Summary
Antimikrobiella laboratorierockar förhindrar korskontaminering av patogenackumulering och oavsiktliga biospill. Här beskriver vi protokollet för att utveckla ett hudvänligt antimikrobiellt tyg med hjälp av nano-herbal inkapsling och modifierade standardtester för att exakt utvärdera effekten och lämpligheten för typisk användning av labbbeläggningen.
Abstract
Labrockar används ofta i biohazardlaboratorier och vårdinrättningar som skyddskläder för att förhindra direkt exponering för patogener, spill och brännskador. Dessa bomullsbaserade skyddsbeläggningar ger idealiska förhållanden för mikrobiell tillväxt och fästplatser på grund av deras porösa natur, fukthållande kapacitet och kvarhållande av värme från användarens kropp. Flera studier har visat överlevnaden av patogena bakterier på sjukhuskläder och labbrockar, som fungerar som vektorer för mikrobiell överföring.
Ett vanligt tillvägagångssätt för att lösa dessa problem är användningen av antimikrobiella medel vid textilbehandling, men farhågor har väckts på grund av toxiciteten och miljöeffekterna av många syntetiska kemikalier. Den pågående pandemin har också öppnat ett fönster för undersökning av effektiva antimikrobiella medel och miljövänliga och toxfria formuleringar. Denna studie använder två naturliga bioaktiva föreningar, carvacrol och tymol, inkapslade i kitosan nanopartiklar, vilket garanterar effektivt skydd mot fyra humana patogener med upp till en 4-log reduktion (99,99%). Dessa patogener upptäcks ofta i laboratorierockar som används i laboratorier för biologisk fara.
De behandlade tygerna motstod också upp till 10 tvättcykler med 90% mikrobiell reduktion, vilket är tillräckligt för avsedd användning. Vi gjorde ändringar i de befintliga standardtygtesterna för att bättre representera de typiska scenarierna för användning av labbbeläggning. Dessa förbättringar möjliggör en mer exakt utvärdering av effektiviteten hos antimikrobiella laboratoriebeläggningar och simulering av ödet för eventuella oavsiktliga mikrobiella spill som måste neutraliseras inom kort tid. Ytterligare studier rekommenderas för att undersöka ackumuleringen av patogener över tid på antimikrobiella laboratorierockar jämfört med vanliga skyddsrockar.
Introduction
Den skyddande vita pälsen är en obligatorisk personlig skyddsutrustning (PPE) i mikrobiologiska laboratorier och vårdinrättningar, och den skyddar mot direkt exponering för patogener, spill och brännskador. Dessa bomullsrockar främjar mikrobiell tillväxt på grund av många faktorer - det vävda tyget ger fästplatser och luftning, bomull och stärkelse som används i tillverkningsprocessen tillsammans med exfolierade epitelceller från användaren levererar näringsämnen, och närheten till användaren ger värme och fukt. Ansamling av mikrober på textilier kan också orsaka hälsoproblem som allergier och nosokomial infektion, obehaglig lukt och tygförsämring1.
Till skillnad från vanliga kläder tvättas eller desinficeras skyddsrockar sällan, vilket finns i många undersökningar 2,3. Många studier visar bevis på laboratorierockar som fungerar som en vektor för mikrobiell överföring och risken för nosokomiala infektioner i vårdmiljön2,4, särskilt resistenta stammar3 såsom meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA); Således väcker de hälsoproblem med personlig skyddsutrustning, som är avsedd att skydda mot mikrobiell kontaminering. Det finns inte tillräckligt med tvärsnittsstudier på laboratoriebeläggningsrelaterade infektioner i samband med biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) anläggningar eller mikrobiologiska undervisningslaboratorier, men många tillsynsmyndigheter begränsar användningen av labbrockar inom inneslutningsnivån. Men många akademiska institutioner i Nordamerika kämpar för att uppfylla kraven på grund av praktiska begränsningar, såsom tvätt och lagring inuti anläggningen, incidenterna med att bära labbrockar i offentliga utrymmen som cafeterior och bibliotek är vanliga. En praktisk lösning på dessa problem är användningen av antimikrobiella medel vid textilbehandling.
Antimikrobiella tyger blir allt populärare i sportkläder, aktiva kläder och strumpor, främst avsedda att minska kroppslukt. Användningen av dessa tyger är dock inte vanlig vid PPE-utveckling, förutom vissa silverbelagda bomullsmasker och sjukvårdskläder5. Vi rapporterar utvecklingen av ett antimikrobiellt tyg för labbrockar, vilket hämmar vanliga patogener som finns i BSL-2-laboratorier och ger effektivt skydd mot korskontaminering av vanliga patogener.
För närvarande finns en mängd antimikrobiella tyger och ytbehandlingar tillgängliga på marknaden, men de flesta av dessa använder tungmetallkolloidala partiklar (t.ex. silver, koppar, zink), organometalliska eller syntetiska kemikalier som triklosan och kvartära ammoniumföreningar, som inte är miljövänliga1 och kan leda till hälsoproblem som hudirritation och allergier6. Vissa syntetiska formuleringar utgör oro på grund av icke-målmikrober, såsom normal flora eller inducerande antimikrobiell resistens (AMR). US Food and Drug Administration (FDA) reglerar kommersiella antimikrobiella tyger, som måste vara giftfria för användaren och fria från ekotoxicitet. Därför är antimikrobiella tyger baserade på naturliga biocider som hämmar ett brett spektrum av mikrober att föredra. Eteriska oljor (EO) används i stor utsträckning som antimikrobiella och terapeutiska medel, men deras användning i antimikrobiell efterbehandling är begränsad på grund av deras hållbarhet 6,7,8. Baserat på vår kunskap och marknadsundersökningar om nano-herbal efterbehandling8, är inget växtbaserat antimikrobiellt tyg kommersiellt tillgängligt. Detta beror på att syntetiska beläggningar är lätta att tillverka och har lång hållbarhet. Några nano-växtbaserade belagda textilier som endast rapporterats för forskningsändamål inkluderar neem7, moringa 9 och curryblad9.
Den aktuella studien använder två bioaktiva komponenter extraherade från oregano EO, carvacrol och tymol, som är effektiva mot ett brett spektrum av bakteriella patogener och virus men är allmänt erkända som säkra för människor10. Dessa bioaktiva komponenter är emellertid flyktiga, och därför är deras antimikrobiella potential kortlivad om den appliceras direkt på tyget. Nano-herbal inkapsling är en process där bioaktiva komponenter eller läkemedel laddas inuti ett polymerskal som skyddar kärnan från miljöförstöring och därmed förbättrar hållbarheten. Dessutom förbättrar den lilla storleken på de polymera partiklarna, som i allmänhet sträcker sig från 10 nm till 100 nm, applikationens effektivitet och saktar frisättningen av de bioaktiva föreningarna på tyget. Dessa bioaktiva föreningar används för olika ändamål, såsom livsmedelskonservering10, men inte för textilbeläggning.
Bland många polymera inkapslingsmedel är kitosan en attraktiv kandidat på grund av många av dess attribut, såsom icke-toxicitet, biologisk nedbrytbarhet, mukoadhesivitet och biokompatibilitet11. Det är en naturlig polysackarid, erhållen genom deacetyleringsprocessen från kitin, som finns i snäckskal och svampcellväggar. Det används i biokemiska och livsmedelskonserveringsapplikationer såsom läkemedels- eller proteinleverans 11,12,13, kontrollerad frisättning14 och antimikrobiella filmer 10. Chitosan är inte lättlösligt i vatten men bildar en kolloidal suspension i sura medier. Bioaktiva molekyler laddas i kitosannanopartiklar (NP) med en enkel tvåstegs jonisk geleringsmetod14,15,16. I denna process bildar hydrofoba bioaktiva föreningar såsom carvacrol och tymol en olja-i-vatten-emulsion, som stöds av ett ytaktivt medel, Tween 80. Därefter används en polyanjonisk förening, pentanatriumtripolyfosfat (TPP), för att bilda tvärbindningarna mellan aminogrupperna längs de polykationiska polymermolekylerna och fosfatgrupperna av TPP-molekyler för att stabilisera komplexet. Denna komplexbildningsprocess stelnar de bioaktiva föreningarna i matrisen av kitosan, som därefter renas och beläggs på bomullsprover för att producera antimikrobiellt tyg.
Nanoformuleringarna måste först testas för antimikrobiell effektivitet i emulsionsform innan de appliceras på tyget. Detta kan enkelt utvärderas med en kvalitativ metod, såsom Kirby-Bauer-diskdiffusion, brunnsdiffusion och cylinderplattanalysen. Cylinderplattanalys17 ger emellertid flexibiliteten att ladda varierande volymer av formuleringen och jämföra frigångszonen. I denna metod laddas de antimikrobiella formuleringarna i cylindrar av rostfritt stål och placeras på ett mjukt agarskikt som inokuleras med testmikroorganismen eller patogenen. Diametern på den clearancezon som produceras mot testorganismen är proportionell mot den antimikrobiella formuleringens hämmande potential och kan därför användas som ett alternativ till buljongspädningsmetoder. Storleken på de fria zonerna är dock endast ett jämförande eller kvalitativt mått inom en specifik skylt om inte särskilda standarder bibehålls. Antimikrobiella medel verkar mot patogenerna antingen genom att hämma deras tillväxt (biostatisk) eller döda cellerna (biocid), som kan kvantifieras med minsta hämmande koncentration (MIC) respektive minsta bakteriedödande koncentration (MBC). Effektiviteten och beteendet hos de bioaktiva kemikalierna är emellertid olika i deras formuleringar (flytande tillstånd) och när de beläggs på ett substrat såsom ett tyg18. Detta beror på att flera faktorer spelar en roll i effekten, såsom stabiliteten hos de antimikrobiella medlen vidhäftning till tyget, fuktinnehåll, substrattyp och vidhäftning av mikroberna. Om det avsedda syftet endast är bakteriostatisk aktivitet kan en kvalitativ analys som "Parallel Streak Method"19 ge en relativt snabb och enkel utvärdering av diffusibel antimikrobiell formulering. Om de bakteriedödande effekterna ska bestämmas kan emellertid "bedömning av antibakteriella ytbehandlingar på textilmaterial"20 användas, vilket ger logreduktionen av den spikade patogenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av nanopartiklar
- Nano-växtbaserade inkapsling
- Bered 50 ml 1% (v / v) ättiksyra.
VARNING: Isättika är irriterande, vilket kan orsaka allvarliga hudbrännskador och ögonskador. Använd en labbrock i full längd, nitrilhandskar och skyddsglasögon och arbeta under en dragskåpa. - Bered kitosanlösning (1,2 % vikt/volym) genom att lösa upp 0,6 g kitosanflingor (medelmolekylvikt) i 50 ml 1 % ättiksyra (beredd ovan). Agitera över natten (O/N) vid rumstemperatur (R/T) för att få en homogen emulsion.
- Tillsätt 0,5 g Tween 80 och rör om (1 000 varv/min) vid 60 °C i 2 timmar för att få en homogen lösning. Ta lösningen till R/T innan du tillsätter bioaktiva föreningar (carvacrol eller tymol).
- Tillsätt 0,75 g carvacrol (eller tymol) droppvis eller gradvis under omrörning (1 000 rpm) blandningen i 20 minuter vid R/T. Viktförhållandet mellan kitosan och bioaktiv förening är 1: 1,25.
- Tillsätt 50 ml (0,5% w/v) TPP droppvis till blandningen under omrörning vid R/T. Fortsätt omrörningen i 30 minuter för att få en homogen emulsion.
- Förbered en negativ kontroll genom att följa samma procedur men utan tillsats av bioaktiva föreningar.
- Bered 50 ml 1% (v / v) ättiksyra.
- Rening
- Centrifugera emulsionen vid 10 000 × g i 30 minuter vid 4 °C och samla upp de bildade NP (pelleten) efter dekantering av supernatanten. Reservera supernatanten för att testa inkapslingseffekten.
- Tvätta partiklarna (från steg 1.2.1) med vattenhaltig Tween 80 (1 % v/v) med dubbelt så mycket pellets som bildats för att avlägsna de obundna eller fria bioaktiva föreningarna. Se till att störa pelleten genom virvelning tills en homogen lösning bildas i varje tvättsteg.
- Tvätta partiklarna (från steg 1.2.2) med avjoniserat vatten två gånger för att bli av med föroreningar.
- Bered NP genom att återsuspendera pelleten (från steg 1.2.3) i 30 ml avjoniserat vatten. Förvara NP vid 4 °C i upp till 6 månader.
OBS: Experimentet kan pausas i detta skede.
- Karakterisering
- Späd NP i avjoniserat vatten tills de ultravioletta synliga (UV-Vis) avläsningarna mellan 250 och 400 nm faller inom området (absorbans >1).
- Registrera NP: s UV-Vis-absorptionsspektra över våglängderna från 250 till 400 nm med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer.
- Förvara en alikvot (1 ml) NP vid R/T under olika tidsperioder (t.ex. 1 till 6 månader) och testa den antimikrobiella effekten med cylinderplattemetoden tillsammans med ett nytt prov.
- Beläggning på tyg
- Applicera NP på ett vävt bomullstyg med en pad-dry-curing-metod 7,21.
- Sänk ner tygproverna i lösningen som innehåller NP blandade med ett tygbindemedel i 3 minuter tills de blötläggs. För sedan proverna genom en laboratoriepadder med två rullar för att avlägsna överflödig vätska.
- Ugnstorka färgrutorna vid 100 °C i 30 min och härda vid 130 °C i 10 minuter.
- Tvätta slutligen färgrutorna i ett ultraljudsbad i 15 minuter för att ta bort obundna NP.
OBS: Alternativt kan du följa den förenklade metoden som beskrivs nedan.
- Skär bomullstyget (eller labbrockproverna) i rutor på 10 cm x 10 cm.
- Sänk ner de skurna bitarna i 2 ml av den syntetiserade NP (10%) i en plastbehållare (12 cm x 12 cm) i 2 minuter vid R/T. Ta bort överflödig vätska genom lufttorkning.
- Värm pressen vid 100 °C i 3 minuter för att binda NP.
- Ta bort obundna NP genom att skölja i vattenhaltig Tween 80 (2 % vikt/volym) och torka i ugnen vid 100 °C i 30 minuter.
OBS: Detta antimikrobiella tyg kan lagras i 2 år vid R / T.
- Applicera NP på ett vävt bomullstyg med en pad-dry-curing-metod 7,21.
- Tvätta hållbarhet
- Skär tyget i 50 mm x 50 mm fyrkantiga prover.
- Placera färgrutorna i 50 ml varmt kranvatten (40 °C) i en glas-/plastbehållare och tillsätt två droppar vanligt rengöringsmedel (icke-antimikrobiellt).
- Skölj på en gungplattformsshaker eller magnetomrörare i 30 minuter.
- Lufttorka eller inkubera vid 60 °C i 2 timmar och testa den antimikrobiella effekten.
2. Cylinderplattanalys för screening av nanopartiklar
- Bered tryptikassojaagar (TSA), tryptikassojabuljong (TSB), antibiotisk basagar (ABA) och antibiotisk fröagar (ASA) enligt tillverkarens instruktioner och sterilisera mediet genom autoklav vid 121 °C vid 15 psi i 15 minuter.
- Subkultur de mikrober (från lager) av intresse, mot vilka effektivitetstesterna utförs, på nyberedda TSA-plattor (eller andra lämpliga medier) med trevägs streckplattmetod och inkubera för att producera renhetsplattor. (Rekommenderade arter: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa och C. albicans.)
- Inokulera kulturerna från plattor med färsk renhet i TSB (10 ml rör) vid 35 °C O/N med måttlig skakning (100–200 rpm).
- Alikvot 5,0 ml smält ASA i vart och ett av provrören. Antalet rör motsvarar antalet testade mikroorganismer.
- Häll 20 ml försteriliserad smält ABA i varje petriskåla (100 mm x 20 mm) aseptiskt för att bilda basskiktet. Antalet agarplattor motsvarar antalet mikroorganismer som ska testas. Vänta tills media stelnar.
- Efter stelning av basskiktet inokuleras varje smält ASA med en nattkultur från steg 2,3 (1,0 ml, förvärmd till 35 °C) och överför omedelbart innehållet (blandning av ASA och odling) till ytan på en ABA-platta. Snurra plattan för att fördela det smälta agarskiktet jämnt. Se till att fröskiktet verkar jämnt och fritt från stötar eller bubblor.
- Placera upp till sex cylindrar av rostfritt stål (6 mm x 6 mm x 10 mm; förautoklaverad), jämnt fördelade på ett sexkantigt mönster, per agarplatta med en steril pincett (figur 1).
- Fyll cylindrarna med syntetiserade NP med olika volymer (30 μL, 50 μL, 75 μL och 100 μL) som ska screenas för antimikrobiella effekter. Den negativa kontrollen är den utan några bioaktiva föreningar.
- Inkubera vanliga bakteriepatogener (t.ex. E. coli, S. aureus, P. aeruginosa) vid 35 °C i 24 timmar och svamparter (t.ex. C. albicans) vid R/T i 3 dagar.
- Mät diametern på den klara zonen och jämför effektiviteten hos de syntetiserade NP: erna.
OBS: Detta test kan användas för att förhandsgranska de bästa NP: erna som ska beläggas på tyget.
3. Parallell streckmetod (modifierad från AATCC 147)
- Materialberedning
- Skär det NP-behandlade tyget i 50 mm x 25 mm prover.
- Förbered Mueller-Hinton agar (MHA), TSA och TSB enligt tillverkarens instruktioner och sterilisera mediet genom autoklav vid 121 °C vid 15 psi i 15 minuter.
- Subkultur de mikrober (från lager) av intresse, mot vilka effektivitetstesterna utförs, på nyberedda TSA-plattor (eller andra lämpliga medier) med trevägsstreckplattmetoden och inkubera vid 35 °C i 2 dagar för bakteriefläckar och vid R/T i 5 dagar för svampstammar för att producera renhetsplattor. (Rekommenderade arter: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa och C. albicans.)
- Spikning av mikrobiella kulturer
- Inokulera kulturerna från plattor med färsk renhet i TSB (10 ml rör) vid 35 °C O/N med måttlig skakning (100–200 rpm).
- Späd O/N-kulturerna till 1,5 × 108 kolonibildande enheter (CFU)/ml eller motsvarande grumligheten av 0,5 McFarland-standard (vanligtvis en 1/10 till 1/20 utspädning för de flesta friska kulturer).
- Inokulera den utspädda kulturen ovan med en 4 mm steril slinga enligt följande. Ladda en slinga av buljongkultur och överför den till ytan på MHA-agarplattan genom att göra fem parallella streck, var och en 6 cm lång och 1 cm från varandra, enligt figur 2. Fyll inte på slingan.
- Tryck försiktigt tygprovet med en steril spatel över de fem strecken så att tyget är i mitten och vidrör alla fem strecklinjerna. Inkubera vid 35 °C i 24 timmar.
- Kvalitativ utvärdering av antimikrobiell effekt
- Undersök den inkuberade plattan för avbrott av tillväxten längs strecken bortom tygets kanter (klar zon indikerar hämning av tillväxt).
- Beräkna den genomsnittliga bredden på en hämningszon längs strecklinjen (W) på vardera sidan av tygprovet med ekvation (1).
W = (t - d)/2 (1)
W = den fria zonens bredd, T = det fria områdets totala längd, inklusive färgrutans bredd, D = tygprovets bredd (25 mm).
4. Kvantitativ logreduktionsmetod (modifierad från AATCC 100)
- Experimentell förberedelse
- Skär tyget i 50 mm x 50 mm fyrkantiga prover.
- Förbered TSA, TSB, Letheen buljong och fosfatbuffrad saltlösning (PBS), enligt tillverkarens instruktioner, och sterilisera media genom autoklavering.
- Bered O/N-kulturer av mikrober av intresse, mot vilka effektivitetstesterna utförs, genom att inokulera isolerade kolonier från renhetsplattor i steril TSB och inkubera vid 35 °C i 18–24 timmar (Rekommenderade arter: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa och C. albicans.)
- Spikning av mikrobiella kulturer
- Späd O/N-kulturerna till 1,5 × 10,8 CFU/ml eller motsvarande grumligheten av 0,5 McFarland-standard (vanligtvis en spädning på 1/10 till 1/20 för de flesta friska kulturer).
- Bestäm lämplig volym kulturer för spikning genom att mäta tygets vätskehållande kapacitet enligt följande.
- Tillsätt en serie volymer av den utspädda buljongkulturen (t.ex. 100-500 μL) på tygprover (i separata Petri-plattor) och välj volymen så att tygprovet absorberar vattnet helt och lämnar ingen kvarvarande / fri vätska. Vätskehållningskapaciteten skiljer sig från tygets typ och tjocklek. För vanliga bomullslabbrockar är det ungefär 200 μL.
- Spika volymen (vätskehållande kapacitet bestämd ovan [t.ex. 200 μL]) för varje kultur på proverna placerade i sterila petrisklackar. Antalet provrutor motsvarar antalet tester (t.ex. tyg som testats omedelbart och efter tvätt [och tvättcyklerna testats]) och de antimikrobiella effekterna som testats under kontakttiden (efter en viss tid/dag [t.ex. 30 min, 2 timmar, dag 1–3]).
OBS: Använd en mikropipett med aerosolfilterspetsar (för att förhindra kontaminering av pipetten vid efterföljande användning) för att inokulera kulturerna på proverna med jämn fördelning. - För den negativa kontrollen, använd samma typ av obehandlade tygprover. Utför den negativa kontrollen för varje motsvarande mikrobiellt test, kontaktperiod, olika tyger och tvättcykler.
- Återvinning av mikrober genom antal livsdugliga plattor
- Låt de inokulerade proverna (både behandlade och obehandlade) lufttorka inuti petriskålarna (locken står på glänt) vid R/T för den kontaktperiod som krävs (t.ex. 0 min, 30 min, 60 min, etc., eller till och med dagar för långsiktiga effekter). Inkludera alltid en "0 min" för att representera en omedelbar effekt och neutraliserande effekt.
- Överför proverna aseptiskt till separata sterila centrifugrör (50 ml) och skruva fast locken.
- Tillsätt Letheen-buljong (alla relevanta neutraliserande buffertar) för att göra en 1/100 utspädning (t.ex. 19,8 ml för en ympning på 200 μl).
- Stäng centrifugrören med skruvlock tätt och virvel i 1 min vid medelhastighet.
- Späd suspensionen seriellt med sterilt PBS i efterföljande 1/10 spädningar, så att antalet mikroorganismer i den "obehandlade" gruppen blir för lågt för att räknas (TLTC).
- Platta utspädningarna (0,1 ml) på lämpliga medieplattor, som stöder tillväxten av mikroorganismen (t.ex. TSA för bakterier eller Sabouraud dextrosagar [SDA] för svampar) eller något medium som optimerar tillväxten och ger god kontrast för att göra koloniräkningen korrekt.
- Inkubera bakterieplattorna vid 35 °C i 2 dagar och svampplattorna vid R/T i 5 dagar.
- Räkna de livskraftiga CFU: erna direkt med hjälp av en koloniräknare eller med hjälp av bildprogramvara (t.ex. CFU AI).
- Beräkna den mikrobiella logreduktionen (R) på grund av antimikrobiellt tyg med hjälp av ekvation (2):
R =
× 100 (2)
A = logaritmiskt värde av antalet CFU som återvunnits från obehandlat tyg, B = logaritmiskt värde av antalet CFU som återvunnits från behandlat tyg.
× 100 (2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inledande screening av de syntetiserade NP: erna
Efter tvåstegs olja-i-vatten-emulsionsteknik16 inkapslades de bioaktiva föreningarna (carvacrol och tymol) framgångsrikt i kitosan. Detta bekräftades av UV-Vis-spektrofotometri för maximal absorption av respektive bioaktiva föreningar jämfört med kontroller, som var kitosan NP utan några bioaktiva föreningar. De konstituerade nonylfenolerna var homogena och stabila under 12 månader vid 4 °C. Den första screeningen av den antimikrobiella effekten verifierades med cylinderplattemetoden (figur 1). Detta är en kvalitativ metod eftersom clearancezonen påverkas av flera faktorer, såsom agartjocklek, inokulatets styrka och koncentrationen av testproverna. Många enklare metoder, såsom Kirby-Bauer-diskdiffusionsmetoden och brunnsdiffusionsmetoden, kan användas för detta ändamål, men cylinderplattmetoden ger möjlighet att variera koncentrationerna (figur 1A) genom att späda NP: erna, och varje cylinder kan hålla provvolymen upp till 200 μL. Dessutom bildar agaröverlagringen med kulturer en jämn ympning, vilket möjliggör bestämning av de klara zonerna med bättre precision17. Resultaten visade att de klara zonerna står i proportion till de gradvis ökande koncentrationerna (figur 1A). Detta lägger till giltighet för data och skiljer dem från artefakter eller onormala zoner. Baserat på storleken på de klara zonerna (vanligtvis över 20 mm) kan rätt koncentration av NP väljas för beläggning. Alla tidigare karakteriserade eller gamla NP, som lagrats på lämpligt sätt (4 °C), kan också verifieras av de stora zonerna (figur 1B, C) innan beläggning på tyget.
Kvalitativ screening av behandlade tygprover
Trots den antimikrobiella effektiviteten hos de inkapslade NP: erna bekräftade av stora klara zoner måste de NP-belagda tygerna testas. Detta beror på att de antimikrobiella medlen kan fungera annorlunda när de appliceras på tyget jämfört med deras ursprungliga formuleringar. Många faktorer, såsom tygets egenskaper (tjocklek, hydrofobicitet), beläggningseffektivitet och nedbrytning av bioaktiva föreningar under beläggning, påverkar effektiviteten20. Som sådan användes parallellstrimmetoden för att utvärdera de antimikrobiella effekterna av de behandlade tygerna kvalitativt. De negativa kontrollerna (obehandlade tyger) visade inga antimikrobiella effekter av den oavbrutna mikrobiella tillväxten längs alla fem strecklinjerna (figur 3 A, B). Det behandlade tyget visade avbruten mikrobiell tillväxt längs strecklinjerna (figur 3 C, D), vilket berodde på de diffusa bioaktiva föreningarna från tyget. Den genomsnittliga bredden på de klara zonerna var dock låg (<5 mm) eftersom testproverna utsattes för 10 tvättcykler före testningen. När inokulatkoncentrationerna minskar längs de parallella biffarna från den första till den femte strimman (figur 2) är de klara zonerna framträdande i de efterföljande strecken. Om den första strimman (hög inokulum) visar en tydlig zon är tygets antimikrobiella potential vanligtvis hög. Vissa oegentligheter, t.ex. den femte raden i figur 3D, kan uppstå på grund av testets kvalitativa karaktär. Den klara zonen (avbruten tillväxt) på grund av den bakteriostatiska aktiviteten ger en indikation på den antimikrobiella potentialen, men ger inte en tillräckligt känslig riktlinje18, som beräknas med "log reduction test". Den parallella streckmetoden är dock användbar för en relativt snabb och lätt utförd procedur för att screena ett stort antal färgrutor 6,7,20, särskilt vid testning för ett tvätthållbarhetstest under många cykler.
Kvantitativ analys av de behandlade tygproverna
Log reduction-testet (även kallat procentuellt reduktionstest) visade en signifikant (<0,001) reduktion av mikrobiella kulturer vid kontakt med det behandlade tyget i 30 minuter (figur 4 och figur 5). De antimikrobiella tygproverna var signifikant effektiva (>99%) mot en grampositiv bakterie (S. aureus), gramnegativa bakterier (E. coli och P. aeruginosa) och en hudsvampart (C. albicans). Eftersom det obehandlade tyget (negativ kontroll) inte hade någon antimikrobiell aktivitet var de återvunna CFU: erna för många för att räkna tills de späddes till utrotning, upp till 106 utspädningar (figur 4). Antalet CFUs som återvunnits från de behandlade tygerna vid "0" kontakttid (pläterad omedelbart vid inokulering och neutralisering) var mycket lik den för det obehandlade tyget, och data utelämnades för enkelhetens skull. Den neutralisator som används (Letheen buljong) är effektiv för att neutralisera effekterna av fenolderivat såsom carvacrol och tymol. Jämfört med carvacrol NPs visade tymol NP något högre antimikrobiella effekter mot alla fyra mikroberna (figur 5). Både tymol- och karvacrolbelagd väv fungerade lika effektivt mot tre mikrober (S. aureus, E. coli och C. albicans) med över en 4-log-reduktion (99,99%), förutom P. aeruginosa, som varierade från en 2,8- till en 3,2-logreduktion (99,9). Detta var väntat, eftersom P. aeruginosa är resistent mot en rad antimikrobiella medel22. Tvätthållbarhetstestet visade att det behandlade tyget kunde uppvisa effektiv antimikrobiell resistens (>99%) mot tre arter (S. aureus, E. coli och C. albicans) och måttlig resistens mot P. aeruginosa efter 10 tvättcykler.
Figur 1: Cylinderplatttest av syntetiserade nanopartiklar med ett intervall av koncentrationer testade mot bakterier . a) Seriellt utspädda tymol NP för en första screening mot E. coli som visar placeringen av cylindrar och klara zoner efter 18 timmars inkubation. Gradvis ökande koncentrationer "o" till "r" resulterade i proportionellt högre zoner. Den klara zonen som produceras av den högsta koncentrationen indikeras med en röd cirkel. Den negativa kontrollen (chitosan NP utan de bioaktiva föreningarna) representeras av "t" och supernatanten extraherad under rening representeras av "s". (B) Två av tre koncentrationer av karvacrol NP (12 månader gamla, lagrade vid 4 °C) screenade för tygbehandling som visar effektiva zoner (>20 mm) mot S. aureus. c) Tre koncentrationer av tymol NP (12 månader gamla, lagrade vid 4 °C) screenade för tygbehandling som visar effektiva zoner mot S. aureus. Förkortning: NP = nanopartikel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Metodlayout för parallell streck. Placering av ett tygprov på Mueller-Hinton agar inokulerat med fem efterföljande parallella streck. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Resultat av metoden med parallell streck som visar tydliga zoner för de behandlade tygfärgrutorna. Färgrutorna placerades ovanpå inokulatet (nedre raden) jämfört med obehandlade (övre raden). (A) obehandlat tyg mot S. aureus, (B) obehandlat tyg mot C. albicans, (C) tymol NP-belagt tyg (efter 10 tvättcykler) mot S. aureus och (D) tymol NP-belagt tyg (efter 10 tvättcykler) mot C. albicans. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Loggreduktionsresultat av antimikrobiellt tyg belagt med tymolinkapslade kitosannanopartiklar testade agaisnt fyra patogener. Laktosagarplattorna i panel B donerades av Canadian Food Inspection Agency, som inkluderar deras etiketter på baksidan och ser ut som prover. Andra agarplattor framställdes i labbet, utan etiketter. Tygprover placerades inte ovanpå agarplattorna, som i experimentet som visas i figur 3. Snarare återvanns mikroberna från proverna (efter virvelning i PBS) och pläterades. (A) S. aureus på blodagar, (B) E. coli på lila laktosagar, (C) P. aeruginosa på cetrimidagar, (D) C. albicans på SDA. Patogenerna spikades på "obehandlade" (övre raden) och "behandlade" (nedre raden) färgrutor i 30 minuter och återhämtade sig vid neutralisering och utspädningsplätering. Utspädningsförhållandena visas mellan behandlade och obehandlade serier. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Loggreduktion av tre bakterier (S. aureus, E. coli och P. aeruginosa) och en svamp (C. albicans) på grund av kontakt med antimikrobiella tyger impregnerade med två bioaktiva föreningar (carvacrol och tymol separat). Den antimikrobiella effekten försvagas efter tvättade cykler (fem gånger respektive 10 gånger) för både karvacrol- och tymolbelagda tyger. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den antimikrobiella effekten av biocider testas konventionellt genom kvantitativa analyser, såsom minsta hämmande koncentration (MIC) och minsta bakteriedödande koncentration (MBC), där bakterierna nedsänks i en antimikrobiell vätska i 24 timmar. Dessa analyser är dock inte lämpliga för belagda tyger, där vätskegränssnittet saknas och biociderna diffunderas långsamt längs tygfibrerna. Därför har många standardtygtester upprättats, såsom AATCC 147, ISO 20645, AATCC 100 och JIS L 1902. En jämförande studie av dessa standarder av Pinho et al.23 bekräftar att det inte finns någon konsensus om vilken metod som är lämpligast. Denna studie ändrade protokollet något för att bättre representera användningen av antimikrobiella laboratorierockar i biosäkerhetslaboratorier. De testmikroorganismer som användes var de arter som ofta upptäcktes från labbbeläggningarna i BSL-2-laboratorier, baserat på en tidigare studie (opublicerad). De representerar också en mängd olika patogena mikrober som vanligtvis används i farmaceutiska tester, till exempel en grampositiv human patogen (S. aureus), en gramnegativ indikatorart (E. coli), en mycket resistent art (P. aeruginosa) och en dermal patogen svamp (C. albicans).
Den totala antimikrobiella effekten som observerades i denna studie (99,99 %) var högre än den effekt som rapporterades i liknande studier 7,9,23,24, som varierade från 80 % till 99 %. Det sätt på vilket experimenten utfördes i de andra studierna (enligt AATCC 100)19 ger dock en begränsning för att förfina effekten, särskilt när effekten är 100%. Det modifierade protokollet med en serie av fem plattor (figur 5) som används i denna studie gör det möjligt att beräkna logreduktionen med större noggrannhet. Vid inokulering av tygproverna utfördes inkubationen vid R/T i 30 minuter, jämfört med standardinkubationen O/N vid 37 °C. Modifieringen representerar bättre den typiska användningen av laboratoriebeläggningen vid R/T och eventuella oavsiktliga mikrobiella spill som måste neutraliseras inom kort tid (20-30 min) för att betrakta den antimikrobiella laboratoriebeläggningen som effektiv. Tvätthållbarhetstesterna visar att den antimikrobiella effekten (>90%) kvarstod efter 10 tvättcykler. Den antimikrobiella retentionen av tyget är lite lägre jämfört med vissa studier7,9, som gav effektivitet upp till 20-30 cykler. Skyddskläder som labbrockar, till skillnad från vanliga kläder, tvättas dock sällan2,3, och därför skulle 10 tvättcykler vara tillräckliga.
Valet av bioaktiva föreningar är av största vikt, eftersom föreningen måste vara säker för användaren. Som sådan är många giftiga kemikalier och irriterande ämnen inte kompatibla. EO från en rad växtbaserade produkter extraherades och screenades för deras lämplighet som en idealisk kandidat för nano-herbal inkapsling, med tanke på effekten mot de fyra patogenerna, fläckar som produceras på tyget och en acceptabel luktnivå. Till exempel visade granatäppleskalextrakt signifikanta effekter mot patogenerna, men fläcken var inte acceptabel för en vit päls. Carvacrol och tymol visade sig emellertid vara effektiva med en acceptabel nivå lukt i textilbehandling. Inkapslingseffekten var optimal när viktförhållandet mellan chitosan och karvacrol (eller tymol) var 1:1,25, vilket överensstämde med tidigare forskningsresultat10,16. Inkapslingen av EO: erna underlättas genom tvärbindning av polykatjoniska grupper (NH3+) av kitosanmolekyler och polyanjoniska grupper (P3O105-) av TPP-molekyler. Tvärbindningen TPP stabiliserar NP: erna, men för mycket tvärbindning kan resultera i klumpiga partiklar. Inkapslingseffekten (EE) är beroende av många faktorer, såsom viktförhållandet mellan polymer och EO, doseringshastigheten för EO och temperaturen. Vissa flyktiga bioaktiva föreningar kan kapslas effektivt under ett kallvattenbad med is10. Ett enkelt sätt att testa EE är att testa supernatanten, som visas i figur 1A. Om supernatanten är mycket antimikrobiell på grund av de obundna EO: erna kommer EE att vara låg. Alla ingredienser som används i processen är livsmedelsklassade material och säkra för användaren och miljön. Endast ett fåtal studier finns på växtbaserade NP-belagda tyger som använder EO och kitosan eller naturliga polymerer. Denna studie har särskilt fokuserat på utveckling och testning av antimikrobiellt tyg för labbrockar och föreslår en effektiv lösning för att minska mikrobiell kontaminering i biosäkerhetslaboratorier. Ytterligare studier rekommenderas för att verifiera effekten av det antimikrobiella tyget i verkliga livet genom provtagning av regelbundna kontra antimikrobiella laboratorierockar efter långvarig användning i biohazardlaboratorier eller vårdinrättningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie finansierades av "Applied Research, Innovation and Entrepreneurship Services" (ARIES), Centennial College, Kanada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Millipore Sigma | 64-19-7 | |
| Antibiotic base agar | BD Difco | DF0270-17-4 | Also known as Antibiotic Medium 2 |
| Antibiotic seed agar | BD Difco | DF0263-17-3 | Also known as Antibiotic Medium 1 |
| Blood Agar (Nutrient Agar with 5% Sheep Blood) | Donated by CFIA | ||
| Bromcresol Purple Lactose Agar | Donated by CFIA | ||
| Candida albicans | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 10231 | |
| Carvacrol | Millipore Sigma | 282197 (CAS# 499-75-2) | |
| Centrifuge Allergra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | Model # X-22R | Refrigerated. Wait at least 20 min or until the temperature reach the set low value (e.g., 4 °C) as the refrigeration takes time. |
| Chitosan Medium Molecular Weight (CS) | Millipore Sigma | 448877 (CAS # 9012-76-4) | |
| Clamshell Heat Press | Intiva | IM1200 | |
| Escherichia coli (E. coli) | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 23725 | |
| Incubator | Thermo Scientific | 1205M34 | |
| Letheen Broth | BD Difco | DF0681-17-7 | Used to neutralize antimicrobial effects. Product from different manufacturers may require to add Polysorbate 80, which is already added in Difco product. |
| Milli Q water | Millipore Sigma | ZR0Q16WW | Deionized water |
| Mueller-Hinton Agar | BD Difco | DF0252-17-6 | |
| Pentasodium tripolyphosphate (TPP) | Millipore Sigma | 238503 (CAS# 7758-29-4) | |
| Phospahte Buffered Saline (PBS) | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 9027 | |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD Difco | DF0109-17-1 | |
| Shaking incubator/ Thermo shaker | VWR | Model# SHKA2000 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 6538 | |
| Thymol | Millipore Sigma | T0501 (CAS# 89-83-8) | |
| Trypticase Soy Agar | BD Difco | 236950 | |
| Trypticase Soy Broth | BD Difco | 215235 | |
| Tween 80 | Millipore Sigma | STS0204 (CAS # 9005-65-6) | |
| UV-Vis Spectrophometer | Thermo Scientific | GENESYS 30 (840-277000) |
References
- Schmidt-Emrich, S., et al. Rapid assay to assess bacterial adhesion on textiles. Materials. 9 (4), 249 (2016).
- Qaday, J., et al. Bacterial contamination of medical doctors and students white coats at Kilimanjaro Christian Medical Centre, Moshi, Tanzania. International Journal of Bacteriology. 2015, 507890 (2015).
- Treakle, A. M., et al. Bacterial contamination of health care workers' white coats. American Journal of Infection Control. 37 (2), 101-105 (2009).
- Wong, D., Nye, K., Hollis, P. Microbial flora on doctors' white coats. BMJ. 303 (6817), 1602-1604 (1991).
- Gouveia, I. C. Nanobiotechnology: A new strategy to develop non-toxic antimicrobial textiles for healthcare applications. Journal of Biotechnology. (150), 349 (2010).
- Joshi, M., Ali, S. W., Purwar, R., Rajendran, S. Ecofriendly antimicrobial finishing of textiles using bioactive agents based on natural products. Indian Journal of Fibre and Textile Research. 34, 295-304 (2009).
- Ahmed, H. A., Rajendran, R., Balakumar, C. Nanoherbal coating of cotton fabric to enhance antimicrobial durability. Elixir Applied Chemistry. 45, 7840-7843 (2012).
- Morais, D. S., Guedes, R. M., Lopes, M. A. Antimicrobial approaches for textiles: From research to market. Materials. 9 (6), 498 (2016).
- Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Development of advanced textile finishes using nano-emulsions from herbal extracts for organic cotton fabrics. Coatings. 11 (8), 939 (2021).
- Martínez-Hernández, G. B., Amodio, M. L., Colelli, G. Carvacrol-loaded chitosan nanoparticles maintain quality of fresh-cut carrots. Innovative Food Science & Emerging Technologies. 41, 56-63 (2017).
- Zhang, H. L., Wu, S. H., Tao, Y., Zang, L. Q., Su, Z. Q. Preparation and characterization of water-soluble chitosan nanoparticles as protein delivery system. Journal of Nanomaterials. 2010, 1-5 (2010).
- Patel, R., Gajra, B., Parikh, R. H., Patel, G. Ganciclovir loaded chitosan nanoparticles: preparation and characterization. Journal of Nanomedicine & Nanotechnology. 7 (6), 1-8 (2016).
- Merodio, M., Arnedo, A., Renedo, M. J., Irache, J. M. Ganciclovir-loaded albumin nanoparticles: characterization and in vitro release properties. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 251-259 (2001).
- Hsieh, W. C., Chang, C. P., Gao, Y. L. Controlled release properties of Chitosan encapsulated volatile Citronella Oil microcapsules by thermal treatments. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 53 (2), 209-214 (2006).
- Yoksan, R., Jirawutthiwongchai, J., Arpo, K. Encapsulation of ascorbyl palmitate in chitosan nanoparticles by oil-in-water emulsion and ionic gelation processes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 76 (1), 292-297 (2010).
- Keawchaoon, L., Yoksan, R. Preparation, characterization and in vitro release study of carvacrol-loaded chitosan nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 84 (1), 163-171 (2011).
- Cazedey, E. C. L., Salgado, H. R. N. Development and validation of a microbiological agar assay for determination of orbifloxacin in pharmaceutical preparations. Pharmaceutics. 3 (3), 572-581 (2011).
- Jayapriya, S., Bagyalakshmi, G. Textile antimicrobial testing and standards. International Journal of Textile and Fashion Technology. 4 (1), 2250-2378 (2013).
- AATCC 100. Antibacterial Finishes on Textile Materials: Assessment of Developed from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 100. , (2004).
- AATCC 147. Antimicrobial Activity Assessment of Textile Materials: Parallel Streak Method from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 147. , (2004).
- Ortelli, S., Costa, A. L., Dondi, M. TiO2 nanosols applied directly on textiles using different purification treatments. Materials. 8 (11), 7988-7996 (2015).
- Poole, K. Pseudomonas aeruginosa: resistance to the max. Frontiers in Microbiology. 2, 65 (2011).
- Pinho, E., Magalhães, L., Henriques, M., Oliveira, R. Antimicrobial activity assessment of textiles: standard methods comparison. Annals of Microbiology. 61 (3), 493-498 (2010).
- Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Novel antimicrobial finishing of organic cotton fabrics using nano-emulsions derived from Karanja and Gokhru plants. Textile Research Journal. 92 (23-24), 5015-5032 (2022).
