Summary
La stria vasculare è vitale per la generazione del potenziale endococleare. Qui, presentiamo la dissezione della stria vasculare del topo adulto per il sequenziamento a singolo nucleo o l'immunocolorazione.
Abstract
Il potenziale endococleare, generato dalla stria vascolare, è essenziale per mantenere un ambiente favorevole alla meccanotrasduzione delle cellule ciliate appropriate e, infine, all'udito. Le patologie della stria vascolare possono causare una diminuzione dell'udito. La dissezione della stria vascolare adulta consente la cattura focalizzata del singolo nucleo e il successivo sequenziamento e immunocolorazione del singolo nucleo. Queste tecniche sono utilizzate per studiare la fisiopatologia della stria vascolare a livello unicellulare.
Il sequenziamento a singolo nucleo può essere utilizzato nell'ambito dell'analisi trascrizionale della stria vascolare. Nel frattempo, l'immunocolorazione continua ad essere utile nell'identificazione di specifiche popolazioni di cellule. Entrambi i metodi richiedono una corretta dissezione della stria vascolare come prerequisito, che può rivelarsi tecnicamente impegnativa.
Introduction
La coclea è costituita da tre camere piene di liquido, la scala vestibuli, la scala media e la scala tympani. I vestiboli della scala e i timpani della scala contengono ciascuno perilinfa, che ha un'alta concentrazione di sodio (138 mM) e una bassa concentrazione di potassio (6,8 mM)1. La scala media contiene endolinfa, che ha un'alta concentrazione di potassio (154 mM) e una bassa concentrazione di sodio (0,91 mM)1,2,3. Questa differenza nella concentrazione di ioni può essere indicata come potenziale endococleare (EP) ed è generata principalmente dal movimento di ioni potassio attraverso vari canali ionici e giunzioni gap nella stria vascolare (SV) lungo la parete laterale della coclea 4,5,6,7,8,9,10,11 . La SV è un tessuto eterogeneo e altamente vascolarizzato che riveste l'aspetto mediale della parete laterale della coclea e contiene tre tipi cellulari principali: cellule marginali, intermedie e basali12 (Figura 1).
Le cellule marginali sono collegate da giunzioni strette per formare la superficie più mediale della SV. La membrana apicale è rivolta verso l'endolinfa della scala media e contribuisce al trasporto di ioni potassio nell'endolinfa utilizzando vari canali, tra cui KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 e Na+-K+-ATPasi (NKA)5,10,13,14. Le cellule intermedie sono cellule pigmentate che risiedono tra le cellule marginali e basali e facilitano il trasporto del potassio attraverso la SV usando KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Le cellule basali si trovano in prossimità della parete laterale della coclea e sono strettamente associate ai fibrociti del legamento a spirale per promuovere il riciclaggio del potassio dalla perilinfa12. La patologia della SV è stata implicata in numerosi disturbi otologici17,18. Le mutazioni nei geni espressi nei principali tipi di cellule SV, come Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 e Cldn11, possono causare sordità e disfunzione SV, inclusa la perdita di EP 19,20,21,22,23. Oltre ai tre principali tipi di cellule, ci sono altri tipi di cellule meno studiati nella SV, come le cellule fusate 22, le cellule radicali12,24, i macrofagi 25, i periciti 26 e le cellule endoteliali 27, che hanno ruoli incompletamente definiti che coinvolgono l'omeostasi ionica e la generazione di EP 28.
Rispetto al sequenziamento dell'RNA di massa, il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (sNuc-Seq) fornisce informazioni sull'eterogeneità cellulare, piuttosto che una media di mRNA in un gruppo di cellule29, e può essere particolarmente utile quando si studia l'eterogeneo SV30. Ad esempio, sNuc-Seq ha prodotto un'analisi trascrizionale che suggerisce che potrebbe esserci un ruolo per le cellule del fuso e della radice nella generazione di EP, nella perdita dell'udito e nella malattia di Meniere18. Un'ulteriore caratterizzazione trascrizionale dei vari tipi di cellule SV può fornirci informazioni preziose sulla fisiopatologia alla base dei diversi meccanismi e sottotipi di fluttuazione dell'udito correlata alla SV e della perdita dell'udito. La raccolta di queste delicate strutture dell'orecchio interno è di fondamentale importanza per un'analisi ottimale dei tessuti.
In questo studio, viene descritto l'approccio di microdissezione per accedere e isolare la stria vascolare dalla coclea del topo adulto per sNuc-Seq o immunocolorazione. La dissezione della SV del topo adulto è necessaria per comprendere vari tipi di cellule SV e caratterizzare ulteriormente il loro ruolo nell'udito.
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Protocol
Tutti gli esperimenti e le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto nazionale di malattie neurologiche e ictus e dall'Istituto nazionale sulla sordità e altri disturbi della comunicazione, National Institutes of Health. Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee del National Institute of Neurological Diseases and Stroke e dal National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto nazionale di malattie neurologiche e ictus e dell'Istituto nazionale sulla sordità e altri disturbi della comunicazione, National Institutes of Health.
1. Eutanasia animale
- Utilizzare topi transgenici C57BL/6J o Kcnj10-ZsGreen, giorno postnatale 30+ (P30+), che pesano tra 15-20 g.
- Eutanasia di un topo adulto (età P30 o superiore) utilizzando un protocollo approvato (qui asfissiaCO 2 ). Esegui la decapitazione come passaggio secondario.
NOTA: In caso di immunocolorazione, alcuni anticorpi possono avere un segnale di fondo a causa del legame non specifico al sangue nei capillari della SV. La perfusione cardiaca con fissativo può risolvere questo problema rimuovendo il sangue dai capillari della SV. Tuttavia, la maggior parte degli anticorpi può ottenere buoni risultati senza questo metodo e non sarà coperto da questo protocollo.
2. Esporre il labirinto osseo
- Pulire il mouse spruzzando con etanolo al 70% e strofinando con un tovagliolo di carta. Prestare particolare attenzione alla regione della testa per ridurre il rischio di contaminazione. Rimuovere la pelle dal cranio tirando la pelle verso il naso.
- Usando forbici affilate, dividere il cranio lungo il piano mediosagittale per separare le porzioni sinistra e destra.
- Rimuovere il cervello dal cranio per esporre il labirinto osseo.
3. Estrazione dell'orecchio interno
- Identificare l'orecchio interno all'interno dell'osso temporale (Figura 2A) e raschiare via i nervi cranici usando una pinza #55.
NOTA: L'utente deve stabilizzare il campione con la mano non dominante utilizzando una seconda serie di pinze #55. Diverse aree del campione possono essere afferrate con la pinza stabilizzatrice durante la dissezione se si evitano aree critiche del campione (ad esempio, non schiacciare la coclea). - Usando una pinza #55, sezionare la bulla e la capsula, staccandole dall'osso circostante. Rimuovere qualsiasi tessuto molle residuo dalla superficie dell'orecchio interno.
- Trasferire il campione in un piatto di coltura tissutale trasparente contenente 1x PBS freddo (soluzione salina tamponata fosfato), pH 7,4, e posto sotto un ambito di dissezione (Figura 2B).
4. Dissezione SV
NOTA: Con la pratica, è possibile sezionare l'SV come un lungo pezzo simile a un nastro. L'SV è fragile, quindi se si rompe in pezzi, questi possono essere conservati insieme. In alternativa, questi possono essere conservati in pozzetti etichettati separatamente in base al loro turno (ad esempio, basale, medio, apicale).
- Se le sorgenti luminose dell'oscilloscopio di dissezione possono essere spostate, posizionare una luce sopra il piatto e la seconda sorgente luminosa lateralmente, parallela alla superficie di dissezione. Ciò consente un migliore contrasto del tessuto sotto l'osso cocleare.
- Usando una pinza #55, tenere il campione per la porzione vestibolare con la coclea rivolta verso l'alto.
- Usando una pinza #55, perforare l'osso cocleare all'apice.
NOTA: le pinze #5 sono più spesse delle #55 e possono essere utilizzate per rompere l'osso, ma l'aumento di dimensioni/forza sacrifica la finezza della pinza e la capacità di manipolare piccoli tessuti. Prendi in considerazione l'utilizzo di pinze realizzate con un materiale come inox o dumostar per evitare danni che possono verificarsi a pinze più delicate. Evitare di spingere la pinza troppo in profondità sotto l'osso per evitare di danneggiare la SV. - Usando una pinza #55, raschiare lungo la curva apicale (Figura 2C), applicando una forza delicata per staccare piccoli pezzi dello strato osseo esterno. Sollevare delicatamente l'osso e staccarlo dalla parete laterale.
NOTA: Può essere utile pensare a questa dissezione come "rimuovere tutto dalla SV", piuttosto che "sezionare la SV dalla coclea". - Continuare a usare la pinza #55 per rimuovere pezzi di osso cocleare dai giri apicali e medi (Figura 2D,E). Spingendo delicatamente verso il basso la parete laterale, fare leva e rimuovere i pezzi di parete ossea verso la curva centrale per esporre la parete laterale delle curve apicali e centrali.
- Continuando a usare la pinza #55, spingere delicatamente la parete laterale apicale, per esporre il ganglio a spirale. Staccare la parete laterale delle curve apicali e centrali dal ganglio a spirale lungo lo strato esterno delle cellule ciliate. Rimuovere pezzi di ganglio a spirale dall'interno della coclea.
NOTA: Le pinze #55 sono più piccole e offrono un vantaggio quando si manipolano tessuti piccoli e delicati. È necessario prestare particolare attenzione per evitare di piegarli o danneggiarli. - Per avere un migliore accesso alla parete laterale del giro basale, staccare la coclea dalla porzione vestibolare dell'osso temporale usando una pinza #55. Metti la pinza # 55 nella finestra rotonda e ovale e spingi verso il basso verso il vestibolo. La coclea si staccherà. Rimuovere la porzione vestibolare dell'orecchio interno.
- Continuando a usare la pinza #55, ora rimuovi pezzi di osso cocleare basale, a partire dall'area del giro centrale. Spingere delicatamente lo strato di parete laterale sotto l'osso per staccarlo.
- Rimuovere la parte basale più lontana della parete laterale facendo leva e tirando delicatamente il tessuto. L'osso in questa regione può essere troppo spesso per essere rimosso senza danneggiare il tessuto molle sottostante.
- Ora, con la parte basale della parete laterale staccata, separare il più possibile la parete laterale dalla coclea. Questo può essere fatto tracciando la pinza # 55 lungo la parete laterale. Spazzolare delicatamente la pinza tra l'osso e la parete laterale rimanente. Questo può essere fatto fino all'apice in un unico pezzo se l'utente è esperto. Spostare la parete laterale su PBS fresco.
NOTA: Sebbene i pezzi più grandi di SV possano essere più facili da immaginare, data la natura delicata dei tessuti, possono essere presi pezzi più piccoli (Figura 2F, G) e, a seconda delle dimensioni, possono anche funzionare per l'imaging. - Utilizzare una pinza #55 per appoggiare la parete laterale piatta. La SV dovrebbe essere visibile come uno strato più scuro di tessuto sul lato interno della parete laterale.
NOTA: Gli utenti possono scoprire, in particolare più vicino all'estremità apicale, che parte del tessuto SV si stacca accidentalmente dalla parete laterale durante la dissezione. - Sollevare delicatamente lo strato SV per staccarlo dalla parete laterale alla sua estremità basale (Figura 2H). Spingere delicatamente da parte l'SV staccato e spostare ulteriormente la pinza verso l'estremità apicale della parete laterale, staccando la SV come un lungo nastro, se possibile (Figura 2I). Non spremere l'SV con una pinza per tirarlo. Se il tessuto è troppo fragile per essere afferrato, può in alternativa essere raccolto utilizzando uno scoop di tessuto, come una curette di calazio.
NOTA: lo spostamento dell'SV deve sempre essere effettuato al microscopio ottico per assicurarsi che non venga perso. Fai sempre attenzione quando afferri usando una pinza a causa del rischio di danni. Gli utenti possono scoprire che l'utilizzo di calazio curette mitiga il rischio di danni al tessuto SV. Per il sequenziamento di un singolo nucleo, procedere alla sezione 5. Per l'immunocolorazione SV, procedere al paragrafo 7.
5. Sospensione SV mononucleo
NOTA: Questo protocollo è adattato per il tessuto SV specificamente dal protocollo di sospensione a nucleo singolo di un produttore pubblicato. Possono essere utilizzate piattaforme di produttori diversi31. Data la variazione specifica della piattaforma, si consiglia di rivedere il protocollo specifico del produttore fornito con l'apparecchiatura. Per ottenere risultati ottimali per sNuc-Seq e ridurre al minimo la degradazione dell'RNA, più veloce è la dissezione dei tessuti, meglio è (raccomandata entro 15-20 minuti dall'eutanasia). Può essere utile eutanasia un animale alla volta e solo quando è pronto per sezionare. Avere più persone che lavorano contemporaneamente sulle dissezioni può anche eliminare il tempo di degradazione (ad esempio, un personale di laboratorio lavora sull'orecchio sinistro mentre un altro lavora sull'orecchio destro).
- Se il tessuto SV sarà utilizzato per sNuc-Seq, porre il tessuto in tampone di lisi refrigerato (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% nonidet P40 in acqua priva di nucleasi).
NOTA: se il sequenziamento deve essere eseguito immediatamente dopo la dissezione, continuare il protocollo. Se si desidera mettere in pausa il protocollo, la conservazione della SV è possibile inserendo la SV in RNAlater. Conservare per una notte a 4 °C, quindi congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso. Quando è pronto per l'uso, scongelare e lavare due volte in PBS per 5 minuti ciascuno, quindi procedere con l'omogeneizzazione (passaggio 5.2). - Omogeneizzare il tessuto in un omogeneizzatore dounce da 2 ml con 10-20 colpi di ghiaccio.
NOTA: Il cilindro di vetro entrerà manualmente in contatto con il fondo del tubo di vetro, frammentando l'SV. L'SV è delicato, quindi 20 colpi di solito raggiungono un'omogeneizzazione di successo. - Lisare il tessuto sul ghiaccio per 25 min.
NOTA: Il tempo di lisi varia a seconda del tipo di tessuto. Una lisi di 25 minuti nel tessuto SV può raggiungere una bassa vitalità cellulare (meno del 4%), ma il tempo può essere adattato se la vitalità cellulare è troppo alta (fase 5.8). - Filtrare attraverso un filtro da 30 μm e ruotare il filtrato a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lavaggio e risospensione dei nuclei (1x PBS, albumina sierica bovina all'1% [BSA], inibitore della RNasi 0,2U/μL).
- Filtrare le celle attraverso un filtro da 10 μm e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e risospendere in 50 μL di tampone di lavaggio e risospensione dei nuclei.
- Contare i nuclei usando un contatore cellulare e la colorazione blu tripano. Diluire 5 μL della sospensione cellulare in 50 μL di 1x PBS per il conteggio delle cellule; La redditività dovrebbe essere minima (3% -4%) a questo punto. Se la vitalità risulta essere superiore, adattare il protocollo per la fase 5.3 (lisi) e standardizzare il tempo di lisi per garantire un'adeguata lisi delle cellule.
NOTA: Un'elevata vitalità cellulare in una singola preparazione del nucleo significa che ci sono più cellule intatte di quanto desiderato e che potrebbe essere necessaria un'ulteriore digestione. - Caricare il campione con la densità nucleare desiderata sull'apparecchio/chip del fabbricante (vedere la guida per il produttore). Le catture di singoli nuclei sono ora pronte.
NOTA: Da un topo adulto SV, di solito si ottengono 50 μL della sospensione ad una concentrazione di 150.000 nuclei/ml.
6. Sequenziamento SV a singolo nucleo
- Inviare i campioni alla struttura principale per il sequenziamento.
NOTA: Questa parte del protocollo segue le fasi generali di (1) generazione di emulsione di gel beads (GEM) e codice a barre, (2) pulizia post-GEM-RT e amplificazione del cDNA e (3) costruzione della libreria di espressione genica 3'. Il resto del protocollo sNuc-Seq è relativamente lungo e si raccomanda ai lettori di utilizzare il protocollo specifico del produttore. La guida del produttore probabilmente descriverà i passaggi con dettagli specifici e immagini di accompagnamento. Potrebbero esserci anche video "how-to" sul sito Web del produttore. I set di dati generati possono essere rappresentati in modo dimensionale ridotto, come un'approssimazione e proiezione uniforme di varietà (UMAP; Figura 3). Molti laboratori utilizzano un nucleo di sequenziamento che può eseguire questo protocollo per gli utenti.
7. Immunocolorazione SV e montaggio dei tessuti
- Se il tessuto verrà utilizzato per l'immunocolorazione, trasferirlo in una piastra da 24 pozzetti, immerso in 200 μL di paraformaldeide al 4% (PFA) in 1x PBS e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: è utile eseguire tutta la rimozione di liquidi, il lavaggio e l'immunocolorazione sotto un microscopio. La visualizzazione durante il pipettaggio del tessuto garantirà che non venga accidentalmente perso durante la rimozione del liquido. I volumi degli anticorpi e dei lavaggi possono essere regolati purché il volume sia abbastanza grande da immergere il tessuto SV all'interno della soluzione. - Dopo la fase di fissaggio, rimuovere il PFA eseguendo due brevi lavaggi in 1x PBS (circa 500 μL) a 4 °C per 5 minuti ciascuno su uno shaker orbitale a basso (30-50) RPM. Durante la conservazione, il tessuto può essere conservato in 1x PBS a 4 °C.
- Rimuovere il PBS e permeabilizzare e bloccare per un minimo di 1 ora a temperatura ambiente in circa 300 μL di soluzione PBS-T (0,05 Tween20 in 1x PBS con siero bovino fetale al 10%).
NOTA: Gli anticorpi primari e secondari devono essere diluiti in questa soluzione bloccante. - Colorare il tessuto con anticorpo primario secondo le specifiche del particolare anticorpo utilizzato, di solito durante la notte a 4 °C . Rimuovere il PBS rimanente e aggiungere l'anticorpo primario diluito.
NOTA: La diluizione deve essere scelta in base ai suggerimenti del produttore, ai dati pubblicati, all'esperienza precedente, ecc. Di solito, la prima concentrazione da testare è una diluizione 1:100-200. Per l'esempio presentato in questo articolo, gli anticorpi GS-IB4 e DAPI sono stati diluiti ciascuno a 1:200. Se si colora per più di una proteina, più anticorpi primari possono essere combinati nella stessa soluzione, purché ogni anticorpo primario abbia un ospite diverso per evitare la reattività crociata degli anticorpi secondari. - Lavare l'anticorpo primario dal tessuto usando circa 500 μL di 1x PBS due volte per 10 minuti ciascuno su uno shaker orbitale a basso RPM.
NOTA: Continuare ad assicurarsi che il tessuto SV sia immerso nella soluzione e non bloccato sul lato del pozzetto. - Colorare con un anticorpo secondario secondo le specifiche del particolare anticorpo utilizzato, di solito per 2 ore a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a basso RPM. Coprire la piastra a 24 pozzetti in modo che l'anticorpo secondario contrassegnato con fluorescenza sia protetto dalla luce.
NOTA: Se è necessario più di un anticorpo secondario, combinare gli anticorpi secondari nella stessa soluzione. Assicurati di evitare l'etichettatura incrociata. - Lavare l'anticorpo secondario dal tessuto usando circa 500 μL di 1x PBS quattro volte per 5 minuti ciascuna su uno shaker orbitale a basso RPM. Tenere coperta la piastra a 24 pozzetti per proteggerla dalla luce.
- Preparare il microvetrino più grande (75 mm x 25 mm) posizionando due piccole strisce di colla lungo l'asse di 25 mm, appena più piccole della vetrina più piccola di 18 x 18 mm. Introdurre una goccia di reagente di montaggio (circa 50 μL) tra le strisce di colla.
NOTA: La colla crea una piccola quantità di spazio verticale in modo che quando il secondo vetrino viene posizionato sopra, il campione di tessuto SV può esistere in sicurezza, ma continuare a rimanere in posizione. Mentre lo spessore della stria è di 30-40 micron, la compressione del tessuto tra le superfici di vetro dovrebbe essere evitata per preservare la morfologia. In alternativa, è possibile utilizzare anche nastro trasparente. - Utilizzando una pinza #55, afferrare il minor tessuto possibile su un'estremità della SV e trasferire dal PBS alla goccia del reagente di montaggio sul microvetrino più grande (75 mm x 25 mm). Posizionare un'estremità di un vetrino più piccolo (18 mm x 18 mm) sul vetrino in cui è stata posizionata una striscia di colla e rilasciare delicatamente per evitare di creare bolle d'aria. Il coprislip cadrà sull'altra striscia di colla e coprirà il tessuto SV.
- Sigillare il supporto tamponando una goccia di smalto trasparente su ogni angolo del supporto. Etichettare il campione di conseguenza sul coperchio di vetroscivolo lontano dal campo di visualizzazione. Ora è pronto per la microscopia confocale (Figura 4).
- Visualizza il tessuto SV usando un microscopio a dissezione per assicurarti che sia piatto e non vicino a bolle d'aria. Se il tessuto SV non è orientato correttamente, l'utente può tentare di spingere fuori le bolle d'aria o rimuovere con attenzione il vetrino più piccolo e riposizionare l'SV. Questo deve essere fatto delicatamente per evitare di rompere i vetrini di copertura.
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Representative Results
Presentiamo un metodo per isolare la SV da utilizzare per sNuc-Seq o immunocolorazione. L'anatomia rilevante (Figura 1) della coclea rispetto alla SV può aiutare gli utenti a comprendere meglio l'organizzazione della SV e le fasi del protocollo di dissezione.
Ogni fase di questa microdissezione di SV da un mouse P30 è dettagliata nel video associato e le istantanee dei passaggi chiave di questa dissezione e isolamento di SV sono presentate nella Figura 2.
sNuc-Seq è utile nello studio del profilo trascrizionale delle varie cellule nella SV eterogenea. Un modo per visualizzarlo è il clustering su un UMAP 2D (Figura 3). Il set di dati generato da sNuc-Seq può essere valutato utilizzando diverse tecniche di analisi dei dati, ulteriormente delineate nella discussione.
L'intero montaggio SV con GS-IB4 e l'immunomarcatura DAPI, insieme alla fluorescenza Kcnj10-ZsGreen, sono presentati nella Figura 4. Utilizzando la florescenza, la SV può essere visualizzata dopo aver rimosso i tessuti circostanti e il montaggio. In questi topi, ZsGreen è espresso in particolare nelle cellule intermedie SV. La vascolarizzazione della SV può essere visualizzata in rosso (cellule endoteliali, GS-IB4).
Figura 1: Schema dell'eterogeneità e dell'organizzazione cellulare della stria vascolare. Stria vasculare eterogeneità cellulare e organizzazione. Schema della stria vasculare (SV) e sua relazione con le strutture della coclea. La SV è composta da tre strati di cellule ed è responsabile della generazione di EP e alta concentrazione di potassio nella scala media contenente endolinfa. La relazione tra le cellule marginali, intermedie e basali è dimostrata con le proiezioni basolaterali marginali che si estendono per intercifrarsi con le cellule intermedie, che hanno proiezioni cellulari bidirezionali che si interdigitano sia con le cellule marginali che basali. Oltre a questi tipi di cellule, altri tipi di cellule, tra cui cellule fusate (gialle), cellule endoteliali, periciti e macrofagi (non mostrati) sono presenti nella SV. Usato con il permesso di Korrapati et al.30. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Dissezione della coclea di un topo adulto maggiore o uguale al giorno postnatale 30 (P30+). (A) Campione durante l'estrazione dell'orecchio interno dall'osso temporale circostante durante la fase 3.2. L'orecchio interno è delineato in viola. (B) Campione durante la fase 4.2 che mostra la superficie della coclea e della SV pigmentata sottostante. (C) Campione durante la fase 4.4 che mostra l'osso rimosso dalla virata apicale e l'SV esposto (freccia gialla). (D) Campione durante la fase 4.5 che mostra la coclea con più osso rimosso dalle curve apicali e centrali. (E) Campione durante la fase 4.5 che mostra l'asportazione dell'osso che copre la curva centrale, mostrando la SV sottostante (freccia gialla). (F) Esempio di parti più piccole di SV (freccia gialla) e parete laterale (freccia blu) durante il punto 4.10. (G) Esempio di ZsGreen SV fluorescente mentre la parete laterale rimanente rimane scura. Kcnj10-ZsGreen è particolarmente espresso nelle cellule intermedie della SV. (H) Esempio di pezzi più grandi di SV (freccia gialla) e parete laterale (blu) separati durante il punto 4.12. (I) L'SV completamente separato dalla parete laterale durante il punto 4.12. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Grafico UMAP di set di dati sNuc-Seq da una stria vascolare adulta trattata con RNAlater. I campioni conservati con il trattamento RNAlater del tessuto SV adulto con successivo isolamento dei nuclei sono stati raggruppati mediante un metodo di clustering basato sulla modularità con l'algoritmo di ottimizzazione di Leiden e visualizzati in modo dimensionalmente ridotto da un grafico UMAP 2D. Ogni punto rappresenta una singola cellula e le cellule con profili trascrizionali simili sono raggruppate insieme. I tipi cellulari sono colorati in base alla loro espressione di geni noti espressi da tipi di cellule SV adulte. I campioni sono stati conservati in RNAsuccessivamente per non più di 6 mesi. L'SV di circa cinque topi CBA / J P30 è stato utilizzato per generare questo set di dati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Stria vascularis montaggio completo da un mouse P30 Kcnj10-ZsGreen. Immagine confocale dell'intero montaggio SV da un topo P30, che dimostra l'espressione di ZsGreen nelle cellule intermedie, GS-IB4 (rosso) marcando le cellule endoteliali e i nuclei di marcatura DAPI (bianco). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Prima dell'avvento del sequenziamento a singola cellula, molti ricercatori utilizzavano l'analisi dei tessuti di massa, che consentiva solo di analizzare i trascrittomi mediati tra le cellule. In particolare, single-cell e sNuc-Seq hanno permesso di isolare il trascrittoma di una singola cellula o di un singolo nucleo, rispettivamente32. In questo caso, i trascrittomi a singolo nucleo possono essere identificati per le cellule marginali, intermedie e basali, così come le cellule del fuso30. Ciò consente lo studio dell'eterogeneità trascrizionale tra i tipi di cellule SV e può essere utilizzato in futuro per studiare il contributo di questi tipi di cellule alla funzione SV, compresa la generazione e il mantenimento di EP. I set di dati generati utilizzando sNuc-Seq possono essere visualizzati in modo dimensionalmente ridotto per facilitare la comprensione delle differenze trascrizionali complessive e confrontare diverse popolazioni cellulari utilizzando un grafico UMAP Figura 4. Esistono numerosi modi per condurre analisi bioinformatiche per l'interpretazione dei set di dati sNuc-Seq. Questi includono, ma non sono limitati a: analisi di espressione differenziale, inferenza e clustering della rete di regolazione a cella singola (SCENIC), costruzione della trama del violino della mappa di calore o del sorriso e analisi di regolazione18. Ulteriori tecniche di analisi computazionale per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula sono simili a sNuc-Seq e sono discusse in modo più dettagliato nelle revisioni di Hwang et al.32, Shafer33 e Chen et al.34.
L'altra importante applicazione di questa tecnica di dissezione è l'immunocolorazione per studiare meglio strutture selezionate all'interno della SV. Possiamo osservarlo nell'impostazione di una montatura intera SV che è stata ripresa utilizzando la microscopia confocale (Figura 3). I nuclei di tutte le cellule sono visualizzati con etichettatura DAPI. I capillari sono visibili attraverso la colorazione delle cellule endoteliali con GS-IB4 in rosso. Le cellule intermedie, in questo caso, sono state geneticamente modificate utilizzando un promotore cellulare intermedio specifico per esprimere ZsGreen.
I limiti di sNuc-Seq includono: (1) mancanza di informazioni spaziali, (2) pregiudizi contro le popolazioni di cellule immunitarie e (3) esclusione dell'RNA citoplasmatico. Le tecniche di trascrittomica spaziale possono fornire informazioni più specifiche sulle sottopopolazioni cellulari all'interno del tessuto35. Date le differenze di protocollo tra sNuc-Seq e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, come la dissociazione e lo stoccaggio dei tessuti, il profilo trascrizionale generato da sNuc-Seq può influenzare le cellule immunitarie pur essendo più potente nel caratterizzare i tipi di cellule attaccate36. Inoltre, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula include l'RNA citoplasmatico come l'RNA mitocondriale, mentre sNuc-Seq no. Nonostante questi casi di differenze trascrizionali tra i due metodi, è stato dimostrato che, in generale, sNuc-Seq ha un profilo trascrizionale simile al sequenziamento dell'RNA a singola cellula intera37, e nella SV in particolare30.
Per una microdissezione di successo, ci sono diversi passaggi critici di cui essere a conoscenza. Nei primi passaggi, è necessario estrarre correttamente l'orecchio interno per evitare di schiacciare la coclea sottostante. L'osservazione della corretta estrazione dell'osso temporale è mostrata nella Figura 2A. Una volta che la coclea è correttamente esposta, bisogna fare attenzione a raschiare delicatamente e rompere l'osso cocleare per esporre la parete laterale sottostante e SV. Una volta che la parete laterale e l'SV sono state estratte correttamente, l'utente deve staccare con attenzione la SV dalla parete laterale. È necessario applicare una forza sufficiente nel piano corretto per sollevare l'SV dalla parete laterale, evitando danni alla fragile SV. Per la microdissezione SV, può essere utile pensare di "sezionare altre strutture lontano dalla SV", piuttosto che "sezionare la SV fuori dalla coclea".
Questo protocollo può essere modificato per diverse età di topi e per diverse specie di mammiferi, come i ratti. Per i topi più giovani, i tessuti differiranno per consistenza e le strutture saranno più piccole in generale. Per diverse specie di mammiferi, l'anatomia cocleare sarà relativamente simile, con la dimensione dell'animale che determina la maggior parte della differenza.
In generale, gli svantaggi di questo protocollo sono simili ad altre tecniche di microdissezione cocleare38. Isolare il delicato SV può essere tecnicamente impegnativo e può essere suddiviso in pezzi più piccoli.
Questa tecnica non è ottimale per salvare l'organo di Corti per l'intero montaggio in quanto è spesso danneggiato con questo protocollo. Esistono altre tecniche di dissezione specificamente volte a preservare l'organo di Corti per il montaggio completo e l'immunocolorazione38, ma queste hanno i loro svantaggi, considerando che sNuc-Seq deve essere fatto con campioni freschi per evitare la degradazione dell'RNA, non nel contesto della fissazione e della decalcificazione dei tessuti.
Con il tempo e la ripetizione, gli utenti diventeranno più a loro agio con questo protocollo di microdissezione SV.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata in parte dal programma di ricerca intramurale del NIH, NIDCD a M.H. (DC000088)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
References
- Bosher, S. K., Warren, R. L. Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry. Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).
- Patuzzi, R. Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential. Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).
- Wangemann, P. K+ cycling and the endocochlear potential. Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).
- Adachi, N., et al. The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear. The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).
- Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).
- Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. The human "cochlear battery"-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239 (2017).
- Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).
- Spicer, S. S., Schulte, B. A. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).
- Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).
- Yoshida, T., et al. The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential. Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).
- Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hearing Research. 428, 108682 (2023).
- Kim, J., Ricci, A. J. In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119 (2022).
- Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models. Physiology. 24, 307-316 (2009).
- Chen, J., Zhao, H. B. The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss. Neuroscience. 265, 137-146 (2014).
- Steel, K. P., Barkway, C. Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear. Development. 107 (3), 453-463 (1989).
- Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome. Neuroscience. 310, 188-197 (2015).
- Gu, S., et al. Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).
- Gow, A., et al. Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function. The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Faridi, R., et al. Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome. Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Medicine. 2, 30 (2004).
- Kitajiri, S. -I., et al. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).
- Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).
- Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y.
- Zhang, J., et al. VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss. JCI Insight. 6 (8), e143285 (2021).
- Shi, X. Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review). Hearing Research. 338, 52-63 (2016).
- Gu, S., et al. Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis. Frontiers in Neurology. 12, 630561 (2021).
- Fischer, J., Ayers, T. Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).
- Korrapati, S., et al. Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316 (2019).
- Pyle, M. P., Hoa, M. Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review. Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).
- Shafer, M. E. R. Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).
- Grindberg, R. V., et al.
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).
