Summary
El presente protocolo describe una tecnología de etiquetado de microscopía electrónica clonable para detectar proteínas marcadas con metalotioneína en células utilizando una nueva técnica de síntesis de nanopartículas de oro basada en el mecanismo de supresión de autonucleación.
Abstract
El análisis de la localización precisa de moléculas de proteínas en células con resolución ultraestructural es de gran importancia para el estudio de diversos procesos fisiológicos o patológicos en todos los organismos vivos. Por lo tanto, el desarrollo de etiquetas clonables que se pueden utilizar como sondas de microscopía electrónica es de gran valor, al igual que las proteínas fluorescentes han jugado un papel crucial en el campo de la imagen óptica. Recientemente se descubrió el mecanismo de supresión de autonucleación (ANSM), que permite la síntesis específica de nanopartículas de oro (AuNP) en etiquetas ricas en cisteína, como la metalotioneína (MT) y la proteína anticongelante (AFP).
Basado en el ANSM, se desarrolló una tecnología de etiquetado por microscopía electrónica, que permite la detección específica de proteínas marcadas en células procariotas y eucariotas con una eficiencia de etiquetado sin precedentes. Este estudio ilustra un protocolo para la detección de proteínas de fusión MTn (una variante de MT diseñada que carece de residuos reactivos al aldehído) en células de mamíferos con una ultraestructura bien conservada. En este protocolo, la congelación a alta presión y la fijación por congelación y sustitución por congelación se realizaron utilizando fijadores no aldehídos (como ácido tánico, acetato de uranilo) para preservar la ultraestructura casi nativa y evitar daños a la actividad de la etiqueta causada por la reticulación de aldehído.
Se utilizó una simple rehidratación de un solo paso antes de la síntesis de AuNP basada en ANSM. Los resultados mostraron que las proteínas marcadas se dirigieron a varios orgánulos, incluidas las membranas y la luz del retículo endoplásmico (RE), y las matrices mitocondriales se detectaron con alta eficiencia y especificidad. Esta investigación proporciona a los biólogos un protocolo robusto para abordar una enorme gama de cuestiones biológicas a nivel de molécula única en contextos ultraestructurales celulares.
Introduction
En la era postgenómica, el desarrollo de la proteína fluorescente verde (GFP) como reportero de una sola molécula para microscopía óptica ha revolucionado el campo de la investigación moderna en ciencias de la vida 1,2. Durante décadas, la microscopía electrónica (EM) ha sido una herramienta poderosa para observar intuitivamente la ultraestructura celular con resolución a nanoescala3; Sin embargo, la identificación precisa y la localización de las moléculas de proteínas siguen siendo un desafío.
La técnica de marcado EM más utilizada es la técnica de marcado de microscopía inmunoelectrónica (IEM), que se basa en la reacción antígeno-anticuerpo. Sin embargo, aunque se han desarrollado muchas técnicas en el campo del etiquetado IEM, incluyendo IEM pre-incrustado y IEM post-incrustado (en secciones de resina o criosecciones hidratadas), todavía sufre de baja eficiencia de etiquetado (<10%)4,5, que está relacionado con la preparación de la muestra y la calidad de los anticuerpos. Para superar estas limitaciones, el desarrollo de etiquetas codificadas genéticamente tiene un gran potencial de aplicación.
Dos tipos principales de etiquetas EM se han explorado a fondo en los últimos años. Un tipo es el método de tinción DAB, que utiliza etiquetas como APEX2 para oxidar 3,3'-diaminobencidina (DAB) a polímeros osmiófilos para la visualización EM 6,7,8,9,10,11,12. Permite el etiquetado de proteínas de alta abundancia en regiones subcelulares, pero no es adecuado para el recuento de moléculas individuales. El otro tipo utiliza proteínas de unión a metales, como la ferritina 13 y la metalotioneína (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, para generar depósitos metálicos densos en electrones en situ para visualización EM. Solo este último tiene un potencial real para la visualización y el conteo de moléculas individuales. El tamaño molecular de la ferritina es demasiado grande (~ 450 kD) para que se use como una etiqueta prometedora, mientras que el pequeño tamaño (~ 5 kD) de MT y su capacidad para unir varios iones a través de sus 20 cisteínas han atraído gran atención. Varios laboratorios han intentado etiquetar proteínas de fusión MT purificadas o células que expresan MT incubando directamente con Au +. Estos intentos han demostrado inicialmente que las etiquetas MT pueden unirse a iones de oro para formar señales de alto contraste, pero ninguno ha logrado realmente la identificación efectiva de proteínas individuales en las células, y no son ampliamente aplicables 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
La técnica de síntesis de AuNP basada en ANSM, que consiste en sintetizar AuNP de tamaño 2-6 nm directamente en etiquetas ricas en cisteína (por ejemplo, MT, las variantes MT MTn y MTα, AFP) como etiquetas densas en electrones para la visualización EM, es el primer enfoque confiable y aplicable para el etiquetado de proteínas y la detección de moléculas individuales en células24,25,26. Permite la síntesis específica de AuNPs en proteínas aisladas de fusión de etiquetas y ha logrado una eficiencia de etiquetado sin precedentes en células procariotas (E. coli) y eucariotas (S. pombe) no fijas o fijadas químicamente. Sin embargo, implementar el mismo protocolo en sistemas más avanzados, como células de mamíferos o incluso tejidos, implica desafíos adicionales, como la homeostasis redox intracelular más compleja y la estructura celular más frágil.
Este estudio presenta una tecnología de etiquetado EM clonable, que combina la novedosa técnica de síntesis de AuNP basada en ANSM para etiquetar etiquetas ricas en cisteína (MT) codificadas genéticamente con el método de preparación de muestras HPF / FSF -rehidratación-HPF / FSF, permite la identificación inequívoca de una sola molécula de proteínas marcadas en la membrana ER, la luz ER y la matriz mitocondrial en células HeLa. El método actual combina las características de alta eficiencia de etiquetado, una alta relación señal-ruido, etiquetado de una sola molécula y una fuerte universalidad, y este método tiene amplias perspectivas de aplicación en la investigación de ciencias de la vida.
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Protocol
Todos los suministros utilizados en este experimento se enumeran en la Tabla de materiales. El flujo de trabajo paso a paso del protocolo actual se muestra en la figura 1.
1. Cultivo celular en discos de zafiro
- Transfiera discos de zafiro de 3 mm x 0,16 mm a un tubo centrífugo de 2 ml que contenga 1 ml de etanol y sanice en un limpiador ultrasónico durante 10 minutos.
- Queme cada disco de zafiro en una llama de lámpara de alcohol hasta que no haya depósitos visibles en la superficie.
NOTA: A través del método anterior, los discos de zafiro se pueden reciclar muchas veces. - Etiquete un lado de cada disco de zafiro con un número usando una pluma resistente a solventes (Figura 1A).
NOTA: La pluma marcador utilizada debe probarse para determinar si es resistente a los disolventes de acetona y metanol de antemano para evitar la pérdida de marcas. - Coloque los discos de zafiro etiquetados en el fondo de una placa de cultivo de 35 mm con el lado etiquetado hacia arriba.
- Esterilice la placa de cultivo celular con discos de zafiro bajo luz UV durante 30 minutos.
- Voltee los discos de zafiro con pinzas (el lado etiquetado hacia abajo) y esterilice bajo luz UV durante 30 minutos adicionales. Ahora, la placa de cultivo que contiene los discos de zafiro está lista para el cultivo celular.
NOTA: Los discos de zafiro también se pueden esterilizar en autoclave. - Siembra las células en los discos de zafiro preparados anteriormente y crece hasta una confluencia del 80% -90% en una incubadora celular a 37 °C, 95% de humedad y 5% deCO2 (Figura 1B).
NOTA: Se generaron líneas celulares HeLa estables que expresan etiquetas MTn como se describe en Jiang et al.26.
2. Congelación a alta presión (HPF)
PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido se utiliza en este experimento. Cuando trabaje con nitrógeno líquido, utilice procedimientos de seguridad adecuados y equipo de protección personal para evitar la congelación y la asfixia.
- Prepare la máquina de congelación a alta presión al menos 2 h antes del experimento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Transfiera portadores de aluminio HPF tipo A (hueco: 0.025 / 0.275 mm) a un tubo centrífugo de 2 ml que contenga 1 ml de etanol y sonicar en un limpiador ultrasónico durante 10 min.
- Secar los portadores en una placa de Petri cubierta con papel de filtro cualitativo (velocidad media).
- Remoje los portadores prelimpiados en 1-hexadeceno.
NOTA: BSA no se recomienda como crioprotector en el experimento actual, ya que interferirá con la posterior síntesis de nanopartículas de oro. - Use pinzas finas para recoger un disco de zafiro con células de la placa de cultivo; Toque la superficie etiquetada con papel de filtro cualitativo (velocidad media) para eliminar el exceso de medio.
NOTA: La conductividad térmica del agua es muy baja, y demasiada agua residual afectará el efecto de congelación. Retenga un mínimo de agua para evitar que las células se sequen. - Monte el disco de zafiro en el portamuestras HPF y tape rápidamente el disco con un soporte de aluminio de 0,025 mm de profundidad que contenga 1-hexadeceno (Figura 1C).
- Aspirar el exceso de solución con papel de filtro cualitativo (velocidad media).
- Cargue el portamuestras para congelarla a alta presión (Figura 1D).
NOTA: El proceso de carga de la muestra debe ser lo más rápido posible (dentro de 1 minuto) para minimizar las alteraciones fisiológicas debidas a cambios en la temperatura, humedad, pH y contenido de oxígeno. - Descargue el conjunto portador de disco de zafiro bajo nitrógeno líquido en una caja criogénica de espuma y guarde el conjunto en un criovial en nitrógeno líquido antes de usarlo.
NOTA: El protocolo puede estar en pausa aquí. Las muestras en crioviales se pueden almacenar en un dewar de nitrógeno líquido durante años.
3. Fijación por congelación y sustitución (FSF) y rehidratación (Figura 1E)
- Llene la máquina automática de sustitución por congelación (AFS) con nitrógeno líquido y enfríe la cámara a -90 °C.
PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido se utiliza en este experimento. Cuando trabaje con nitrógeno líquido, utilice procedimientos de seguridad adecuados y equipo de protección personal para evitar la congelación y la asfixia. - Preparar 2 ml de ácido tánico (p/v) al 0,01% en acetona (solución FSF 1) en un recipiente redondo de polipropileno de 20 mm (Figura 1E) en una campana extractora y congelarlo en nitrógeno líquido.
- Cargue las muestras (los conjuntos portadores de discos de zafiro) en el recipiente con la solución FSF congelada 1 bajo LN2 utilizando un par de pinzas preenfriadas.
- Transfiera el contenedor a la cámara AFS preenfriada para el procesamiento FSF a -90 °C.
- Mantener las muestras a −90 °C durante 1 h; Luego, separe los discos de zafiro de los portadores con pinzas preenfriadas y asegúrese de que los lados marcados de los discos de zafiro estén hacia abajo.
NOTA: Las pinzas deben estar suficientemente preenfriadas para evitar cambios de temperatura. Los discos de zafiro deben separarse fácilmente. - Conservar a -90 °C durante otras 8-10 h; luego, calentar a -60 °C en 3 h.
- Sustituir la solución 1 de FSF en el recipiente por acetona preenfriada e incubar durante 1 h. Repita este lavado de acetona 2x.
- Calentar a -30 °C en 3 h. Durante este período, prepare y preenfríe 2 ml de acetato de uranilo al 0,01% en acetona (solución 2 de FSF, diluida a partir de acetato de uranilo al 10% en metanol) en un tubo de centrífuga de 2 ml.
PRECAUCIÓN: El acetato de uranil, utilizado en el experimento actual, es radiactivo y altamente tóxico; Debe manipularse de acuerdo con los procedimientos de seguridad adecuados y eliminarse como residuo químico peligroso. - Sustituir la acetona por la solución 2 de FSF e incubar a -30 °C durante 3 h.
- Sustituir la solución 2 de FSF en el recipiente por acetona preenfriada e incubar durante 30 min a −30 °C. Repita este lavado de acetona 2x.
- Calentar de -30 °C a 4 °C en 2 h.
- Reemplace la acetona con 2 ml de tampón HEPES 0,2 M que contenga 1 mM CaCl 2 y 1 mM MgCl2 a pH 5,5.
- Cambie el tampón una vez e incube a temperatura ambiente durante 1 h o a 4 °C durante la noche.
NOTA: El protocolo puede detenerse aquí durante una noche o continuar durante al menos 6 h hasta que las muestras se congelen nuevamente en el paso 5.
4. Síntesis de AuNP basada en ANSM para células de mamíferos (Figura 1F)
- Lavar con tampón PBS-A 3 veces durante 5 minutos cada vez.
- Transfiera los discos de zafiro a una placa de cultivo de 35 mm que contenga 1 ml de tampón PBS-A a temperatura ambiente.
NOTA: Siempre mantenga los lados marcados de los discos de zafiro hacia abajo, y evite superponer los discos de zafiro y frotar las celdas. - Preparar la solución reductora añadiendo 4,28 μL de 2-mercaptoetanol en un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga 1 ml de tampón PBS-A y mezclando bien en una campana extractora.
PRECAUCIÓN: El 2-mercaptoetanol es tóxico y tiene un olor acre; Debe manipularse de acuerdo con los procedimientos de seguridad adecuados. - Reemplace el tampón PBS-A en la placa de cultivo con 1 ml de solución reductora e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Prepare el precursor de oro antes de usarlo.
- Añadir 80 μL de HAuCl4 de 10 mM enddH2Oen un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga 1 ml de solución reductora e inmediatamente vórtice.
NOTA: La solución puede volverse turbia. - Agregue 80 μL de 500 mM de D-penicilamina en ddH2O en la solución anterior, e inmediatamente vórtice.
NOTA: La solución puede volver a ser clara.
- Añadir 80 μL de HAuCl4 de 10 mM enddH2Oen un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga 1 ml de solución reductora e inmediatamente vórtice.
- Sustituir la solución en la placa de cultivo por 1 ml de solución precursora de oro preparada en la etapa 4.5 e incubar durante 2 h a 4 °C.
NOTA: Un mililitro del precursor de oro es suficiente para reaccionar con aproximadamente 1 × 106 celdas (confluente en una placa de 35 mm). Se necesitan mayores volúmenes del precursor cuando los AuNP se vuelven significativamente más pequeños. - Pesar 0,0038 g de NaBH 4 en un tubo de centrífuga de 1,5 ml, añadir 1 ml de ddH2O helado y vórtice para hacer 100 mM de NaBH4 fresco justo antes de su uso.
- Añadir 20-100 μL de NaBH 4 a 100 mM a la solución a partir del paso4.6 , agitar inmediatamente para mezclar bien e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
NOTA: Prepare 100 mM NaBH4 recién para su uso inmediato. Después de agregar el NaBH4, el color de la solución se volverá rojo gradualmente y luego se profundizará. Si no se observa ningún cambio de color, indica en gran medida que el experimento ha fallado. - Reemplace la solución con 2 ml de tampón PBS-A para detener la reacción.
NOTA: Detener la reacción dentro de los 30 minutos es crítico, ya que una reacción prolongada romperá gradualmente los AuNP.
5. Congelación a alta presión y fijación por congelación y sustitución por congelación (Figura 1C-F)
NOTA: Las muestras son HPF y FSF de nuevo, y el procedimiento es casi el mismo que el descrito anteriormente en la sección 2 y la sección 3 con algunas modificaciones.
- Preparar tetróxido de osmio al 1% y acetato de uranilo al 0,1% en acetona (solución 3 de FSF, diluida a partir de tetróxido de osmio al 4% en acetona y acetato de uranilo al 10% en metanol).
PRECAUCIÓN: El tetróxido de osmio y el acetato de uranilo son sustancias químicas altamente tóxicas; Deben manipularse de acuerdo con los procedimientos de seguridad adecuados y eliminarse como residuos químicos peligrosos. - Cargue las muestras (los conjuntos portadores de discos de zafiro) en el recipiente con la solución FSF congelada 3 bajo LN2 utilizando un par de pinzas preenfriadas.
- Transfiera el contenedor a la cámara AFS preenfriada para el procesamiento de FSF a −90 °C, y ejecute el programa FSF de la siguiente manera: mantener a -90 °C durante 8-10 h; luego, calentar a −60 °C en 3 h; mantener a -60 °C durante 3 h; luego, calentar a −30 °C en 3 h; mantener a -30 °C durante 3 h; luego, calentar a 4 °C en 2 h.
- Cuando la temperatura alcance los 4 °C, transfiera las muestras a la campana extractora y manténgalas a temperatura ambiente durante 15 min.
- Lavar con acetona 3 veces durante 15 minutos cada vez.
- Mantener en acetona a temperatura ambiente durante al menos 2 h.
6. Infiltración de resina, incrustación y polimerización
- Prepare la mezcla de resina epoxi de acuerdo con las instrucciones del fabricante antes de usar.
PRECAUCIÓN: La resina epoxi utilizada en el experimento actual es tóxica antes de la polimerización; Debe manipularse de acuerdo con los procedimientos de seguridad adecuados. La resina no polimerizada debe eliminarse como residuo químico peligroso o polimerizarse antes de su eliminación. - Transfiera los discos de zafiro a cápsulas de incrustación de fondo plano e infílelos con resina durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Mantenga los lados marcados de los discos de zafiro hacia abajo. - Polimerizar la muestra a 60 °C en un horno durante al menos 18 h.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí después de la polimerización. Los bloques de muestras polimerizadas se pueden almacenar en un recipiente seco durante años.
7. Sección ultrafina
- Recorte cuidadosamente los bloques de muestras polimerizadas con una navaja de afeitar para exponer los discos de zafiro.
- Sumerja las puntas de los bloques con discos de zafiro en nitrógeno líquido durante varios segundos y descongele a temperatura ambiente. Repita la acción de congelación-descongelación varias veces para separar los discos de los bloques.
NOTA: Evite la congelación prolongada, ya que esto puede agrietar los bloques de muestras. Separe suavemente los discos de zafiro con una cuchilla, evitando una fuerza excesiva, que puede dañar las muestras. - Recorte la cara del bloque a una forma trapezoidal para la sección ultrafina (Figura 1G).
- Obtener secciones ultrafinas de 70-100 nm con un ultramicrotomo (Figura 1H).
- Elija las secciones en rejillas hexagonales de cobre de 200 mallas.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí después de seccionar. Las secciones de las fajas se pueden almacenar en un recipiente seco durante años. Si se desea, las secciones en las rejillas se pueden teñir con acetona de uranilo al 2% para obtener un mejor contraste de membrana. Se debe evitar la tinción de plomo, ya que enmascarará las señales de partículas de nanooro.
8. Imágenes TEM (Figura 1I)
- Examine las secciones ultrafinas en las rejillas de cobre utilizando un microscopio electrónico de transmisión. Normalmente, un rango de ampliación de 11 kX a 30 kX es adecuado para visualizar AuNP en las celdas, y se necesita un valor de desenfoque adecuado para garantizar que los AuNP de 2-3 nm sean visibles.
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Representative Results
La técnica de síntesis de AuNP basada en ANSM es una herramienta extremadamente útil para etiquetar y detectar proteínas marcadas con MT con TEM26. Para validar su robustez en células de mamíferos, se generaron tres líneas celulares estables que expresan EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn o Mito-acGFP-MTn en células Hela. KDEL es una secuencia canónica de retención/recuperación del retículo endoplásmico C-terminal (ER), que mantiene la proteína de fusión EGFP-MTn-KDEL dentro del lumen ER o el espacio perinuclear de la envoltura nuclear (NE). Ost4 es una subunidad del complejo oligosacariltransferasa, que es un complejo proteico de membrana localizado en el RE y NE que cataliza la N-glicosilación de polipéptidos nacientes. El extremo C de la proteína de fusión Ost4 Ost4-EGFP-MTn se enfrenta al citosol. Mito es una secuencia dirigida mitocondrial que se dirige a la proteína de fusión Mito-acGFP-MTn en la matriz mitocondrial.
La preparación de la muestra HPF/FSF, combinada con el uso de ácido tánico y acetato de uranilo en lugar de fijadores de aldehído, preservó una excelente ultraestructura con buen contraste de membrana (Figura 2, Figura 3 y Figura 4). La estructura general de la muestra fue densa, sin extracción obvia de citoplasma y lípidos. La estructura de la membrana era lisa, sin deformación obvia, y la estructura de la bicapa de fosfolípidos se reveló claramente.
Además de la ultraestructura bien conservada, se observó un etiquetado eficiente en los tres casos que representan distintas especificidades de orgánulos. La proteína EGFP-MTn-KDEL apareció como nanopartículas de oro de tamaño 2-5 nm distribuidas exclusivamente en el lumen periférico del RE y en el espacio perinuclear del NE (Figura 2A-C). La ultraestructura bien conservada no solo permitió la identificación de una sola molécula de proteínas marcadas, sino que también facilitó el análisis de las interacciones orgánulos, como las interacciones ER-mitocondrias (Figura 2D, E). Las nanopartículas de la proteína Ost4-EGFP-MTn delinearon la membrana del RE (Figura 3A-D) y la membrana externa del NE (Figura 3E). Las nanopartículas también se distribuyeron en la membrana interna del NE, pero el número de nanopartículas allí fue menor que en la membrana externa, lo que indica que la composición proteica de las membranas interna y externa era diferente (Figura 3E). Asimismo, las células que expresan Mito-acGFP-MTn exhibieron un etiquetado específico en la matriz mitocondrial (Figura 4A-E). No se observaron partículas en las vesículas o RE (Figura 4A-D), y se mostraron pocas partículas en los MVB (Figura 4D).
Figura 1: Esquema para el flujo de trabajo de la tecnología de etiquetado de microscopía electrónica clonable . (A) Los discos de zafiro se etiquetan y esterilizan para cultivo celular. (B) Las células se cultivan en discos de zafiro en una placa de cultivo de 35 mm. (C) Los discos de zafiro con celdas están cubiertos con portadores de aluminio de 0,025 mm de profundidad para la congelación a alta presión, y el espacio adicional se llena con 1-hexadeceno. (D) Las células son criofijadas por HPF. E) Fijación por congelación y sustitución. (F) Los pasos esquemáticos de la síntesis de AuNP basada en ANSM. (G) Los discos de zafiro con células están incrustados en cápsulas de incrustación de fondo plano. Los bloques de resina están recortados para una sección ultrafina. (H) Los bloques de resina recortados se seccionan con un ultramicrótomo. (I) Las secciones ultrafinas se visualizan con TEM. Abreviaturas: ANSM = mecanismo de supresión de autonucleación; AuNP = nanopartícula de oro; HPF = congelación a alta presión; FSF = fijación por congelación-sustitución; TEM = microscopía electrónica de transmisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Síntesis de AuNP basada en ANSM en EGFP-MTn-KDEL expresada en células HeLa. (A,D) Las imágenes EM de una sección de 90 nm de espesor de células HeLa que expresan EGFP-MTn-KDEL muestran AuNPs específicamente acumulados en la luz del retículo endoplásmico y en el espacio perinuclear de la envoltura nuclear. Se observan pocas partículas en las mitocondrias, el lisosoma, el núcleo o el citosol. (B,C) Imágenes ampliadas de las áreas rectangulares rojas y amarillas, respectivamente, en (A). (E) Imagen ampliada del área del rectángulo verde en (D). Esta cifra ha sido modificada de Jiang et al.26. Barras de escala = (B,C,E) 200 nm; (A,D) 500 nm. Abreviaturas: ANSM = mecanismo de supresión de autonucleación; AuNP = nanopartícula de oro; EGFP = proteína fluorescente verde mejorada; RE = retículo endoplásmico; NE = envoltura nuclear; M = mitocondrias; Lyso = lisosoma; N = núcleo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Síntesis de AuNP basada en ANSM en Ost4-EGFP-MTn expresada en células HeLa. (A-D) Las imágenes EM de una sección de 90 nm de espesor de células HeLa que expresan Ost4-EGFP-MTn muestran AuNPs específicamente acumuladas en la membrana del retículo endoplásmico. (E) Una imagen EM de una sección de 90 nm de espesor de células HeLa que expresan Ost4-EGFP-MTn muestra AuNPs específicamente acumulados en la membrana del NE (envoltura nuclear). Se observan pocas partículas en las mitocondrias, el lisosoma, el núcleo o el citosol. (C) Imagen ampliada del área del rectángulo rojo en (A). Esta cifra ha sido modificada de Jiang et al.26. Barras de escala = (B-E) 200 nm; (A) 500 nm. Abreviaturas: ANSM = mecanismo de supresión de autonucleación; AuNP = nanopartícula de oro; EGFP = proteína fluorescente verde mejorada; RE = retículo endoplásmico; NE = sobre nuclear; M = mitocondrias; Lyso = lisosoma; N = núcleo; EM = microscopía electrónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Síntesis de AuNP basada en ANSM en Mito-acGFP-MTn expresada en células HeLa. (A,D,E) Las imágenes EM de una sección de 90 nm de espesor de células HeLa que expresan Mito-acGFP-MTn muestran AuNPs específicamente acumulados en la matriz de las mitocondrias (M). Se observan pocas partículas en el retículo endoplásmico, núcleo, vesícula, cuerpo multivesicular o citosol. (B,C) Imagen ampliada de las áreas rectangulares rojas y amarillas, respectivamente, en (A). Esta cifra ha sido modificada de Jiang et al.26. Barras de escala = (D,E) 200 nm; (B,C) 500 nm; (A) 1 μm. Abreviaturas: ANSM = mecanismo de supresión de autonucleación; AuNP = nanopartícula de oro; EGFP = proteína fluorescente verde mejorada; RE = retículo endoplásmico; NE = envoltura nuclear; M = mitocondrias; Lyso = lisosoma; N = núcleo; V= vesícula; MVB = cuerpo multivesicular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El estudio presenta aquí una robusta tecnología de etiquetado EM clonable para la visualización de moléculas de proteínas individuales dentro del entorno celular con resolución ultraestructural. Las AuNP sintetizadas directamente en etiquetas ricas en cisteína codificadas genéticamente proporcionan una localización inequívoca y precisa de las proteínas diana. La técnica de congelación a alta presión y la sustitución por congelación preservan excelentemente la ultraestructura de las muestras biológicas. En conjunto, la tecnología de etiquetado de microscopía electrónica clonable presentada aquí proporciona una poderosa herramienta para la localización y el reconocimiento eficientes de una sola molécula en contextos ultraestructurales celulares in situ con EM.
El mecanismo ANSM suprime el proceso de autonucleación de los polímeros de tiolato-Au(I)26, que es una reacción típica en el método clásico de Brust-Schiffrin (BSM)27 que es ampliamente utilizado para sintetizar nanoclusters de oro con tapa de tiolato. Por lo tanto, la técnica de síntesis de AuNP basada en ANSM puede sintetizar específicamente AuNP de 2-6 nm de tamaño directamente en etiquetas ricas en cisteína como etiquetas densas en electrones para la visualización EM con una alta relación señal-ruido y alta eficiencia. A diferencia de las técnicas de etiquetado APEX2 o HPR que se basan en la deposición de polímero DAB, que es incontable y no es adecuada para proteínas solubles en el citosol, la técnica de síntesis de AuNP basada en ANSM es la única técnica que permite la detección de una sola molécula hasta el momento.
El inconveniente de la tecnología de etiquetado de microscopía electrónica clonable es que la técnica de síntesis de AuNP basada en ANSM se basa en la actividad del grupo tiol de la cisteína, que es sensible a los fijadores de aldehído. La protección oxidativa de los tioles por el ácido 3,3'-ditiodipropiónico (DTDPA) ha sido introducida antes de la fijación de aldehído en E. coli y la levadura de fisión S. pombe, resultando en una buena morfología y una excelente eficiencia de etiquetado24,25,26. En este trabajo, el método de oxidación / fijación funcionó correctamente para aquellas etiquetas expresadas en un compartimento relativamente oxidativo, como la luz ER y la matriz mitocondrial (en células EGFP-MTn-KDEL y Mito-acGFP-MTn). Sin embargo, fue subóptimo para las etiquetas citosólicas (Ost4-GFP-MTn) en células de mamíferos. La razón puede ser que las etiquetas en los compartimentos reductores no están bien plegadas, y las sustancias reductoras como el GSH que están presentes en abundancia en el citoplasma pueden resistir la oxidación.
La técnica HPF-FSF es el estándar de oro en la preservación ultraestructural de muestras biológicas para microscopía electrónica. En este trabajo, el método de HPF / FSF -rehidratación-HPF / FSF, que evita completamente la fijación química convencional y la permeabilización, logró un etiquetado eficiente con Ost4-GFP-MTn y produjo una excelente estructura celular. Sin embargo, este método todavía tiene ciertas limitaciones. Primero, un segundo HPF puede provocar daños significativos en los cristales de hielo. En segundo lugar, los diferentes lotes de acetato de uranilo tienen problemas de calidad y solubilidad inconsistentes. Los precipitados aciculares aparecieron ocasionalmente en las muestras rehidratadas cuando se visualizaron por microscopía electrónica. El lavado con tampón HEPES a pH 5.5 puede aliviar este problema. En tercer lugar, la preparación de muestras para muestras de tejido necesita una mayor optimización.
En conclusión, la tecnología de etiquetado EM clonable, que combina la técnica de síntesis de AuNP basada en ANSM con el método de preparación de muestras de HPF / FSF -rehidratación-HPF / FSF, permite la identificación inequívoca de una sola molécula de proteínas marcadas genéticamente en células por microscopía electrónica. El protocolo actual debería permitir abordar una enorme gama de cuestiones biológicas.
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Disclosures
El autor declara no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
El protocolo descrito aquí se derivó del artículo publicado por Jiang et al. (2020). Este trabajo fue apoyado por subvenciones de MOST (973 Programas nos. 2011CB812502 y 2014CB849902) y por el apoyo financiero del Gobierno Municipal de Beijing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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