Summary
मेथनॉल का उपयोग रेटिना होल-माउंट तैयारी और दीर्घकालिक भंडारण के लिए एक सहायक निश्चित माध्यम के रूप में किया जा सकता है, जो रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं की जांच के लिए उपयोगी है।
Abstract
रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं (आरजीसी), जो रेटिना के प्रक्षेपण न्यूरॉन्स हैं, मस्तिष्क को बाहरी दृश्य जानकारी का प्रसार करती हैं। आरजीसी में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों का कई रेटिना अपक्षयी रोगों के साथ घनिष्ठ संबंध है। रेटिना के विकास और रोग संबंधी स्थितियों का मूल्यांकन करने के लिए आरजीसी पर प्रयोगात्मक अध्ययनों में होल-माउंट रेटिना इम्यूनोस्टेनिंग का अक्सर उपयोग किया जाता है। कुछ परिस्थितियों में, कुछ मूल्यवान रेटिना नमूने, जैसे कि ट्रांसजेनिक चूहों से, आकृति विज्ञान या आरजीसी की संख्या को प्रभावित किए बिना लंबे समय तक बनाए रखने की आवश्यकता हो सकती है। विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक परिणामों के लिए, एक प्रभावी संरक्षण माध्यम का उपयोग करना आवश्यक है। यहां, हम रेटिना पूरे-माउंट तैयारी और दीर्घकालिक भंडारण के लिए एक सहायक निश्चित माध्यम के रूप में मेथनॉल के प्रभाव का वर्णन करते हैं। संक्षेप में, अलगाव प्रक्रिया के दौरान, ठंडे मेथनॉल (−20 डिग्री सेल्सियस) को ऊतकों को ठीक करने और उनकी पारगम्यता को सुविधाजनक बनाने में मदद करने के लिए रेटिना की सतह पर पाइप किया जाता है, और फिर रेटिना को इम्यूनोस्टेन्ड होने से पहले ठंडे मेथनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस) में संग्रहीत किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल रेटिना अलगाव वर्कफ़्लो और ऊतक नमूना भंडारण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो आरजीसी की जांच के लिए उपयोगी और व्यावहारिक है।
Introduction
रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं (आरजीसी) रेटिना में एकमात्र प्रक्षेपण न्यूरॉन्स हैं, औरवे मस्तिष्क 1 के बाहर दृश्य जानकारी को एकीकृत और संचारित करते हैं। ग्लूकोमा और दर्दनाक ऑप्टिक न्यूरोपैथी जैसे कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों को अपरिवर्तनीय क्षति और आरजीसी 2,3 के नुकसान की विशेषता है। आरजीसी के रूपात्मक और मात्रात्मक परिवर्तनों का विश्लेषण यह निर्धारित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है कि न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग कैसे विकसित होते हैं और 4,5 को आगे बढ़ाते हैं।
अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख प्रोटीन और सेल गिनती के वितरण की निगरानी के लिए एक व्यापक रूप से स्वीकृत विधि है। प्रयोगशाला में, रेटिना6 की शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों का मूल्यांकन करने के लिए आरजीसी पर प्रयोगात्मक अध्ययनों में आमतौर पर होल-माउंट रेटिना इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग किया जाता है। पूरे रेटिना में आरजीसी परिमाणीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम मार्करों में बीआरएन 3 ए, मल्टीपल स्प्लिसिंग (आरबीपीएमएस) के साथ आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन शामिल हैं, और इसी तरह 7,8 पर। आरजीसी की मात्रा और वितरण को चिह्नित करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले पूरे माउंट रेटिना इम्यूनोस्टेनिंग की आवश्यकता होती है। आम तौर पर, इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल में, एंटीबॉडी में इनक्यूबेट होने से पहले रेटिना को रासायनिक फिक्सेटिव में डुबोया जाता है। आदर्श फिक्सेटिव को कोशिकाओं के आकार, एंटीबॉडी के लिए एपिटोप्स की पहुंच या आत्मीयता, या ऊतक 9,10 के रैखिक आयामों को नहीं बदलना चाहिए।
रेटिना की जटिल संरचना के कारण, रेटिना नाजुकता और तह जैसी समस्याएं, साथ ही सेल संकोचन और अस्पष्ट नाभिक सहित कुछ सामान्य कठिनाइयां, पूरे माउंट रेटिना पैच बनाते समय होने की संभावना होती है, जिसका प्रयोगात्मक अनुसंधान पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है। इसके अलावा, सभी रेटिना तुरंत इम्यूनोस्टेन्ड नहीं होते हैं, खासकर जब यह महंगी कीमतों के साथ ट्रांसजेनिक चूहों के रेटिना की बात आती है जो कीमती मूल के होते हैं, जिससे आगे के उपयोग के लिए अतिरिक्त रेटिना नमूनों के संरक्षण की आवश्यकता होती है।
उपयुक्त फिक्सेटिव समाधान ऊतक को जल्दी से ठीक कर सकता है, ऊतक ऑटोलिसिस से बच सकता है, ऊतक कोशिकाओं की सामान्य आकृति विज्ञान और संरचना को संरक्षित कर सकता है, और प्रोटीन औरअन्य पदार्थों की एंटीजेनिसिटी को बनाए रख सकता है। वर्तमान में, फॉर्मलाडेहाइड-आधारित निर्धारण का व्यापक रूप से विभिन्न ऊतकों में उपयोग किया जाता है, जिसमें अलग-अलग रेटिना, हेमीसेक्टेड आईकप और पूरे नेत्रगोलक10 शामिल हैं। फॉर्मलाडेहाइड11 में विसर्जन के बाद ऊतक संकोचन और कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन दो महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं। इसके अलावा, रेटिना और लक्ष्य कोशिकाओं 9,10 के मूल गुणों के प्रतिधारण को अधिकतम करने के लिए संशोधित निर्धारण फॉर्मूलेशन तेजी से उभर रहे हैं। विभिन्न रेटिना निर्धारण उपचार रेटिना संरचना, प्रोटीन इम्युनोजेनेसिटी, प्रतिदीप्ति उत्तेजना और क्षीणन शमन चक्र को अलग-अलग प्रभावित कर सकते हैं। डेविडसन के समाधान के साथ तय किए गए रेटिना फॉर्मेलिन के साथ तय किए गए लोगों की तुलना में अधिक रूपात्मक रूप से बरकरार हैं, लेकिन डेविडसन का समाधान कुछ एंटीबॉडी के साथ कम संगत है, जैसे कि माइक्रोग्लियल मार्कर-आयनित कैल्शियम बाइंडिंग एडाप्टर अणु 112। रेटिना की नाजुक प्रकृति को ध्यान में रखते हुए, शोधकर्ता स्वाभाविक रूप से आश्चर्यचकित होंगे कि क्या रेटिना अखंडता, साथ ही लक्ष्य कोशिकाओं के गुण और आकृति विज्ञान, दीर्घकालिक भंडारण के बाद बदल जाएंगे। हालांकि, कई महीनों तक भंडारण के बाद रेटिना और आरजीसी सेल आकृति विज्ञान पर निर्धारण समाधान के संभावित प्रभाव शायद ही कभी रिपोर्ट किए गए हैं। आरजीसी के मूल्यांकन और संरक्षण के लिए रेटिना निर्धारण का अनुकूलन महत्वपूर्ण है।
हम एक विश्वसनीय और तकनीकी रूप से सरल विधि का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं जिसका उपयोग हम पूरे-माउंट मुराइन रेटिना स्टेनिंग के लिए करते हैं। हमारी विधि आरजीसी जांच के लिए रेटिना की उचित तैयारी और भंडारण पर जोर देती है, रेटिना ऊतक के दीर्घकालिक भंडारण की आवश्यकता के साथ-साथ फ्लोरोफोर गठन या गिरावट के विशिष्ट पहलुओं को ध्यान में रखते हुए।
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Protocol
सभी चरण कमरे के तापमान पर किए जाते हैं जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए। उपयोग किए गए सभी C57BL / 6J चूहों को वुहान विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला पशु केंद्र से प्राप्त किया गया था, और सभी संबंधित प्रयोगों को वुहान विश्वविद्यालय के पशु प्रयोगों की नैतिकता पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। चूहों की पीड़ा को कम करने के लिए सभी प्रयास किए गए थे।
1. आंखों का न्यूक्लियेशन और निर्धारण
- कार्बन डाइऑक्साइड श्वासावरोध के साथ चूहों को इच्छामृत्यु करें, और दांत रहित चिमटी का उपयोग करके नेत्रगोलक को धीरे से शुद्ध करें।
- फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में एक बार नेत्रगोलक को धो लें।
- नेत्रगोलक में निर्धारण में तेजी लाने और फिक्सिंग दक्षता में सुधार करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कॉर्निया पर एक सिरिंज सुई के साथ नेत्रगोलक को पंचर करें (आईपीस डब्ल्यूएफ: 10x/22; निरंतर आवर्धन उद्देश्य: 0.67x-4.5x)।
- 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) युक्त 24-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें।
- 45 मिनट के लिए 4% पीएफए में नेत्रगोलक को ठीक करें, और फिर अतिरिक्त पीएफए को तुरंत हटाने के लिए इसे 1x पीबीएस में स्थानांतरित करें (तीन बार, 5 मिनट / समय धोएं)।
2. रेटिना अलगाव और चपटापन
- नेत्रगोलक को एक ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें, और इसे एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (आईपीस डब्ल्यूएफ: 10x/22; निरंतर आवर्धन उद्देश्य: 0.67x-4.5x) के नीचे रखें।
- एक हाथ में बल पकड़ें, और नेत्रगोलक आंदोलन को रोकने के लिए कॉर्निया के मार्जिन को दबाने के लिए इसका उपयोग करें। विच्छेदन कैंची को पकड़ने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें और कॉर्नियोस्क्लेरल लिम्बस के माध्यम से लगभग 1 मिमी गहराई पर कॉर्निया के चारों ओर काट लें। लेंस और विट्रियस बॉडी को हटा दें।
- ऑप्टिक डिस्क को केंद्र में रखें, और विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, रेटिना को चार क्वाड्रंट के साथ रेडियल रूप से काटें, रेटिना की त्रिज्या के लगभग 2/3 तक पहुंच जाएं।
- टूटे हुए बल का उपयोग करके स्क्लरल किनारों में से एक को दबाएं। दूसरी ओर, श्वेतपटल के किनारे को बिना टूटे हुए बल के साथ पकड़ें, और वहां से आगे बढ़ें जहां श्वेतपटल को स्क्लेरा के आधार की ओर टोथेड बल द्वारा तय किया जाता है। रेटिना को सावधानी से छीलें।
- रेटिना को फ्लश और गीला करने के लिए पिपेट (200 μL) का उपयोग करके पीबीएस को बंद करें, और फिर शोषक कागज के एक छोटे टुकड़े के साथ किसी भी अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें। यदि आवश्यक हो, तो एक छोटे ब्रिसल ब्रश के साथ रेटिना को धीरे से समतल करें।
- धीरे-धीरे पिपेट ठंडा मेथनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में प्रीकूल्ड) रेटिना की आंतरिक सतह पर बूंद द्वारा गिरता है (मेथनॉल की मात्रा तय नहीं होती है, जब तक रेटिना को पूरी तरह से मेथनॉल द्वारा कवर किया जा सकता है)। रेटिना सफेद हो जाता है और बढ़ी हुई दृढ़ता विकसित करता है।
- धीरे से रेटिना को समतल करें, और छोटे ब्रिसल ब्रश के साथ अवशिष्ट वर्णक झिल्ली और विट्रस शरीर जैसी अशुद्धियों को हटा दें। छोटे ब्रिसल ब्रश का उपयोग करके रेटिना को उलटा करें, और उपर्युक्त प्रक्रिया को दोहराएं।
- मेथनॉल-उपचारित रेटिना को 24-वेल प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें, और इसे मेथनॉल में भिगोकर रखें।
- तत्काल इम्यूनोस्टेनिंग के लिए इसे 1-2 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, या रेटिना को मेथनॉल में छोड़ दें, और इसे दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 24-वेल प्लेट से मेथनॉल निकालें, और 1x पीबीएस के साथ रेटिना को कुल्ला करें।
3. आरजीसी का इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन
- रेटिना को प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ 24-वेल हेमग्लूटिनेशन प्लेट में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें, और 5% पीबीएस-टीएक्स-बीएसए (1 x PBST घोल के 100 मिलीलीटर में 5 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन पाउडर घुल जाता है) में ब्लॉक करें; PBST 4 घंटे के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर ट्राइटन एक्स -100 से 2,000 एमएल ट्राइटन एक्स -100 से 2,000 एमएल जोड़कर बनता है। नाड़ीग्रन्थि को ऊपर रखें।
- पीबीएस-टीएक्स-बीएसए को हटा दें, और 48-96 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रेटिना को इनक्यूबेट करें, 1: 400 कमजोर पड़ने का उपयोग करके चयनित प्राथमिक एंटीबॉडी (गिनी पिग एंटी-आरबीपीएमएस एंटीबॉडी) के 100 μL जोड़ें।
- प्राथमिक एंटीबॉडी को हटा दें, और कमरे के तापमान पर हिलाते हुए 1x पीबीएस के साथ रेटिना को तीन बार (20 मिनट प्रत्येक) कुल्ला करें।
- रेटिना को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हल्के झटकों के साथ 100 μL संबंधित द्वितीयक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका देखें), साइनिन Cy3 affiniPure गधा एंटी-गिनी पिग आईजीजी (एच + एल) के साथ 1: 400 कमजोर पड़ने का उपयोग करके इनक्यूबेट करें।
- रेटिना को 1x PBS के साथ तीन बार (प्रत्येक 20 मिनट) कुल्ला करें।
- रेटिना को गैंग्लियन सेल परत के साथ स्लाइड पर सपाट रखें, एक पिपेट के साथ रेटिना के चारों ओर एंटी-फ्लोरेसेंस शमन एजेंट की एक उचित मात्रा गिराएं, और स्लाइड को कवरस्लिप के साथ कवर करें (सावधान रहें कि बुलबुले न हों)।
नोट: एंटी फ्लोरेसेंस बुझाने वाले की उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए, सुनिश्चित करें कि यह पूरे रेटिना को कवर करता है। उसके बाद, रेटिना को तैरने और आसानी से स्थानांतरित करने की अनुमति दिए बिना स्लाइड को कवर करें। - स्लाइड को हिलने से रोकने के लिए सीलिंग एजेंट के साथ चारों ओर सील करें। नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और उन्हें प्रकाश से बचाएं।
- प्रतिदीप्ति / कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रेटिना की छवि बनाएं।
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Representative Results
विच्छेदन के बाद, रेटिना को एक सपाट चार-पत्ती वाले क्लोवर की तरह दिखना चाहिए। इस अध्ययन में, ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, मेथनॉल जोड़े जाने के बाद रेटिना सफेद हो गया (चित्रा 1)। इस बीच, रेटिना नरम से लचीला और सपाट हो गया। इसके बाद, आरजीसी को एंटी-आरबीपीएमएस8 के साथ लेबल किया गया था। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (आईपीस: 10x; उद्देश्य: 40x) का उपयोग करके पूरे-माउंट रेटिना (n = 3) में चार छवि फ़ील्ड लिए गए थे। मेथनॉल प्रसंस्करण से पहले और मेथनॉल में दीर्घकालिक संरक्षण के 12 महीने बाद रेटिना के विज़ुअलाइज़ किए गए आरजीसी के प्रतिनिधि विचार चित्र 2 में प्रदर्शित किए गए हैं। प्रतिदीप्ति तीव्रता ने कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखाया। मेथनॉल संरक्षण ने आरजीसी इम्यूनोस्टेनिंग को प्रभावित नहीं किया।
चित्र 1: मेथनॉल उपचार के बाद रेटिना परिवर्तन । (ए) मेथनॉल उपचार से पहले। (बी) मेथनॉल उपचार के बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: रेटिना गैंग्लियन सेल (आरजीसी) इम्यूनोस्टेनिंग पर मेथनॉल का प्रभाव। (ए) मेथनॉल उपचार के बिना रेटिना। (बी) मेथनॉल में 12 महीने के भंडारण के साथ रेटिना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
रेटिना को संरक्षित करने के लिए निर्धारण एक आवश्यक कदम है, जो आकृति विज्ञान के आधार पर किसी भी बाद की आरजीसी जांच को प्रभावित कर सकता है। सफल निर्धारण तेजी से रेटिना की संरचना और स्थिति को फिक्सिंग माध्यम में उजागर करने के समय पकड़ता है, जो आगे के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। यद्यपि फॉर्मलाडेहाइड को ऊतक और कोशिका निर्धारण और संरक्षण के लिए सबसे आम फिक्सिंग एजेंटों में से एक माना जाता है, अकेले फॉर्मलाडेहाइड हमेशा कुछजांचों के लिए इष्टतम रासायनिक फिक्सेटिव के रूप में अच्छी तरह से काम नहीं करता है। विभिन्न प्रकार के फिक्सेटिव में अमीनो एसिड और न्यूक्लियोटाइड को अवक्षेपित करने, प्रोटीन को स्थिर करने और सेल आकृति विज्ञानको बनाए रखने की अलग-अलग क्षमता होती है। दोनों प्रकार के फिक्सेटिव एजेंटों के मिश्रण का उपयोग करके, प्रत्येक की ताकत का पूरी तरह से उपयोग किया जा सकता है16,17. मेथनॉल का उपयोग अक्सर कई निर्धारण प्रक्रियाओं में किया जाता है, इससे पहले कि ऊतक ताजा जमे हुए या आदर्श काटने की सामग्री16,18 में एम्बेडेड हो। पूरे माउंट प्रयोगों के लिए, रेटिना नमूना निर्धारण प्राप्त करने के लिए 100% ठंडा (−20 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल का उपयोग किया जाता है, जो बाद के प्रतिदीप्ति-आधारित इमेजिंग19 के लिए नमूना परमेबिलाइजेशन में सहायता करता है।
मेथनॉल निर्धारण का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह आसान संरक्षण की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में, रेटिना को चपटा करने के बाद मेथनॉल को -20 डिग्री सेल्सियस पर रेटिना के सामने और पीछे उत्तरोत्तर जोड़ा जाता है। यह आसानी से देखा जा सकता है कि रेटिना का रंग तेजी से पारभासी से दूधिया सफेद में बदल जाता है, और अशुद्धियां स्पष्ट हो जाती हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि मेथनॉल-टपकने की प्रक्रिया के दौरान रेटिना को ब्रश के साथ धीरे से चपटा किया जाना चाहिए ताकि इसके चारों ओर कर्लिंग को रोका जा सके। मेथनॉल उपचार के बाद, रेटिना की समग्र कठोरता बढ़ जाती है, जिससे अशुद्धियों को हटाने और रेटिना को स्थानांतरित करने की कठिनाई कम हो जाती है। मेथनॉल के साथ पोस्ट-फिक्सेशन रेटिना को संरक्षित करने के लिए अधिक सुविधाजनक है जो पीएफए के साथ थोड़ा पूर्व-निर्धारित किया गया है। हालांकि, जब रेटिना की दृढ़ता में सुधार होता है, तो विट्रस और अन्य अशुद्धियों की दृढ़ता भी तदनुसार बढ़ने की संभावना है। मेथनॉल का उपयोग करने से पहले कुछ अशुद्धियों को धीरे-धीरे हटाने की कोशिश की जा सकती है, और फिर ड्रिप-एडेड मेथनॉल के बाद शेष अशुद्धियों को हटा दिया जाता है, जो प्रदर्शन करना अधिक आसान होता है। अशुद्धियों को जल्दी हटाने के लिए पर्याप्त अभ्यास और अनुभव की आवश्यकता होती है। ऑप्टिक डिस्क से रेडियल रूप से रेटिना पर शेष विट्रस शरीर को धीरे से ब्रश करने की सिफारिश की जाती है।
इस प्रोटोकॉल में, उपचार के बाद, रेटिना को मेथनॉल में भिगोया जाता है और बाद में सीलिंग से पहले कुछ समय के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जाता है, और अन्य उपचार रेटिना की कठोरता को और बढ़ा सकते हैं। हालांकि, समय की सटीक लंबाई बताना मुश्किल है जो विसर्जन निर्धारण के लिए सार्वभौमिक रूप से इष्टतम होगा। यदि आवश्यक हो, तो रेटिना को लंबे समय तक ठंडे मेथनॉल में संग्रहीत किया जा सकता है।
इस काम में, प्रस्तुत पद्धति के साथ, आरजीसी धुंधला होने पर मेथनॉल में भंडारण के प्रभाव - रेटिना गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन में एक महत्वपूर्ण तकनीक - की जांच की गई थी। मेथनॉल के उपयोग के साथ, आरजीसी की प्रतिदीप्ति तीव्रता, जो गुणात्मक और मात्रात्मक परीक्षण के परिणामों को प्रभावित करेगी, इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान नहीं बदली गई थी। रेटिना को धुंधला होने से पहले कम से कम 12 महीने के लिए एक संरक्षित समाधान, ठंडा (-20 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल में अनिश्चित काल तक रखा जा सकता है। इसके अलावा, हमारे पिछले अध्ययन में मेथनॉल में दीर्घकालिक भंडारण के बाद ऑप्टिक तंत्रिका क्रश माउस मॉडल में आरजीसी जीवित रहने की दर में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, और मेथनॉल संरक्षण का ऑक्सीजन-प्रेरित रेटिनोपैथी मॉडल20 में रेटिना वास्कुलचर और रेटिना हाइपोक्सिया के मात्रात्मक विश्लेषण पर भी बहुत कम प्रभाव पड़ा। हम नमूना तैयार करने के लिए क्रमिक रूप से 4% पीएफए और कोल्ड (-20 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल का उपयोग करने की सलाह देते हैं, साथ ही प्रयोगशाला में भंडारण रणनीतियों के लिए मेथनॉल निर्धारण को अपनाते हैं। एक सीमा यह है कि विश्लेषण डेंड्राइट या अक्षीय स्तर पर सूक्ष्म रूपात्मक परिवर्तनों को पूरी तरह से प्रदर्शित नहीं करते हैं, हालांकि आरजीसी का घनत्व और सोमा की आकृति विज्ञान21,22 नहीं बदलता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, इस प्रोटोकॉल में, हमने केवल आरजीसी के लिए आरबीपीएमएस का परीक्षण किया। आगे विभिन्न आरजीसी प्रोटीन (जैसे, बीआरएन 3 ए, न्यूरोनल नाभिक, न्यूरोफिलामेंट-एल) को सत्यापित करना अधिक मजबूत परिणाम प्रदान करेगा। इसके अलावा, प्रोटोकॉल में रेटिना में किसी भी अन्य सेल प्रकार पर लागू होने की क्षमता भी है जिसे आगे के शोध की आवश्यकता है। हालांकि, लंबे समय तक साँस लेना या मेथनॉल के प्रत्यक्ष त्वचीय जोखिम से मानव शरीर पर विषाक्त प्रभाव पड़ सकता है। इसलिए, मेथनॉल का उपयोग करने की प्रक्रिया में अच्छी सावधानी बरतना आवश्यक है।
हमारी विधि आरजीसी जांच के लिए रेटिना के भंडारण के लिए मेथनॉल निर्धारण का उपयोग करने पर एक मजबूत जोर देती है और आरजीसी परिमाणीकरण, और प्रतिदीप्ति तीव्रता के बारे में महत्वपूर्ण विचारों पर प्रकाश डालती है। यह प्रोटोकॉल आगे के उपयोग के लिए रेटिना नमूनों को संरक्षित करने की आवश्यकता को पूरा करने के लिए एक सीधा और व्यावहारिक तरीका प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों को किसी भी संबद्धता, सदस्यता, वित्त पोषण या वित्तीय होल्डिंग्स के बारे में पता नहीं है जो इस अध्ययन की निष्पक्षता को प्रभावित कर सकते हैं।
Acknowledgments
इस काम को हुबेई की लेबोरेटरीज ओपनिंग प्रोजेक्ट (अनुदान संख्या 2021 केएफवाई 055), हुबेई प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2020सीएफबी 240), और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान निधि (अनुदान संख्या 2042020केएफ0065) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
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