Summary
Metanol, retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için yararlı olan retinal tüm montaj preparatları ve uzun süreli depolama için yardımcı bir sabit ortam olarak kullanılabilir.
Abstract
Retinanın projeksiyon nöronları olan retinal ganglion hücreleri (RGC'ler), dış görsel bilgiyi beyne yayar. RGC'lerdeki patolojik değişiklikler çok sayıda retinal dejeneratif hastalık ile yakın ilişki içindedir. Tam montajlı retinal immün boyama, retinanın gelişimsel ve patolojik durumlarını değerlendirmek için RGC'ler üzerine yapılan deneysel çalışmalarda sıklıkla kullanılmaktadır. Bazı koşullar altında, transgenik farelerden alınanlar gibi bazı değerli retina örneklerinin, RGC'lerin morfolojisini veya sayısını etkilemeden uzun süre tutulması gerekebilir. Güvenilir ve tekrarlanabilir deneysel sonuçlar için, etkili bir koruma ortamı kullanmak esastır. Burada, metanolün retinal tüm montaj preparatları ve uzun süreli depolama için yardımcı bir sabit ortam olarak etkisini açıklıyoruz. Kısacası, izolasyon işlemi sırasında, dokuların sabitlenmesine ve geçirgenliklerinin kolaylaştırılmasına yardımcı olmak için retina yüzeyine soğuk metanol (-20 ° C) pipetlenir ve daha sonra retinalar immün boyanmadan önce soğuk metanol (-20 ° C) içinde saklanabilir. Bu protokol, RGC'lerin araştırılması için yararlı ve pratik olan retina izolasyon iş akışını ve doku örneği depolama protokolünü açıklar.
Introduction
Retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) retinadaki tek projeksiyon nöronlarıdır ve dış görsel bilgileri beyne entegre eder ve iletirler1. Glokom ve travmatik optik nöropati gibi birçok nörodejeneratif hastalık, geri dönüşümsüz hasar ve RGC 2,3 kaybı ile karakterizedir. RGC'lerin morfolojik ve kantitatif değişikliklerinin analiz edilmesi, nörodejeneratif hastalıkların nasıl geliştiğini ve ilerlediğini belirlemede çok önemli bir adımdır 4,5.
Dolaylı immünofloresan testi, proteinlerin dağılımını ve hücre sayımını izlemek için yaygın olarak kabul edilen bir yöntemdir. Laboratuvarda, retina6'nın fizyolojik ve patolojik koşullarını değerlendirmek için RGC'ler üzerinde yapılan deneysel çalışmalarda tam montajlı retinal immünoboyama yaygın olarak kullanılmaktadır. Tüm retinada RGC nicelleştirmesi için kullanılan en yaygın belirteçler arasında Brn3a, çoklu ekleme (RBPMS) ile RNA bağlayıcı protein ve benzeri 7,8 bulunur. RGC'lerin miktarını ve dağılımını karakterize etmek, yüksek kaliteli tam montajlı retinal immün boyama gerektirir. Genel olarak, immün boyama protokollerinde, retina antikorlarda inkübe edilmeden önce kimyasal fiksatiflere daldırılır. İdeal fiksatifler, hücrelerin şeklini, antikorlar için epitopların erişilebilirliğini veya afinitesini veya 9,10 dokusunun doğrusal boyutlarını değiştirmemelidir.
Retinanın karmaşık yapısı nedeniyle, retina kırılganlığı ve katlanması gibi sorunların yanı sıra hücre büzülmesi ve belirsiz çekirdekler gibi bazı yaygın zorluklar, deneysel araştırmalar üzerinde olumsuz bir etkisi olan tam montajlı retina yaması yaparken ortaya çıkmaya eğilimlidir. Ek olarak, tüm retinalar hemen immün boyanmaz, özellikle de değerli kökenli pahalı fiyatlara sahip transgenik farelerin retinaları söz konusu olduğunda, ekstra retinal örneklerin daha fazla kullanım için korunmasını gerektirir.
Uygun fiksatif çözelti dokuyu hızlı bir şekilde düzeltebilir, doku otolizini önleyebilir, doku hücrelerinin normal morfolojisini ve yapısını koruyabilir ve proteinlerin ve diğer maddelerin antijenitesini koruyabilir10. Günümüzde, formaldehit bazlı fiksasyon, ayrılmış retinalar, hemiseke edilmiş göz kapakları ve tüm göz küreleri dahil olmak üzere çeşitli dokularda yaygın olarak kullanılmaktadır10. Doku büzülmesi ve hücrelerin morfolojik değişimi, formaldehit11'e daldırıldıktan sonra karşılaşılan iki kritik zorluktur. Ek olarak, modifiye fiksasyon formülasyonları, retinanın ve hedef hücrelerin orijinal özelliklerinin korunmasını en üst düzeye çıkarmak için giderek daha fazla ortaya çıkmaktadır 9,10. Farklı retina fiksasyon tedavileri retina yapısını, protein immünojenitesini, floresan uyarımını ve zayıflama söndürme döngüsünü farklı şekilde etkileyebilir12,13. Davidson'un çözeltisi ile sabitlenmiş retinalar, formalin ile sabitlenenlere kıyasla morfolojik olarak daha sağlamdır, ancak Davidson'un çözeltisi, mikroglial marker-iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 112 gibi bazı antikorlarla daha az uyumludur. Retinaların kırılgan doğası göz önüne alındığında, araştırmacılar doğal olarak retina bütünlüğünün yanı sıra hedef hücrelerin özelliklerinin ve morfolojisinin uzun süreli depolamadan sonra değişip değişmeyeceğini merak edeceklerdir. Bununla birlikte, fiksasyon solüsyonunun birkaç ay bekletildikten sonra retina ve RGC hücre morfolojisi üzerindeki olası etkileri nadiren bildirilmiştir. Retina fiksasyonunun optimizasyonu, RGC'lerin değerlendirilmesi ve korunması için kritik öneme sahiptir.
Tüm montajlı murin retinal boyama için kullandığımız güvenilir ve teknik olarak basit bir yöntemin ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz. Yöntemimiz, retina dokusunun uzun süreli depolanması ihtiyacının yanı sıra florofor oluşumu veya bozulmasının spesifik yönlerini göz önünde bulundurarak, RGC araştırması için retinaların uygun şekilde hazırlanmasını ve depolanmasını vurgulamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Kullanılan tüm C57BL / 6J fareleri, Wuhan Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Merkezi'nden elde edildi ve ilgili tüm deneyler Wuhan Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etiği Komitesi tarafından onaylandı. Farelerin acısını en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.
1. Gözlerin enükleasyonu ve sabitlenmesi
- Fareleri karbondioksit boğulması ile ötenazi yapın ve dişsiz cımbız kullanarak göz küresini nazikçe süklee edin.
- Göz küresini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde bir kez durulayın.
- Göz küresine fiksasyonu hızlandırmak ve sabitleme verimliliğini artırmak için mikroskop altında korneada bir şırınga iğnesi ile göz küresini delin (göz merceği WF: 10x/22; sürekli büyütme hedefi: 0.67x-4.5x).
- % 4 paraformaldehit (PFA) içeren 24 delikli bir plakaya aktarın.
- Göz küresini 45 dakika boyunca% 4 PFA'ya sabitleyin ve ardından fazla PFA'yı hemen çıkarmak için 1x PBS'ye aktarın (üç kez, 5 dakika / zaman yıkayın).
2. Retina izolasyonu ve düzleşmesi
- Göz küresini bir cam slayta aktarın ve diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin (göz merceği WF: 10x/22; sürekli büyütme hedefi: 0.67x-4.5x).
- Forsepsleri bir elinizde tutun ve göz küresi hareketini önlemek için korneanın kenarını sıkıştırmak için kullanın. Diseksiyon makasını tutmak için diğer elinizi kullanın ve korneanın etrafını korneoskleral limbus boyunca yaklaşık 1 mm derinlikte kesin. Lensi ve vitreus gövdesini çıkarın.
- Optik diski merkezde tutun ve diseksiyon makası kullanarak, retinayı dört kadran boyunca radyal olarak kesin ve retinanın yarıçapının yaklaşık 2 / 3'üne ulaşın.
- Skleral kenarlardan birini dişli forseps kullanarak kelepçeleyin. Öte yandan, skleranın kenarını dişsiz forsepslerle tutun ve skleranın dişli forseps tarafından sabitlendiği yerden skleranın tabanına doğru hareket edin. Retinayı dikkatlice soyun.
- Retinayı yıkamak ve ıslatmak için bir pipet (200 μL) kullanarak PBS'yi çekin ve ardından fazla PBS'yi küçük bir emici kağıt parçasıyla çıkarın. Gerekirse, retinayı küçük kıllı bir fırçayla hafifçe düzleştirin.
- Yavaş yavaş pipet soğuk metanol (-20 ° C'lik bir dondurucuda önceden soğutulur) retinanın iç yüzeyine damla damla düşer (retina metanol tarafından tamamen kaplanabildiği sürece metanol hacmi sabit değildir). Retina beyaza döner ve artan azim geliştirir.
- Retinayı nazikçe düzleştirin ve artık pigment zarları ve vitreus gövdesi gibi safsızlıkları küçük kıllı fırçalarla temizleyin. Küçük kıllı fırçalar kullanarak retinayı ters çevirin ve yukarıda belirtilen işlemi tekrarlayın.
- Metanol ile muamele edilmiş retinayı 24 delikli bir plakanın kuyucuğuna aktarın ve metanole batırılmış halde tutun.
- Acil immün boyama için 1-2 saat boyunca -20 ° C'de saklayın veya retinayı metanol içinde bırakın ve uzun süreli depolama için -20 ° C'de saklayın.
- Metanolü 24 delikli plakadan çıkarın ve retinayı 1x PBS ile durulayın.
3. RGC'lerin immünofloresan boyanması
- Retinayı plastik bir Pasteur pipet ile 24 delikli bir hemaglutinasyon plakasına dikkatlice aktarın ve% 5 PBS-TX-BSA'da (100 mL 1x PBST çözeltisi içinde çözülmüş 5 g sığır serum albümin tozu; PBST, oda sıcaklığında 4 saat veya 4 ° C'de bir gecede 10 mL Triton X-100 ila 2.000 mL 1 x PBS ilave edilerek oluşturulur. Ganglion tarafını yukarıda tutun.
- PBS-TX-BSA'yı çıkarın ve retinayı 48-96 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin, 1:400 seyreltme kullanarak seçilen birincil antikorun (kobay anti-RBPMS antikoru) 100 μL'sini ekleyin.
- Birincil antikoru çıkarın ve retinayı 1x PBS ile üç kez (her biri 20 dakika) durulayın, oda sıcaklığında çalkalayın.
- Retinayı, karşılık gelen ikincil antikorun 100 μL'si (bakınız Malzeme Tablosu), siyanin Cy3 affiniPure eşek anti-gine domuzu IgG (H + L) ile 1:400 seyreltme kullanarak gece boyunca 4 ° C'de hafifçe sallayarak inkübe edin.
- Retinayı 1x PBS ile üç kez durulayın (her biri 20 dakika).
- Retinayı, ganglion hücre tabakası yukarı bakacak şekilde slayt üzerine düz bir şekilde yerleştirin, retinanın etrafına bir pipetle uygun miktarda anti-floresan söndürme maddesi bırakın ve slaytı bir kapak kayması ile örtün (kabarcıklara sahip olmamaya dikkat edin).
NOT: Uygun miktarda anti floresan söndürücüyü belirlemek için, tüm retinayı kapladığından emin olun. Bundan sonra, retinanın yüzmesine ve kolayca hareket etmesine izin vermeden slaytı örtün. - Hareket etmesini önlemek için slaytın her tarafını bir sızdırmazlık maddesi ile kapatın. Numuneleri -20°C'de saklayın ve ışıktan koruyun.
- Retinayı floresan / konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Diseksiyondan sonra, retina düz dört yapraklı bir yonca gibi görünmelidir. Bu çalışmada, yukarıda özetlenen protokol kullanılarak, metanol eklendikten sonra retina beyaza dönmüştür (Şekil 1). Bu arada, retina yumuşaktan esnek ve düze değişti. Daha sonra, RGC'ler anti-RBPMS8 ile etiketlendi. Konfokal mikroskop (göz merceği: 10x; objektif: 40x) kullanılarak tüm montajlı retinada (n = 3) dört görüntü alanı alındı. Metanol işlenmeden önce ve metanolde 12 aylık uzun süreli korumadan sonra retinaların görselleştirilmiş RGC'lerinin temsili görünümleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Floresan yoğunluğu önemli bir değişiklik göstermedi. Metanol korunması RGC immün boyamasını etkilemedi.
Şekil 1: Metanol tedavisinden sonra retina değişiklikleri vardır. (A) Metanol tedavisinden önce. (B) Metanol tedavisinden sonra. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Metanolün retinal ganglion hücre (RGC) immün boyama üzerine etkisi. (A) Metanol tedavisi olmayan retina. (B) Metanol içinde 12 ay saklanan retina. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fiksasyon, retinayı korumak için önemli bir adımdır ve morfolojiye dayalı sonraki RGC araştırmalarını etkileyebilir. Başarılı fiksasyon, retinaların yapısını ve durumunu, daha fazla analiz için kritik olan sabitleme ortamına maruz bıraktıkları anda hızla yakalar. Formaldehit, doku ve hücre fiksasyonu ve korunması için en yaygın sabitleme ajanlarından biri olarak kabul edilmesine rağmen, formaldehit tek başına bazı araştırmalar için en uygun kimyasal fiksatif olarak her zaman iyi çalışmaz10,14. Farklı fiksatif türleri, amino asitleri ve nükleotitleri çökeltmek, proteinleri stabilize etmek ve hücre morfolojisini korumak için farklı kapasitelere sahiptir15. Her iki tip fiksatif ajanın karışımları kullanılarak, her birinin güçlü yönleri tam olarak kullanılabilir16,17. Metanol, doku taze dondurulmadan veya ideal kesme malzemelerine gömülmeden önce birçok fiksasyon prosedüründe sıklıkla kullanılır16,18. Tam montajlı deneyler için, retinal numune fiksasyonunu elde etmek için% 100 soğuk (-20 ° C) metanol kullanılır, bu da sonraki floresan bazlı görüntüleme19 için numune geçirgenliğine yardımcı olur.
Metanol fiksasyonunun önemli bir avantajı, kolay korumaya izin vermesidir. Bu protokolde, retina düzleştirildikten sonra retinanın önüne ve arkasına -20 ° C'de kademeli olarak metanol eklenir. Retinanın renginin yarı saydamdan süt beyazına hızla değiştiği ve safsızlıkların daha net hale geldiği kolayca gözlemlenebilir. Metanol damlama işlemi sırasında etrafında kıvrılmayı önlemek için retinanın bir fırça ile hafifçe düzleştirilmesi gerektiğine dikkat edilmelidir. Metanol tedavisinden sonra, retinanın genel tokluğu artar, safsızlıkların giderilmesi ve retinanın aktarılması zorluğu azalır. Metanol ile fiksasyon sonrası, PFA ile hafifçe önceden sabitlenmiş retinaları korumak için daha uygundur. Bununla birlikte, retinanın dayanıklılığı iyileştirildiğinde, vitreus ve diğer safsızlıkların dayanıklılığının da buna göre artması muhtemeldir. Metanol kullanmadan önce çıkarılması kolay olan bazı safsızlıkları nazikçe çıkarmaya ve daha sonra damlama metanolü ekledikten sonra kalan safsızlıkları gidermeye çalışabilirsiniz, bu da gerçekleştirilmesi daha kolaydır. Kirliliklerin erken giderilmesi yeterli uygulama ve deneyim gerektirir. Retina üzerinde kalan vitreus gövdesinin optik diskten radyal olarak dışarı doğru nazikçe fırçalanması önerilir.
Bu protokolde, tedaviden sonra, retina metanole batırılır ve sonraki sızdırmazlıktan önce bir süre -20 ° C'lik bir dondurucuya yerleştirilir ve diğer tedaviler retinanın tokluğunu daha da artırabilir. Bununla birlikte, daldırma fiksasyonu için evrensel olarak en uygun olacak kesin bir süre belirtmek zordur. Gerekirse, retina uzun süre soğuk metanol içinde saklanabilir.
Bu çalışmada, sunulan metodoloji ile metanol içinde depolanmasının retina kalitatif ve kantitatif değerlendirmelerinde çok önemli bir teknik olan RGC boyaması üzerindeki etkisi incelenmiştir. metanol kullanımı ile, RGC'lerin kalitatif ve kantitatif testlerin sonuçlarını etkileyecek floresan yoğunluğu, immün boyama sırasında değiştirilmemiştir. Retinalar, lekelenmeden önce en az 12 ay boyunca koruyucu bir çözelti olan soğuk (-20 ° C) metanol içinde süresiz olarak tutulabilir. Ek olarak, önceki çalışmamız, metanolde uzun süreli depolamayı takiben optik sinir ezilme faresi modelinde RGC sağkalım oranında anlamlı bir fark ortaya koymamıştır ve metanol korunmasının, oksijene bağlı retinopati model20'de retinal vaskülatür ve retinal hipoksinin kantitatif analizi üzerinde çok az etkisi olmuştur. Numune hazırlama için sırasıyla% 4 PFA ve soğuk (-20 ° C) metanol kullanılmasını ve ayrıca laboratuvarda depolama stratejileri için metanol fiksasyonunu benimsemenizi öneririz. Bir sınırlama, analizlerin dendrit veya aksonal düzeyde ince morfolojik değişiklikleri tam olarak göstermemesidir, ancak RGC'lerin yoğunluğu ve soma'nın morfolojisi21,22'yi değiştirmiyor gibi görünmektedir. Bu protokolde, RBPMS'yi yalnızca RGC'ler için test ettiğimize dikkat edilmelidir. Farklı RGC proteinlerinin (örneğin, Brn3a, nöronal çekirdekler, nörofilament-L) daha fazla doğrulanması daha sağlam bir sonuç sağlayacaktır. Dahası, protokol retinada daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyan diğer hücre tiplerine de uygulanma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, uzun süreli inhalasyon veya metanole doğrudan kutanöz maruz kalma, insan vücudu üzerinde toksik etkilere neden olabilir. Bu nedenle, metanol kullanma sürecinde iyi önlemler almak gerekir.
Yöntemimiz, RGC araştırmaları için retinaların depolanması için metanol fiksasyonunun kullanılmasına güçlü bir vurgu yapmakta ve RGC niceliği ve floresan yoğunluğu ile ilgili önemli hususları vurgulamaktadır. Bu protokol, retina örneklerinin daha fazla kullanım için korunması gerekliliğini karşılamak için basit ve pratik bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu çalışmanın nesnelliğini etkileyebilecek herhangi bir bağlantı, üyelik, fon veya finansal varlığın farkında değildir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Hubei Anahtar Laboratuvarları Açılış Projesi (hibe no. 2021KFY055), Hubei Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (hibe no. 2020CFB240) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (hibe no. 2042020kf0065) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
References
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
