En arbejdsgang for lipidnanopartikelformuleringsoptimering (LNP) ved hjælp af designede blandingsproceseksperimenter og selvvaliderede ensemblemodeller (SVEM)

Summary

Denne protokol giver en tilgang til formuleringsoptimering over blandings-, kontinuerlige og kategoriske undersøgelsesfaktorer, der minimerer subjektive valg i den eksperimentelle designkonstruktion. Til analysefasen anvendes en effektiv og brugervenlig modelleringstilpasningsprocedure.

Abstract

Vi præsenterer en Quality by Design (QbD) stil tilgang til optimering af lipid nanopartikel (LNP) formuleringer, der sigter mod at tilbyde forskere en tilgængelig arbejdsgang. Den iboende begrænsning i disse undersøgelser, hvor molære forhold mellem ioniserbare, hjælper og PEG-lipider skal tilføje op til 100%, kræver specialiserede design- og analysemetoder for at imødekomme denne blandingsbegrænsning. Med fokus på lipid- og procesfaktorer, der almindeligvis anvendes i LNP-designoptimering, giver vi trin, der undgår mange af de vanskeligheder, der traditionelt opstår i design og analyse af blandingsproceseksperimenter ved at anvende rumpåfyldningsdesign og udnytte den nyligt udviklede statistiske ramme for selvvaliderede ensemblemodeller (SVEM). Ud over at producere kandidatoptimale formuleringer bygger workflowet også grafiske resuméer af de tilpassede statistiske modeller, der forenkler fortolkningen af resultaterne. De nyligt identificerede kandidatformuleringer vurderes med bekræftelseskørsler og kan eventuelt udføres i forbindelse med et mere omfattende andetfasestudie.

Introduction

Lipidnanopartikel (LNP) formuleringer til in vivo genleveringssystemer involverer generelt fire bestanddele lipider fra kategorierne ioniserbare, hjælper og PEG lipider ^1,2,3. Uanset om disse lipider undersøges alene eller samtidig med andre ikke-blandingsfaktorer, kræver eksperimenter for disse formuleringer "blandingsdesign", fordi - givet en kandidatformulering - forøgelse eller formindskelse af forholdet mellem et hvilket som helst af lipiderne nødvendigvis fører til et tilsvarende fald eller stigning i summen af forholdet mellem de andre tre lipider.

Til illustration antages det, at vi optimerer en LNP-formulering, der i øjeblikket bruger en fast opskrift, der vil blive behandlet som benchmark. Målet er at maksimere styrken af LNP, mens sekundært sigter mod at minimere den gennemsnitlige partikelstørrelse. De undersøgelsesfaktorer, der varieres i eksperimentet, er molære forhold mellem de fire bestanddele lipider (ioniserbart, kolesterol, DOPE, PEG), N: P-forholdet, strømningshastigheden og den ioniserbare lipidtype. De ioniserbare og hjælpelipider (inklusive kolesterol) får lov til at variere over et bredere udvalg af molært forhold, 10-60%, end PEG, som vil blive varieret fra 1-5% i denne illustration. Benchmarkformuleringsopskriften og intervallerne for de øvrige faktorer og deres afrundingsgranularitet er specificeret i supplerende fil 1. I dette eksempel er forskerne i stand til at udføre 23 kørsler (unikke partier af partikler) på en enkelt dag og vil gerne bruge det som deres prøvestørrelse, hvis den opfylder minimumskravene. Simulerede resultater for dette eksperiment findes i supplerende fil 2 og supplerende fil 3.

Rampado og Peer⁴ har offentliggjort et nyligt gennemgangspapir om emnet designede eksperimenter til optimering af nanopartikelbaserede lægemiddelleveringssystemer. Kauffman et ^al.5 overvejede LNP-optimeringsundersøgelser ved hjælp af fraktioneret faktorisk og definitivt screeningsdesign⁶; Disse typer design kan imidlertid ikke rumme en blandingsbegrænsning uden at ty til ineffektive "slack-variabler"7 og anvendes typisk ikke, når blandingsfaktorer er til stede ^7,8. I stedet anvendes "optimale design", der er i stand til at inkorporere en blandingsbegrænsning, traditionelt til blandingsprocesforsøg⁹. Disse designs er rettet mod en brugerspecificeret funktion af undersøgelsesfaktorerne og er kun optimale (i en af en række mulige sanser), hvis denne funktion fanger det sande forhold mellem undersøgelsesfaktorerne og svarene. Bemærk, at der i teksten skelnes mellem "optimale formuleringer" og "optimale formuleringskandidater", hvor sidstnævnte henviser til de bedste formuleringer, der er identificeret ved hjælp af en statistisk model. Optimale designs har tre hovedulemper ved blandingsprocesforsøg. For det første, hvis forskeren ikke forudser en interaktion mellem undersøgelsesfaktorerne, når han specificerer målmodellen, vil den resulterende model være forudindtaget og kan producere ringere kandidatformuleringer. For det andet placerer optimale designs de fleste kørsler på den ydre grænse af faktorrummet. I LNP-undersøgelser kan dette føre til et stort antal tabte kørsler, hvis partiklerne ikke dannes korrekt ved nogen ekstremer af lipid- eller procesindstillingerne. For det tredje foretrækker forskere ofte at have eksperimentelle kørsler på det indre af faktorrummet for at få en modeluafhængig fornemmelse af responsoverfladen og observere processen direkte i tidligere uudforskede områder af faktorrummet.

Et alternativt designprincip er at sigte mod en omtrentlig ensartet dækning af det (blandingsbegrænsede) faktorrum med et rumfyldende design¹⁰. Disse designs ofrer en vis eksperimentel effektivitet i forhold til optimale designs⁹ (forudsat at hele faktorrummet fører til gyldige formuleringer), men præsenterer flere fordele i en afvejning, der er nyttige i denne applikation. Det rumfyldende design gør ingen a priori antagelser om responsfladens struktur; Dette giver det fleksibilitet til at fange uventede forhold mellem undersøgelsesfaktorerne. Dette strømliner også designgenereringen, fordi det ikke kræver, at der træffes beslutninger om, hvilke regressionsbetingelser der skal tilføjes eller fjernes, når den ønskede kørselsstørrelse justeres. Når nogle designpunkter (opskrifter) fører til mislykkede formuleringer, gør rumudfyldningsdesign det muligt at modellere fejlgrænsen over undersøgelsesfaktorerne, samtidig med at de understøtter statistiske modeller for undersøgelsessvarene over de vellykkede faktorkombinationer. Endelig giver den indvendige dækning af faktorrummet mulighed for modeluafhængig grafisk udforskning af responsoverfladen.

For at visualisere blandingsfaktorunderrummet i et blandingsproceseksperiment anvendes specialiserede trekantede "ternære plots". Figur 1 motiverer denne brug: I terningen af punkter, hvor tre ingredienser hver får lov til at variere fra 0 til 1, fremhæves de punkter, der opfylder en begrænsning om, at summen af ingredienserne er lig med 1, med rødt. Blandingsbegrænsningen på de tre ingredienser reducerer det mulige faktorrum til en trekant. I LNP-applikationer med fire blandingsingredienser producerer vi seks forskellige ternære plots for at repræsentere faktorrummet ved at plotte to lipider ad gangen mod en "Andre" -akse, der repræsenterer summen af de andre lipider.

Figur 1: Trekantede faktorregioner. I plottet, der fylder rummet i kuben, repræsenterer de små grå prikker formuleringer, der ikke er i overensstemmelse med blandingsbegrænsningen. De større røde punkter ligger på en trekant indskrevet i terningen og repræsenterer formuleringer, for hvilke blandingsbegrænsningen er opfyldt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Ud over lipidblandingsfaktorerne er der ofte en eller flere kontinuerlige procesfaktorer såsom N: P-forhold, bufferkoncentration eller strømningshastighed. Kategoriske faktorer kan være til stede, såsom ioniserbar lipidtype, hjælperlipidtype eller buffertype. Målet er at finde en formulering (en blanding af lipider og indstillinger for procesfaktorer), der maksimerer en vis grad af styrke og / eller forbedrer fysiokemiske egenskaber såsom minimering af partikelstørrelse og PDI (polydispersitetsindeks), maksimering af procentindkapsling og minimering af bivirkninger - såsom vægttab - i in vivo-undersøgelser . Selv når man starter fra en rimelig benchmarkopskrift, kan der være interesse for at optimere igen givet en ændring i den genetiske nyttelast eller når man overvejer ændringer i procesfaktorerne eller lipidtyperne.

Cornell⁷ giver en endelig tekst om de statistiske aspekter af blandings- og blandingsproceseksperimenter, hvor Myers et ^al.9 giver et fremragende resumé af de mest relevante blandingsdesign- og analyseemner til optimering. Disse værker kan dog overbelaste forskere med statistiske detaljer og med specialiseret terminologi. Moderne software til design og analyse af eksperimenter giver en robust løsning, der i tilstrækkelig grad understøtter de fleste LNP-optimeringsproblemer uden at skulle appellere til den relevante teori. Mens mere komplicerede eller højt prioriterede undersøgelser stadig vil drage fordel af samarbejde med en statistiker og kan anvende optimale snarere end pladsudfyldende design, er vores mål at forbedre forskernes komfortniveau og tilskynde til optimering af LNP-formuleringer uden at appellere til ineffektiv OFAT-test (en-faktor ad gangen)¹¹ eller blot nøjes med den første formulering, der opfylder specifikationerne.

I denne artikel præsenteres en arbejdsgang, der bruger statistisk software til at optimere et generisk LNP-formuleringsproblem, der adresserer design- og analyseproblemer i den rækkefølge, de vil blive stødt på. Faktisk vil metoden fungere for generelle optimeringsproblemer og er ikke begrænset til LNP'er. Undervejs behandles flere almindelige spørgsmål, der opstår, og der gives anbefalinger, der er baseret på erfaring og simuleringsresultater¹². Den nyligt udviklede ramme for selvvaliderede ensemblemodeller (SVEM)¹³ har i høj grad forbedret den ellers skrøbelige tilgang til analyse af resultater fra blandingsproceseksperimenter, og vi bruger denne tilgang til at give en forenklet strategi for formuleringsoptimering. Mens arbejdsgangen er konstrueret på en generel måde, der kunne følges ved hjælp af andre softwarepakker, er JMP 17 Pro unik ved at tilbyde SVEM sammen med de grafiske resuméværktøjer, som vi har fundet nødvendige for at forenkle den ellers mystiske analyse af blandingsproceseksperimenter. Som følge heraf findes JMP-specifikke instruktioner også i protokollen.

SVEM anvender det samme lineære regressionsmodelgrundlag som den traditionelle tilgang, men det giver os mulighed for at undgå kedelige ændringer, der er nødvendige for at passe til en "fuld model" af kandidateffekter ved at bruge enten en fremadrettet udvælgelse eller en straffet selektionsbasistilgang (Lasso). Derudover giver SVEM en forbedret "reduceret model" tilpasning, der minimerer potentialet for at inkorporere støj (proces plus analytisk varians), der vises i dataene. Det fungerer ved at beregne gennemsnittet af de forudsagte modeller, der fremkommer ved gentagne gange at omvægte den relative betydning af hver kørsel i modellen 13,14,15,16,17,18. SVEM giver en ramme for modellering af blandingsproceseksperimenter, der både er lettere at implementere end traditionel single-shot regression og giver bedre kvalitet optimale formuleringskandidater^12,13. De matematiske detaljer i SVEM ligger uden for rammerne af dette papir, og selv et overfladisk resumé ud over den relevante litteraturgennemgang ville distrahere fra dets største fordel i denne applikation: det giver mulighed for en enkel, robust og nøjagtig klik-til-kør-procedure for praktikere.

Den præsenterede arbejdsgang er i overensstemmelse med Quality by Design (QbD)^19-tilgangen til farmaceutisk udvikling²⁰. Resultatet af undersøgelsen vil være en forståelse af det funktionelle forhold, der forbinder materialeattributterne og procesparametrene med kritiske kvalitetsattributter (CQA'er)²¹. Daniel et ^al.22 diskuterer brugen af en QbD-ramme specifikt til RNA-platformproduktion: vores arbejdsgang kan bruges som et værktøj inden for denne ramme.

Protocol

Forsøget, der er beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater, blev udført i overensstemmelse med vejledningen om pasning og brug af forsøgsdyr, og procedurerne blev udført efter retningslinjer fastlagt af vores Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 6-8 uger gamle Balb/C-hunmus blev anskaffet kommercielt. Dyrene modtog ad libitum standard chow og vand og blev opstaldet under standardbetingelser med 12 timers lys / mørke cyklusser ved en temperatur på 65-75 ° F (~ 18-23 ° C) med 40-60% fugtighed.

1. Registrering af undersøgelsens formål, svar og faktorer

BEMÆRK: I hele denne protokol bruges JMP 17 Pro til at designe og analysere eksperimentet. Tilsvarende software kan bruges ved at følge lignende trin. For eksempler og yderligere instruktioner til alle de trin, der udføres i afsnit 1, henvises til supplerende fil 1.

1. Opsummer formålet med eksperimentet i et datostemplet dokument.
2. Angiv de primære responser (CQA'er), der måles under eksperimentet.
3. Angiv eventuelle sekundære reaktioner (f.eks. nedstrømsbegrænsninger på fysiokemiske egenskaber), der kan måles.
4. Angiv procesparametre, der kan være relateret til svarene, herunder dem, der er mest relevante for formålet med undersøgelsen.
5. Hvis undersøgelsen løber over flere dage, skal du inkludere en Dagkategorisk "blokeringsfaktor".
   BEMÆRK: Dette afbalancerer faktorindstillinger på tværs af dage for at forhindre, at skift på dagsniveau i procesgennemsnittet forveksles med undersøgelsesfaktorerne.
6. Vælg de faktorer, der skal varieres, og dem, der skal holdes konstante under undersøgelsen.
   BEMÆRK: Brug risikoprioriteringsværktøjer som fejltilstandseffektanalyser²⁰ til at vælge den mest relevante delmængde af faktorer (figur 2). Normalt bør alle lipider have lov til at variere; selvom det i nogle budgetbegrænsede tilfælde er rimeligt at låse PEG i et fast forhold.
7. Fastlæg intervallerne for de forskellige faktorer og den relevante decimalpræcision for hver.
8. Bestem undersøgelsens designstørrelse (antallet af unikke batcher af partikler) ved hjælp af minimum og maksimum heuristik. Manuelt inkluderede kontrolbenchmarkkørsler tæller ikke med i den kørselsstørrelse, der anbefales af heuristikken.
   BEMÆRK: Følgende heuristik antager, at svarene er kontinuerlige. Den minimale heuristik forudsætter, at det vil være muligt at udføre en opfølgningsundersøgelse, hvis det er nødvendigt, ud over at udføre bekræftelseskørsler for kandidatoptimale formuleringer. Hvis det kun er muligt at udføre bekræftelseskørsler, er det bedre at budgettere for antallet af kørsler opnået fra den maksimale heuristik. For binære primære svar skal du søge hjælp fra en statistiker til at bestemme det passende antal kørsler.
   1. Minimum heuristik: Alloker tre kørsler pr. blandingsfaktor, to pr. kontinuerlig procesfaktor og en pr. niveau af hver kategorisk faktor.
      BEMÆRK: For en undersøgelse med fire lipidfaktorer, to kontinuerlige og en trevejs kategorisk procesvariabel fører dette til et forslag om (3 x 4) + (2 x 2) + 3 = 19 pladsudfyldningskørsler. Tilføj yderligere kørsler, hvis nogle sandsynligvis mislykkes på grund af formulerings- eller måleproblemer.
   2. Maksimal heuristik: Start softwaren til opbygning af optimale designs, og indtast de nødvendige parametre til en anden ordre (inklusive hovedeffekter, tovejsinteraktioner mellem alle effekter og kvadratiske effekter til kontinuerlige procesfaktorer). Beregn den mindste kørselsstørrelse i henhold til softwarens algoritme. Tilføj 1 til resultatet opnået fra softwaren for at definere den maksimale heuristik.
      BEMÆRK: Se Supplerende fil 1 for detaljerede instruktioner om udførelse af disse trin. En prøvesag med fire lipidfaktorer, to kontinuerlige og en trevejs kategorisk procesvariabel, fører til en anbefalet kørselsstørrelse på 34 (33 fra softwareanbefaling + 1). Eventuelle kørsler ud over dette ville sandsynligvis være bedre brugt til bekræftelses- eller opfølgningsundersøgelser.

Figur 2: Årsag og virkning diagram. Diagrammet viser almindelige faktorer i et problem med optimering af LNP-formulering. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Oprettelse af designbordet med et rumfyldende design

1. Åbn JMP, og naviger menulinjen til DOE > Special Purpose > Space Filling Design.
2. Indtast undersøgelsens svar (se supplerende fil 1).
3. Valgfrit: Tilføj kolonner til yderligere svar, der angiver, om hver enkelt skal maksimeres, minimeres eller målrettes, ved at klikke på Tilføj svar.
   BEMÆRK: Disse indstillinger kan ændres senere og påvirker ikke designet. På samme måde kan der tilføjes yderligere kolonner til yderligere svar efter oprettelse af designtabellen.
4. Indtast undersøgelsesfaktorerne og de tilsvarende intervaller. Brug knappen Blanding til at tilføje blandingsfaktorer, knappen Kontinuerlig til at tilføje kontinuerlige faktorer eller knappen Kategorisk til at tilføje kategoriske faktorer.
   BEMÆRK: Denne eksempelundersøgelse bruger de faktorer og intervaller, der er illustreret i figur 3, som inkluderer det ioniserbare molære forhold (mellem 0,1 og 0,6), Helper-molært forhold (også mellem 0,1 og 0,6), kolesterolmolært forhold (mellem 0,1 og 0,6), PEG-molært forhold (fra 0,01 til 0,05) og den ioniserbare lipidtype (som kan være H101, H102 eller H103).
5. Indtast det forudbestemte antal kørsler for designet i feltet Antal kørsler .
6. Valgfrit: Forøg den gennemsnitlige klyngestørrelse fra standard 50 til 2000 via den røde trekantmenu ved siden af overskriften Space Filling Design og i undermenuen Avancerede indstillinger .
   BEMÆRK: Dette er en indstilling for pladsfyldningsalgoritmen, der kan føre til lidt bedre designkonstruktion på bekostning af yderligere beregningstid.
7. Generer designtabellen, der fylder plads, for de valgte faktorer og kørselsstørrelse. Klik på Hurtig fleksibel udfyldning, og klik derefter på Opret tabel.
   BEMÆRK: De første to kørsler fra et eksempeldesign er vist i figur 4.
8. Føj kolonnen Noter til tabellen for at anmærke manuelt oprettede kørsler. Dobbeltklik på den første tomme kolonneoverskrift for at tilføje en kolonne, og dobbeltklik derefter på den nye kolonneoverskrift for at redigere navnet.
9. Hvis det er relevant, skal du manuelt inkorporere benchmarkkontrolkørsler i designtabellen. Medtag en replikat for et af kontrolbenchmarkene. Markér benchmarknavnet i kolonnen Noter , og farvekod benchmarkets replikerede rækker for nem grafidentifikation.
   1. Tilføj en ny række ved at dobbeltklikke på den første tomme rækkeoverskrift, og indtast benchmarkfaktorindstillingerne. Dupliker denne række for at oprette en replikat af benchmarket. Fremhæv begge rækker, og naviger til Rækker > farver for at tildele en farve til graftegningsformål.
      BEMÆRK: Replikatet giver et modeluafhængigt estimat af processen plus analytisk varians og giver yderligere grafisk indsigt.
10. Hvis en benchmarkkontrolkørsel overstiger undersøgelsesfaktorernes rækkevidde, angives dette i kolonnen "Bemærkninger" for fremtidig udelukkelse fra analysen.
11. Blandingsfaktorerne afrundes til den passende granularitet. For at gøre det,
    1. Fremhæv kolonneoverskrifterne for blandingsfaktorerne, højreklik på en af kolonneoverskrifterne, og naviger til Ny formelkolonne > Transformér > Afrund..., indtast det korrekte afrundingsinterval, og klik på OK.
    2. Sørg for, at ingen rækker er markeret ved at klikke på den nederste trekant i skæringspunktet mellem række- og kolonneoverskrifter.
    3. Kopiér værdierne fra de nyoprettede afrundede kolonner (Ctrl + C), og indsæt (Ctrl + V) i de oprindelige blandingskolonner. Til sidst skal du slette kolonnerne med midlertidige afrundede værdier.
12. Når du har afrundet lipidforholdene, skal du kontrollere, at deres sum er lig med 100% ved at vælge kolonneoverskrifterne for blandingsfaktorerne, højreklikke på en og gå til Ny formelkolonne > Kombiner > sum. Hvis en rækkes sum ikke er lig med 1, skal du manuelt justere en af blandingsfaktorerne og sikre, at faktorindstillingen forbliver inden for faktorområdet. Slet sumkolonnen, når justeringerne er udført.
13. Følg den samme procedure, der anvendes til afrunding af blandingsfaktorerne for at afrunde procesfaktorerne til deres respektive granularitet.
14. Formater lipidkolonnerne, så de vises som procenter med det ønskede antal decimaler: Vælg kolonneoverskrifterne, højreklik, og vælg Standardiser attributter .... I det næste vindue skal du indstille Format til Procent og justere antallet af decimaler efter behov.
15. Hvis der tilføjes manuelle kørsler, f.eks. benchmarks, skal du randomisere rækkefølgen af tabelrækkerne igen: Tilføj en ny kolonne med tilfældige værdier (højreklik på den sidste kolonneoverskrift, og vælg Ny formelkolonne > Tilfældig > Tilfældig normal). Sortér denne kolonne i stigende rækkefølge ved at højreklikke på kolonneoverskriften, og slet derefter kolonnen.
16. Valgfrit: Tilføj kolonnen Kør id . Udfyld dette med dags dato, eksperimentnavn og rækkenummer fra tabellen.
    BEMÆRK: Se (figur 5) for et eksempel.
17. Generer ternære plots for at visualisere designpunkterne over lipidfaktorerne (figur 6). Undersøg også kørselsfordelingen over procesfaktorerne (figur 7): Vælg Graf > ternære plot. Vælg kun blandingsfaktorerne for X, Afbildning.
18. Hvis du vil undersøge fordelingen over procesfaktorerne, skal du vælge Analysér > fordeling og angive procesfaktorerne for Y, Kolonner.
    BEMÆRK: Formuleringsforskeren skal bekræfte gennemførligheden af alle kørsler. Hvis der findes umulige kørsler, skal du genstarte designet i betragtning af de nyligt opdagede begrænsninger.

Figur 3: Undersøgelsesfaktorer og intervaller. Skærmbilleder af indstillinger i eksperimentel software er nyttige til gengivelse af undersøgelsesopsætningen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Startoutput for et design, der fylder rummet. Viser de første to rækker i tabellen, indstillinger skal afrundes til den ønskede præcision, samtidig med at det sikres, at lipidmængderne summeres til 1. Benchmarket blev føjet til tabellen manuelt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Formateret undersøgelsestabel. Faktorniveauerne er afrundet og formateret, og kolonnen Kør id er blevet tilføjet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Designpunkter på et ternært plot. De 23 formuleringer er vist som en funktion af de tilsvarende ioniserbare, hjælper og "andre" (kolesterol + PEG) forhold. Det grønne punkt i midten repræsenterer benchmark 33:33:33:1 molært forhold mellem ioniserbart (H101):kolesterol:Helper (DOPE):P EG. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Fordeling af procesfaktorer uden blanding i eksperimentet. Histogrammerne viser, hvordan de eksperimentelle kørsler er fordelt på tværs af ioniserbar lipidtype, N: P-forhold og strømningshastighed. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Kørsel af eksperimentet

1. Kør eksperimentet i den rækkefølge, der er angivet i designtabellen. Registrer udlæsningerne i de kolonner, der er indbygget i eksperimenttabellen.
2. Hvis der udføres flere assays for samme respons på en identisk formuleringsbatch, beregnes et gennemsnit for disse resultater inden for hver batch. Føj en kolonne for hver analysemåling til tabellen.
   1. Hvis du vil opnå et gennemsnit, skal du markere alle relaterede kolonner, højreklikke på en af de valgte kolonneoverskrifter og vælge Ny formelkolonne > Kombiner > Gennemsnit. Brug kolonnen Gennemsnit til fremtidig svaranalyse.
      BEMÆRK: Uden at starte opskriften på ny, registrerer gentagne analysemålinger kun assayvarians og udgør ikke uafhængige replikater.
3. Dokumentér enhver forekomst af formuleringsudfældning eller in vivo-tolerabilitetsproblemer (såsom alvorligt vægttab eller død) med binære (0/1) indikatorer i en ny kolonne for hver type problem.

4. Analyse af de eksperimentelle resultater

1. Afbild aflæsningerne, og undersøg fordelingen af svarene: Åbn Graph > Graph Builder , og træk hvert svar ind i Y-området for individuelle plot. Gentag dette for alle svar.
2. Undersøg den relative afstand mellem de farvekodede replikserier, hvis en sådan var inkluderet. Dette giver mulighed for at forstå den samlede (procesmæssige og analytiske) variation ved benchmarket sammenlignet med variabiliteten som følge af ændringer i faktorindstillingerne på tværs af hele faktorrummet (figur 8).
3. Bestem, om det rå svar skal modelleres, eller om der skal bruges en transformation i stedet. For svar, der er begrænset til at være positive, men er ubegrænsede ovenfor (f.eks. styrke), skal du passe både en normalfordeling og en lognormalfordeling til de eksperimentelle resultater. Hvis lognormalfordelingen passer bedre med en lavere AICc (korrigeret Akaike's Information Criterion), skal du tage en logtransformation af dette svar.
   1. Gå til Analysér > distribution , og vælg svaret for Y, Kolonner. I den resulterende distributionsrapport skal du klikke på den røde trekant ud for svarnavnet og vælge Kontinuerlig tilpasning > Tilpas normal og Kontinuerlig pasform > Tilpas Lognormal i rullemenuen. I den efterfølgende rapport Sammenlign fordelinger skal du kontrollere AICc-værdierne for at fastslå, hvilken distribution der passer bedst til svaret.
   2. Hvis du vil udføre en logtransformering, skal du højreklikke på svarkolonneoverskriften og vælge Ny formelkolonne > Log > Log. Når en model er oprettet, og en forudsigelseskolonne på logskalaen gemmes, skal du transformere svaret tilbage til den oprindelige skala ved at vælge Ny formelkolonne > Log > Exp.
   3. For proportionsresponser afgrænset mellem 0 og 1 skal du sammenligne tilpasningen af en normal- og betafordeling. Hvis betadistributionen har en lavere AICc, skal du udføre en logittransformation. I rapporten Distribution for svaret skal du vælge Kontinuerlig tilpasning > Tilpas normal og Kontinuerlig tilpasning > Tilpas beta.
      1. I forbindelse med logittransformationen skal du højreklikke på kolonneoverskriften for svar i datatabellen og vælge Ny formelkolonne > Specialitet > Logit. Efter modelbygning skal du gemme forudsigelseskolonnen. Hvis du vil vende tilbage til den oprindelige skala, skal du bruge Ny formelkolonne > Specialitet > Logistik.
         BEMÆRK: Den regressionsbaserede SVEM-analyse er robust over for afvigelser fra normalitet i responsfordelingen. Disse transformationer kan dog føre til lettere fortolkning af resultaterne og til en forbedret tilpasning af modellerne.
4. Graf kørslerne på et ternært plot. Farv punkterne i henhold til svarene (eller de transformerede svar, hvis der blev anvendt en transformation): Åbn Diagram > ternært plot. Vælg kun blandingsfaktorerne for X, Afbildning. Højreklik på en af de resulterende grafer, vælg Rækkeforklaring , og vælg derefter kolonnen (transformeret) svar.
   BEMÆRK: Farvning af punkterne i henhold til svar giver et modeluafhængigt visuelt perspektiv på adfærd i forhold til blandingsfaktorer.
5. Slet det modelscript, der genereres af designet til udfyldning af plads.
6. Opbyg en uafhængig model for hvert svar som funktion af undersøgelsesfaktorerne, og gentag følgende trin for hvert svar.
   BEMÆRK: I tilfælde af et sekundært binært svar (f.eks. formuleringsfejl eller musedød) skal du også modellere dette svar. Skift målfordelingsindstillingen fra Normal til Binomial.
7. Konstruer en "fuld" model, der omfatter alle kandidateffekter. Denne model skal omfatte hovedvirkningerne af hver faktor, to- og trevejsinteraktioner, kvadratiske og delvise kubiske termer i procesfaktorerne og Scheffé-kubiktermer for blandingsfaktorerne^23,24.
   BEMÆRK: Brug det samme sæt kandidateffekter til hvert svar. SVEM-modelvalgsteknikken vil uafhængigt forfine modellerne for hvert svar, hvilket potentielt resulterer i unikke reducerede modeller for hver enkelt. Figur 9 illustrerer nogle af disse kandidatvirkninger. Følgende undertrin beskriver denne proces.
   1. Vælg Analysér > tilpasningsmodel.
   2. Sørg for, at blokerende faktorer (f.eks. Dag) ikke får lov til at interagere med andre undersøgelsesfaktorer. Vælg eventuelle blokeringsfaktorer, og klik på Tilføj. Medtag ikke disse faktorer i nogen af de efterfølgende undertrin.
      BEMÆRK: Blokeringsfaktorer er vigtige at tage højde for i modellen, men blokeringsfaktorer bør ikke have lov til at interagere med andre undersøgelsesfaktorer. Hovedformålet med blokeringsfaktorer er at hjælpe med at kontrollere eksperimentets variabilitet og forbedre eksperimentets følsomhed.
   3. Fremhæv alle undersøgelsesfaktorerne. Rediger værdien i feltet Grad til 3 (den er som standard indstillet til 2). Klik på Factorial til grad.
      BEMÆRK: Denne handling omfatter hovedeffekter samt to- og trevejsinteraktioner i modellen.
   4. Vælg kun faktorerne for ikke-blanding i valgvinduet. Klik på Makroer > Delvis kubik.
      BEMÆRK: Denne handling introducerer kvadratiske effekter for de kontinuerlige procesfaktorer og deres interaktion med andre ikke-blandingsfaktorer i modellen.
   5. Vælg kun blandingsfaktorerne på valglisten. Klik på Makroer > Scheffe Cubic. Deaktiver standardindstillingen Ingen skæringspunkt (se figur 9).
      BEMÆRK: Inkludering af et skæringspunkt i modellen er et vigtigt trin, når du bruger lassometoder, og det er også nyttigt i forbindelse med fremadrettet valg. Den traditionelle standardindstilling Intet skæringspunkt er normalt på plads, fordi det ikke er muligt at tilpasse et skæringspunkt samtidigt med alle blandingens hovedeffekter uden ændringer såsom SVEM-metoden med den almindelige mindste kvadraters regressionsprocedure¹².
   6. Angiv svarkolonnen: Fremhæv svarkolonnen, og klik på Y.
   7. Skift indstillingen Personlighed til Generaliseret regression. Hold Distribution indstillet til Normal.
   8. Gem denne modelopsætning i datatabellen til brug med yderligere svar ved at klikke på den røde trekantmenu ud for Modelspecifikation og vælge Gem i datatabel.
8. Anvend SVEM-metoden til fremadrettet udvælgelse, så den passer til den reducerede model, uden obligatorisk medtagelse af blandingsfaktorens hovedeffekter, og gem kolonnen med forudsigelsesformlen i datatabellen.
   1. I dialogboksen Tilpas model skal du klikke på Kør.
   2. For estimeringsmetoden skal du vælge SVEM-fremadrettet valg.
   3. Udvid menuerne Avancerede kontrolelementer > gennemtving udtryk , og fjern markeringen i de felter, der er knyttet til blandingens hovedeffekter. Kun feltet Skæringspunkt bør forblive markeret. Figur 10 viser standardopsætningen, hvor hovedeffekterne tvinges. I dette trin skal disse felter ikke være markeret, så modellen kan medtage eller udelukke disse effekter baseret på proceduren for fremadrettet udvælgelse.
   4. Klik på Gå for at køre SVEM-proceduren for fremadrettet udvælgelse.
9. Plot de faktiske svar ved hjælp af de forudsagte svar fra SVEM-modellen for at verificere en rimelig forudsigelsesevne. (Figur 11). Klik på den røde trekant ud for SVEM-markering fremad, og vælg Diagnostiske afbildninger > Afbild faktisk efter forudsagt.
10. Klik på den røde trekant ud for SVEM-markering fremad, og vælg Gem kolonner > Gem forudsigelsesformel for at oprette en ny kolonne, der indeholder forudsigelsesformlen i datatabellen.
11. Valgfrit: Gentag ovenstående trin ved hjælp af SVEM Lasso som estimeringsmetode for at afgøre, om der foreslås en anden optimal opskrift efter udførelse af de efterfølgende trin. Hvis det er tilfældet, skal du køre begge opskrifter som bekræftelseskørsler (diskuteret i afsnit 5) for at se, hvilken der fungerer bedst i praksis¹².
12. Gentag modelopbygningstrinnene for hvert svar.
13. Når forudsigelseskolonner for alle svar er gemt i datatabellen, skal du tegne grafen over svarsporingerne for alle forudsagte svarkolonner ved hjælp af profilplatformen: Vælg Graph > Profiler, og vælg alle de forudsigelseskolonner, der blev oprettet i forrige trin for Y, Forudsigelsesformel, og klik på OK (Figur 12).
14. Identificer kandidat optimal formulering(er).
    1. Definer "ønskværdighedsfunktionen" for hvert svar, og angiv, om svaret skal maksimeres, minimeres eller matches med et mål. Angiv alle primære svar til at bruge en vigtighedsvægt på 1,0 og eventuelle sekundære svar til at bruge en vigtighedsvægt på 0,2. Fra den røde trekantmenu Forudsigelsesprofil skal du vælge Optimering og ønskværdighed > Ønskelighedsfunktioner og derefter Optimering og ønskværdighed > Angiv ønskværdigheder. Indtast indstillingerne i de efterfølgende vinduer.
       BEMÆRK: De vigtige vægte er relative og subjektive, så det er værd at kontrollere følsomheden af det kombinerede optimale for ændringer i disse vægte inden for et rimeligt interval (f.eks. fra lige vægtning til 1:5 vægtning).
    2. Befal profilen for at finde de optimale faktorindstillinger, der maksimerer ønskelighedsfunktionen (figur 12): Vælg Optimering og ønskværdighed > Maksimer ønskværdighed fra profilen.
       BEMÆRK: De forudsagte værdier af svarene hos de optimale kandidater kan overvurdere værdien af højreskæve svar såsom styrke; Bekræftelseskørslerne vil dog give mere nøjagtige observationer af disse kandidatformuleringer. Hovedformålet er at finde den optimale formulering ( indstillingerne for den optimale opskrift).
    3. Registrer de optimale faktorindstillinger, og bemærk de vigtige vægtninger, der bruges til hvert svar: I menuen Forudsigelsesprofil skal du vælge Faktorindstillinger > Husk indstillinger.
15. Valgfrit: For kategoriske faktorer såsom ioniserbar lipidtype skal du finde de betinget optimale formuleringer for hvert faktorniveau.
    1. Indstil først det ønskede niveau for faktoren i profilen, hold derefter Ctrl-tasten nede, og venstreklik inde i grafen for den faktor, og vælg Lås faktorindstilling. Vælg Optimering og ønskværdighed > Maksimer ønskværdighed for at finde det betingede optimale med denne faktor låst ved dens aktuelle indstilling.
    2. Lås faktorindstillingerne op, før du fortsætter, ved hjælp af den samme menu, der bruges til at låse faktorindstillingerne.
16. Gentag optimeringsprocessen efter justering af svarenes vigtighedsvægte (ved hjælp af Optimering og ønskværdighed > Indstil ønskværdigheder), måske kun optimering af de primære svar eller indstilling af nogle af de sekundære svar til at have mere eller mindre vigtighedsvægt eller indstilling af målet for de sekundære svar på Ingen (figur 13).
17. Optag den nye optimale kandidat (vælg Faktorindstillinger > Husk indstillinger i menuen Forudsigelsesprofil).
18. Fremstil grafiske oversigter over de optimale områder af faktorrummet: Generer en datatabel med 50.000 rækker udfyldt med tilfældigt genererede faktorindstillinger inden for det tilladte faktorrum sammen med de tilsvarende forudsagte værdier fra den reducerede model for hvert af svarene og den fælles ønskværdighedsfunktion.
    1. I profilen skal du vælge Output tilfældig tabel. Indstil Hvor mange kørsler der skal simuleres? til 50.000, og klik på OK .
       BEMÆRK: Dette genererer en ny tabel med de forudsagte værdier for svarene ved hver af de 50.000 formuleringer. Kolonnen Ønskværdighed afhænger af vigtighedsvægtene for de svar, der er på plads, når indstillingen Tilfældig outputtabel er valgt.
    2. I den nyoprettede tabel skal du tilføje en ny kolonne, der beregner fraktilen for kolonnen Ønskelighed. Brug denne fraktilkolonne i de ternære afbildninger i stedet for den rå ønskværdighedskolonne. Højreklik på kolonneoverskriften Ønskværdighed, og vælg Ny formelkolonne > Fordelingsmæssig > Akkumuleret sandsynlighed for at oprette en ny kolonne Kumulativ sandsynlighed[Ønskelighed].
    3. Generer den grafik, der er beskrevet i følgende trin. Gentagne gange ændre grafikkens farveskema for at få vist forudsigelserne for hvert svar og for kolonnen Kumulativ sandsynlighed[Ønskelighed].
    4. Konstruere ternære plots for de fire lipidfaktorer. Gå til Diagram > ternært diagram i tabellen, vælg blandingsfaktorerne for X, Afbildning, og klik på OK. Højreklik i en af de resulterende grafer, vælg Rækkeforklaring, og vælg derefter kolonnen med forudsagt svar. Skift rullemenuen Farver til Jet.
       BEMÆRK: Dette viser de bedste og dårligste regioner med hensyn til lipidfaktorerne. Figur 14 viser percentilerne af ledønskværdigheden, når man overvejer at maksimere styrken (vigtighed=1) og minimere størrelsen (vigtighed=0,2), mens gennemsnittet af faktorer, der ikke er vist på de ternære plotakser. Figur 15 viser den rå forudsagte størrelse. Det er også rimeligt at nedbryde disse grafer betinget af andre faktorer, såsom at skabe et særskilt sæt ternære plots for hver ioniserbar lipidtype med et lokalt datafilter (tilgængeligt fra den røde trekantmenu ved siden af Ternary Plot).
    5. På samme måde skal du bruge Graph > Graph Builder til at plotte de 50.000 farvekodede punkter (der repræsenterer unikke formuleringer) mod procesfaktorerne uden blanding, enten individuelt eller i fællesskab, og søge efter relationer mellem responsen (e) og faktoren (e). Se efter de faktorindstillinger, der giver den højeste ønskværdighed. Udforsk forskellige kombinationer af faktorer i grafikken.
       BEMÆRK: Når du farvelægger grafer, skal du bruge Kumulativ sandsynlighed[Ønskværdighed], men når du plotter ønskværdigheden på den lodrette akse mod procesfaktorer, skal du bruge den rå ønskværdighedskolonne . Kolonnen Ønskværdighed kan også placeres på en akse i graf- > scatterplot-3D-visualiseringen sammen med to andre procesfaktorer til multivariat udforskning. Figur 16 viser den fælles ønskværdighed af alle de formuleringer, der kan dannes med hver af de tre ioniserbare lipidtyper. De mest ønskelige formuleringer bruger H102, hvor H101 giver nogle potentielt konkurrencedygtige alternativer.
    6. Gem profilen og dens huskede indstillinger i datatabellen igen. Klik på den røde trekant ud for Profiler , og vælg Gem script > Datatabel....

Figur 8: Observerede styrkemålinger fra eksperimentet. Punkterne viser styrkeværdierne, der blev observeret fra de 23 kørsler; De replikerede benchmarkkørsler vises med grønt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 9: Softwaredialog til start af analysen. Kandidateffekterne er indtastet sammen med målstyrkeresponsen, og indstillingen Ingen skæringspunkt er ikke markeret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 10. Yderligere dialogboks til angivelse af SVEM-indstillinger. Som standard tvinges lipidhovedeffekterne ind i modellen. Da et skæringspunkt er inkluderet, anbefaler vi, at du fjerner markeringen i disse felter for ikke at gennemtvinge effekterne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 11: Faktisk efter forventet plot. Denne figur plotter den observerede styrke mod den værdi, der forudsiges for hver formulering af SVEM-modellen. Korrelationen behøver ikke at være så stærk som i dette eksempel, men forventningen er at se mindst en moderat korrelation og kontrollere for outliers. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 12: Forudsigelsesprofil. De to øverste rækker af grafer viser udsnittene af den forudsagte responsfunktion ved den optimale formulering (som identificeret ved SVEM-metoden). Den nederste række af grafer viser formuleringens vægtede "ønskværdighed", som er en funktion af den sidste kolonne af grafer, der viser, at styrken skal maksimeres, og størrelsen skal minimeres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 13: Tre optimale formuleringskandidater fra SVEM-Forward Selection. Ændring af den relative vigtighedsvægtning af svarene kan føre til forskellige optimale formuleringer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 14: Ternære plots for percentilen af ønskværdighed. Plottet viser de 50.000 formuleringer farvekodet med percentil af ønskværdighed, hvor ønskværdigheden er indstillet med vigtighedsvægt på 1,0 for at maksimere styrke og 0,2 for at minimere størrelse, disse plots viser, at det optimale område af formuleringer består af lavere procentdele ioniserbart lipid og højere procentdele af PEG. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 15: Ternært plot for den forudsagte størrelse. Plottet viser størrelsesforudsigelserne fra SVEM-modellen for hver af de 50.000 formuleringer. Størrelsen minimeres med højere procentdele af hjælperlipid og maksimeres med lavere procentdele af hjælper. Da de andre faktorer varierer frit på tværs af de 50.000 plottede formuleringer, indebærer dette, at dette forhold gælder på tværs af intervallerne for de andre faktorer (PEG, strømningshastighed osv.). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 16: Violinplots for ønskeligheden af formuleringer, der involverer de tre forskellige ioniserbare lipidtyper. Hvert af de 50.000 punkter repræsenterer en unik formulering fra hele det tilladte faktorrum. Toppene af disse fordelinger er de maksimale værdier af ønskværdighed, der beregnes analytisk med forudsigelsesprofilen. H102 har den største top og giver dermed den optimale formulering. SVEM-tilgangen til opbygning af modellen, der genererer dette output, filtrerer automatisk statistisk ubetydelige faktorer fra: Formålet med denne graf er at overveje praktisk betydning på tværs af faktorniveauerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Bekræftelsen kører

1. Udarbejd en tabel over de optimale kandidater, der tidligere er identificeret (figur 17).
   BEMÆRK: Værdierne True Potency og True Size i figur 17 udfyldes ved hjælp af de simulerede genereringsfunktioner: i praksis opnås disse ved at formulere og derefter måle ydeevnen af disse opskrifter.
   1. Medtag benchmarkkontrolelementet med det sæt kandidatkørsler, der skal formuleres og måles.
   2. Hvis nogen af formuleringerne fra eksperimentet viste sig at give ønskelige resultater, måske ved at overgå benchmarket, skal du vælge det bedste, der skal føjes til kandidattabellen og teste igen sammen med nye formuleringer.
      BEMÆRK: Tilføj enten manuelt ønskede kørsler til kandidattabellen, eller brug profilvinduets huskede indstillinger , hvis disse kørsler er fra det forrige eksperiment. Identificer kørslens rækkenummer, naviger til Forudsigelsesprofil > Faktorindstillinger > Angiv til Data i række, og indtast rækkenummeret. Vælg derefter Forudsigelsesprofil > Faktorindstillinger > Husk indstillinger , og mærk dem korrekt (f.eks. "benchmark" eller "bedst kørsel fra det forrige eksperiment").
   3. Højreklik på tabellen Huskede indstillinger i profilen, og vælg Gør til datatabel.
      BEMÆRK: Afhængigt af undersøgelsens prioritet og budget kan du overveje at køre replikater for hver bekræftelseskørsel, især hvis benchmarket udskiftes. Opret og analyser hver formulering to gange ved hjælp af det gennemsnitlige resultat til rangering. Vær opmærksom på kandidater med et bredt svarområde på tværs af de to replikater, da dette kan indikere høj procesvarians.
   4. Hvis det er nødvendigt på grund af budgetbegrænsninger, skal du nedvælge blandt de identificerede kandidater for at matche forsøgsbudgettet eller for at eliminere overflødige kandidater.
2. Udfør bekræftelseskørslerne. Konstruer formuleringerne og saml aflæsningerne.
3. Kontroller, om der er overensstemmelse mellem resultaterne fra det oprindelige eksperiment og resultaterne for bekræftelsesbatchen for benchmarks eller andre gentagne opskrifter. Hvis der er et stort og uventet skift, skal du overveje, hvad der kan have bidraget til skiftet, og om det er muligt, at alle kørsler fra bekræftelsesbatchen blev påvirket.
4. Sammenlign ydeevnen af kandidatens optimale formuleringer. Undersøg, om der var nye kandidater, der klarede sig bedre end benchmarket.
5. Valgfrit: Føj resultatet af bekræftelseskørslerne til forsøgstabellen, og kør analysen igen i afsnit 4.
   BEMÆRK: Det næste trin i arbejdsprocessen indeholder instruktioner til opbygning af en opfølgningsundersøgelse sammen med disse kørsler, hvis det ønskes.

Figur 17: Tabel over ti optimale kandidater, der skal køres som bekræftelseskørsler. True Potency og True Size er blevet udfyldt fra simuleringsgenereringsfunktionerne (uden nogen tilføjet proces eller analytisk variation). Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Valgfrit: Design af en opfølgningsundersøgelse, der skal køres samtidig med bekræftelseskørslerne

1. Vurder behovet for en opfølgende undersøgelse under hensyntagen til følgende kriterier:
   1. Bestem, om den optimale formulering ligger langs en af faktorgrænserne, og om et andet eksperiment ønskes at udvide mindst et af faktorområderne.
   2. Evaluer, om det indledende eksperiment brugte en relativt lille kørselsstørrelse eller relativt store faktorintervaller, og om der er behov for at "zoome ind" på det identificerede optimale område med yderligere kørsler og opdateret analyse.
   3. Kontroller, om der indføres en yderligere faktor. Dette kan være et niveau af en kategorisk faktor, såsom et yderligere ioniserbart lipid eller en faktor, der forblev konstant i den indledende undersøgelse, for eksempel bufferkoncentration.
   4. Hvis ingen af ovenstående betingelser er opfyldt, skal du fortsætte til trin 7.
2. Forbered dig på, at der udføres yderligere forsøgskørsler samtidig med bekræftelseskørslerne.
   1. Definer faktorgrænserne, der sikrer en delvis overlapning med regionen fra den indledende undersøgelse. Hvis der ikke er overlapning, skal der udarbejdes en ny undersøgelse.
   2. Udvikl de nye eksperimentelle kørsler med et rumfyldende design. Vælg DOE > Special Purpose > Space Filling Design.
      BEMÆRK: For avancerede brugere skal du overveje et D-optimalt design via DOE > Custom Design.
   3. Når pladsudfyldningskørslerne er genereret, skal du manuelt inkorporere to eller tre kørsler fra det oprindelige eksperiment, der ligger inden for det nye faktorrum. Fordel disse kørsler tilfældigt i eksperimenttabellen ved hjælp af de trin, der er beskrevet i afsnit 2, for at tilføje rækker og derefter randomisere rækkerækkefølgen.
      BEMÆRK: Disse vil blive brugt til at estimere ethvert skift i responsmidlerne mellem blokke.
   4. Sammenkæd bekræftelseskørslerne, og den nye pladsudfyldning løber i en enkelt tabel, og randomiser kørselsrækkefølgen. Brug Tabeller > sammenkæd , og opret og sortér derefter efter en ny tilfældig kolonne for at randomisere kørselsrækkefølgen, som beskrevet i afsnit 2.
3. Formuler de nye opskrifter og saml resultaterne.
4. Sammenkæd de nye eksperimentkørsler og -resultater med den oprindelige eksperimentdatatabel, og introducer en eksperiment-id-kolonne for at angive kilden til hvert resultat. Brug tabeller > sammenkædning , og vælg indstillingen Opret kildekolonne.
5. Kontroller, at kolonneegenskaberne for hver faktor viser det kombinerede område over begge undersøgelser: Højreklik på kolonneoverskriften for hver faktor, og undersøg egenskabsområderne Kodning og blanding , hvis de findes.
6. Begynd analysen af det nye eksperiments resultater.
   1. Medtag kolonnen eksperiment-id som et udtryk i modellen, der fungerer som en blokeringsfaktor. Sørg for, at dette udtryk ikke interagerer med undersøgelsesfaktorerne. Kør dialogscriptet Tilpas model , der er gemt i tabellen i Afsnit 4, vælg kolonnen eksperiment-id, og klik på Tilføj for at medtage den på listen over kandidateffekter.
   2. Kør dialogboksen Tilpas model i tabellen sammenkædede data for i fællesskab at analysere resultaterne fra det nye eksperiment og den indledende undersøgelse. Overhold tidligere instruktioner for at generere opdaterede, optimale formuleringskandidater og grafiske resuméer.
   3. Til validering skal du uafhængigt analysere resultaterne fra det nye eksperiment, eksklusive resultater fra det oprindelige eksperiment. Det vil sige, udfør trinene beskrevet i afsnit 4 på den nye eksperimentelle tabel.
   4. Sørg for, at optimale formuleringer identificeret af disse modeller stemmer nøje overens med dem, der anerkendes af den fælles analyse.
   5. Gennemgå grafiske resuméer for at bekræfte, at både de fælles og individuelle analyser af de nye eksperimentelle resultater udviser lignende responsoverfladeadfærd (hvilket betyder, at der er et lignende forhold mellem responsen (e) og faktorerne).
   6. Sammenlign de kombinerede og individuelle analyser af nye resultater med det indledende eksperiment for konsistens. Brug lignende grafstrukturer til sammenligning og undersøg de identificerede optimale opskrifter for forskelle.

7. Dokumentation af undersøgelsens endelige videnskabelige konklusioner

1. Hvis benchmarkkontrolelementet ændres til en nyligt identificeret opskrift på grund af undersøgelsen, skal du logge den nye indstilling og angive de design- og analysefiler, der registrerer dens oprindelse.
2. Oprethold alle eksperimentelle tabeller og analyseoversigter, helst med datostemplede filnavne, til fremtidig reference.

Representative Results

Denne tilgang er blevet valideret på tværs af begge bredt klassificerede lipidtyper: MC3-lignende klassiske lipider og lipidoider (f.eks. C12-200), generelt afledt af kombinatorisk kemi. Sammenlignet med en benchmark LNP-formulering udviklet ved hjælp af en One Factor at a Time (OFAT) -metode viser kandidatformuleringerne, der genereres gennem vores arbejdsgang, ofte styrkeforbedringer på 4 til 5 gange på en logaritmisk skala, som vist i museleverluciferaseaflæsningerne i figur 18. Tabel 1 viser de tilsvarende forbedringer i luciferaseekspression i muselever, der blev observeret over benchmarkkontrolydelsen gennem to optimeringsfaser (en indledende undersøgelse og en efterfølgende opfølgningsundersøgelse). I den første fase var fokus på at optimere lipidforholdene, samtidig med at andre faktorer blev holdt konstante. I opfølgningsundersøgelsen blev en yderligere hjælperlipidtype introduceret, og optimering blev udført under hensyntagen til både lipidforholdets sammensætning og hjælperlipidtypen. Derfor blev den nyligt introducerede hjælperlipidtype valgt til at blive brugt med den tilhørende optimerede lipidsammensætning. Den betydelige forbedring i styrke tyder på, at disse optimerede sammensætninger kan udvise overlegne endosomale flugtegenskaber²⁵.

Simuleringer kan bruges til at vise den forventede kvalitet af den optimale kandidat, der produceres ved denne procedure. Inden for rammerne af eksempeleksperimentet, der bruges i protokollen, kan vi gentage simuleringen mange gange for forskellige kørselsstørrelser og evaluere resultaterne i henhold til den simulerede procesgenererende funktion. Et JMP-script til dette formål findes i supplerende fil 4. Specifikt blev der genereret et rumudfyldningsdesign, og responskolonnerne blev befolket med værdier fra vores generatorfunktioner plus støj, der repræsenterer analytisk og procesvariation. Vi tilpasser disse simulerede svar med forskellige analyseteknikker (herunder SVEM Forward Selection) for at producere en tilsvarende kandidatoptimal opskrift. Kandidaterne fra hver analysemetode sammenlignes derefter med værdien af det sande optimale fra de genererende funktioner. Figur 19 illustrerer den gennemsnitlige procentdel af den maksimale teoretiske respons, der opnås ved hver af de tre analysemetoder ved hjælp af rumudfyldningsdesign af størrelse angivet på den vandrette akse. Den fulde model, som omfatter alle kandidateffekter og ikke reducerer modellen baseret på den statistiske signifikans af disse effekter, klarer sig dårligst. Meget af det ekstra arbejde, der traditionelt går ud på at tilpasse regressionsmodeller til blandingsproceseksperimenter, involverer ændringer (fjernelse af skæringspunktet, tvungen blandingens hovedvirkninger, udelukkelse af brugen af rene kvadratiske blandingseffekter osv.), der er nødvendige for at passe til denne fulde model⁹, og ud fra dette perspektiv er disse procedurer unødvendige¹². Desuden kan denne model ikke passe, før designstørrelsen når antallet af effekter i modellen. Ved mindre eksperimentelle størrelser kan vi tilpasse den traditionelle fremadrettede udvælgelsesmetode, som overgår den fulde model med hensyn til den gennemsnitlige ydeevne for den optimale kandidatformulering for hver fast eksperimentel størrelse. På samme måde forbedrer SVEM-ændringen af denne forward selection-tilgang yderligere resultaterne for de optimale kandidater. Dette plot afslører, at brug af SVEM-Forward Selection^12,13 til at analysere et 24-kørsler rumudfyldningseksperiment opnår den samme gennemsnitlige kvalitet, der typisk kræver 50 kørsler, når den analyseres med en traditionel fremadrettet udvælgelse (målretning minimum AICc) model. Selvom den faktiske ydeevne vil variere fra proces til proces, demonstrerer denne simulering - sammen med offentliggjorte resultater på SVEM 12,13,16,17,26 - potentialet i denne modelleringsprocedure til formuleringsoptimering.

Figur 18: Forbedring af leverluciferaseekspression efter to forsøgsrunder. Runde 0 viser leverluciferaseaflæsningen for benchmarkformuleringen; Runde 1 viser leverluciferaseaflæsningen efter det første eksperiment, som optimerer LNP-bestanddelen lipidmolære forhold; Runde 2 viser leverluciferaseaflæsningen efter det andet eksperiment, som yderligere optimerer de konstituerende molære forhold, samtidig med at der overvejes en yderligere hjælperlipidtype. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 19: Kvaliteten af optimal formulering som funktion af eksperimentel størrelse og statistisk model. Den lodrette akse repræsenterer procentdelen af teoretisk maksimal ønskværdighed, og den vandrette akse repræsenterer størrelsen af rumfyldningsdesignet. Hvert punkt viser gennemsnittet over 150 simuleringer. Den blå linje (trekanter) repræsenterer den fulde model (uden eliminering af statistisk ubetydelige effekter), den gule linje (cirkler) repræsenterer den traditionelle AICc-baserede fremadrettede udvælgelsesmodel (med et skæringspunkt og uden at tvinge blandingens hovedeffekter), og den grønne linje (omvendte trekanter) repræsenterer den SVEM-baserede fremadrettede udvælgelsesmodel (med et skæringspunkt og uden at tvinge blandingens hovedeffekter). Klik her for at se en større version af denne figur.

Rund	Partikel-id	Luciferaseekspression i leveren (foton/sek)
0	Benchmark for kontrol	8.E+06
1	Optimeret over lipidforhold	2.E+09
2	Optimeret over lipidforhold og hjælper lipidtype	8.E+10

Tabel 1: Systematisk forbedring af luciferase ekspression gennem Design of Experiment (DOE) optimering. Denne tabel illustrerer den betydelige forbedring i ekspressionen af luciferase, med en op til 10.000 gange forbedring på foton/sekund-skalaen, fra det indledende benchmark til den endelige "optimale kandidat".

Supplerende fil 1: 04APR2023 Resumé.docx - Dette dokument indeholder en oversigt over undersøgelsen, herunder dens formål, de vurderede svar, de overvejede faktorer og det samlede antal kørsler, der er udført. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: 23_run_simulated_experiment.jmp - En JMP-fil med det simulerede eksperiment og dets resultater. Denne fil indeholder også vedhæftede analyse scripts kompatibel med JMP 17 Pro. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: 23_run_simulated_experiment.xlsx - En Excel-fil, der indeholder det simulerede eksperiment og dets resultater, velegnet til læsere, der muligvis ikke har adgang til JMP. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: blandingssimulering 20DEC22.jsl - Dette er et JMP 17 Pro-script, der bruges til at simulere LNP-formuleringseksperimenter og evaluere udførelsen af forskellige analysemetoder. Scriptet bruger SVEM-Forward Selection (no intercept)-metoden, som er den nøgleanalysemetode, der bruges i denne arbejdsproces. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Moderne software til design og analyse af blandingsproceseksperimenter gør det muligt for forskere at forbedre deres lipidnanopartikelformuleringer i en struktureret arbejdsgang, der undgår ineffektive OFAT-eksperimenter. Den nyligt udviklede SVEM-modelleringsmetode eliminerer mange af de mystiske regressionsmodifikationer og modelreduktionsstrategier, der tidligere kan have distraheret forskere med fremmede statistiske overvejelser. Når resultaterne er indsamlet, tilbyder SVEM-analyserammen en tilgang, der både er lettere at implementere og har tendens til at producere bedre modeller end traditionelle modelleringsmetoder¹³. Desuden er de grafiske analyser, der er baseret på forudsigelsesformlerne for hvert svar, let fortolkelige af forskere, hvilket giver et klart resumé af responsens marginale opførsel over individuelle faktorer såvel som små grupper af faktorer uden at kræve fortolkning af stærkt korrelerede parameterestimater fra en regressionsmodel. Dette giver forskere mulighed for at fokusere på at vurdere praktisk betydning på tværs af undersøgelsesfaktorer, efter at SVEM automatisk har fjernet statistisk ubetydelige effekter.

Arbejdsprocessen er blevet brugt i praksis til systematisk at variere lipidsammensætning og formuleringsparametre såsom N / P-forhold, strømningshastighed og blandingsforhold til optimering og til at vælge de bedste hjælperlipidtyper, ioniserbare lipidtyper og buffertyper. Målene på tværs af disse eksempler inkluderer normalt maksimering af in vivo- eller in vitro-styrke og indkapsling af varierende nyttelast som mRNA eller DNA til relevante in vivo-mål såsom leverceller eller undertiden på tværs af flere celletyper i tilfælde af in vitro-applikationer. Til specifikke anvendelser skal vi muligvis afbalancere biofysiske egenskaber såsom størrelse, PDI, zetapotentiale og procentvis indkapsling, mens vi undersøger in vivo-styrke. Derudover er målet at finde en potent, men veltolereret formulering, og derfor kan vi inkludere reaktioner som ændring i kropsvægt, cytokinrespons eller udløsning af leverenzymer som ASAT / ALT i analysen. Der er opstået mønstre fra talrige LNP-eksperimenter. Især synes ændringer i det molære forhold mellem det ioniserbare lipid og N / P-forholdet at påvirke RNA-indkapsling betydeligt. Desuden synes ændringer i PEG-molært forhold at påvirke partikelstabiliteten, som indikeret af påvirkninger på størrelse og PDI. Generelt har et overskud af PEG i LNP-kernen tendens til at have en skadelig virkning på styrken hos mus.

Præstationsforbedringer er især mærkbare, når mere end et svar er målrettet: selvom benchmarket allerede fungerer godt med hensyn til det primære respons (f.eks. Styrke), opretholder eller forbedrer ledoptimering typisk adfærden med hensyn til det primære respons, samtidig med at adfærd forbedres i forhold til andre svar (minimering af PDI, størrelse eller vægttab). Vi validerer ægtheden af disse forbedringer med bekræftelseskørsler, hvor vi forbereder og direkte sammenligner benchmarkformuleringen (muligvis med en replikat) og nye kandidatformuleringer.

Designfasen af denne arbejdsgang har flere kritiske trin. Først skal du sikre dig, at faktorerne og deres intervaller indtastes korrekt i den pladsfyldende designplatform. For det andet skal du bruge grafik og emnekendskab til at bekræfte gennemførligheden af hver resulterende formulering, inden eksperimentet påbegyndes. Til sidst skal du udføre eksperimentet efter den randomiserede rækkefølge, der er angivet af designtabellen. Overholdelse af denne sekvens hjælper med at forhindre ikke-målte kovariater - såsom rækkefølgen af formuleringsproduktion eller omgivelsestemperatur - i at forvirre de faktorer, der undersøges. Designene, der fylder rummet, er lettere at konstruere - med mindre potentiale for brugerfejl end optimale blandingsprocesdesign, som kræver ekstra beslutninger under opsætningen, der kan frustrere uerfarne brugere og afskrække dem fra at bruge designede eksperimenter. Ikke desto mindre kan forskere efter at have arbejdet gennem denne protokol drage fordel af yderligere læsning om, hvordan optimale designs potentielt kan erstatte rumudfyldningsdesign i protokollen, som beskrevet i kapitel 6 i Goos og Jones (2011) ²⁷. Især for opfølgende undersøgelser, der "zoomer ind" på et optimalt område - hvor der er mindre bekymring for fejl langs blandingsgrænserne - kan D-optimale designs være mere effektive end rumudfyldende design.

På samme måde har analysefasen af denne arbejdsgang flere kritiske trin. Først skal du sikre dig, at modellen specificerer et passende sæt kandidateffekter, herunder interaktioner, snarere end kun de vigtigste (førsteordens) effekter af faktorerne. For det andet skal du anvende SVEM Forward Selection som modelleringsramme. For det tredje skal du deaktivere standardindstillingen Ingen skæringspunkt og undgå at tvinge blandingens hovedeffekter. Endelig skal du indstille ønskelighedsfunktionerne korrekt for svarene, før du starter optimering. For brugere uden adgang til SVEM er den bedste tilgang at bruge traditionel fremadrettet udvælgelse (målretning mod minimum AICc) til regressionsproblemet¹². Protokollen nævner, at det også er muligt at bruge SVEM Lasso: i gennemsnit giver denne tilgang lignende resultater som SVEM Forward Selection, selvom de to tilgange for bestemte datasæt kan producere lidt forskellige optimale formuleringer, der kan sammenlignes med bekræftelseskørsler¹². SVEM Lasso vil dog give ringere modelleringsresultater, hvis brugeren begår den lette fejl at glemme at deaktivere standard No Intercept-indstillingen ¹²: af denne grund har vi brugt SVEM Forward Selection som standardmetode, da den er mere robust over for denne mulighed.

Den primære begrænsning af denne metode er, at der vil være lejlighedsvise undersøgelser med større kompleksitet, der vil drage fordel af hjælp fra en statistiker til design og analyse. Situationer, hvor run-budgettet er mere begrænset end normalt (under minimumsheuristikken), svarene er binære, der er et stort antal kategoriske faktorer eller niveauer af en enkelt kategorisk faktor, hvor et forskningsmål er at overveje at fjerne en eller flere blandingsfaktorer fra opskriften, eller hvor der er yderligere begrænsninger på faktorrummet, kan gribes anderledes an af en statistiker, såsom ved at bruge optimale eller hybrid ^12,28 designs eller ved at tilføje yderligere struktur til designet. Specifikt kan et hybriddesign dannes ved at skabe et pladsudfyldende design med de fleste af de budgetterede kørsler og derefter "forstærke" designet med de resterende kørsler (normalt 2-4) ved hjælp af et D-optimalt kriterium. En anden hybrid tilgang er at generere et rumudfyldningsdesign over blandingen (lipid) og kontinuerlige (proces) faktorer og derefter tilføje eventuelle kategoriske faktorer ved hjælp af en "optimal" tildeling af faktorniveauer. Ikke desto mindre er den forenklede rumudfyldningsdesigntilgang, der er taget i protokollen, blevet udviklet i løbet af de sidste par år i processen med at køre snesevis af LNP-formuleringsoptimeringseksperimenter, og vi mener, at det giver en robust tilgang, der vil fungere med succes i de fleste tilfælde, samtidig med at forskere får tillid til deres evne til at udnytte designede eksperimenter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP Pro 17.1	JMP Statistical Discovery LLC