Summary
Det nuvarande protokollet beskriver en klonbar elektronmikroskopimärkningsteknik för detektering av metallotioneintaggade proteiner i celler med hjälp av en ny autonukleationssuppressionsmekanismbaserad guldnanopartikelsyntesteknik.
Abstract
Att analysera den exakta lokaliseringen av proteinmolekyler i celler med ultrastrukturell upplösning är av stor betydelse för studier av olika fysiologiska eller patologiska processer i alla levande organismer. Därför är utvecklingen av klonbara taggar som kan användas som elektronmikroskopiprober av stort värde, precis som fluorescerande proteiner har spelat en avgörande roll inom optisk avbildning. Autonucleation suppression mechanism (ANSM) upptäcktes nyligen, vilket möjliggör specifik syntes av guldnanopartiklar (AuNP) på cysteinrika taggar, såsom metallotionein (MT) och frostskyddsprotein (AFP).
Baserat på ANSM utvecklades en elektronmikroskopimärkningsteknik som möjliggör specifik detektion av märkta proteiner i prokaryota och eukaryota celler med en oöverträffad märkningseffektivitet. Denna studie illustrerar ett protokoll för detektion av MTn (en konstruerad MT-variant som saknar aldehydreaktiva rester) fusionsproteiner i däggdjursceller med välbevarad ultrastruktur. I detta protokoll utfördes högtrycksfrysning och fryssubstitutionsfixering med användning av icke-aldehydfixeringsmedel (såsom garvsyra, uranylacetat) för att bevara nästan naturlig ultrastruktur och undvika skador på taggaktiviteten orsakad av aldehydtvärbindning.
En enkel enstegs rehydrering användes före den ANSM-baserade AuNP-syntesen. Resultaten visade att de märkta proteinerna riktade sig mot olika organeller, inklusive membranen och lumen i endoplasmatisk retikulum (ER), och mitokondriella matriser detekterades med hög effektivitet och specificitet. Denna forskning ger biologer ett robust protokoll för att ta itu med ett enormt antal biologiska frågor på enmolekylnivå i cellulära ultrastrukturella sammanhang.
Introduction
I den postgenomiska eran har utvecklingen av grönt fluorescerande protein (GFP) som en enmolekylär reporter för ljusmikroskopi revolutionerat området för modern life science-forskning 1,2. I årtionden har elektronmikroskopi (EM) varit ett kraftfullt verktyg för att intuitivt observera den cellulära ultrastrukturen med nanoskala upplösning3; Den exakta identifieringen och lokaliseringen av proteinmolekyler är dock fortfarande utmanande.
Den vanligaste EM-märkningstekniken är immunelektronmikroskopi (IEM) märkningsteknik, som är baserad på antigen-antikroppsreaktionen. Även om många tekniker har utvecklats inom IEM-märkning, inklusive förinbäddning av IEM och efterinbäddning av IEM (på hartssektioner eller hydratiserade kryosektioner), lider den fortfarande av låg märkningseffektivitet (<10%)4,5, vilket är relaterat till provberedningen och antikroppskvaliteten. För att övervinna dessa begränsningar har utveckling av genetiskt kodade taggar stor applikationspotential.
Två huvudtyper av EM-taggar har utforskats grundligt de senaste åren. En typ är DAB-färgningsmetoden, som använder taggar som APEX2 för att oxidera 3,3'-diaminobensidin (DAB) till osmiofila polymerer för EM-visualisering 6,7,8,9,10,11,12. Det möjliggör märkning av proteiner med hög förekomst i subcellulära regioner men är inte lämpligt för räkning av enstaka molekyler. Den andra typen använder metallbindande proteiner, såsom ferritin 13 och metallotionein (MT) 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, för att generera elektrontäta metallavlagringar i situ för EM-visualisering. Endast den senare har verklig potential för visualisering och räkning av en molekyl. Ferritins molekylstorlek är för stor (~450 kD) för att den ska kunna användas som en lovande tagg, medan den lilla storleken (~5 kD) på MT och dess förmåga att binda olika joner genom sina 20 cystein har väckt stor uppmärksamhet. Flera laboratorier har försökt märka renade MT-fusionsproteiner eller MT-uttryckande celler genom att inkubera direkt med Au+. Dessa försök har initialt visat att MT-taggar kan binda guldjoner för att bilda högkontrastsignaler, men ingen har verkligen uppnått effektiv identifiering av enskilda proteiner i celler, och de är inte allmänt tillämpliga 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Den ANSM-baserade AuNP-syntestekniken, som innebär att man syntetiserar 2-6 nm-stora AuNPs direkt på cysteinrika taggar (t.ex. MT, MT-varianterna MTn och MTα, AFP) som elektrontäta etiketter för EM-visualisering, är det första pålitliga och tillämpliga tillvägagångssättet för proteinmärkning och detektering av enstaka molekyler i celler24,25,26. Det möjliggör specifik syntes av AuNPs på isolerade taggfusionsproteiner och har uppnått en oöverträffad märkningseffektivitet i icke-fixerade eller kemiskt fixerade prokaryota (E. coli) och eukaryota (S. pombe) celler. Att implementera samma protokoll i mer avancerade system som däggdjursceller eller till och med vävnader innebär emellertid ytterligare utmaningar, såsom den mer komplexa intracellulära redoxhomeostasen och mer ömtålig cellulär struktur.
Denna studie presenterar en klonbar EM-märkningsteknik, som kombinerar den nya ANSM-baserade AuNP-syntestekniken för märkning av genetiskt kodade cysteinrika taggar (MT) med HPF / FSF-rehydrering-HPF / FSF-provberedningsmetoden, möjliggör entydig enmolekylidentifiering av märkta proteiner i ER-membranet, ER-lumen och mitokondriell matris i HeLa-celler. Den nuvarande metoden kombinerar egenskaperna hög märkningseffektivitet, ett högt signal-brusförhållande, enmolekylmärkning och stark universalitet, och denna metod har breda tillämpningsmöjligheter inom life science-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla tillbehör som används i detta experiment listas i materialtabellen. Det stegvisa arbetsflödet för det aktuella protokollet visas i figur 1.
1. Cellodling på safirskivor
- Överför 3 mm x 0,16 mm safirskivor till ett 2 ml centrifugrör innehållande 1 ml etanol och ultraljudsbehandling i en ultraljudsrengörare i 10 minuter.
- Bränn varje safirskiva i en alkohollamplåga tills det inte finns några synliga avlagringar på ytan.
OBS: Genom ovanstående metod kan safirskivor återvinnas många gånger. - Märk en sida av varje safirskiva med ett nummer med en lösningsmedelsresistent penna (bild 1A).
OBS: Den markörpenna som används måste testas för att avgöra om den är resistent mot aceton och metanollösningsmedel i förväg för att förhindra förlust av märken. - Placera de märkta safirskivorna på botten av en 35 mm kulturskål med den märkta sidan uppåt.
- Sterilisera cellodlingsskålen med safirskivor under UV-ljus i 30 minuter.
- Vänd safirskivorna med pincett (den märkta sidan nedåt) och sterilisera under UV-ljus i ytterligare 30 minuter. Nu är odlingsskålen som innehåller safirskivorna redo för cellodling.
OBS: Safirskivorna kan också steriliseras genom autoklavering. - Frö cellerna på safirskivorna beredda ovan och växa till 80% -90% sammanflöde i en cellinkubator vid 37 ° C, 95% luftfuktighet och 5% CO2 (figur 1B).
OBS: Stabila HeLa-cellinjer som uttrycker MTn-taggar genererades enligt beskrivningen i Jiang et al.26.
2. Högtrycksfrysning (HPF)
VARNING: Flytande kväve används i detta experiment. När du arbetar med flytande kväve, använd lämpliga säkerhetsförfaranden och personlig skyddsutrustning för att förhindra frostskador och kvävning.
- Förbered högtrycksfrysmaskinen minst 2 timmar före experimentet enligt tillverkarens instruktioner.
- Överför typ A HPF aluminiumbärare (urtag: 0,025 / 0,275 mm) till ett 2 ml centrifugrör innehållande 1 ml etanol och sonikat i en ultraljudsrengörare i 10 min.
- Torka bärarna i en petriskål täckt med kvalitativt filterpapper (medelhastighet).
- Blötlägg de förrenade bärarna i 1-hexadecen.
OBS: BSA rekommenderas inte som kryoskyddsmedel i det aktuella experimentet eftersom det kommer att störa den efterföljande guldnanopartikelsyntesen. - Använd fin pincett för att plocka upp en safirskiva med celler från odlingsskålen; Vidrör den märkta ytan med kvalitativt filterpapper (medelhastighet) för att ta bort överflödigt medium.
OBS: Vattnets värmeledningsförmåga är mycket låg och för mycket restvatten påverkar fryseffekten. Behåll minimalt med vatten för att förhindra att cellerna torkar ut. - Montera safirskivan i HPF-provhållaren och täck snabbt skivan med en 0,025 mm djup aluminiumbärare innehållande 1-hexadecen (figur 1C).
- Aspirera överskottslösning med kvalitativt filterpapper (medelhastighet).
- Fyll på provhållaren för högtrycksfrysning (bild 1D).
OBS: Provladdningsprocessen måste vara så snabb som möjligt (inom 1 min) för att minimera fysiologiska förändringar på grund av förändringar i temperatur, fuktighet, pH och syrehalt. - Lossa safirskivbärarenheten under flytande kväve i en skumkryobox och förvara enheten i en kryovial i flytande kväve före användning.
OBS: Protokollet kan pausas här. Proverna i kryovialer kan lagras i en flytande kvävedewar i flera år.
3. Fryssubstitutionsfixering (FSF) och rehydrering (figur 1E)
- Fyll den automatiska frysersättningsmaskinen (AFS) med flytande kväve och kyl kammaren till −90 °C.
VARNING: Flytande kväve används i detta experiment. När du arbetar med flytande kväve, använd lämpliga säkerhetsförfaranden och personlig skyddsutrustning för att förhindra frostskador och kvävning. - Bered 2 ml 0,01 % garvsyra (w/v) i aceton (FSF-lösning 1) i en 20 mm rund polypropenbehållare (figur 1E) i en dragskåp och frys den i flytande kväve.
- Fyll proverna (skivbärarenheterna för safir) i behållaren med fryst FSF-lösning 1 under LN2 med en förkyld pincett.
- Överför behållaren till förkyld AFS-kammare för FSF-bearbetning vid −90 °C.
- Håll proverna vid -90 ° C i 1 h; Separera sedan safirskivorna från bärarna med förkyld pincett och se till att de markerade sidorna på safirskivorna är vända nedåt.
OBS: Pincetten måste vara tillräckligt förkyld för att förhindra temperaturförändringar. Safirskivorna ska lätt separeras. - Håll vid -90 ° C i ytterligare 8-10 timmar; värm sedan till -60 ° C inom 3 timmar.
- Byt ut FSF-lösning 1 i behållaren mot förkyld aceton och inkubera i 1 timme. Upprepa denna acetontvätt 2x.
- Värm till -30 °C inom 3 timmar. Under denna period bereds och förkyls 2 ml 0,01% uranylacetat i aceton (FSF-lösning 2, utspädd från 10% uranylacetat i metanol) i ett 2 ml centrifugrör.
VARNING: Uranylacetat, som används i det aktuella experimentet, är radioaktivt och mycket giftigt; Det måste hanteras enligt korrekta säkerhetsrutiner och bortskaffas som farligt kemiskt avfall. - Byt ut acetonet mot FSF-lösning 2 och inkubera vid −30 °C i 3 timmar.
- Byt ut FSF-lösning 2 i behållaren mot förkyld aceton och inkubera i 30 minuter vid −30 °C. Upprepa denna acetontvätt 2x.
- Värm från -30 ° C till 4 ° C inom 2 timmar.
- Byt ut acetonen mot 2 ml 0,2 M HEPES-buffert innehållande 1 mM CaCl 2 och 1 mM MgCl2 vid pH 5,5.
- Byt buffert en gång och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme eller vid 4 °C över natten.
OBS: Protokollet kan pausas här i en natt eller fortsätta i minst 6 timmar tills proverna fryses igen i steg 5.
4. ANSM-baserad AuNP-syntes för däggdjursceller (figur 1F)
- Tvätta med PBS-A buffert 3x i 5 min varje gång.
- Överför safirskivorna till en 35 mm odlingsskål som innehåller 1 ml PBS-A-buffert vid rumstemperatur.
OBS: Håll alltid de markerade sidorna av safirskivorna nedåt och undvik att överlappa safirskivorna och gnugga bort cellerna. - Bered reduktionslösningen genom att tillsätta 4,28 μl 2-merkaptoetanol i ett 2 ml centrifugrör innehållande 1 ml PBS-A-buffert och blanda väl i ett dragskåp.
VARNING: 2-Merkaptoetanol är giftigt och har en skarp lukt; Det måste hanteras enligt lämpliga säkerhetsförfaranden. - Byt ut PBS-A-bufferten i odlingsskålen med 1 ml reducerande lösning och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Förbered guldprekursorn före användning.
- Tillsätt 80 μL 10 mM HAuCl4 i ddH2Oi ett 2 ml centrifugrör innehållande 1 ml reducerande lösning och virvel omedelbart.
OBS: Lösningen kan bli grumlig. - Tillsätt 80 μL 500 mM D-penicillamin i ddH2O i ovanstående lösning och virvla omedelbart.
OBS: Lösningen kan bli klar igen.
- Tillsätt 80 μL 10 mM HAuCl4 i ddH2Oi ett 2 ml centrifugrör innehållande 1 ml reducerande lösning och virvel omedelbart.
- Ersätt lösningen i odlingsskålen med 1 ml guldprekursorlösning som beretts i steg 4.5 och inkubera i 2 timmar vid 4 °C.
OBS: En milliliter av guldprekursorn är tillräcklig för att reagera med ungefär 1 × 106 celler (sammanflytande på en 35 mm skål). Större volymer av prekursorn behövs när AuNP blir betydligt mindre. - Väg upp 0,0038 g NaBH 4 i ett 1,5 ml centrifugrör, tillsätt 1 ml iskall ddH2O och virvel för att göra färsk 100 mM NaBH4 strax före användning.
- Tillsätt 20-100 μl 100 mM NaBH 4 till lösningen från steg4.6 , skaka omedelbart för att blanda väl och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Förbered 100 mM NaBH4 färskt för omedelbar användning. Efter tillsats av NaBH4 blir lösningens färg gradvis röd och fördjupas sedan. Om ingen färgförändring observeras indikerar det till stor del att experimentet har misslyckats. - Byt ut lösningen mot 2 ml PBS-A-buffert för att stoppa reaktionen.
OBS: Att stoppa reaktionen inom 30 minuter är kritiskt, eftersom en långvarig reaktion gradvis kommer att bryta ner AuNP.
5. Högtrycksfrysning och fixering vid fryssubstitution (figur 1C–F)
OBS: Provexemplaren är HPF och FSF igen, och förfarandet är nästan detsamma som tidigare beskrivits i avsnitt 2 och avsnitt 3 med några ändringar.
- Förbered 1% osmiumtetroxid och 0,1% uranylacetat i aceton (FSF-lösning 3, utspädd från 4% osmiumtetroxid i aceton och 10% uranylacetat i metanol).
VARNING: Osmiumtetroxid och uranylacetat är mycket giftiga kemikalier; De måste hanteras enligt korrekta säkerhetsrutiner och bortskaffas som farligt kemiskt avfall. - Fyll proverna (skivbärarenheterna för safir) i behållaren med fryst FSF-lösning 3 under LN2 med en förkyld pincett.
- Överför behållaren till förkyld AFS-kammare för FSF-bearbetning vid −90 °C och kör FSF-programmet enligt följande: förvaras vid −90 °C i 8–10 timmar; värm sedan till -60 ° C inom 3 timmar; förvaras vid −60 °C i 3 timmar, värm sedan till -30 ° C inom 3 timmar; förvaras vid −30 °C i 3 timmar, Värm sedan till 4 °C inom 2 timmar.
- När temperaturen når 4 °C, överför proverna till dragskåpet och håll den i rumstemperatur i 15 minuter.
- Tvätta med aceton 3x i 15 min varje gång.
- Håll i aceton vid rumstemperatur i minst 2 timmar.
6. Hartinfiltrering, inbäddning och polymerisation
- Förbered epoxihartsblandningen enligt tillverkarens instruktioner före användning.
VARNING: Epoxihartset som används i det aktuella experimentet är giftigt före polymerisation; Det måste hanteras enligt lämpliga säkerhetsförfaranden. Opolymeriserat harts ska kasseras som farligt kemiskt avfall eller polymeriseras före bortskaffande. - Överför safirskivorna till inbäddningskapslar med platt botten och infiltrera med harts i minst 30 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Håll de markerade sidorna av safirskivorna nedåt. - Polymerisera provexemplaret vid 60 °C i ugn i minst 18 timmar.
OBS: Protokollet kan pausas här efter polymerisation. Polymeriserade provblock kan förvaras i en torr behållare i flera år.
7. Ultratunn sektionering
- Trimma de polymeriserade provblocken försiktigt med en rakhyvel för att exponera safirskivorna.
- Doppa blockspetsarna med safirskivor i flytande kväve i flera sekunder och tina vid rumstemperatur. Upprepa frys-tina åtgärden flera gånger för att lossa skivorna från blocken.
OBS: Undvik långvarig frysning, eftersom detta kan spricka provblocken. Lossa försiktigt safirskivorna med ett blad och undvik överdriven kraft, vilket kan skada proverna. - Trimma blockytan till en trapetsform för ultratunn snittning (figur 1G).
- Få 70-100 nm ultratunna sektioner med en ultramikrotom (figur 1H).
- Välj sektionerna på sexkantiga kopparnät med 200 maskor.
OBS: Protokollet kan pausas här efter sektionering. Sektionerna på bälten kan förvaras i en torr behållare i flera år. Om så önskas kan sektionerna på galler färgas med 2% uranylaceton för att få bättre membrankontrast. Blyfärgning bör undvikas eftersom det kommer att maskera nanoguldpartikelsignalerna.
8. TEM-avbildning (figur 1I)
- Undersök de ultratunna sektionerna på kopparnät med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop. Vanligtvis är ett förstoringsområde från 11 kX till 30 kX lämpligt för visualisering av AuNP i celler, och ett lämpligt defokusvärde behövs för att säkerställa att 2-3 nm AuNP är synliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ANSM-baserade AuNP-syntestekniken är ett extremt användbart verktyg för märkning och detektering av MT-märkta proteiner med TEM26. För att validera dess robusthet i däggdjursceller genererades tre stabila cellinjer som uttrycker EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn eller Mito-acGFP-MTn i Hela-celler. KDEL är en kanonisk C-terminal endoplasmatisk retikulum (ER) retentions-/hämtningssekvens, som upprätthåller fusionsproteinet EGFP-MTn-KDEL inom ER-lumen eller det perinukleära utrymmet i kärnhöljet (NE). Ost4 är en underenhet av oligosackaryltransferaskomplexet, vilket är ett membranproteinkomplex lokaliserat i ER och NE som katalyserar N-glykosyleringen av framväxande polypeptider. C-terminalen för Ost4-fusionsproteinet Ost4-EGFP-MTn vetter mot cytosolen. Mito är en mitokondriell målsekvens som riktar sig mot fusionsproteinet Mito-acGFP-MTn i mitokondriell matris.
HPF/FSF-provberedningen, kombinerad med användning av garvsyra och uranylacetat i stället för aldehydfixeringsmedel, bevarade utmärkt ultrastruktur med god membrankontrast (figur 2, figur 3 och figur 4). Provets övergripande struktur var tät, utan uppenbar cytoplasma och lipidextraktion. Membranstrukturen var slät, utan uppenbar deformation, och fosfolipid-dubbelskiktsstrukturen avslöjades tydligt.
Förutom den välbevarade ultrastrukturen observerades effektiv märkning i alla tre fallen som representerar distinkta organellspecificiteter. EGFP-MTn-KDEL-proteinet uppträdde som 2-5 nm stora guldnanopartiklar uteslutande fördelade i perifer ER-lumen och i NE: s perinukleära utrymme (figur 2A-C). Den välbevarade ultrastrukturen möjliggjorde inte bara identifiering av märkta proteiner utan underlättade också analysen av organellinteraktioner, såsom ER-mitokondrier interaktioner (figur 2D, E). Nanopartiklar av Ost4-EGFP-MTn-proteinet avgränsade ER-membranet (figur 3A-D) och det yttre membranet i NE (figur 3E). Nanopartiklar fördelades också på det inre membranet i NE, men antalet nanopartiklar där var lägre än på det yttre membranet, vilket indikerar att proteinsammansättningen i de inre och yttre membranen var olika (figur 3E). På samma sätt uppvisade Mito-acGFP-MTn-uttryckande celler specifik märkning i mitokondriell matris (figur 4A-E). Inga partiklar observerades i vesiklarna eller ER (figur 4A-D), och få partiklar visades i MVB (figur 4D).
Figur 1: Schema för arbetsflödet för märkningstekniken för klonerbar elektronmikroskopi . (A) Safirskivor märks och steriliseras för cellodling. (B) Cellerna odlas på safirskivor i en 35 mm odlingsskål. (C) Safirskivorna med celler är täckta med 0,025 mm djupa aluminiumbärare för högtrycksfrysning och det extra utrymmet fylls med 1-hexadecen. (D) Cellerna är kryofixerade av HPF. E) Fastställande av frys-substitution. (F) De schematiska stegen i den ANSM-baserade AuNP-syntesen. (G) Safirskivorna med celler är inbäddade i inbäddningskapslar med platt botten. Hartsblocken är trimmade för ultratunn sektionering. (H) De trimmade hartsblocken är snittade med en ultramikrotom. (I) De ultratunna sektionerna avbildas med TEM. Förkortningar: ANSM = autonucleation suppression mechanism; AuNP = guld nanopartikel; HPF = högtrycksfrysning; FSF = fixering vid frys-substitution, TEM = transmissionselektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: ANSM-baserad AuNP-syntes på EGFP-MTn-KDEL uttryckt i HeLa-celler. (A,D) EM-bilder av en 90 nm tjock sektion av HeLa-celler som uttrycker EGFP-MTn-KDEL visar AuNPs specifikt ackumulerade i lumen i endoplasmatisk retikulum och i kärnhöljets perinukleära utrymme. Få partiklar observeras i mitokondrier, lysosom, kärna eller cytosol. (B,C) Inzoomade bilder av de röda respektive gula rektangelområdena i (A). (E) Inzoomad bild av det gröna rektangelområdet i (D). Denna siffra har modifierats från Jiang et al.26. Skalstänger = (B,C,E) 200 nm; (A,D) 500 nm. Förkortningar: ANSM = autonucleation suppression mechanism; AuNP = guld nanopartikel; EGFP = förstärkt grönt fluorescerande protein; ER = endoplasmatisk retikulum; NE = kärnhölje, M = mitokondrier; Lyso = lysosom; N = kärna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: ANSM-baserad AuNP-syntes på Ost4-EGFP-MTn uttryckt i HeLa-celler. (AD) EM-bilder av en 90 nm tjock sektion av HeLa-celler som uttrycker Ost4-EGFP-MTn visar AuNPs specifikt ackumulerade på membranet i endoplasmatisk retikulum. (E) En EM-bild av en 90 nm tjock sektion av HeLa-celler som uttrycker Ost4-EGFP-MTn visar AuNPs specifikt ackumulerade på membranet i NE (kärnhöljet). Få partiklar observeras i mitokondrier, lysosom, kärna eller cytosol. (C) Inzoomad bild av det röda rektangelområdet i (A). Denna siffra har modifierats från Jiang et al.26. Skalstänger = (B-E) 200 nm; A) 500 nm. Förkortningar: ANSM = autonucleation suppression mechanism; AuNP = guld nanopartikel; EGFP = förstärkt grönt fluorescerande protein; ER = endoplasmatisk retikulum; NE = kärnkuvert; M = mitokondrier; Lyso = lysosom; N = kärna; EM = elektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: ANSM-baserad AuNP-syntes på Mito-acGFP-MTn uttryckt i HeLa-celler. (A,D,E) EM-bilder av en 90 nm tjock sektion av HeLa-celler som uttrycker Mito-acGFP-MTn visar AuNPs specifikt ackumulerade i mitokondriernas matris (M). Få partiklar observeras i endoplasmatisk retikulum, kärna, vesikel, multivesikulär kropp eller cytosol. (B,C) Inzoomad bild av de röda respektive gula rektangelområdena i (A). Denna siffra har modifierats från Jiang et al.26. Skalstänger = (D,E) 200 nm; (B,C) 500 nm. A) 1 μm. Förkortningar: ANSM = autonucleation suppression mechanism; AuNP = guld nanopartikel; EGFP = förstärkt grönt fluorescerande protein; ER = endoplasmatisk retikulum; NE = kärnhölje, M = mitokondrier; Lyso = lysosom; N = kärna; V= vesikel; MVB = multivesikulär kropp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studien presenterar här en robust klonbar EM-märkningsteknik för enmolekylvisualisering av proteinmolekyler i cellmiljön med ultrastrukturell upplösning. AuNPs direkt syntetiserade på genetiskt kodade cysteinrika taggar ger entydig och exakt lokalisering av målproteinerna. Högtrycksfrysning och fryssubstitutionsteknik bevarar utmärkt ultrastrukturen hos biologiska prover. Sammantaget ger den klonbara elektronmikroskopimärkningstekniken som presenteras här ett kraftfullt verktyg för effektiv lokalisering och igenkänning av en enda molekyl i cellulära ultrastrukturella sammanhang in situ med EM.
ANSM-mekanismen undertrycker autonukleationsprocessen för tiolat-Au(I)-polymerer26, vilket är en typisk reaktion i den klassiska Brust-Schiffrin-metoden (BSM)27 som ofta används för att syntetisera tiolattäckta guldnanokluster. Därför kan den ANSM-baserade AuNP-syntestekniken specifikt syntetisera 2-6 nm-storlek AuNPs direkt på cysteinrika taggar som elektrontäta etiketter för EM-visualisering med ett högt signal-brusförhållande och hög effektivitet. Till skillnad från APEX2- eller HPR-märkningstekniker som förlitar sig på DAB-polymeravsättning, vilket är oräkneligt och inte lämpligt för lösliga proteiner i cytosolen, är den ANSM-baserade AuNP-syntestekniken den enda tekniken som möjliggör detektering av en molekyl hittills.
Nackdelen med den klonerbara elektronmikroskopimärkningstekniken är att den ANSM-baserade AuNP-syntestekniken bygger på aktiviteten hos tiolgruppen cystein, som är känslig för aldehydfixeringsmedel. Det oxidativa skyddet av tioler med 3,3'-ditiodipropionsyra (DTDPA) har införts före aldehydfixering i E. coli och fissionsjästen S. pombe, vilket resulterar i god morfologi och utmärkt märkningseffektivitet24,25,26. I detta arbete fungerade oxidations- / fixeringsmetoden korrekt för de taggar som uttrycks i ett relativt oxidativt fack, såsom ER-lumen och mitokondrimatrisen (i EGFP-MTn-KDEL och Mito-acGFP-MTn-celler). Det var dock suboptimalt för cytosoliska taggar (Ost4-GFP-MTn) i däggdjursceller. Anledningen kan vara att taggarna i reduktionsfacken inte är väl vikta, och de reducerande ämnena som GSH som finns i överflöd i cytoplasman kan motstå oxidation.
HPF-FSF-tekniken är guldstandarden i ultrastrukturellt bevarande av biologiska prover för elektronmikroskopi. I detta arbete uppnådde metoden HPF/FSF-rehydrering-HPF/FSF, som helt undviker konventionell kemisk fixering och permeabilisering, effektiv märkning med Ost4-GFP-MTn och gav utmärkt cellstruktur. Denna metod har dock fortfarande vissa begränsningar. För det första kan en andra HPF leda till betydande iskristallskador. För det andra har olika satser av uranylacetat problem med inkonsekvent kvalitet och löslighet. Acicular utfällningar uppträdde ibland i de rehydrerade proverna när de visualiserades med elektronmikroskopi. Tvätt med HEPES-buffert vid pH 5,5 kan lindra detta problem. För det tredje behöver provberedningen för vävnadsprover optimeras ytterligare.
Sammanfattningsvis möjliggör den klonerbara EM-märkningstekniken, som kombinerar den ANSM-baserade AuNP-syntestekniken med provberedningsmetoden för HPF / FSF-rehydrering-HPF / FSF, entydig enmolekylidentifiering av genetiskt märkta proteiner i celler genom elektronmikroskopi. Det nuvarande protokollet bör göra det möjligt att ta itu med ett enormt antal biologiska frågor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Protokollet som beskrivs här härleddes från artikeln publicerad av Jiang et al. (2020). Detta arbete stöddes av bidrag från MOST (973 Program nr 2011CB812502 och 2014CB849902) och genom finansieringsstöd från Pekings kommunregering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Tsien, R. Y.
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Masters, B. R. History of the electron microscope in cell biology. Encylopedia of Life Sciences. , (2009).
- Griffiths, G., Hoppeler, H. Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).
- Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase. Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).
- Grabenbauer, M., et al. Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation. Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296 (5567), 503-507 (2002).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biology. 9 (4), e1001041 (2011).
- Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Mavlyutov, T. A., et al. APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum. Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).
- Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19 (2), 147-154 (2011).
- Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy. Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).
- Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).
- Morphew, M. K., et al. Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells. Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).
- Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).
- Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).
- Fukunaga, Y., et al. Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons. Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).
- Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).
- Risco, C., et al. sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20 (5), 759-766 (2012).
- Ding, S. -W., et al. Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087 (2014).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells. Protocol Exchange. , (2020).
- Jiang, Z., et al. Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells. Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).
- Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).
