Summary
Stria vascularis er afgørende for dannelsen af endochoclear potentiale. Her præsenterer vi dissektionen af den voksne mus stria vascularis til enkeltkernesekventering eller immunfarvning.
Abstract
Endochollear potentiale, som genereres af stria vascularis, er afgørende for at opretholde et miljø, der fremmer passende hårcellemekanotransduktion og i sidste ende hørelse. Patologier i stria vascularis kan resultere i nedsat hørelse. Dissektion af den voksne stria vascularis muliggør fokuseret enkeltkerneindfangning og efterfølgende enkeltkernesekventering og immunfarvning. Disse teknikker bruges til at studere stria vascularis patofysiologi på enkeltcelleniveau.
Enkeltkernesekventering kan anvendes til indstilling af transkriptionel analyse af stria vascularis. I mellemtiden er immunfarvning fortsat nyttig til identifikation af specifikke populationer af celler. Begge metoder kræver korrekt stria vaskularis dissektion som en forudsætning, hvilket kan vise sig at være teknisk udfordrende.
Introduction
Cochlea består af tre væskefyldte kamre, scala vestibuli, scala media og scala tympani. Scala vestibuli og scala tympani indeholder hver perilymph, som har en høj koncentration af natrium (138 mM) og en lav koncentration af kalium (6,8 mM)1. Scala-mediet indeholder endolymph, som har en høj koncentration af kalium (154 mM) og en lav koncentration af natrium (0,91 mM)1,2,3. Denne forskel i ionkoncentration kan betegnes som det endokkleære potentiale (EP) og genereres primært ved bevægelse af kaliumioner gennem forskellige ionkanaler og mellemrumskryds i stria vascularis (SV) langs sidevæggen af cochlea 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV er et heterogent, stærkt vaskulariseret væv, der linjer det mediale aspekt af cochleas laterale væg og indeholder tre hovedcelletyper: marginale, mellemliggende og basale celler12 (figur 1).
Marginale celler er forbundet med tætte kryds for at danne SV's mest mediale overflade. Den apikale membran vender mod scalamediets endolymfe og bidrager til kaliumiontransport ind i endolymfen ved hjælp af forskellige kanaler, herunder KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 og Na + -K + -ATPase (NKA) 5,10,13,14. Mellemceller er pigmenterede celler, der befinder sig mellem marginale og basale celler og letter kaliumtransport gennem SV ved hjælp af KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Basalceller ligger tæt på cochleas laterale væg og er tæt forbundet med fibrocytter i spiralbåndet for at fremme kaliumgenanvendelse fra perilymph12. SV's patologi har været impliceret i talrige otologiske lidelser17,18. Mutationer i gener udtrykt i de vigtigste SV-celletyper, såsom Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 og Cldn11, kan forårsage døvhed og SV-dysfunktion, herunder tab af EP 19,20,21,22,23. Ud over de tre hovedcelletyper er der andre mindre undersøgte celletyper i SV, såsom spindelceller 22, rodceller12,24, makrofager 25, pericytter 26 og endotelceller 27, der har ufuldstændigt definerede roller, der involverer ionisk homeostase og generering af EP 28.
I sammenligning med bulk RNA-sekventering giver enkeltkerner RNA-sekventering (sNuc-Seq) information om celleheterogenitet snarere end et gennemsnit af mRNA på tværs af en gruppe celler29 og kan være særlig nyttig, når man studerer den heterogene SV30. For eksempel har sNuc-Seq produceret transkriptionsanalyse, der tyder på, at der kan være en rolle for spindel- og rodceller i EP-generation, høretab og Menières sygdom18. Yderligere transkriptionel karakterisering af de forskellige SV-celletyper kan give os uvurderlig information om patofysiologien bag forskellige mekanismer og undertyper af SV-relaterede høreudsving og høretab. Høsten af disse sarte indre ørestrukturer er af afgørende betydning for optimal vævsanalyse.
I dette studie beskrives mikrodissektionsmetoden til at få adgang til og isolere stria vascularis fra den voksne musecochlea til sNuc-Seq eller immunfarvning. Dissektion af den voksne mus SV er nødvendig for at forstå forskellige SV-celletyper og yderligere karakterisere deres rolle i hørelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg og procedurer blev udført i henhold til protokoller godkendt af Animal Care and Use Committee of National Institute of Neurological Diseases and Stroke og National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af Animal Care and Use Committee of National Institute of Neurological Diseases and Stroke og National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alle metoder blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler fra Animal Care and Use Committee of National Institute of Neurological Diseases and Stroke og National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health.
1. Eutanasi af dyr
- Brug C57BL/6J eller Kcnj10-ZsGreen transgene mus, postnatal dag 30+ (P30+), der vejer mellem 15-20 g.
- Aflive en voksen mus (alder P30 eller ældre) ved hjælp af en godkendt protokol (her CO2 kvælning). Udfør halshugning som et sekundært trin.
BEMÆRK: Ved immunfarvning kan nogle antistoffer have baggrundssignal på grund af uspecifik binding til blod i SV's kapillærer. Hjerteperfusion med fikseringsmiddel kan løse dette problem ved at fjerne blod fra SV's kapillærer. Imidlertid kan de fleste antistoffer opnå gode resultater uden denne metode, og det vil ikke blive dækket af denne protokol.
2. Eksponering af knoglelabyrint
- Rengør musen ved at sprøjte med 70% ethanol og tørre af med et køkkenrulle. Vær særlig opmærksom på hovedregionen for at reducere risikoen for kontaminering. Fjern huden fra kraniet ved at trække huden mod næsen.
- Brug en skarp saks til at opdele kraniet langs midtsagittalplanet for at adskille venstre og højre del.
- Fjern hjernen fra kraniet for at udsætte den benede labyrint.
3. Udtrækning af det indre øre
- Identificer det indre øre i tindingeknoglen (figur 2A) og skrab kraniale nerver væk ved hjælp af # 55 tang.
BEMÆRK: Brugeren skal stabilisere prøven med sin ikke-dominerende hånd ved hjælp af et andet sæt #55 tang. Forskellige områder af prøven kan gribes med den stabiliserende tang under hele dissektionen, hvis kritiske områder af prøven undgås (f.eks. Knus ikke cochlea). - Brug # 55 tang til at dissekere bulla og kapsel og løsne dem fra omgivende knogle. Fjern eventuelt resterende blødt væv fra det indre øres overflade.
- Prøven overføres til en klar vævskulturskål indeholdende 1x kold PBS (fosfatbufret saltvand), pH 7,4, og anbringes under et dissektionsomfang (figur 2B).
4. SV dissektion
BEMÆRK: Med øvelse er det muligt at dissekere SV som et langt stykke, der ligner et bånd. SV er skrøbelig, så hvis den går i stykker, kan disse opbevares sammen. Alternativt kan disse opbevares i separat mærkede brønde i henhold til deres tur (f.eks. Basal, midt, apikal).
- Hvis dissektionskikkertens lyskilder kan flyttes, skal du placere et lys over skålen og den anden lyskilde fra siden parallelt med dissekeringsoverfladen. Dette giver mulighed for en bedre kontrast af vævet under cochlear knoglen.
- Brug #55 tang til at holde prøven ved den vestibulære del med cochlea opad.
- Brug #55 tang til at gennembore cochlear knoglen ved toppen.
BEMÆRK: #5 tang er tykkere end #55 og kan bruges til at bryde knogle, men stigningen i størrelse / styrke ofrer pincetens finhed og evnen til at manipulere små væv. Overvej at bruge tang lavet med et materiale som inox eller dumostar for at undgå skader, der kan opstå på mere sarte tang. Undgå at skubbe tangen for dybt ind under knoglen for at undgå at beskadige SV. - Brug # 55 tang, skrab langs den apikale drejning (figur 2C), og påfør blid kraft for at bryde små stykker af det ydre knoglelag væk. Løft forsigtigt knoglen og løsn den fra sidevæggen.
BEMÆRK: Det kan være nyttigt at tænke på denne dissektion som "at fjerne alt væk fra SV", snarere end "dissekere SV ud af cochlea". - Fortsæt med at bruge #55 tang til at fjerne cochlear knoglestykker fra apikale og midterste drejninger (figur 2D, E). Skub forsigtigt sidevæggen ned, lirk og fjern knoglevægsstykker mod midterdrejningen for at udsætte sidevæggen i de apikale og midterste sving.
- Fortsæt med at bruge # 55 tang, skub forsigtigt den apikale drejning sidevæg til side for at udsætte spiralganglionen. Fjern sidevæggen af apikale og midterste sving fra spiralganglionen langs det ydre hårcellelag. Fjern stykker spiralganglion inde fra cochlea.
BEMÆRK: #55 tang er mindre og giver en fordel ved manipulation af små og sarte væv. Der skal udvises ekstra forsigtighed for at undgå at bøje eller beskadige dem. - For at få bedre adgang til basaldrejningens laterale væg skal du løsne cochlea fra den vestibulære del af den tidlige knogle ved hjælp af # 55 tang. Sæt #55 tangen ind i det runde og ovale vindue og skub ned mod vestibulen. Cochlea løsner sig. Fjern den vestibulære del af det indre øre.
- Fortsæt med at bruge #55 tang, fjern nu stykker af basal cochlear knogle, startende fra det midterste svingområde. Skub forsigtigt sidevægslaget under knoglen for at løsne det.
- Fjern den fjerneste basale del af sidevæggen ved at lirke og forsigtigt trække vævet. Benet i denne region kan være for tykt til at blive fjernet uden at beskadige blødt væv nedenfor.
- Nu, med den basale del af sidevæggen løsnet, adskilles så meget af sidevæggen fra cochlea som muligt. Dette kan gøres ved at spore #55 tangen langs sidevæggen. Børst forsigtigt tangen mellem knoglen og den resterende sidevæg. Dette kan gøres hele vejen til toppen i ét stykke, hvis brugeren er erfaren. Flyt sidevæggen til frisk PBS.
BEMÆRK: Selvom større stykker SV kan være lettere at afbilde, i betragtning af vævets sarte natur, kan mindre stykker tages (figur 2F, G), og afhængigt af størrelsen kan de også fungere til billeddannelse. - Brug #55 tang til at lægge sidevæggen fladt. SV skal være synlig som et mørkere lag væv på indersiden af sidevæggen.
BEMÆRK: Brugere kan opleve, især tættere på den apikale ende, at noget af SV-vævet tilfældigt løsner sig fra sidevæggen under hele dissektionen. - Lirk forsigtigt SV-laget for at løsne det fra sidevæggen i basalenden (figur 2H). Skub forsigtigt den løsrevne SV til side, og flyt tangen længere mod den apikale ende af sidevæggen, og løsn SV som et langt bånd, hvis det er muligt (figur 2I). Klem ikke SV med tang for at trække den. Hvis vævet er for skrøbeligt til at blive grebet, kan det alternativt opsamles ved hjælp af en vævsskovl, såsom en chalazion curette.
BEMÆRK: Flytning af SV skal altid ske under lysmikroskopi for at sikre, at den ikke går tabt. Vær altid forsigtig, når du griber fat med pincet på grund af risikoen for skader. Brugere kan opleve, at brug af chalazion curette mindsker risikoen for skade på SV-væv. For enkeltkernesekventering, fortsæt til afsnit 5. For SV-immunfarvning fortsættes til punkt 7.
5. SV enkeltkerne suspension
BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset SV-væv specifikt fra en offentliggjort producents enkeltkernesuspensionsprotokol. Platforme fra forskellige producenter kan anvendes31. På grund af platformsspecifik variation anbefales det at gennemgå den producentspecifikke protokol, der følger med udstyret. For at opnå optimale resultater for sNuc-Seq og minimere RNA-nedbrydning, jo hurtigere vævsdissektion jo bedre (anbefales inden for 15-20 minutter fra eutanasi). Det kan være nyttigt at aflive et dyr ad gangen og kun når det er klar til at dissekere. At have flere personer samtidigt arbejde på dissektionerne kan også eliminere nedbrydningstid (f.eks. Et laboratoriepersonale, der arbejder på venstre øre, mens et andet arbejder på højre øre).
- Hvis SV-vævet skal anvendes til sNuc-Seq, anbringes vævet i kølet lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mMMgCl2, 0,005% nonidet P40 i nukleasefrit vand).
BEMÆRK: Hvis sekventering skal udføres umiddelbart efter dissektion, skal du fortsætte protokollen. Hvis det ønskes at sætte protokollen på pause, er SV-konservering mulig ved at placere SV i RNAlater. Opbevares natten over ved 4 °C, lynfryses derefter i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C, indtil den er klar til brug. Når den er klar til brug, tøs op og vaskes to gange i PBS i 5 minutter hver, og derefter fortsættes med homogenisering (trin 5.2). - Homogeniser vævet i en 2 ml dounce homogenisator med 10-20 slag på is.
BEMÆRK: Glascylinderen kommer manuelt i kontakt med bunden af glasrøret og fragmenterer SV. SV er delikat, så 20 streger opnår normalt vellykket homogenisering. - Lys vævet på is i 25 min.
BEMÆRK: Lysistiden varierer afhængigt af vævstypen. En 25 minutters lysis i SV-væv kan opnå en lav cellelevedygtighed (mindre end 4%), men tiden kan tilpasses, hvis cellelevedygtigheden er for høj (trin 5.8). - Der filtreres gennem et 30 μm filter og centrifugeres filtratet ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes og cellepelletten resuspenderes i 1 ml buffer til cellevask og resuspension (1x PBS, 1 % bovint serumalbumin [BSA], 0,2E/μL RNasehæmmer).
- Cellerne filtreres gennem et 10 μm filter og centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes og resuspenderes i 50 μl buffer til cellevask og resuspension.
- Tæl kernerne ved hjælp af en celletæller og trypanblå farvning. 5 μL af cellesuspensionen fortyndes til 50 μL 1x PBS til celletælling; Levedygtigheden bør være minimal (3% -4%) på dette tidspunkt. Hvis levedygtigheden viser sig at være højere, skal du tilpasse protokollen til trin 5.3 (lysis) og standardisere lysistiden for at sikre tilstrækkelig lysering af cellerne.
BEMÆRK: En høj cellelevedygtighed i et enkelt kernepræparat betyder, at der er flere intakte celler end ønsket, og at yderligere fordøjelse kan være påkrævet. - Prøven fyldes med den ønskede nukleare densitet på producentens apparat/chip (se producentens vejledning). Enkeltkerneoptagelser er nu klar.
BEMÆRK: Fra en voksen mus SV opnås normalt 50 μL af suspensionen i en koncentration på 150.000 kerner/ml.
6. SV enkeltkerne sekventering
- Send prøverne til kernefaciliteten til sekventering.
BEMÆRK: Denne del af protokollen følger de generelle trin i (1) gelperler-in emulsion (GEM) generering og stregkode, (2) post-GEM-RT oprydning og cDNA-amplifikation og (3) 3' genekspressionsbibliotekskonstruktion. Resten af sNuc-Seq-protokollen er relativt lang, og det anbefales, at læserne bruger deres producentspecifikke protokol. Producentvejledningen vil sandsynligvis beskrive trin med specifikke detaljer og ledsagende billeder. Der kan også være 'how-to' videoer på producentens hjemmeside. Genererede datasæt kan repræsenteres på en dimensionelt reduceret måde, såsom en ensartet mangfoldig tilnærmelse og projektion (UMAP; Figur 3). Mange laboratorier bruger en sekventeringskerne, der kan udføre denne protokol for brugerne.
7. SV-immunfarvning og vævsmontering
- Hvis vævet skal bruges til immunfarvning, overføres det til en plade med 24 huller, nedsænkes i 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Det er nyttigt at udføre al væskefjernelse, vask og immunfarvning under et mikroskop. Visualisering under pipettering af vævet sikrer, at det ikke ved et uheld går tabt under væskefjernelse. Volumenet af antistoffer og vaske kan justeres, så længe rumfanget er stort nok til at nedsænke SV-vævet i opløsningen. - Efter fikseringstrinnet fjernes PFA'en ved at udføre to korte vaske i 1x PBS (ca. 500 μL) ved 4 °C i hver 5 minutter på en orbitalryster ved lave (30-50) omdr./min. Ved opbevaring kan vævet opbevares i 1x PBS ved 4 °C.
- PBS fjernes og permeabiliteres og blokeres i mindst 1 time ved stuetemperatur i ca. 300 μL PBS-T-opløsning (0,05 Tween20 i 1x PBS med 10% føtalt bovint serum).
BEMÆRK: Primære og sekundære antistoffer skal fortyndes i denne blokerende opløsning. - Plet vævet med primært antistof i overensstemmelse med specifikationerne for det anvendte antistof, normalt natten over ved 4 °C. Fjern det resterende PBS og tilsæt det fortyndede primære antistof.
BEMÆRK: Fortyndingen skal vælges ud fra producentens forslag, offentliggjorte data, tidligere erfaringer osv. Normalt er den første koncentration, der skal testes, en 1: 100-200 fortynding. For eksemplet præsenteret i dette papir blev GS-IB4- og DAPI-antistofferne hver fortyndet ved 1:200. Ved farvning for mere end et protein kan flere primære antistoffer kombineres til den samme opløsning, så længe hvert primært antistof har en anden vært for at undgå krydsreaktivitet af sekundære antistoffer. - Det primære antistof vaskes af vævet med ca. 500 μL 1x PBS to gange i 10 minutter hver på en orbitalryster ved lave omdrejningstal.
BEMÆRK: Fortsæt med at sikre, at SV-vævet er nedsænket i opløsningen og ikke sidder fast på siden af brønden. - Plet med et sekundært antistof i henhold til specifikationerne for det anvendte antistof, normalt i 2 timer ved stuetemperatur på en orbitalryster ved lave omdrejningstal. Dæk pladen med 24 brønde, så det fluorescerende mærkede sekundære antistof er beskyttet mod lys.
BEMÆRK: Hvis der er behov for mere end et sekundært antistof, kombineres de sekundære antistoffer i den samme opløsning. Sørg for at undgå krydsmærkning. - Det sekundære antistof vaskes af vævet med ca. 500 μL 1x PBS fire gange i 5 minutter hver på en orbitalryster ved lave omdrejningstal. Hold pladen med 24 brønde tildækket for at beskytte den mod lys.
- Forbered det større mikrodias (75 mm x 25 mm) ved at placere to små limstriber langs 25 mm-aksen, lige mindre end det 18 mm x 18 mm mindre glasdæksel. Anbring en dråbe monteringsreagens (ca. 50 μL) mellem limstriberne.
BEMÆRK: Limen skaber en lille mængde lodret plads, så når den anden dæksel placeres ovenpå, kan SV-vævsprøven sikkert eksistere, men fortsætte med at forblive på plads. Mens striatykkelsen er 30-40 mikron, bør klemning af vævet mellem glasoverfladerne undgås for at bevare morfologi. Alternativt kan der også anvendes klar tape. - Brug #55 tang, tag så lidt væv som muligt på den ene ende af SV og overfør fra PBS til dråben af monteringsreagens på det større mikrodias (75 mm x 25 mm). Placer den ene ende af et mindre glasdæksel (18 mm x 18 mm) på objektglasset, hvor en limstribe blev placeret, og slip forsigtigt for at undgå at skabe luftbobler. Dæksedlen falder til den anden limstribe og dækker SV-vævet.
- Forsegl holderen ved at duppe en dråbe gennemsigtig neglelak på hvert hjørne af holderen. Mærk prøven i overensstemmelse hermed på glasdækslet væk fra visualiseringsfeltet. Den er nu klar til konfokal mikroskopi (figur 4).
- Visualiser SV-vævet ved hjælp af et dissektionsmikroskop for at sikre, at det ligger fladt og ikke i nærheden af luftbobler. Hvis SV-vævet ikke vender korrekt, kan brugeren forsøge at skubbe luftbobler ud eller forsigtigt fjerne det mindre glasdæksel og flytte SV. Dette skal gøres forsigtigt for at undgå at bryde glasdækslerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi præsenterer en metode til at isolere SV, der skal bruges til enten sNuc-Seq eller immunfarvning. Den relevante anatomi (figur 1) af cochlea i forhold til SV kan hjælpe brugerne med bedre at forstå organisationen af SV og trin i dissektionsprotokollen.
Hvert trin i denne mikrodissektion af SV fra en P30-mus er detaljeret i den tilhørende video, og snapshots af de vigtigste trin i denne dissektion og isolering af SV er vist i figur 2.
sNuc-Seq er nyttig til at undersøge transkriptionsprofilen af de forskellige celler i den heterogene SV. En måde, hvorpå dette kan visualiseres, er ved klyngedannelse på en 2D UMAP (figur 3). Datasættet genereret fra sNuc-Seq kan evalueres ved hjælp af forskellige dataanalyseteknikker, der yderligere skitseres i diskussionen.
SV hele monteringen med GS-IB4 og DAPI immunmærkning sammen med Kcnj10-ZsGreen fluorescens er vist i figur 4. Ved hjælp af florescens kan SV visualiseres efter fjernelse af det omgivende væv og montering. I disse mus udtrykkes ZsGreen især i SV-mellemcellerne. SV's vaskulatur kan visualiseres i rødt (endotelceller, GS-IB4).
Figur 1: Skematisk oversigt over stria vascularis cellulære heterogenitet og organisation. Stria vascularis cellulær heterogenitet og organisation. Skematisk oversigt over stria vascularis (SV) og dens forhold til strukturer i cochlea. SV består af tre lag celler og er ansvarlig for at generere EP og høj kaliumkoncentration i det endolymfholdige scala-medie. Forholdet mellem de marginale, mellemliggende og basale celler demonstreres med de marginale forlængede basolaterale fremskrivninger for at interdigitere med mellemcellerne, som har tovejs cellulære fremskrivninger, der interdigiterer med både de marginale og basale celler. Ud over disse celletyper er andre celletyper, herunder spindelceller (gul), endotelceller, pericytter og makrofager (ikke vist) til stede i SV. Brugt med tilladelse fra Korrapati et al.30. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Dissektion af en voksen musecochlea på mere end eller lig med postnatal dag 30 (P30+). (A) Prøve under ekstraktion af det indre øre fra den omgivende tindingeknogle under trin 3.2. Det indre øre er skitseret i lilla. (B) Prøve under trin 4.2, der viser overfladen af cochlea og underliggende pigmenteret SV. (C) Prøve under trin 4.4, der viser knogle fjernet fra den apikale drejning og den blottede SV (gul pil). (D) Prøve under trin 4.5, der viser cochlea med mere knogle fjernet fra apikale og midterste sving. (E) Prøve under trin 4.5, der viser fjernelse af knogle, der dækker midterdrejningen, og som viser den underliggende SV (gul pil). (F) Eksempel på mindre stykker SV (gul pil) og sidevæggen (blå pil) under trin 4.10. (G) Eksempel på fluorescerende ZsGreen SV, mens den resterende sidevæg forbliver mørk. Kcnj10-ZsGreen udtrykkes især i de mellemliggende celler i SV. (H) Eksempel på større stykker SV (gul pil) og sidevæggen (blå), der adskilles under trin 4.12. (I) SV er helt adskilt fra sidevæggen under trin 4.12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: UMAP-plot af sNuc-Seq-datasæt fra en RNAlater-behandlet voksen stria vascularis. Prøver konserveret med RNAlater-behandling af voksent SV-væv med efterfølgende kerneisolering blev grupperet ved en modularitetsbaseret klyngemetode med Leiden-optimeringsalgoritmen og visualiseret på en dimensionelt reduceret måde af et 2D UMAP-plot. Hver prik repræsenterer en enkelt celle, og celler med lignende transkriptionsprofiler grupperes sammen. Celletyper farves baseret på deres ekspression af kendte gener udtrykt af voksne SV-celletyper. Prøverne blev opbevaret i RNAlater i højst 6 måneder. SV fra omkring fem CBA/J P30-mus blev brugt til at generere dette datasæt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Stria vascularis hel montering fra en P30 Kcnj10-ZsGreen mus. Konfokal billede af SV hele montering fra en P30 mus, der demonstrerer ZsGreen ekspression i mellemcellerne, GS-IB4 (rød) mærkning endotelceller, og DAPI (hvid) mærkning kerner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Før fremkomsten af enkeltcellesekventering brugte mange forskere bulkvævsanalyse, hvilket kun gjorde det muligt at analysere transkriptomer i gennemsnit på tværs af celler. Især gjorde enkeltcelle og sNuc-Seq det muligt at isolere transkriptomet af henholdsvis en enkelt celle eller en enkelt kerne32. I dette tilfælde kan enkeltkernetranskriptomer identificeres for marginale, mellemliggende og basale celler samt spindelceller30. Dette muliggør undersøgelse af transkriptionel heterogenitet blandt SV-celletyper og kan i fremtiden bruges til at undersøge disse celletypers bidrag til SV-funktion, herunder generering og vedligeholdelse af EP. Datasæt genereret ved hjælp af sNuc-Seq kan vises på en dimensionelt reduceret måde for at lette forståelsen af overordnede transkriptionelle forskelle og sammenligne forskellige cellepopulationer ved hjælp af et UMAP-plot Figur 4. Der er mange måder at udføre bioinformatisk analyse til fortolkning af sNuc-Seq datasæt. Disse omfatter, men er ikke begrænset til: differentiel ekspressionsanalyse, enkeltcelleregulatorisk netværksinferens og klyngedannelse (SCENIC), heatmap eller grinviolinplotkonstruktion og regulonanalyse18. Yderligere beregningsanalyseteknikker til enkeltcelle RNA-sekventering ligner sNuc-Seq og diskuteres mere detaljeret i anmeldelser af Hwang et al.32, Shafer33 og Chen et al.34.
Den anden store anvendelse af denne dissektionsteknik er immunfarvning for bedre at studere udvalgte strukturer inden for SV. Vi kan observere dette i indstillingen af en SV-helmontering, der blev afbildet ved hjælp af konfokal mikroskopi (figur 3). Kernerne i alle celler visualiseres med DAPI-mærkning. Kapillærerne ses via endotelcellefarvning med GS-IB4 i rødt. Mellemliggende celler er i dette tilfælde blevet genetisk modificeret ved hjælp af en mellemliggende cellespecifik promotor til at udtrykke ZsGreen.
Begrænsninger af sNuc-Seq inkluderer: (1) mangel på rumlig information, (2) forstyrrelser mod immuncellepopulationer og (3) udelukkelse af cytoplasmatisk RNA. Rumlige transkriptomiske teknikker kan give mere specifik information om cellulære subpopulationer inden for væv35. I betragtning af protokolforskelle mellem sNuc-Seq og enkeltcelle RNA-sekventering, såsom vævsdissociation og opbevaring, kan den sNuc-Seq-genererede transkriptionsprofil bias mod immunceller, mens den er mere kraftfuld til at karakterisere vedhæftede celletyper36. Enkeltcelle RNA-sekventering inkluderer også cytoplasmatisk RNA, såsom mitokondrielt RNA, mens sNuc-Seq ikke gør det. På trods af disse tilfælde af transkriptionelle forskelle mellem de to metoder er det blevet påvist, at sNuc-Seq stort set har en lignende transkriptionsprofil som helcelle RNA-sekventering37 og isæri SV 30.
For vellykket mikrodissektion er der flere kritiske trin at være opmærksom på. I de første par trin skal man trække det indre øre korrekt ud for at undgå at knuse den underliggende cochlea. Observation af korrekt tindingeknogleekstraktion er vist i figur 2A. Når cochlea er korrekt eksponeret, skal man sørge for forsigtigt at skrabe og bryde cochlear knoglen for at afsløre den underliggende sidevæg og SV. Når sidevæggen og SV er trukket ud med succes, skal brugeren forsigtigt løsne SV fra sidevæggen. Der skal påføres tilstrækkelig kraft i det korrekte plan til at lirke SV fra sidevæggen, samtidig med at man undgår skader på den skrøbelige SV. For SV-mikrodissektion kan det være nyttigt at tænke på at "dissekere andre strukturer væk fra SV" snarere end "dissekere SV ud af cochlea".
Denne protokol kan ændres til forskellige aldre af mus og for forskellige pattedyrarter, såsom rotter. For yngre mus vil væv variere i tekstur, og strukturer vil generelt være mindre. For forskellige pattedyrarter vil cochlear anatomien være relativt ens, hvor dyrets størrelse bestemmer størstedelen af forskellen.
Generelt svarer ulemperne ved denne protokol til andre cochlear mikrodissektionsteknikker38. Isolering af den sarte SV kan være teknisk udfordrende, og den kan brydes i mindre stykker.
Denne teknik er ikke optimal til at gemme Corti-organet til hel montering, da det ofte beskadiges med denne protokol. Der findes andre dissektionsteknikker, der specifikt er rettet mod at bevare Corti-organet til helmontering og immunfarvning38, men disse har deres egne ulemper, idet sNuc-Seq skal udføres med friske prøver for at undgå RNA-nedbrydning, ikke i indstillingen af vævsfiksering og afkalkning.
Med tiden og gentagelse bliver brugerne mere komfortable med denne SV-mikrodissektionsprotokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev delvist støttet af NIH's intramurale forskningsprogram, NIDCD til M.H. (DC000088)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
References
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
- Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
- Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
- Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
- Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
- Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239 (2017).
- Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
- Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
- Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
- Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
- Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682 (2023).
- Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119 (2022).
- Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
- Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
- Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
- Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
- Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).
- Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30 (2004).
- Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
- Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
- Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y.
- Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).
- Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
- Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).
- Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
- Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).
- Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
- Grindberg, R. V., et al.
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).
