Summary
El metanol se puede utilizar como medio fijo auxiliar para preparaciones retinianas de montaje completo y almacenamiento a largo plazo, lo que es útil para la investigación de las células ganglionares de la retina.
Abstract
Las células ganglionares de la retina (CGR), que son las neuronas de proyección de la retina, propagan información visual externa al cerebro. Los cambios patológicos en las CGR tienen una estrecha relación con numerosas enfermedades degenerativas de la retina. La inmunotinción retiniana de montaje completo se utiliza con frecuencia en estudios experimentales sobre CGR para evaluar las condiciones de desarrollo y patológicas de la retina. En algunas circunstancias, algunas muestras valiosas de retina, como las de ratones transgénicos, pueden necesitar ser retenidas durante un largo período sin afectar la morfología o el número de CGR. Para obtener resultados experimentales creíbles y reproducibles, es esencial utilizar un medio de conservación eficaz. Aquí, describimos el efecto del metanol como un medio fijo auxiliar para preparaciones retinianas de montaje completo y almacenamiento a largo plazo. En resumen, durante el proceso de aislamiento, el metanol frío (-20 ° C) se pipetea sobre la superficie de la retina para ayudar a fijar los tejidos y facilitar su permeabilidad, y luego las retinas se pueden almacenar en metanol frío (-20 ° C) antes de ser inmunoteñidas. Este protocolo describe el flujo de trabajo de aislamiento de retina y el protocolo de almacenamiento de muestras de tejido, que es útil y práctico para la investigación de CGR.
Introduction
Las células ganglionares de la retina (CGR) son las únicas neuronas de proyección en la retina, e integran y transmiten información visual externa al cerebro1. Muchas enfermedades neurodegenerativas como el glaucoma y la neuropatía óptica traumática se caracterizan por daño irreversible y pérdida de CGR 2,3. El análisis de los cambios morfológicos y cuantitativos de las CGR es un paso crucial para determinar cómo se desarrollan y avanzan las enfermedades neurodegenerativas 4,5.
El ensayo de inmunofluorescencia indirecta es un método ampliamente aceptado para monitorear la distribución de proteínas y el recuento celular. En el laboratorio, la inmunotinción retiniana de montaje completo se utiliza comúnmente en estudios experimentales sobre CGR para evaluar las condiciones fisiológicas y patológicas de la retina6. Los marcadores más comunes utilizados para la cuantificación de RGC en toda la retina incluyen Brn3a, proteína de unión a ARN con empalme múltiple (RBPMS), y así sucesivamente 7,8. La caracterización de la cantidad y distribución de las CGR requiere inmunotinción retiniana de montaje completo de alta calidad. Generalmente, en los protocolos de inmunotinción, la retina se sumerge en fijadores químicos antes de ser incubada en anticuerpos. Los fijadores ideales no deben cambiar la forma de las células, la accesibilidad o afinidad de los epítopos por los anticuerpos, o las dimensiones lineales del tejido 9,10.
Debido a la compleja estructura de la retina, problemas como la fragilidad retiniana y el plegamiento, así como algunas dificultades comunes, como la contracción celular y los núcleos poco claros, son propensos a ocurrir cuando se hace un parche retiniano de montaje completo, lo que tiene un impacto negativo en la investigación experimental. Además, no todas las retinas se inmunotiñen inmediatamente, especialmente cuando se trata de las retinas de ratones transgénicos con precios caros que son de origen precioso, lo que requiere la preservación de las muestras de retina adicionales para su uso posterior.
La solución fijadora adecuada puede fijar el tejido rápidamente, evitar la autólisis tisular, preservar la morfología y estructura normales de las células tisulares y mantener la antigenicidad de las proteínas y otras sustancias10. En la actualidad, la fijación a base de formaldehído se ha utilizado ampliamente en diversos tejidos, incluyendo retinas separadas, oculares hemisecados y globos oculares enteros10. La contracción del tejido y la alteración morfológica de las células son los dos desafíos críticos encontrados después de la inmersión en formaldehído11. Además, las formulaciones de fijación modificada están emergiendo cada vez más para maximizar la retención de las propiedades originales de la retina y las células diana 9,10. Diferentes tratamientos de fijación retiniana pueden afectar la estructura retiniana, la inmunogenicidad de proteínas, la excitación fluorescente y el ciclo de enfriamiento de atenuación de manera diferente12,13. Las retinas fijadas con la solución de Davidson están más morfológicamente intactas en comparación con las fijadas con formalina, pero la solución de Davidson es menos compatible con algunos anticuerpos, como la molécula adaptadora de unión al calcio ionizada del marcador microglial 112. Teniendo en cuenta la naturaleza frágil de las retinas, los investigadores naturalmente se preguntarían si la integridad de la retina, así como las propiedades y la morfología de las células diana, cambiarán después del almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, rara vez se han informado los posibles efectos de la solución de fijación sobre la morfología de las células retinianas y RGC después del almacenamiento durante varios meses. La optimización de la fijación retiniana es crítica para la evaluación y preservación de las CGR.
Proporcionamos una descripción detallada de un método confiable y técnicamente sencillo que utilizamos para la tinción retiniana murina de montaje completo. Nuestro método enfatiza la preparación y almacenamiento adecuados de las retinas para la investigación de RGC, teniendo en cuenta la necesidad de almacenamiento a largo plazo del tejido retiniano, así como aspectos específicos de la formación o degradación de fluoróforos.
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Protocol
Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Todos los ratones C57BL / 6J utilizados se obtuvieron del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Wuhan, y todos los experimentos relacionados fueron aprobados por el Comité de Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Wuhan. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los ratones.
1. Enucleación y fijación de los ojos
- Eutanasia a los ratones con asfixia de dióxido de carbono y enuclear el globo ocular suavemente usando pinzas sin dientes.
- Enjuague el globo ocular una vez en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Perfore el globo ocular con una aguja de jeringa en la córnea bajo un microscopio (ocular WF: 10x/22; objetivo de aumento continuo: 0.67x-4.5x) para acelerar la fijación en el globo ocular y mejorar la eficiencia de fijación.
- Transfiera a una placa de 24 pocillos que contenga 4% de paraformaldehído (PFA).
- Fije el globo ocular en PFA al 4% durante 45 minutos y luego transfiéralo a 1x PBS para eliminar el exceso de PFA (lavar tres veces, 5 minutos / vez) inmediatamente.
2. Aislamiento y aplanamiento de la retina
- Transfiera el globo ocular a un portaobjetos de vidrio y colóquelo bajo un microscopio de disección (ocular WF: 10x/22; objetivo de aumento continuo: 0.67x-4.5x).
- Sostenga los fórceps en una mano y úselos para sujetar el margen de la córnea para evitar el movimiento del globo ocular. Use la otra mano para sostener las tijeras de disección y corte alrededor de la córnea a aproximadamente 1 mm de profundidad a través del limbo corneoescleral. Retire el cristalino y el cuerpo vítreo.
- Sostenga el disco óptico en el centro y, utilizando tijeras de disección, corte la retina radialmente a lo largo de los cuatro cuadrantes, alcanzando aproximadamente 2/3 del radio de la retina.
- Sujete uno de los bordes esclerales con pinzas dentadas. Con la otra mano, sostenga el borde de la esclerótica con pinzas sin dientes y muévase desde donde la esclerótica está fijada por las pinzas dentadas hacia la base de la esclerótica. Pelar cuidadosamente la retina.
- Extraiga PBS usando una pipeta (200 μL) para enjuagar y humedecer la retina, y luego retire cualquier exceso de PBS con un pequeño trozo de papel absorbente. Si es necesario, aplanar suavemente la retina con un cepillo de cerdas pequeñas.
- Pipetear lentamente metanol frío (preenfriado en un congelador de -20 °C) gota a gota sobre la superficie interna de la retina (el volumen de metanol no es fijo, siempre y cuando la retina pueda estar completamente cubierta por el metanol). La retina se vuelve blanca y desarrolla una mayor tenacidad.
- Aplanar suavemente la retina y eliminar las impurezas como las membranas pigmentarias residuales y el cuerpo vítreo con pequeños cepillos de cerdas. Invierta la retina con pequeños cepillos de cerdas y repita el proceso mencionado anteriormente.
- Transfiera la retina tratada con metanol a un pocillo de una placa de 24 pocillos y manténgala empapada en metanol.
- Guárdelo a -20 °C durante 1-2 h para la inmunotinción inmediata, o deje la retina en metanol y guárdelo a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo.
- Retire el metanol de la placa de 24 pocillos y enjuague la retina con 1x PBS.
3. Tinción inmunofluorescente de las CGR
- Transfiera cuidadosamente la retina a una placa de hemaglutinación de 24 pocillos con una pipeta plástica de Pasteur y bloquee en un 5% de PBS-TX-BSA (5 g de polvo de albúmina de suero bovino disuelto en 100 ml de 1x solución de PBST; el PBST se forma agregando 10 ml de Triton X-100 a 2,000 ml de 1 x PBS) a temperatura ambiente durante 4 h o durante la noche a 4 °C. Mantenga el lado ganglionar hacia arriba.
- Extraer el PBS-TX-BSA e incubar la retina a 4 °C durante 48-96 h, añadiendo 100 μL del anticuerpo primario seleccionado (anticuerpo anti-RBPMS de cobaya) mediante una dilución 1:400.
- Retire el anticuerpo primario y enjuague la retina tres veces (20 minutos cada una) con 1x PBS, agitando a temperatura ambiente.
- Incubar la retina con agitación suave durante la noche a 4 °C con 100 μL del anticuerpo secundario correspondiente (ver Tabla de materiales), cianina Cy3 affiniPure burro anti-cobaya IgG (H+L), utilizando una dilución 1:400.
- Enjuague la retina con 1x PBS tres veces (20 minutos cada una).
- Coloque la retina plana sobre el portaobjetos con la capa de células ganglionares hacia arriba, deje caer una cantidad adecuada de agente antifluorescente alrededor de la retina con una pipeta y cubra el portaobjetos con un cubreobjetos (tenga cuidado de no tener burbujas).
NOTA: Para determinar la cantidad adecuada de calmante antifluorescente, asegúrese de que cubra toda la retina. Después de eso, cubra el portaobjetos sin permitir que la retina flote y se mueva fácilmente. - Selle la corredera alrededor con un agente de sellado para evitar que se mueva. Almacene las muestras a -20 ° C y protéjalas de la luz.
- Imagen de la retina con un microscopio fluorescente/confocal.
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Representative Results
Después de la disección, la retina debe verse como un trébol plano de cuatro hojas. En este estudio, mediante el uso del protocolo descrito anteriormente, la retina se volvió blanca después de que se agregó metanol (Figura 1). Mientras tanto, la retina cambió de suave a flexible y plana. A continuación, los RGC fueron etiquetados con anti-RBPMS8. Se tomaron cuatro campos de imagen en toda la retina de montaje (n = 3) utilizando un microscopio confocal (ocular: 10x; objetivo: 40x). En la Figura 2 se muestran vistas representativas de CGR visualizadas de retinas antes del procesamiento de metanol y después de 12 meses de preservación a largo plazo en metanol. La intensidad de fluorescencia no mostró cambios significativos. La preservación del metanol no afectó la inmunotinción de RGC.
Figura 1: Cambios en la retina después del tratamiento con metanol. (A) Antes del tratamiento con metanol. (B) Después del tratamiento con metanol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efecto del metanol en la inmunotinción de células ganglionares de la retina (CGR). (A) Retina sin tratamiento con metanol. (B) Retina con 12 meses de almacenamiento en metanol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La fijación es un paso esencial para preservar la retina, lo que puede afectar cualquier investigación posterior de RGC basada en la morfología. La fijación exitosa captura rápidamente la estructura y el estado de las retinas en el momento de exponerlas al medio de fijación, lo cual es crítico para un análisis posterior. Aunque el formaldehído ha sido considerado como uno de los agentes fijadores más comunes para la fijación y preservación de tejidos y células, el formaldehído por sí solo no siempre funciona bien como fijador químico óptimo para algunas investigaciones10,14. Diferentes tipos de fijadores tienen diferentes capacidades para precipitar aminoácidos y nucleótidos, estabilizar proteínas y mantener la morfología celular15. Mediante el uso de mezclas de ambos tipos de agentes fijadores, las fortalezas de cada uno se pueden utilizar completamente16,17. El metanol se utiliza con frecuencia en muchos procedimientos de fijación antes de que el tejido esté recién congelado o incrustado en materiales de corte ideales16,18. Para experimentos de montaje completo, se utiliza metanol 100% frío (-20 °C) para lograr la fijación de la muestra retiniana, lo que ayuda a la permeabilización de la muestra para la posterior obtención de imágenes basadas en fluorescencia19.
Una ventaja clave de la fijación de metanol es que permite una fácil conservación. En este protocolo, el metanol se añade a la parte frontal y posterior de la retina progresivamente a -20 °C después de que la retina se haya aplanado. Se puede observar fácilmente que el color de la retina cambia rápidamente de translúcido a blanco lechoso, y las impurezas se vuelven más claras. Cabe señalar que la retina debe aplanarse suavemente con un cepillo para evitar que se enrosque alrededor de ella durante el proceso de goteo de metanol. Después del tratamiento con metanol, la dureza general de la retina aumenta, reduciendo la dificultad de eliminar las impurezas y transferir la retina. La post-fijación con metanol es más conveniente para preservar las retinas que han sido ligeramente prefijadas con PFA. Sin embargo, cuando se mejora la tenacidad de la retina, también es probable que la tenacidad del vítreo y otras impurezas aumente en consecuencia. Uno puede tratar de eliminar suavemente algunas impurezas que son fáciles de eliminar antes de usar metanol, y luego eliminar las impurezas restantes después de agregar metanol por goteo, que es más fácil de realizar. La eliminación temprana de las impurezas requiere suficiente práctica y experiencia. Se recomienda cepillar suavemente el cuerpo vítreo restante en la retina radialmente hacia afuera desde el disco óptico.
En este protocolo, después del tratamiento, la retina se empapa en metanol y se coloca en un congelador de -20 ° C durante algún tiempo antes del sellado posterior, y otros tratamientos podrían aumentar aún más la dureza de la retina. Sin embargo, es difícil establecer un período de tiempo preciso que sea universalmente óptimo para la fijación por inmersión. Si es necesario, la retina podría almacenarse en metanol frío durante largos períodos.
En este trabajo, con la metodología presentada, se examinó el impacto del almacenamiento en metanol en la tinción de RGC, una técnica crucial en las evaluaciones cualitativas y cuantitativas de la retina. con el uso de metanol, la intensidad de fluorescencia de las CGR, que afectaría los resultados de las pruebas cualitativas y cuantitativas, no se alteró durante la inmunotinción. Las retinas podrían mantenerse indefinidamente en una solución conservante, metanol frío (-20 ° C), durante al menos 12 meses antes de la tinción. Además, nuestro estudio anterior no reveló diferencias significativas en la tasa de supervivencia de RGC en el modelo de ratón de aplastamiento del nervio óptico después del almacenamiento a largo plazo en metanol, y la preservación del metanol también tuvo poco impacto en el análisis cuantitativo de la vasculatura retiniana y la hipoxia retiniana en el modelo de retinopatía inducida por oxígeno20. Recomendamos usar PFA al 4% y metanol frío (-20 ° C) secuencialmente para la preparación de muestras, así como adoptar la fijación de metanol para estrategias de almacenamiento en el laboratorio. Una limitación es que los análisis no demuestran completamente cambios morfológicos sutiles a nivel dendrítico o axonal, aunque la densidad de las CGR y la morfología del soma no parecen cambiar21,22. Cabe señalar que, en este protocolo, solo probamos RBPMS para RGC. La verificación adicional de diferentes proteínas RGC (por ejemplo, Brn3a, núcleos neuronales, neurofilamento-L) proporcionaría un resultado más robusto. Además, el protocolo también tiene el potencial de aplicarse a cualquier otro tipo de célula en la retina que necesite más investigación. Sin embargo, la inhalación a largo plazo o la exposición cutánea directa al metanol pueden causar efectos tóxicos en el cuerpo humano. Por lo tanto, es necesario tomar buenas precauciones en el proceso de uso de metanol.
Nuestro método pone un fuerte énfasis en el uso de la fijación de metanol para el almacenamiento de retinas para investigaciones de RGC y destaca consideraciones importantes con respecto a la cuantificación de RGC y la intensidad de fluorescencia. Este protocolo proporciona un método sencillo y práctico para satisfacer la necesidad de preservar muestras de retina para su uso posterior.
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Disclosures
Los autores no tienen conocimiento de ninguna afiliación, membresía, financiamiento o tenencia financiera que pueda afectar la objetividad de este estudio.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Proyecto de Apertura de Hubei Key Laboratories (subvención no. 2021KFY055), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hubei (subvención no. 2020CFB240) y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (subvención no. 2042020kf0065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
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