estabilizar o complexo. Este processo de complexação solidifica os compostos bioativos dentro da matriz de quitosana, que é posteriormente purificada e revestida em amostras de algodão para produzir tecido antimicrobiano.

As nanoformulações devem ser testadas primeiro quanto à eficácia antimicrobiana na forma de emulsão antes de serem aplicadas no tecido. Isso pode ser convenientemente avaliado por um método qualitativo, como a difusão em disco de Kirby-Bauer, a difusão de poços e o ensaio de placa de cilindro. No entanto, o ensaio da placa do cilindro17 fornece a flexibilidade para carregar volumes variáveis da formulação e comparar a zona de folga. Neste método, as formulações antimicrobianas são carregadas em cilindros de aço inoxidável e colocadas sobre uma camada macia de ágar, que é inoculada com o microrganismo ou patógeno teste. O diâmetro da zona de depuração produzida contra o organismo em estudo é proporcional ao potencial inibitório da formulação antimicrobiana e, por conseguinte, pode ser utilizado como alternativa aos métodos de diluição em caldo. No entanto, o tamanho das zonas claras é apenas uma medida comparativa ou qualitativa dentro de uma placa específica, a menos que padrões específicos sejam mantidos. Os antimicrobianos atuam contra os patógenos, inibindo seu crescimento (biostático) ou matando as células (biocidas), que podem ser quantificadas pela concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM), respectivamente. Entretanto, a eficácia e o comportamento dos produtos químicos bioativos são diferentes em suas formulações (estado líquido) e quando revestidos sobre um substrato como um tecido18. Isso ocorre porque múltiplos fatores desempenham um papel na eficácia, como a estabilidade da aderência dos agentes antimicrobianos ao tecido, o teor de umidade, o tipo de substrato e a aderência dos micróbios. Se o objetivo pretendido for apenas a atividade bacteriostática, um ensaio qualitativo como o "Parallel Streak Method"19 pode fornecer uma avaliação relativamente rápida e fácil da formulação de antimicrobianos difusíveis. No entanto, se os efeitos bactericidas forem determinados, pode-se empregar a "Avaliação de Acabamentos Antibacterianos em Materiais Têxteis"20 , o que proporciona a redução logarítmica do patógeno fortificado.

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Protocol

1. Preparação de nanopartículas

  1. Encapsulação nano-herbal
    1. Preparar 50 mL de ácido acético a 1% (v/v).
      CUIDADO: O ácido acético glacial é um irritante, que pode causar queimaduras graves na pele e danos nos olhos. Use um jaleco completo, luvas de nitrilo e óculos de proteção, e trabalhe sob um exaustor.
    2. Preparar solução de quitosana (1,2% p/v) dissolvendo 0,6 g de flocos de quitosana (peso molecular médio) em 50 mL de ácido acético a 1% (preparado acima). Agitar durante a noite (O/N) à temperatura ambiente (R/T) para obter uma emulsão homogénea.
    3. Adicionar 0,5 g de Tween 80 e agitar (1.000 rpm) a 60 °C durante 2 h para obter uma solução homogénea. Levar a solução a R/T antes de adicionar compostos bioativos (carvacrol ou timol).
    4. Adicionar 0,75 g de carvacrol (ou timol) gota ou gradualmente enquanto agita (1.000 rpm) a mistura durante 20 min a R/T. A relação peso da quitosana para o composto bioativo é de 1:1,25.
    5. Adicione 50 mL (0,5% p/v) de TPP dropwise à mistura enquanto agita em R/T. Continue mexendo por 30 min para obter uma emulsão homogênea.
    6. Preparar um controle negativo seguindo o mesmo procedimento, mas sem a adição de compostos bioativos.
  2. Purificação
    1. Centrifugar a emulsão a 10.000 × g por 30 min a 4 °C e coletar os NPs formados (pellet) após decantar o sobrenadante. Reserve o sobrenadante para testar a eficácia do encapsulamento.
    2. Lavar as partículas (do passo 1.2.1) utilizando Tween 80 aquoso (1% v/v) com o dobro do volume de pellets formados para remover os compostos bioactivos não ligados ou livres. Certifique-se de perturbar o pellet por vórtice até que uma solução homogênea seja formada em cada etapa de lavagem.
    3. Lavar as partículas (a partir do passo 1.2.2) com água deionizada duas vezes para se livrar das impurezas.
    4. Reconstituir os NPs ressuspendendo o pellet (a partir do passo 1.2.3) em 30 mL de água deionizada. Conservar os NPs a 4 °C por até 6 meses.
      NOTA: O experimento pode ser pausado neste estágio.
  3. Caracterização
    1. Diluir os NPs em água deionizada até que as leituras ultravioleta-visível (UV-Vis) entre 250 e 400 nm estejam dentro da faixa (absorbância >1).
    2. Registrar os espectros de absorção UV-Vis dos NPs nos comprimentos de onda que variam de 250 a 400 nm usando um espectrofotômetro UV-Vis.
    3. Armazenar uma alíquota (1 mL) de NPs em R/T por um intervalo de durações (por exemplo, 1 a 6 meses) e testar o efeito antimicrobiano pelo método da placa do cilindro juntamente com uma nova amostra.
  4. Revestimento em tecido
    1. Aplicar NPs sobre um tecido de algodão usando um método de pad-dry-cure 7,21.
      1. Mergulhe as amostras de tecido na solução contendo NPs misturadas com um aglutinante de tecido por 3 min até ficar de molho. Em seguida, passe as amostras por uma pá de laboratório de dois rolos para remover o excesso de líquido.
      2. Secar as amostras em estufa a 100 °C durante 30 min e curar a 130 °C durante 10 min.
      3. Finalmente, lave as amostras em um banho de ultrassom por 15 minutos para remover NPs não ligados.
        NOTA: Alternativamente, siga o método simplificado descrito abaixo.
    2. Corte o tecido de algodão (ou amostras de jaleco de laboratório) em quadrados de 10 cm x 10 cm.
    3. Imergir as peças cortadas em 2 mL do NP sintetizado (10%) em um recipiente plástico (12 cm x 12 cm) por 2 min a R/T. Retire o excesso de líquido por secagem ao ar.
    4. Prensar a 100 °C durante 3 minutos para ligar os NP.
    5. Retire os NPs não ligados enxaguando em Tween 80 aquoso (2% p/v) e seque no forno a 100 °C por 30 min.
      NOTA: Este tecido antimicrobiano pode ser armazenado por 2 anos em R/T.
  5. Durabilidade da lavagem
    1. Corte o tecido em amostras quadradas de 50 mm x 50 mm.
    2. Colocar as amostras em 50 ml de água morna da torneira (40 °C) num recipiente de vidro/plástico e adicionar duas gotas de detergente normal (não antimicrobiano).
    3. Enxágue em um agitador de plataforma de balanço ou agitador magnético por 30 min.
    4. Secar ao ar ou incubar a 60 °C durante 2 h e testar a eficácia antimicrobiana.

2. Ensaio em placa de cilindro para triagem de nanopartículas

  1. Preparar ágar de soja tripticase (TSA), caldo de soja tripticase (TSB), ágar base antibiótico (ABA) e ágar semente antibiótico (ASA), de acordo com as instruções do fabricante, e esterilizar o meio por autoclavagem a 121 °C a 15 psi por 15 min.
  2. Subcultivar os micróbios (do estoque) de interesse, contra os quais os testes de eficácia são realizados, em placas de TSA recém-preparadas (ou qualquer meio apropriado) pelo método de placa de raia de três vias e incubar para produzir placas de pureza. (Espécies recomendadas: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e C. albicans.)
  3. Inocular as culturas a partir de placas de pureza fresca em TSB (tubos de 10 mL) a 35 °C O/N com agitação moderada (100-200 rpm).
  4. Alíquota 5,0 mL do AAS fundido em cada um dos tubos de ensaio. O número de tubos corresponde ao número de microrganismos testados.
  5. Despeje 20 mL de ABA fundido pré-esterilizado em cada placa de Petri (100 mm x 20 mm) assepticamente para formar a camada de base. O número de placas de ágar corresponde ao número de microrganismos a serem testados. Espere até que a mídia se solidifique.
  6. Após a solidificação da camada de base, inocular cada AAS fundido com uma cultura noturna a partir da etapa 2.3 (1,0 mL, pré-aquecido a 35 °C) e transferir imediatamente o conteúdo (mistura de AAS e cultura) para a superfície de uma placa ABA. Agite a placa para distribuir uniformemente a camada de ágar fundida. Certifique-se de que a camada de semente pareça lisa e livre de solavancos ou bolhas.
  7. Colocar até seis cilindros de aço inoxidável (6 mm x 6 mm x 10 mm; pré-autoclavados), espaçados uniformemente em padrão hexagonal, por placa de ágar, utilizando uma pinça estéril (Figura 1).
  8. Carregar os cilindros com os NPs sintetizados de diferentes volumes (30 μL, 50 μL, 75 μL e 100 μL) para serem rastreados quanto aos efeitos antimicrobianos. O controle negativo é aquele sem compostos bioativos.
  9. Incubar patógenos bacterianos comuns (por exemplo, E. coli, S. aureus, P. aeruginosa) a 35 °C por 24 h e espécies fúngicas (por exemplo, C. albicans) a R/T por 3 dias.
  10. Meça o diâmetro da zona livre e compare a eficácia dos NPs sintetizados.
    NOTA: Este teste pode ser usado para pré-selecionar os melhores NPs a serem revestidos no tecido.

3. Método de raia paralela (modificado da AATCC 147)

  1. Preparação do material
    1. Corte o tecido tratado com NP em amostras de 50 mm x 25 mm.
    2. Preparar ágar Mueller-Hinton (MHA), TSA e TSB, de acordo com as instruções do fabricante, e esterilizar o meio por autoclavagem a 121 °C a 15 psi por 15 min.
    3. Subcultivar os micróbios (de stock) de interesse, contra os quais são realizados os testes de eficácia, em placas de TSA recém-preparadas (ou qualquer meio apropriado) pelo método de três vias de placa de raia e incubar a 35 °C durante 2 dias para corantes bacterianas e a R/T durante 5 dias para estirpes fúngicas para produzir placas de pureza. (Espécies recomendadas: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e C. albicans.)
  2. Spiking de culturas microbianas
    1. Inocular as culturas a partir de placas de pureza fresca em TSB (tubos de 10 mL) a 35 °C O/N com agitação moderada (100-200 rpm).
    2. Diluir as culturas de O/N para 1,5 × 108 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL ou correspondendo à turbidez do padrão de 0,5 McFarland (geralmente uma diluição de 1/10 a 1/20 para a maioria das culturas saudáveis).
    3. Inocular a cultura diluída acima usando uma alça estéril de 4 mm da seguinte forma. Coloque uma alça de cultura em caldo e transfira-a para a superfície da placa de ágar MHA fazendo cinco estrias paralelas, cada uma com 6 cm de comprimento e 1 cm de distância, conforme Figura 2. Não recarregue o loop.
    4. Pressione suavemente a amostra de tecido usando uma espátula estéril nas cinco estrias para que o tecido fique no centro e toque todas as cinco linhas de estria. Incubar a 35 °C durante 24 h.
  3. Avaliação qualitativa da eficácia antimicrobiana
    1. Examine a placa incubada para a interrupção do crescimento ao longo das estrias além das bordas do tecido (zona clara indica inibição do crescimento).
    2. Calcule a largura média de uma zona de inibição ao longo da linha de raia (W) em cada lado da amostra de tecido usando a equação (1).
      W = (T - D)/2 (1)
      W = largura da zona livre; T = comprimento total da zona livre, incluindo a largura da amostra; D = largura da amostra de tecido (25 mm).

4. Método quantitativo de redução logarítmica (modificado da AATCC 100)

  1. Preparo experimental
    1. Corte o tecido em amostras quadradas de 50 mm x 50 mm.
    2. Preparar TSA, TSB, caldo Letheen e solução salina tamponada com fosfato (PBS), de acordo com as instruções do fabricante, e esterilizar o meio por autoclavagem.
    3. Preparar culturas O/N de micróbios de interesse, contra as quais são realizados os testes de eficácia, inoculando colônias isoladas de placas de pureza em TSB estéril e incubando a 35 °C por 18-24 h. (Espécies recomendadas: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e C. albicans.)
  2. Spiking de culturas microbianas
    1. Diluir as culturas de O/N para 1,5 × 108 UFC/mL ou correspondendo à turbidez do padrão de 0,5 McFarland (geralmente uma diluição de 1/10 a 1/20 para a maioria das culturas saudáveis).
    2. Determine o volume adequado de culturas para picar medindo a capacidade de retenção de líquidos do tecido da seguinte forma.
      1. Adicione uma série de volumes da cultura de caldo diluído (por exemplo, 100-500 μL) em amostras de tecido (em placas de Petri separadas) e escolha o volume de tal forma que a amostra de tecido absorva totalmente a água e não deixe líquido residual/livre. A capacidade de retenção de líquidos difere do tipo e da espessura do tecido. Para jalecos de algodão comuns, é de aproximadamente 200 μL.
      2. Aumentar o volume (capacidade de retenção de líquido determinada acima [por exemplo, 200 μL]) de cada cultura nas amostras colocadas em placas de Petri estéreis. O número de amostras corresponde ao número de testes (por exemplo, tecido testado imediatamente e após a lavagem [e os ciclos de lavagem testados]) e aos efeitos antimicrobianos testados ao longo do tempo de contato (após um determinado tempo/dia [por exemplo, 30 min, 2 h, Dia 1-3]).
        OBS: Utilizar uma micropipeta com pontas de filtro de aerossol (para evitar contaminação da pipeta em usos subsequentes) para inocular as culturas nas amostras com distribuição uniforme.
      3. Para o controle negativo, use o mesmo tipo de amostras de tecido não tratadas. Realizar o controle negativo para cada espécie microbiana de teste correspondente, período de contato, diferentes tecidos e ciclos de lavagem.
  3. Recuperação de micróbios por contagem de placas viáveis
    1. Permitir que as amostras inoculadas (tratadas e não tratadas) sequem ao ar no interior das placas de Petri (tampas entreabertas) em R/T durante o(s) período(s) de contacto requerido(s) a testar (por exemplo, 0 min, 30 min, 60 min, etc., ou mesmo dias para efeitos a longo prazo). Sempre inclua um "0 min" para representar um efeito imediato e eficácia neutralizante.
    2. Transfira as amostras assepticamente para separar os tubos centrífugos estéreis (50 mL) e rosqueie bem as tampas.
    3. Adicionar caldo de Letheen (quaisquer tampões neutralizantes relevantes) para fazer uma diluição de 1/100 (por exemplo, 19,8 mL para um inóculo de 200 μL).
    4. Feche os tubos da centrífuga com tampas de rosca firmemente e vórtice por 1 min em velocidade média.
    5. Diluir a suspensão com o PBS estéril em diluições subsequentes de 1/10, de modo que a contagem de colônias do grupo "não tratado" se torne muito baixa para contar (TLTC).
    6. Plaquear as diluições (0,1 mL) em placas de meios apropriados, que suportam o crescimento do microrganismo (por exemplo, TSA para bactérias ou ágar Sabouraud dextrose [SDA] para fungos) ou qualquer meio que otimize o crescimento e forneça bom contraste para tornar a contagem de colônias precisa.
    7. Incubar as placas bacterianas a 35 °C durante 2 dias e as placas fúngicas a R/T durante 5 dias.
    8. Conte as CFUs viáveis diretamente usando um contador de colônias ou usando software de imagem (por exemplo, CFU AI).
    9. Calcular a redução de log microbiano (R) devido ao tecido antimicrobiano usando a equação (2):
      R = Equation 1 × 100 (2)
      A = valor logarítmico do número de CFU recuperadas de tecido não tratado; B = valor logarítmico do número de UFC recuperadas do tecido tratado.

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Representative Results

Triagem inicial dos NPs sintetizados
Seguindo a técnica de emulsão óleo-em-água em duas etapas16, os compostos bioativos (carvacrol e timol) foram encapsulados com sucesso em quitosana. Isso foi confirmado por espectrofotometria UV-Vis para o pico de absorção dos respectivos compostos bioativos em comparação com os controles, que foram os NPs de quitosana sem quaisquer compostos bioativos. Os NPs constituídos foram homogêneos e estáveis ao longo de 12 meses a 4 °C. A triagem inicial da eficácia antimicrobiana foi verificada pelo método cilindro em placa (Figura 1). Trata-se de um método qualitativo, uma vez que a zona de depuração é influenciada por múltiplos fatores, tais como a espessura do ágar, a resistência do inóculo e a concentração das amostras de teste. Muitos métodos mais simples, como o método de difusão em disco de Kirby-Bauer e o método de difusão de poços, podem ser empregados para este fim, mas o método da placa de cilindro oferece a oportunidade de variar as concentrações (Figura 1A) diluindo os NPs, e cada cilindro pode conter o volume da amostra de teste até 200 μL. Além disso, a cobertura de ágar com culturas forma um inóculo liso, permitindo a determinação das zonas claras com melhor precisão17. Os resultados demonstraram que as zonas claras são proporcionais às concentrações progressivamente crescentes (Figura 1A). Isso adiciona validade aos dados e os diferencia de quaisquer artefatos ou zonas anormais. Com base no tamanho das zonas claras (geralmente acima de 20 mm), a concentração correta de NPs pode ser selecionada para revestimento. Quaisquer NPs previamente caracterizados ou antigos, que foram armazenados adequadamente (4 °C), também podem ser verificados pelas grandes zonas (Figura 1B,C) antes do revestimento no tecido.

Triagem qualitativa das amostras de tecido tratadas
Apesar da eficácia antimicrobiana dos NPs encapsulados confirmada por grandes zonas claras, os tecidos revestidos com NP devem ser testados. Isso ocorre porque os agentes antimicrobianos podem funcionar de forma diferente quando aplicados no tecido em comparação com suas formulações originais. Muitos fatores, como as propriedades do tecido (espessura, hidrofobicidade), eficácia do revestimento e degradação de compostos bioativos durante o revestimento, influenciam a eficácia20. Para tanto, o método de raias paralelas foi utilizado para avaliar qualitativamente os efeitos antimicrobianos dos tecidos tratados. Os controles negativos (tecidos não tratados) não demonstraram efeitos antimicrobianos pelo crescimento microbiano ininterrupto ao longo das cinco linhas de estria (Figura 3 A,B). O tecido tratado apresentou interrupção do crescimento microbiano ao longo das linhas de estria (Figura 3 C,D), devido aos compostos bioativos difusos do tecido. No entanto, a largura média das zonas claras foi baixa (<5 mm), uma vez que as amostras de ensaio foram submetidas a 10 ciclos de lavagem antes do ensaio. À medida que as concentrações de inóculo diminuem ao longo dos bifes paralelos da primeira à quinta estria (Figura 2), as zonas claras são proeminentes nas estrias subsequentes. Se a primeira faixa (alto inóculo) mostra uma zona clara, o potencial antimicrobiano do tecido é geralmente alto. Algumas irregularidades, como a quinta linha da Figura 3D, podem ocorrer devido à natureza qualitativa do teste. A zona clara (crescimento interrompido) devido à atividade bacteriostática fornece uma indicação do potencial antimicrobiano, mas não fornece uma diretriz adequadamente sensível18, que é calculada pelo "teste de redução logarítmica". No entanto, o método de estrias paralelas é útil para um procedimento relativamente rápido e de fácil execução para triagem de um grande número de amostras 6,7,20, particularmente quando se testa um teste de durabilidade de lavagem ao longo de muitos ciclos.

Análise quantitativa das amostras de tecido tratadas
O teste de redução logarítmica (também conhecido como teste de redução percentual) demonstrou redução significativa (<0,001) das culturas microbianas ao contato com o tecido tratado por 30 min (Figura 4 e Figura 5). As amostras de tecido antimicrobiano foram significativamente eficazes (>99%) contra uma bactéria Gram-positiva (S. aureus), bactérias Gram-negativas (E. coli e P. aeruginosa) e uma espécie fúngica da pele (C. albicans). Como o tecido não tratado (controle negativo) não tinha atividade antimicrobiana, as UFCs recuperadas eram muito numerosas para serem contadas até serem diluídas até a extinção, até 106 diluições (Figura 4). O número de UFCs recuperadas dos tecidos tratados no tempo de contato "0" (plaqueadas imediatamente após a inoculação e neutralização) foi muito semelhante ao do tecido não tratado, e os dados foram omitidos por simplicidade. O neutralizador utilizado (caldo de Letheen) é eficaz na neutralização dos efeitos de derivados fenólicos como carvacrol e timol. Em comparação com as NPs de carvacrol, as NPs de timol mostraram efeitos antimicrobianos ligeiramente maiores contra todos os quatro micróbios (Figura 5). Tanto o tecido revestido com timol quanto o tecido revestido com carvacrol trabalharam igualmente eficazmente contra três micróbios (S. aureus, E. coli e C. albicans) com redução de mais de 4 log (99,99%), exceto P. aeruginosa, que variou de 2,8 a 3,2 log de redução (99,9). Isso era esperado, uma vez que P. aeruginosa é intrinsecamente resistente a uma variedade de antimicrobianos22. O teste de durabilidade de lavagem demonstrou que o tecido tratado foi capaz de apresentar resistência antimicrobiana efetiva (>99%) contra três espécies (S. aureus, E. coli e C. albicans) e moderada resistência contra P. aeruginosa após 10 ciclos de lavagem.

Figure 1
Figura 1: Ensaio em placa cilíndrica de nanopartículas sintetizadas com uma faixa de concentrações testadas contra bactérias . (A) NPs de timol diluídos em série para uma triagem inicial contra E. coli mostrando a colocação de cilindros e zonas claras após 18 h de incubação. O aumento progressivo das concentrações "o" a "r" resultou em zonas proporcionalmente mais altas. A zona clara produzida pela maior concentração é indicada por um círculo vermelho. O controle negativo (NPs de quitosana sem os compostos bioativos) é representado por "t" e o sobrenadante extraído durante a purificação é representado por "s". (B) Duas das três concentrações de NPs de carvacrol (12 meses de idade, armazenadas a 4 °C) foram selecionadas para o tratamento do tecido mostrando zonas efetivas (>20 mm) contra S. aureus. (C) Três concentrações de NPs de timol (12 meses de idade, armazenadas a 4 °C) triadas para o tratamento do tecido mostrando zonas efetivas contra S. aureus. Abreviação: NP = nanopartícula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Layout do método de raias paralelas. Colocação de uma amostra de tecido em ágar Mueller-Hinton inoculada com cinco faixas paralelas subsequentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Resultados do método de estrias paralelas mostrando zonas claras para as amostras de tecido tratadas. As amostras foram colocadas no topo do inóculo (fileira inferior) em comparação com as não tratadas (fileira superior). (A) Tecido não tratado contra S. aureus, (B) tecido não tratado contra C. albicans, (C) tecido revestido com timol NP (após 10 ciclos de lavagem) contra S. aureus, e (D) tecido revestido com timol NP (após 10 ciclos de lavagem) contra C. albicans. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados da redução logarítmica do tecido antimicrobiano revestido com nanopartículas de quitosana encapsuladas com timol testadas em quatro patógenos. As placas de ágar lactose no painel B foram doadas pela Agência Canadense de Inspeção de Alimentos, que incluem seus rótulos na parte de trás e parecem amostras. Outras placas de ágar foram preparadas em laboratório, sem rótulos. Amostras de tecido não foram colocadas sobre as placas de ágar, como no experimento mostrado na Figura 3. Em vez disso, os micróbios foram recuperados das amostras (após vórtice em PBS) e plaqueados. (A) S. aureus em ágar sangue, (B) E. coli em ágar lactose roxa, (C) P. aeruginosa em ágar cetrimida, (D) C. albicans em SDA. Os patógenos foram fortificados em amostras "não tratadas" (fileira superior) e "tratadas" (fileira inferior) por 30 min e recuperadas em neutralização e diluição. As razões de diluição são mostradas entre as séries tratadas e não tratadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Redução logarítmica de três bactérias (S. aureus, E. coli e P. aeruginosa) e um fungo (C. albicans) devido ao contato de tecidos antimicrobianos impregnados com dois compostos bioativos (carvacrol e timol separadamente). A eficácia antimicrobiana é enfraquecida após ciclos lavados (cinco vezes e 10 vezes, respectivamente) para tecidos revestidos com carvacrol e timol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A eficácia antimicrobiana dos biocidas é convencionalmente testada por ensaios quantitativos, como concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM), nos quais as bactérias são imersas em um líquido antimicrobiano por 24 horas. No entanto, esses ensaios não são adequados para tecidos revestidos, onde a interface líquida é insuficiente e os biocidas são difundidos lentamente ao longo das fibras do tecido. Portanto, muitos testes de tecido padrão foram estabelecidos, como AATCC 147, ISO 20645, AATCC 100 e JIS L 1902. Estudo comparativo desses padrões realizado por Pinho et al.23 reconhece que não há consenso sobre o método mais adequado a ser utilizado. Este estudo modificou um pouco o protocolo para melhor representar o uso de jalecos antimicrobianos em laboratórios de biossegurança. Os microrganismos testes utilizados foram as espécies detectadas com frequência nos jalecos dos laboratórios BSL-2, com base em estudo prévio (não publicado). Eles também representam uma grande variedade de micróbios patogênicos que são comumente usados em testes farmacêuticos, por exemplo, um patógeno humano Gram-positivo (S. aureus), uma espécie indicadora Gram-negativa (E. coli), uma espécie altamente resistente (P. aeruginosa) e um fungo patogênico dérmico (C. albicans).

A eficácia antimicrobiana global observada neste estudo (99,99%) foi superior à relatada em estudos semelhantes 7,9,23,24, que variou de 80% a 99%. No entanto, a forma como os experimentos foram realizados nos demais estudos (de acordo com a AATCC 100)19 fornece uma restrição para refinar a eficácia, particularmente quando a eficácia é de 100%. O protocolo modificado com uma série de cinco placas (Figura 5) utilizado neste estudo permite calcular a redução logarítmica com maior precisão. Após a inoculação das amostras de tecido, a incubação foi realizada em R/T por 30 min, comparada ao padrão de incubação O/N a 37 °C. A modificação representa melhor o uso típico do jaleco em R/T e quaisquer derramamentos microbianos acidentais que devem ser neutralizados em um curto espaço de tempo (20-30 min) para considerar o jaleco de laboratório antimicrobiano eficaz. Os testes de durabilidade da lavagem mostram que a eficácia antimicrobiana (>90%) permaneceu após 10 ciclos de lavagem. A retenção antimicrobiana do tecido é um pouco menor em comparação com alguns estudos7,9, que produziram eficácias de até 20-30 ciclos. No entanto, vestimentas de proteção, como jalecos, ao contrário das roupas comuns, são raramente lavadas2,3 e, portanto, 10 ciclos de lavagem seriam adequados.

A seleção de compostos bioativos é fundamental, pois o composto deve ser seguro para o usuário. Como tal, muitos produtos químicos tóxicos e irritantes não são compatíveis. EOs de uma variedade de produtos fitoterápicos foram extraídos e selecionados quanto à sua adequação como um candidato ideal para encapsulamento nano-fitoterápico, considerando a eficácia contra os quatro patógenos, manchas produzidas no tecido e um nível aceitável de odor. Por exemplo, o extrato de casca de romã mostrou efeitos significativos contra os patógenos, mas a coloração não foi aceitável para uma pelagem branca. No entanto, carvacrol e timol mostraram-se eficazes com um odor aceitável no acabamento têxtil. A eficácia do encapsulamento foi ótima quando a relação peso/quitosana (ou timol) foi de 1:1,25, o que foi consistente com achados de pesquisas anteriores10,16. O encapsulamento dos OEs é facilitado pela reticulação de grupos policatiônicos (NH3+) de moléculas de quitosana e grupos polianiônicos (P3O105-) de moléculas de TPP. O reticulador TPP estabiliza os NPs, mas muito reticulante pode resultar em partículas aglomeradas. A eficácia da encapsulação (EE) é dependente de muitos fatores, tais como a relação peso do polímero para OEs, a taxa de dispensação dos EOs e a temperatura. Alguns compostos bioativos voláteis podem ser encapsulados efetivamente sob banho de água fria com gelo10. Uma maneira fácil de testar o EE é testar o sobrenadante, como mostrado na Figura 1A. Se o sobrenadante for altamente antimicrobiano devido aos EOs não ligados, o EE será baixo. Todos os ingredientes utilizados no processo são materiais de grau alimentício e seguros para o usuário e o meio ambiente. Existem poucos estudos sobre tecidos revestidos com NP à base de ervas que usam EOs e quitosana ou polímeros naturais. Este estudo concentrou-se particularmente no desenvolvimento e teste de tecido antimicrobiano para jalecos e sugere uma solução eficaz para reduzir a contaminação microbiana em laboratórios de biossegurança. Mais estudos são recomendados para verificar a eficácia do tecido antimicrobiano na vida real, por meio de amostragem de jalecos regulares versus antimicrobianos após uso prolongado em laboratórios de risco biológico ou instalações de saúde.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

O presente estudo foi financiado por "Applied Research, Innovation and Entrepreneurship Services" (ARIES), Centennial College, Canadá.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Millipore Sigma 64-19-7
Antibiotic base agar BD Difco DF0270-17-4 Also known as Antibiotic Medium 2
Antibiotic seed agar BD Difco DF0263-17-3 Also known as Antibiotic Medium 1
Blood Agar (Nutrient Agar with 5% Sheep Blood) Donated by CFIA
Bromcresol Purple Lactose Agar Donated by CFIA
Candida albicans ATCC The Global Bioresource Center ATTC 10231
Carvacrol Millipore Sigma 282197 (CAS# 499-75-2)
Centrifuge  Allergra X-22R Centrifuge Beckman Coulter Model # X-22R Refrigerated. Wait at least 20 min or until the temperature reach the set low value (e.g., 4 °C) as the refrigeration takes time.
Chitosan Medium Molecular Weight (CS) Millipore Sigma 448877 (CAS # 9012-76-4)
Clamshell Heat Press Intiva IM1200
Escherichia coli (E. coli) ATCC The Global Bioresource Center ATTC 23725
Incubator Thermo Scientific 1205M34
Letheen Broth BD Difco DF0681-17-7 Used to neutralize antimicrobial effects. Product from different manufacturers may require to add Polysorbate 80, which is already added in Difco product.
Milli Q water Millipore Sigma ZR0Q16WW Deionized water
Mueller-Hinton Agar BD Difco DF0252-17-6
Pentasodium tripolyphosphate (TPP) Millipore Sigma 238503 (CAS# 7758-29-4)
Phospahte Buffered Saline (PBS) Thermo Scientific AM9624
Pseudomonas aeruginosa ATCC The Global Bioresource Center ATTC 9027
Sabouraud Dextrose Agar BD Difco DF0109-17-1
Shaking incubator/ Thermo shaker VWR Model# SHKA2000
Staphylococcus aureus ATCC The Global Bioresource Center ATTC 6538
Thymol Millipore Sigma T0501 (CAS# 89-83-8)
Trypticase Soy Agar BD Difco 236950
Trypticase Soy Broth BD Difco 215235
Tween 80 Millipore Sigma STS0204 (CAS # 9005-65-6)
UV-Vis Spectrophometer Thermo Scientific GENESYS 30 (840-277000)

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Subair, S., Singh, N., Maru, M., Prakash, S., Hasanar, M. An Antimicrobial Fabric Using Nano-Herbal Encapsulation of Essential Oils. J. Vis. Exp. (194), e65187, doi:10.3791/65187 (2023).

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