Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine klonierbare elektronenmikroskopische Markierungstechnologie zum Nachweis von Metallothionein-markierten Proteinen in Zellen unter Verwendung einer neuartigen, auf dem Mechanismus der Autonukleationsunterdrückung basierenden Gold-Nanopartikel-Synthesetechnik.
Abstract
Die Analyse der präzisen Lokalisation von Proteinmolekülen in Zellen mit ultrastruktureller Auflösung ist von großer Bedeutung für die Untersuchung verschiedener physiologischer oder pathologischer Prozesse in allen lebenden Organismen. Daher ist die Entwicklung klonbarer Tags, die als elektronenmikroskopische Sonden verwendet werden können, von großem Wert, so wie fluoreszierende Proteine im Bereich der optischen Bildgebung eine entscheidende Rolle gespielt haben. Kürzlich wurde der Mechanismus zur Unterdrückung der Autonukleation (ANSM) aufgedeckt, der die spezifische Synthese von Goldnanopartikeln (AuNPs) auf Cystein-reichen Markern wie Metallothionein (MT) und Antifreeze Protein (AFP) ermöglicht.
Basierend auf dem ANSM wurde eine elektronenmikroskopische Markierungstechnologie entwickelt, die den spezifischen Nachweis von markierten Proteinen in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen mit einer bisher unerreichten Markierungseffizienz ermöglicht. Diese Studie veranschaulicht ein Protokoll für den Nachweis von MTn-Fusionsproteinen (einer technisch hergestellten MT-Variante, der aldehydreaktive Rückstände fehlen) in Säugetierzellen mit gut erhaltener Ultrastruktur. In diesem Protokoll wurden Hochdruckgefrieren und Gefriersubstitutionsfixierung unter Verwendung von Nicht-Aldehyd-Fixiermitteln (wie Gerbsäure, Uranylacetat) durchgeführt, um die nahezu native Ultrastruktur zu erhalten und eine Schädigung der Tag-Aktivität durch Aldehydvernetzung zu vermeiden.
Vor der ANSM-basierten AuNP-Synthese wurde eine einfache einstufige Rehydrierung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die markierten Proteine auf verschiedene Organellen abzielten, einschließlich der Membranen und des Lumens des endoplasmatischen Retikulums (ER), und mitochondriale Matrizen wurden mit hoher Effizienz und Spezifität detektiert. Diese Forschung bietet Biologen ein robustes Protokoll, um eine enorme Bandbreite biologischer Fragestellungen auf Einzelmolekülebene in zellulären ultrastrukturellen Kontexten zu beantworten.
Introduction
In der postgenomischen Ära hat die Entwicklung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als Einzelmolekül-Reporter für die Lichtmikroskopie das Feld der modernen lebenswissenschaftlichen Forschung revolutioniert 1,2. Die Elektronenmikroskopie (EM) ist seit Jahrzehnten ein leistungsfähiges Werkzeug zur intuitiven Beobachtung der zellulären Ultrastruktur mit nanoskaliger Auflösung3; Die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Proteinmolekülen bleibt jedoch eine Herausforderung.
Die am häufigsten verwendete EM-Markierungstechnik ist die Immunelektronenmikroskopie (IEM)-Markierungstechnik, die auf der Antigen-Antikörper-Reaktion basiert. Obwohl auf dem Gebiet der IEM-Markierung viele Techniken entwickelt wurden, einschließlich der Präeinbettung von IEM und der Post-Embedding-IEM (auf Harzschnitten oder hydratisierten Kryosektionen), leidet sie immer noch unter einer geringen Markierungseffizienz (<10%)4,5, was mit der Probenvorbereitung und der Antikörperqualität zusammenhängt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, birgt die Entwicklung genetisch kodierter Tags ein großes Anwendungspotenzial.
Zwei Haupttypen von EM-Tags wurden in den letzten Jahren gründlich erforscht. Eine Art ist die DAB-Färbemethode, bei der Tags wie APEX2 verwendet werden, um 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) zu osmiophilen Polymeren für die EM-Visualisierungzu oxidieren 6,7,8,9,10,11,12. Es ermöglicht die Markierung von Proteinen mit hoher Abundanz in subzellulären Regionen, ist aber nicht für die Einzelmolekülzählung geeignet. Der andere Typ nutzt metallbindende Proteine wie Ferritin 13 und Metallothionein (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, um elektronendichte Metallablagerungen in situ für die EM-Visualisierung. Nur Letzteres hat ein echtes Potenzial für die Visualisierung und Zählung einzelner Moleküle. Die Molekülgröße von Ferritin ist zu groß (~450 kD), um als vielversprechender Marker verwendet zu werden, während die geringe Größe (~5 kD) von MT und seine Fähigkeit, verschiedene Ionen durch seine 20 Cystone zu binden, große Aufmerksamkeit erregt haben. Mehrere Labore haben versucht, gereinigte MT-Fusionsproteine oder MT-exprimierende Zellen zu markieren, indem sie direkt mit Au+ inkubiert wurden. Diese Versuche haben zunächst bewiesen, dass MT-Tags Goldionen binden können, um kontrastreiche Signale zu bilden, aber keiner hat wirklich die effektive Identifizierung einzelner Proteine in Zellen erreicht, und sie sind nicht breit anwendbar 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Die ANSM-basierte AuNP-Synthesetechnik, bei der 2-6 nm große AuNPs direkt auf Cystein-reichen Tags (z. B. MT, die MT-Varianten MTn und MTα, AFP) als elektronendichte Markierungen für die EM-Visualisierung synthetisiert werden, ist der erste zuverlässige und anwendbare Ansatz für die Proteinmarkierung und den Einzelmolekülnachweis in Zellen24,25,26. Es ermöglicht die spezifische Synthese von AuNPs auf isolierten Tag-Fusionsproteinen und hat eine beispiellose Markierungseffizienz in nicht fixierten oder chemisch fixierten prokaryotischen (E. coli) und eukaryotischen (S. pombe) Zellen erreicht. Die Implementierung desselben Protokolls in fortschrittlicheren Systemen wie Säugetierzellen oder sogar Geweben bringt jedoch zusätzliche Herausforderungen mit sich, wie z. B. die komplexere intrazelluläre Redoxhomöostase und die fragilere Zellstruktur.
In dieser Arbeit wird eine klonierbare EM-Markierungstechnologie vorgestellt, die die neuartige ANSM-basierte AuNP-Synthesetechnik zur Markierung genetisch kodierter Cystein-reicher Tags (MT) mit der HPF/FSF-Rehydratation-HPF/FSF-Probenvorbereitungsmethode kombiniert und die eindeutige Einzelmolekülidentifizierung von markierten Proteinen in der ER-Membran, im ER-Lumen und in der mitochondrialen Matrix in HeLa-Zellen ermöglicht. Die aktuelle Methode vereint die Eigenschaften einer hohen Markierungseffizienz, eines hohen Signal-Rausch-Verhältnisses, einer Einzelmolekülmarkierung und einer starken Universalität und hat breite Anwendungsperspektiven in der Life-Science-Forschung.
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Protocol
Alle in diesem Experiment verwendeten Verbrauchsmaterialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Der Schritt-für-Schritt-Workflow des aktuellen Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Zellkultur auf Saphirscheiben
- 3 mm x 0,16 mm große Saphirscheiben werden in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml Ethanol überführt und 10 Minuten lang in einem Ultraschallreiniger bescholten.
- Brennen Sie jede Saphirscheibe in einer Alkohollampenflamme, bis keine sichtbaren Ablagerungen mehr auf der Oberfläche vorhanden sind.
HINWEIS: Durch die obige Methode können Saphirscheiben viele Male recycelt werden. - Beschriften Sie eine Seite jeder Saphirscheibe mit einem lösungsmittelbeständigen Stift mit einer Zahl (Abbildung 1A).
Anmerkungen: Der verwendete Markierungsstift muss vorab getestet werden, um festzustellen, ob er gegen Aceton- und Methanollösungsmittel beständig ist, um den Verlust von Markierungen zu vermeiden. - Legen Sie die beschrifteten Saphirscheiben mit der beschrifteten Seite nach oben auf den Boden einer 35-mm-Kulturschale.
- Sterilisieren Sie die Zellkulturschale mit Saphirscheiben unter UV-Licht für 30 min.
- Drehen Sie die Saphirscheiben mit einer Pinzette um (die beschriftete Seite zeigt nach unten) und sterilisieren Sie sie weitere 30 Minuten lang unter UV-Licht. Nun ist die Kulturschale mit den Saphirscheiben bereit für die Zellkultur.
HINWEIS: Die Saphirscheiben können auch durch Autoklavieren sterilisiert werden. - Säen Sie die Zellen auf den oben vorbereiteten Saphirscheiben aus und wachsen Sie in einem Zellinkubator bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 zu 80 % bis 90 % Konfluenz (Abbildung 1B).
HINWEIS: Stabile HeLa-Zelllinien, die MTn-Tags exprimieren, wurden generiert, wie in Jiang et al.26 beschrieben.
2. Hochdruckgefrieren (HPF)
ACHTUNG: In diesem Experiment wird flüssiger Stickstoff verwendet. Verwenden Sie bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff geeignete Sicherheitsverfahren und persönliche Schutzausrüstung, um Erfrierungen und Ersticken zu vermeiden.
- Bereiten Sie die Hochdruck-Gefriermaschine mindestens 2 h vor dem Versuch gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
- HPF-Aluminiumträger vom Typ A (Aussparung: 0,025/0,275 mm) in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml Ethanol überführen und 10 Minuten lang in einem Ultraschallreiniger beschallen.
- Trocknen Sie die Träger in einer Petrischale, die mit hochwertigem Filterpapier bedeckt ist (mittlere Geschwindigkeit).
- Tränken Sie die vorgereinigten Träger in 1-Hexadecen.
HINWEIS: BSA wird im aktuellen Experiment nicht als Kryoprotektivum empfohlen, da es die anschließende Synthese von Goldnanopartikeln stört. - Verwenden Sie eine feine Pinzette, um eine Saphirscheibe mit Zellen aus der Kulturschale zu nehmen. Berühren Sie die beschriftete Oberfläche mit qualitativem Filterpapier (mittlere Geschwindigkeit), um das überschüssige Medium zu entfernen.
Anmerkungen: Die Wärmeleitfähigkeit von Wasser ist sehr gering und zu viel Restwasser beeinträchtigt den Gefriereffekt. Bewahren Sie nur wenig Wasser auf, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern. - Montieren Sie die Saphirscheibe in den HPF-Probenhalter und verschließen Sie die Scheibe schnell mit einem 0,025 mm tiefen Aluminiumträger, der 1-Hexadecen enthält (Abbildung 1C).
- Überschüssige Lösung mit qualitativem Filterpapier (mittlere Geschwindigkeit) absaugen.
- Beladen Sie den Probenhalter für das Hochdruckgefrieren (Abbildung 1D).
Anmerkungen: Der Probenladevorgang muss so schnell wie möglich (innerhalb von 1 Minute) erfolgen, um physiologische Veränderungen aufgrund von Änderungen der Temperatur, der Luftfeuchtigkeit, des pH-Werts und des Sauerstoffgehalts zu minimieren. - Entladen Sie die Saphirscheiben-Trägerbaugruppe unter flüssigem Stickstoff in einer Schaumstoff-Kryobox und lagern Sie die Baugruppe vor der Verwendung in einem Kryogeschoss in flüssigem Stickstoff.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Die Proben in Kryogefäßen können jahrelang in einem Flüssigstickstoff-Dewar gelagert werden.
3. Fixierung und Rehydrierung von Gefriersubstitution (FSF) (Abbildung 1E)
- Füllen Sie die automatische Gefriersubstitutionsmaschine (AFS) mit flüssigem Stickstoff und kühlen Sie die Kammer auf −90 °C ab.
ACHTUNG: In diesem Experiment wird flüssiger Stickstoff verwendet. Verwenden Sie bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff geeignete Sicherheitsverfahren und persönliche Schutzausrüstung, um Erfrierungen und Ersticken zu vermeiden. - Bereiten Sie 2 ml 0,01%ige Gerbsäure (w/v) in Aceton (FSF-Lösung 1) in einem 20 mm runden Polypropylenbehälter (Abbildung 1E) in einem Abzug vor und frieren Sie ihn in flüssigem Stickstoff ein.
- Legen Sie die Proben (die Saphirscheiben-Träger-Baugruppen) mit einer vorgekühlten Pinzette in den Behälter mit gefrorener FSF-Lösung 1 unter LN2.
- Überführen Sie den Behälter zur FSF-Verarbeitung bei −90 °C in die vorgekühlte AFS-Kammer.
- Bewahren Sie die Proben 1 h lang bei −90 °C auf. Trennen Sie dann die Saphirscheiben mit einer vorgekühlten Pinzette von den Trägern und stellen Sie sicher, dass die markierten Seiten der Saphirscheiben nach unten zeigen.
Anmerkungen: Die Pinzette muss ausreichend vorgekühlt sein, um Temperaturschwankungen zu vermeiden. Die Saphirscheiben sollten sich leicht trennen lassen. - Bei −90 °C weitere 8-10 h aufbewahren; dann innerhalb von 3 h auf −60 °C erwärmen.
- Ersetzen Sie die FSF-Lösung 1 im Behälter durch vorgekühltes Aceton und inkubieren Sie sie 1 h lang. Wiederholen Sie diese Acetonwäsche 2x.
- Innerhalb von 3 h auf −30 °C erwärmen. Während dieser Zeit werden 2 ml 0,01%iges Uranylacetat in Aceton (FSF-Lösung 2, verdünnt aus 10%igem Uranylacetat in Methanol) in einem 2-ml-Zentrifugenröhrchen vorbereitet und vorgekühlt.
VORSICHT: Uranylacetat, das im aktuellen Experiment verwendet wird, ist radioaktiv und hochgiftig; Es muss nach ordnungsgemäßen Sicherheitsverfahren gehandhabt und als gefährlicher chemischer Abfall entsorgt werden. - Ersetzen Sie das Aceton durch FSF-Lösung 2 und inkubieren Sie es 3 h lang bei −30 °C.
- Ersetzen Sie die FSF-Lösung 2 im Behälter durch vorgekühltes Aceton und inkubieren Sie sie 30 min lang bei −30 °C. Wiederholen Sie diese Acetonwäsche 2x.
- Innerhalb von 2 h von −30 °C auf 4 °C erwärmen.
- Ersetzen Sie das Aceton durch 2 ml 0,2 M HEPES-Puffer, der 1 mM CaCl 2 und 1 mM MgCl2 bei einem pH-Wert von 5,5 enthält.
- Wechseln Sie den Puffer einmal und inkubieren Sie ihn 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier für eine Nacht pausiert oder für mindestens 6 Stunden fortgesetzt werden, bis die Proben in Schritt 5 wieder eingefroren sind.
4. ANSM-basierte AuNP-Synthese für Säugetierzellen (Abbildung 1F)
- Mit PBS-A-Puffer 3x für jeweils 5 min waschen.
- Die Saphirscheiben werden in eine 35-mm-Kulturschale mit 1 ml PBS-A-Puffer bei Raumtemperatur überführt.
Anmerkungen: Halten Sie die markierten Seiten der Saphirscheiben immer nach unten und vermeiden Sie es, die Saphirscheiben zu überlappen und die Zellen abzureiben. - Bereiten Sie die Reduktionslösung vor, indem Sie 4,28 μl 2-Mercaptoethanol in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml PBS-A-Puffer geben und in einem Abzug gut mischen.
ACHTUNG: 2-Mercaptoethanol ist giftig und hat einen stechenden Geruch; Es muss nach den richtigen Sicherheitsverfahren gehandhabt werden. - Ersetzen Sie den PBS-A-Puffer in der Kulturschale durch 1 ml Reduktionslösung und inkubieren Sie ihn 1 h lang bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie die Goldvorstufe vor der Verwendung vor.
- 80 μl 10 mM HAuCl4 in ddH 2 O in ein2ml Zentrifugenröhrchen mit 1 ml Reduktionslösung geben und sofort vortexen.
Anmerkungen: Die Lösung kann trüb werden. - Fügen Sie 80 μl 500 mM D-Penicillamin in ddH2O in die obige Lösung hinzu und wirbeln Sie sofort.
HINWEIS: Die Lösung kann wieder klar werden.
- 80 μl 10 mM HAuCl4 in ddH 2 O in ein2ml Zentrifugenröhrchen mit 1 ml Reduktionslösung geben und sofort vortexen.
- Ersetzen Sie die Lösung in der Kulturschale durch die in Schritt 4.5 hergestellte 1 ml Goldvorläuferlösung und inkubieren Sie sie 2 h lang bei 4 °C.
HINWEIS: Ein Milliliter der Goldvorstufe reicht aus, um mit ca. 1 × 106 Zellen (konfluent auf einer 35-mm-Schale) zu reagieren. Größere Mengen der Vorstufe werden benötigt, wenn die AuNPs deutlich kleiner werden. - Wiegen Sie 0,0038 g NaBH 4 in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 1 ml eiskaltes ddH2O hinzu und vertexen Sie kurz vor der Anwendung, um frische 100 mM NaBH4 herzustellen.
- 20-100 μl 100 mM NaBH 4 in die Lösung aus Schritt4.6 geben, sofort schütteln, um gut zu mischen, und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
HINWEIS: Bereiten Sie 100 mM NaBH4 frisch für den sofortigen Gebrauch vor. Nach der Zugabe von NaBH4 färbt sich die Farbe der Lösung allmählich rot und vertieft sich dann. Wenn keine Farbveränderung beobachtet wird, deutet dies weitgehend darauf hin, dass das Experiment fehlgeschlagen ist. - Ersetzen Sie die Lösung durch 2 ml PBS-A-Puffer, um die Reaktion zu stoppen.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Reaktion innerhalb von 30 Minuten zu stoppen, da eine längere Reaktion die AuNPs allmählich abbaut.
5. Hochdruckgefrieren und Gefriersubstitutionsfixierung (Abbildung 1C-F)
HINWEIS: Die Proben sind wieder HPF und FSF, und das Verfahren ist fast das gleiche wie zuvor in Abschnitt 2 und Abschnitt 3 beschrieben, mit einigen Modifikationen.
- Bereiten Sie 1 % Osmiumtetroxid und 0,1 % Uranylacetat in Aceton her (FSF-Lösung 3, verdünnt aus 4 % Osmiumtetroxid in Aceton und 10 % Uranylacetat in Methanol).
VORSICHT: Osmiumtetroxid und Uranylacetat sind hochgiftige Chemikalien; Sie müssen gemäß den ordnungsgemäßen Sicherheitsverfahren gehandhabt und als gefährlicher chemischer Abfall entsorgt werden. - Legen Sie die Proben (die Saphirscheiben-Träger-Baugruppen) mit einer vorgekühlten Pinzette in den Behälter mit gefrorener FSF-Lösung 3 unter LN2.
- Den Behälter zur FSF-Verarbeitung bei −90 °C in die vorgekühlte AFS-Kammer überführen und das FSF-Programm wie folgt ausführen: 8-10 h bei −90 °C aufbewahren; dann innerhalb von 3 h auf −60 °C erwärmen; 3 h bei −60 °C halten; dann innerhalb von 3 h auf −30 °C erwärmen; 3 h bei −30 °C aufbewahren; dann innerhalb von 2 h auf 4 °C erwärmen.
- Wenn die Temperatur 4 °C erreicht, übertragen Sie die Proben in den Abzug und halten Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Mit Aceton 3x für jeweils 15 Minuten waschen.
- In Aceton bei Raumtemperatur mindestens 2 h halten.
6. Infiltration, Einbettung und Polymerisation von Harz
- Bereiten Sie die Epoxidharzmischung vor Gebrauch gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
VORSICHT: Das im aktuellen Experiment verwendete Epoxidharz ist vor der Polymerisation giftig; Es muss nach den richtigen Sicherheitsverfahren gehandhabt werden. Unpolymerisiertes Harz sollte vor der Entsorgung als gefährlicher chemischer Abfall entsorgt oder polymerisiert werden. - Übertragen Sie die Saphirscheiben in Einbettkapseln mit flachem Boden und infiltrieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Harz.
Anmerkungen: Halten Sie die markierten Seiten der Saphirscheiben nach unten. - Polymerisieren Sie die Probe bei 60 °C im Ofen für mindestens 18 h.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier nach der Polymerisation pausiert werden. Polymerisierte Probenblöcke können jahrelang in einem trockenen Behälter gelagert werden.
7. Ultradünne Schnitte
- Schneiden Sie die polymerisierten Probenblöcke vorsichtig mit einem Rasiermesser ab, um die Saphirscheiben freizulegen.
- Tauchen Sie die Blockspitzen mit Saphirscheiben einige Sekunden lang in flüssigen Stickstoff und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Wiederholen Sie den Gefrier-Tau-Vorgang mehrmals, um die Discs von den Blöcken zu lösen.
Anmerkungen: Vermeiden Sie längeres Einfrieren, da dies die Probenblöcke reißen kann. Lösen Sie die Saphirscheiben vorsichtig mit einer Klinge und vermeiden Sie übermäßige Krafteinwirkung, die die Proben beschädigen kann. - Trimmen Sie die Blockfläche auf eine trapezförmige Form, um ultradünne Schnitte zu erzielen (Abbildung 1G).
- Mit einem Ultramikrotom erhalten Sie ultradünne Schnitte von 70-100 nm (Abbildung 1H).
- Wählen Sie die Abschnitte auf sechseckigen Kupfergittern mit 200 Maschen aus.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier nach dem Schneiden pausiert werden. Die Profile an Trägern können jahrelang in einem trockenen Behälter gelagert werden. Falls gewünscht, können die Abschnitte auf den Gittern mit 2%igem Uranylaceton gefärbt werden, um einen besseren Membrankontrast zu erhalten. Bleifärbungen sollten vermieden werden, da sie die Signale der Nanogoldpartikel überdecken.
8. TEM-Bildgebung (Abbildung 1I)
- Untersuchen Sie die ultradünnen Schnitte auf Kupfergittern mit einem Transmissionselektronenmikroskop. Typischerweise ist ein Vergrößerungsbereich von 11 kX bis 30 kX für die Visualisierung von AuNPs in Zellen geeignet, und ein geeigneter Unschärfewert ist erforderlich, um sicherzustellen, dass 2-3 nm AuNPs sichtbar sind.
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Representative Results
Die ANSM-basierte AuNP-Synthesetechnik ist ein äußerst nützliches Werkzeug für die Markierung und Detektion von MT-markierten Proteinen mit TEM26. Um seine Robustheit in Säugetierzellen zu validieren, wurden drei stabile Zelllinien generiert, die EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn oder Mito-acGFP-MTn in Hela-Zellen exprimieren. KDEL ist eine kanonische Retentions-/Retrievalsequenz des C-terminalen endoplasmatischen Retikulums (ER), die das Fusionsprotein EGFP-MTn-KDEL innerhalb des ER-Lumens oder des perinukleären Raums der Kernhülle (NE) hält. Ost4 ist eine Untereinheit des Oligosaccharyltransferase-Komplexes, bei dem es sich um einen Membranproteinkomplex handelt, der im ER und NE lokalisiert ist und die N-Glykosylierung von entstehenden Polypeptiden katalysiert. Der C-Terminus des Ost4-Fusionsproteins Ost4-EGFP-MTn ist dem Zytosol zugewandt. Mito ist eine mitochondriale Targeting-Sequenz, die auf das Fusionsprotein Mito-acGFP-MTn in der mitochondrialen Matrix abzielt.
Die HPF/FSF-Probenvorbereitung in Kombination mit der Verwendung von Gerbsäure und Uranylacetat anstelle von Aldehydfixiermitteln bewahrte eine hervorragende Ultrastruktur mit gutem Membrankontrast (Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4). Die Gesamtstruktur der Probe war dicht, ohne offensichtliche Zytoplasma- und Lipidextraktion. Die Membranstruktur war glatt, ohne offensichtliche Verformung, und die Phospholipid-Doppelschichtstruktur war deutlich sichtbar.
Neben der gut erhaltenen Ultrastruktur wurde in allen drei Fällen eine effiziente Markierung beobachtet, die unterschiedliche Organellenspezifitäten aufwies. Das EGFP-MTn-KDEL-Protein erschien als 2-5 nm große Goldnanopartikel, die ausschließlich im peripheren ER-Lumen und im perinukleären Raum des NO verteilt waren (Abbildung 2A-C). Die gut erhaltene Ultrastruktur ermöglichte nicht nur die Identifizierung von markierten Proteinen durch einzelne Moleküle, sondern erleichterte auch die Analyse von Organelleninteraktionen, wie z. B. ER-Mitochondrien-Interaktionen (Abbildung 2D,E). Nanopartikel des Ost4-EGFP-MTn-Proteins grenzten die ER-Membran (Abbildung 3A-D) und die äußere Membran des NE (Abbildung 3E) ab. Nanopartikel waren auch auf der inneren Membran des NO verteilt, aber die Anzahl der Nanopartikel war dort geringer als auf der äußeren Membran, was darauf hindeutet, dass die Proteinzusammensetzung der inneren und äußeren Membran unterschiedlich war (Abbildung 3E). Ebenso zeigten die Mito-acGFP-MTn-exprimierenden Zellen eine spezifische Markierung in der mitochondrialen Matrix (Abbildung 4A-E). In den Vesikeln oder im ER wurden keine Partikel beobachtet (Abbildung 4A-D), und in den MVBs wurden nur wenige Partikel gezeigt (Abbildung 4D).
Abbildung 1: Schema für den Arbeitsablauf der klonbaren Elektronenmikroskopie-Markierungstechnologie . (A) Saphirscheiben werden für die Zellkultur markiert und sterilisiert. (B) Die Zellen werden auf Saphirscheiben in einer 35-mm-Kulturschale gezüchtet. (C) Die Saphirscheiben mit Zellen sind mit 0,025 mm tiefen Aluminiumträgern für das Hochdruckgefrieren verschlossen, und der zusätzliche Raum ist mit 1-Hexadecen gefüllt. (D) Die Zellen werden durch HPF kryofixiert. (E) Fixierung von Gefriersubstitution. (F) Die schematischen Schritte der ANSM-basierten AuNP-Synthese. (G) Die Saphirscheiben mit Zellen sind in Einbettkapseln mit flachem Boden eingebettet. Die Harzblöcke sind für ultradünne Schnitte getrimmt. (H) Die beschnittenen Harzblöcke werden mit einem Ultramikrotom geschnitten. (I) Die ultradünnen Schnitte werden mit TEM abgebildet. Abkürzungen: ANSM = Autonukleationsunterdrückungsmechanismus; AuNP = Gold-Nanopartikel; HPF = Hochdruckgefrieren; FSF = Fixierung von Gefriersubstitutionen; TEM = Transmissionselektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: ANSM-basierte AuNP-Synthese auf EGFP-MTn-KDEL, exprimiert in HeLa-Zellen. (A,D) EM-Aufnahmen eines 90 nm dicken Schnitts von HeLa-Zellen, die EGFP-MTn-KDEL exprimieren, zeigen AuNPs, die spezifisch im Lumen des endoplasmatischen Retikulums und im perinukleären Raum der Kernhülle akkumuliert sind. Nur wenige Partikel werden in den Mitochondrien, im Lysosom, im Zellkern oder im Zytosol beobachtet. (B,C) Vergrößerte Bilder der roten bzw. gelben Rechteckbereiche in (A). (E) Vergrößertes Bild des grünen Rechteckbereichs in (D). Diese Zahl wurde von Jiang et al.26 modifiziert. Maßstabsbalken = (B,C,E) 200 nm; (A,D) 500 nm. Abkürzungen: ANSM = Autonukleationsunterdrückungsmechanismus; AuNP = Gold-Nanopartikel; EGFP = verstärktes grün fluoreszierendes Protein; ER = endoplasmatisches Retikulum; NE = Kernhülle; M = Mitochondrien; Lyso = Lysosom; N = Kern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: ANSM-basierte AuNP-Synthese auf Ost4-EGFP-MTn, exprimiert in HeLa-Zellen. (A-D) EM-Bilder eines 90 nm dicken Schnitts von HeLa-Zellen, die Ost4-EGFP-MTn exprimieren, zeigen AuNPs, die spezifisch auf der Membran des endoplasmatischen Retikulums akkumuliert sind. (E) Eine EM-Aufnahme eines 90 nm dicken Schnitts von HeLa-Zellen, die Ost4-EGFP-MTn exprimieren, zeigt AuNPs, die spezifisch auf der Membran des NE (Kernhülle) akkumuliert sind. Nur wenige Partikel werden in den Mitochondrien, im Lysosom, im Zellkern oder im Zytosol beobachtet. (C) Vergrößertes Bild des roten Rechteckbereichs in (A). Diese Zahl wurde von Jiang et al.26 modifiziert. Maßstabsbalken = (B-E) 200 nm; (A) 500 nm. Abkürzungen: ANSM = Autonukleationsunterdrückungsmechanismus; AuNP = Gold-Nanopartikel; EGFP = verstärktes grün fluoreszierendes Protein; ER = endoplasmatisches Retikulum; NE = nukleare Umhüllung; M = Mitochondrien; Lyso = Lysosom; N = Kern; EM = Elektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: ANSM-basierte AuNP-Synthese auf Mito-acGFP-MTn, exprimiert in HeLa-Zellen. (A,D,E) EM-Bilder eines 90 nm dicken Schnitts von HeLa-Zellen, die Mito-acGFP-MTn exprimieren, zeigen AuNPs, die spezifisch in der Matrix der Mitochondrien (M) akkumuliert sind. Nur wenige Partikel werden im endoplasmatischen Retikulum, Zellkern, Vesikel, multivesikulären Körper oder Zytosol beobachtet. (B,C) Vergrößertes Bild der roten bzw. gelben Rechteckbereiche in (A). Diese Zahl wurde von Jiang et al.26 modifiziert. Maßstabsbalken = (D,E) 200 nm; (B,C) 500 nm; (A) 1 μm. Abkürzungen: ANSM = Autonukleationsunterdrückungsmechanismus; AuNP = Gold-Nanopartikel; EGFP = verstärktes grün fluoreszierendes Protein; ER = endoplasmatisches Retikulum; NE = Kernhülle; M = Mitochondrien; Lyso = Lysosom; N = Kern; V = Vesikel; MVB = multivesikulärer Körper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Studie stellt hier eine robuste klonierbare EM-Markierungstechnologie für die Einzelmolekül-Visualisierung von Proteinmolekülen in der zellulären Umgebung mit ultrastruktureller Auflösung vor. Die direkt synthetisierten AuNPs auf genetisch kodierten Cystein-reichen Tags ermöglichen eine eindeutige und präzise Lokalisierung der Zielproteine. Hochdruckgefrieren und Gefriersubstitutionstechnik erhalten die Ultrastruktur biologischer Proben hervorragend. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellte klonierbare elektronenmikroskopische Markierungstechnologie ein leistungsfähiges Werkzeug für die effiziente Lokalisierung und Erkennung eines einzelnen Moleküls in zellulären ultrastrukturellen Kontexten in situ mit EM darstellt.
Der ANSM-Mechanismus unterdrückt den Autonukleationsprozess von Thiolat-Au(I)-Polymeren26, was eine typische Reaktion der klassischen Brust-Schifferin-Methode (BSM)27 ist, die häufig für die Synthese von Goldnanoclustern mit Thiolat-Kappe verwendet wird. Daher kann die ANSM-basierte AuNP-Synthesetechnik spezifische 2-6 nm große AuNPs direkt auf Cystein-reichen Tags als elektronendichte Marker für die EM-Visualisierung mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und hoher Effizienz synthetisieren. Im Gegensatz zu APEX2- oder HPR-Markierungstechniken, die auf der DAB-Polymerabscheidung beruhen, die nicht zählbar ist und für lösliche Proteine im Zytosol nicht geeignet ist, ist die ANSM-basierte AuNP-Synthesetechnik die einzige Technik, die bisher den Nachweis einzelner Moleküle ermöglicht.
Der Nachteil der klonierbaren elektronenmikroskopischen Markierungstechnologie besteht darin, dass die ANSM-basierte AuNP-Synthesetechnik auf der Aktivität der Thiolgruppe von Cystein beruht, die empfindlich auf Aldehydfixiermittel reagiert. Der oxidative Schutz von Thiolen durch 3,3'-Dithiodipropionsäure (DTDPA) wurde vor der Aldehydfixierung in E. coli und der Spalthefe S. pombe eingeführt, was zu einer guten Morphologie und einer ausgezeichneten Markierungseffizienz führt24,25,26. In dieser Arbeit funktionierte die Oxidations-/Fixierungsmethode für die Tags, die in einem relativ oxidativen Kompartiment exprimiert werden, wie z.B. das ER-Lumen und die Mitochondrienmatrix (in EGFP-MTn-KDEL- und Mito-acGFP-MTn-Zellen). Es war jedoch suboptimal für zytosolische Tags (Ost4-GFP-MTn) in Säugetierzellen. Der Grund dafür kann sein, dass die Tags in den reduzierenden Kompartimenten nicht gut gefaltet sind und die reduzierenden Substanzen wie GSH, die im Zytoplasma reichlich vorhanden sind, der Oxidation widerstehen können.
Die HPF-FSF-Technik ist der Goldstandard in der ultrastrukturellen Konservierung biologischer Proben für die Elektronenmikroskopie. In dieser Arbeit wurde mit der Methode der HPF/FSF-Rehydrierung-HPF/FSF, die die konventionelle chemische Fixierung und Permeabilisierung vollständig vermeidet, eine effiziente Markierung mit Ost4-GFP-MTn erreicht und eine hervorragende Zellstruktur erzielt. Diese Methode hat jedoch noch gewisse Einschränkungen. Erstens kann eine zweite HPF zu erheblichen Schäden durch Eiskristalle führen. Zweitens haben verschiedene Chargen von Uranylacetat Probleme mit inkonsistenter Qualität und Löslichkeit. Gelegentlich traten in den rehydrierten Proben nadelförmige Ausscheidungen auf, wenn sie elektronenmikroskopisch sichtbar gemacht wurden. Das Waschen mit HEPES-Puffer bei einem pH-Wert von 5,5 kann dieses Problem lindern. Drittens muss die Probenvorbereitung für Gewebeproben weiter optimiert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die klonierbare EM-Markierungstechnologie, die die ANSM-basierte AuNP-Synthesetechnik mit der Probenvorbereitungsmethode HPF/FSF-Rehydratation-HPF/FSF kombiniert, die eindeutige Einzelmolekülidentifizierung genetisch markierter Proteine in Zellen durch Elektronenmikroskopie ermöglicht. Das aktuelle Protokoll soll es ermöglichen, ein enormes Spektrum biologischer Fragestellungen zu beantworten.
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Disclosures
Der Autor erklärt keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Das hier beschriebene Protokoll wurde aus dem Artikel von Jiang et al. (2020) abgeleitet. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des MOST (973 Programme Nr. 2011CB812502 und 2014CB849902) und durch finanzielle Unterstützung der Stadtregierung von Peking unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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