Summary
선조체 혈관은 달팽이관 내 전위 생성에 필수적입니다. 여기에서 우리는 단일 핵 시퀀싱 또는 면역 염색을 위한 성인 마우스 stria vascularis의 해부를 제시합니다.
Abstract
선조체 혈관에 의해 생성되는 내와우 전위는 적절한 유모 세포 기계 형질도입과 궁극적으로 청력에 도움이 되는 환경을 유지하는 데 필수적입니다. 선조체 혈관의 병리는 청력 저하를 초래할 수 있습니다. 성인 선조체 혈관의 해부는 집중된 단일 핵 포획 및 후속 단일 핵 시퀀싱 및 면역 염색을 허용합니다. 이러한 기술은 단일 세포 수준에서 선조체 혈관 병태생리학을 연구하는 데 사용됩니다.
단일 핵 시퀀싱은 선조체 혈관의 전사 분석 설정에 사용할 수 있습니다. 한편, 면역염색은 특정 세포 집단을 식별하는 데 계속 유용합니다. 두 방법 모두 전제 조건으로 적절한 선조체 혈관 박리가 필요하며, 이는 기술적으로 어려울 수 있습니다.
Introduction
달팽이관은 3개의 유체로 채워진 챔버, 스칼라 현관, 스칼라 중막 및 스칼라 고막으로 구성됩니다. 스칼라 현정과 스칼라 고막은 각각 고농도의 나트륨(138mM)과 낮은 농도의 칼륨(6.8mM)을 함유하고 있는 외림프를 함유하고 있습니다.1. 스칼라 배지는 고농도의 칼륨 (154 mM)과 낮은 농도의 나트륨 (0.91 mM)을 갖는 내 림프를 함유하고 있습니다 1,2,3. 이러한 이온 농도의 차이는 달팽이관 내 전위(EP)라고 할 수 있으며, 주로 달팽이관 4,5,6,7,8,9,10,11의 측벽을 따라 선조체 혈관(SV)의 다양한 이온 채널과 간극 접합부를 통한 칼륨 이온의 이동에 의해 생성됩니다 . SV는 달팽이관 외벽의 내측을 둘러싸고 있으며 변연, 중간 및 기저 세포의 세 가지 주요 세포 유형을 포함하는 이질적이고 혈관이 많이 형성된 조직입니다12(그림 1).
변연 세포는 단단한 접합부로 연결되어 SV의 가장 중간 표면을 형성합니다. 정단막은 스칼라 매막의 내림프를 향하고 KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 및 Na+-K+-ATPase(NKA)5,10,13,14를 포함한 다양한 채널을 사용하여 내림프로의 칼륨 이온 수송에 기여합니다. 중간 세포는 변연부와 기저 세포 사이에 존재하며 KCNJ10 (Kir 4.1) 15,16을 사용하여 SV를 통한 칼륨 수송을 촉진하는 색소 세포입니다. 기저 세포는 달팽이관의 외벽에 매우 근접해 있으며 나선형 인대의 섬유세포와 밀접하게 연관되어 외림프에서 칼륨 재활용을 촉진한다12. SV의 병리학은 수많은 이과적 장애에 연루되어 있다17,18. Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 및 Cldn11과 같은 주요 SV 세포 유형에서 발현되는 유전자의 돌연변이는 EP 19,20,21,22,23의 손실을 포함하여 난청 및 SV 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 세 가지 주요 세포 유형 외에도 방추 세포 22, 뿌리 세포12,24, 대식세포 25, 혈관주위세포 26 및 내피 세포 27과 같이 SV에서 덜 연구된 다른 세포 유형이 있으며, 이는 이온 항상성 및 EP 28의 생성과 관련된 역할이 불완전하게 정의되어 있습니다.
벌크 RNA-염기서열분석과 비교하여, 단일-핵 RNA-염기서열분석(sNuc-Seq)은 세포 그룹29에 걸친 mRNA의 평균이 아닌 세포 이질성에 대한 정보를 제공하며, 이질적인 SV30을 연구할 때 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, sNuc-Seq는 EP 생성, 청력 상실 및 메니에르병에서 방추 세포와 뿌리 세포에 역할이 있을 수 있음을 시사하는 전사 분석을 생성했다18. 다양한 SV 세포 유형의 추가 전사 특성화는 SV 관련 청력 변동 및 청력 손실의 다양한 메커니즘 및 하위 유형의 기초가 되는 병태생리학에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 섬세한 내이 구조의 수확은 최적의 조직 분석에 가장 중요합니다.
이 연구에서는 sNuc-Seq 또는 면역염색을 위해 성인 마우스 달팽이관에서 선조체 혈관에 접근하고 분리하기 위한 미세 해부 접근법이 설명됩니다. 성인 마우스 SV의 해부는 다양한 SV 세포 유형을 이해하고 청력에서의 역할을 추가로 특성화하는 데 필요합니다.
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Protocol
모든 동물 실험 및 절차는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회와 국립 보건원의 국립 청각 장애 및 기타 의사소통 장애 연구소에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 모든 실험 프로토콜은 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회와 국립 보건원의 국립 난청 및 기타 의사소통 장애 연구소의 승인을 받았습니다. 모든 방법은 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용위원회와 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 국립 청각 장애 및 기타 의사 소통 장애 연구소 (National Institute on Deafness and Other Communication Disorders)의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 동물 안락사
- 체중이 15-20g인 C57BL/6J 또는 Kcnj10-ZsGreen 형질전환 마우스, 출생 후 30+(P30+)를 사용하십시오.
- 성인 마우스(P30세 이상)를 승인된 프로토콜(여기서는CO2 질식)을 사용하여 안락사시킨다. 2 차 단계로 참수를 수행하십시오.
참고: 면역염색의 경우 일부 항체는 SV의 모세혈관에서 혈액에 대한 비특이적 결합으로 인해 배경 신호를 가질 수 있습니다. 고정제를 사용한 심장 관류는 SV의 모세혈관에서 혈액을 제거하여 이 문제를 해결할 수 있습니다. 그러나 대부분의 항체는 이 방법 없이 좋은 결과를 얻을 수 있으며 이 프로토콜에서는 다루지 않습니다.
2. 뼈 미로 노출
- 70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 닦아 마우스를 청소합니다. 오염 위험을 줄이기 위해 머리 부분에 특히주의하십시오. 피부를 코 쪽으로 당겨 두개골에서 피부를 제거합니다.
- 날카로운 가위를 사용하여 중간 시상면을 따라 두개골을 분할하여 왼쪽과 오른쪽 부분을 분리합니다.
- 두개골에서 뇌를 제거하여 뼈 미로를 드러냅니다.
3. 내이 추출
- 측두골 내의 내이를 확인하고(그림 2A) #55 집게를 사용하여 뇌신경을 긁어냅니다.
알림: 사용자는 두 번째 #55 집게 세트를 사용하여 주로 사용하지 않는 손으로 표본을 안정시켜야 합니다. 검체의 중요한 영역을 피하는 경우(예: 달팽이관을 부수지 마십시오) 해부 내내 안정화 집게로 표본의 다른 영역을 잡을 수 있습니다. - #55 집게를 사용하여 수포와 캡슐을 해부하여 주변 뼈에서 분리합니다. 내이 표면에 남아 있는 연조직을 제거합니다.
- 검체를 1x 차가운 PBS(인산염 완충 식염수), pH 7.4가 들어 있는 투명한 조직 배양 접시에 옮기고 해부 범위 아래에 놓습니다(그림 2B).
4. SV 해부
알림: 연습을 통해 SV를 리본을 닮은 하나의 긴 조각으로 해부할 수 있습니다. SV는 깨지기 쉽기 때문에 조각으로 부서지면 함께 보관할 수 있습니다. 대안적으로, 이들은 그들의 차례에 따라 개별적으로 라벨링된 웰(예를 들어, 기저, 중간, 정점)에 저장될 수 있다.
- 해부 스코프 광원을 이동할 수 있는 경우 접시 위에 하나의 조명을 배치하고 측면에서 두 번째 광원을 해부 표면과 평행하게 놓습니다. 이것은 달팽이관 뼈 아래 조직의 더 나은 대조를 허용합니다.
- #55 집게를 사용하여 달팽이관이 위를 향하도록 하여 전정 부분으로 표본을 잡습니다.
- #55 집게를 사용하여 정점의 달팽이관 뼈를 뚫습니다.
참고: #5 겸자는 #55보다 두껍고 뼈를 부러뜨리는 데 사용할 수 있지만 크기/강도의 증가는 집게의 섬세함과 작은 조직을 조작하는 능력을 희생합니다. 더 섬세한 집게에 발생할 수 있는 손상을 방지하기 위해 inox 또는 dumostar와 같은 재료로 만든 집게를 사용하는 것이 좋습니다. SV가 손상되지 않도록 집게를 뼈 아래로 너무 깊숙이 밀어 넣지 마십시오. - #55 집게를 사용하여 정점 회전을 따라 긁어내고(그림 2C) 부드러운 힘을 가하여 바깥쪽 뼈층의 작은 조각을 떼어냅니다. 뼈를 부드럽게 들어 올려 측면 벽에서 분리하십시오.
참고: 이 해부는 "달팽이관에서 SV를 해부"하는 것이 아니라 "SV에서 모든 것을 제거하는 것"으로 생각하는 것이 도움이 될 수 있습니다. - #55 집게를 계속 사용하여 정점 및 중간 회전에서 달팽이관 뼈 조각을 제거합니다(그림 2D,E). 측면 벽을 부드럽게 아래로 밀고 중간 회전을 향해 뼈 벽 조각을 들어 올려 제거하여 정점 및 중간 회전의 측면 벽을 노출시킵니다.
- #55 집게를 계속 사용하여 정점 회전 측벽을 옆으로 부드럽게 밀어 나선형 신경절을 노출시킵니다. 바깥 쪽 유모 세포층을 따라 나선형 신경절에서 정점 및 중간 회전의 측벽을 분리합니다. 달팽이관 내부에서 나선형 신경절 조각을 제거합니다.
알림: #55 집게는 더 작고 작고 섬세한 조직을 조작할 때 이점을 제공합니다. 구부러지거나 손상되지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다. - 기저부의 외벽에 더 잘 접근하려면 #55 집게를 사용하여 측두골의 전정 부분에서 달팽이관을 분리합니다. #55 집게를 원형 타원형 창에 넣고 현관 쪽으로 아래로 밉니다. 달팽이관이 분리됩니다. 내이의 전정 부분을 제거하십시오.
- #55 집게를 계속 사용하여 중간 회전 영역부터 시작하여 기초 달팽이관 뼈 조각을 제거합니다. 뼈 아래의 측면 벽 층을 부드럽게 밀어 분리합니다.
- 조직을 들어 올리고 부드럽게 잡아 당겨 측벽의 가장 먼 기저 부분을 제거하십시오. 이 부위의 뼈는 너무 두꺼워서 아래의 연조직을 손상시키지 않고 제거할 수 없습니다.
- 이제 외벽의 기저부를 분리한 상태에서 달팽이관에서 외벽을 최대한 분리합니다. 이것은 측면 벽을 따라 #55 집게를 추적하여 수행할 수 있습니다. 뼈와 나머지 측벽 사이의 집게를 부드럽게 닦습니다. 이것은 사용자가 경험이 있는 경우 한 조각으로 정점까지 수행할 수 있습니다. 측벽을 새 PBS로 옮깁니다.
참고: SV의 큰 조각은 이미징하기가 더 쉬울 수 있지만 조직의 섬세한 특성을 감안할 때 더 작은 조각을 촬영할 수 있으며(그림 2F, G) 크기에 따라 이미징에도 사용할 수 있습니다. - #55 집게를 사용하여 측면 벽을 평평하게 놓습니다. SV는 측벽의 내부에 더 어두운 조직층으로 보여야 합니다.
참고: 사용자는 특히 정점 끝에 가까울수록 SV 조직의 일부가 해부 내내 측면 벽에서 우연히 분리되는 것을 발견할 수 있습니다. - SV 레이어를 부드럽게 들어 올려 기저부의 측면 벽에서 분리합니다(그림 2H). 분리된 SV를 부드럽게 옆으로 밀고 집게를 측면 벽의 정점 끝 쪽으로 더 이동하여 가능하면 SV를 하나의 긴 리본으로 분리합니다(그림 2I). 집게로 SV를 쥐어 당기지 마십시오. 조직이 너무 약해서 잡을 수 없는 경우 칼라지온 큐렛과 같은 조직 국자를 사용하여 수집할 수 있습니다.
알림: SV 이동은 손실되지 않도록 항상 광학 현미경으로 수행해야 합니다. 집게를 사용하여 잡을 때는 손상의 위험이 있으므로 항상 주의하십시오. 사용자는 chalazion 큐레트를 사용하면 SV 조직 손상 위험을 완화할 수 있습니다. 단일 핵 시퀀싱의 경우 섹션 5로 진행합니다. SV 면역염색의 경우, 섹션 7로 진행한다.
5. SV 단핵 현탁액
참고: 이 프로토콜은 특히 공개된 제조업체의 단일 핵 현탁액 프로토콜에서 SV 조직에 맞게 조정되었습니다. 상이한 제조업자로부터의 플랫폼들이 사용될 수 있다31. 플랫폼별 변형을 감안할 때 장비와 함께 제공되는 제조업체별 프로토콜을 검토하는 것이 좋습니다. sNuc-Seq에 대한 최적의 결과를 얻고 RNA 분해를 최소화하려면 조직 절개가 빠를수록 좋습니다(안락사 후 15-20분 이내 권장). 한 번에 한 마리씩 해부할 준비가 되었을 때만 안락사시키는 것이 도움이 될 수 있습니다. 여러 사람이 동시에 해부 작업을 하면 분해 시간도 없앨 수 있습니다(예: 한 실험실 직원이 왼쪽 귀에서 작업하고 다른 실험실 직원이 오른쪽 귀에서 작업).
- SV 조직이 sNuc-Seq에 사용될 경우, 조직을 차가운 용해 완충액(10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mMMgCl2, 0.005% nonidet P40 in nuclease free water)에 넣는다.
알림: 해부 직후 시퀀싱을 수행해야 하는 경우 프로토콜을 계속하십시오. 프로토콜을 일시 중지하려는 경우 SV를 RNAlater에 배치하여 SV 보존이 가능합니다. 4 °C에서 밤새 보관한 다음 액체 질소에서 급속 냉동하고 사용할 준비가 될 때까지 -80 °C에서 보관하십시오. 사용할 준비가 되면 PBS에서 각각 5분 동안 해동하고 세척한 다음 균질화를 진행합니다(단계 5.2). - 얼음 위에서 2-10회 스트로크로 2mL dounce 균질화기에서 조직을 균질화합니다.
알림: 유리 실린더는 유리관 바닥에 수동으로 접촉하여 SV를 조각화합니다. SV는 섬세하므로 일반적으로 20 스트로크로 성공적인 균질화를 달성합니다. - 얼음 위에서 25분 동안 티슈를 녹입니다.
참고: 용해 시간은 조직 유형에 따라 다릅니다. SV 조직에서의 25분 용해는 낮은 세포 생존율(4% 미만)을 달성할 수 있지만, 세포 생존율이 너무 높은 경우 시간을 조정할 수 있다(단계 5.8). - 30μm 필터를 통해 여과하고 여과액을 4°C에서 5분 동안 500 x g 로 회전시킵니다.
- 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 1mL의 핵 세척 및 재현탁 완충액(1x PBS, 1% 소 혈청 알부민[BSA], 0.2U/μL RNase 억제제)에 재현탁합니다.
- 4°C에서 5분 동안 10 μm 필터 및 500 x g 에서 원심분리기를 통해 세포를 여과한다.
- 상층액을 제거하고 50 μL의 핵 세척 및 재현탁 완충액에 재현탁합니다.
- 세포 계수기 및 트리판 블루 염색을 사용하여 핵을 계수합니다. 세포 계수를 위해 5 μL의 세포 현탁액을 50 μL의 1x PBS로 희석합니다. 이 시점에서 생존력은 최소(3%-4%)여야 합니다. 생존율이 더 높은 것으로 판명되면 5.3단계(용해)에 대한 프로토콜을 조정하고 용해 시간을 표준화하여 세포의 적절한 용해를 보장합니다.
참고: 단일 핵 제제에서 세포 생존율이 높다는 것은 원하는 것보다 더 많은 온전한 세포가 있고 추가 소화가 필요할 수 있음을 의미합니다. - 원하는 핵 밀도를 가진 샘플을 제조업체의 장치/칩에 로드합니다(제조업체 가이드 참조). 이제 단일 핵 캡처가 준비되었습니다.
참고: 성인 마우스 SV 1마리에서 일반적으로 150,000 nuclei/mL 농도의 현탁액 50μL가 달성됩니다.
6. SV 단일 핵 시퀀싱
- 시퀀싱을 위해 샘플을 핵심 시설로 보냅니다.
참고: 프로토콜의 이 부분은 (1) 겔 비드-인 에멀젼(GEM) 생성 및 바코드, (2) GEM-RT 후 클린업 및 cDNA 증폭, (3) 3' 유전자 발현 라이브러리 구축의 일반적인 단계를 따릅니다. sNuc-Seq 프로토콜의 나머지 부분은 비교적 길기 때문에 리더는 제조업체별 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 제조업체 가이드에는 특정 세부 정보 및 함께 제공되는 이미지와 함께 단계가 설명되어 있습니다. 제조업체 웹 사이트에 '방법' 비디오가 있을 수도 있습니다. 생성된 데이터세트는 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP; 그림 3). 많은 랩에서는 사용자를 위해 이 프로토콜을 수행할 수 있는 시퀀싱 코어를 사용합니다.
7. SV 면역염색 및 조직 장착
- 조직을 면역염색에 사용할 경우 24웰 플레이트로 옮기고 1x PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA) 200μL에 담근 후 실온에서 20분 동안 배양합니다.
알림: 현미경으로 모든 액체 제거, 세척 및 면역염색을 수행하는 것이 도움이 됩니다. 조직을 피펫팅하는 동안 시각화하면 액체를 제거하는 동안 조직이 우발적으로 손실되지 않도록 할 수 있습니다. 항체 및 세척액의 부피는 부피가 SV 조직을 용액 내에 잠길 수 있을 만큼 충분히 큰 한 조정될 수 있다. - 고정 단계 후, 낮은 (30-50) RPM의 오비탈 쉐이커 상에서 각각 5분 동안 4°C에서 1x PBS(약 500 μL)에서 2회의 짧은 세척을 수행하여 PFA를 제거한다. 보관하는 경우, 조직은 4°C에서 1x PBS에 저장될 수 있다.
- PBS를 제거하고 약 300μL의 PBS-T 용액(10% 소 태아 혈청이 포함된 1x PBS 중 0.05Tween20)에서 실온에서 최소 1시간 동안 투과화 및 차단합니다.
참고: 1차 및 2차 항체는 이 차단 용액에 희석해야 합니다. - 사용된 특정 항체의 사양에 따라 1차 항체로 조직을 염색하고, 보통 4°C에서 하룻밤 동안 소독합니다. 나머지 PBS를 제거하고 희석된 1차 항체를 추가합니다.
알림: 희석은 제조업체 제안, 게시된 데이터, 이전 경험 등을 기반으로 선택해야 합니다. 일반적으로 테스트할 첫 번째 농도는 1:100-200 희석입니다. 본 논문에 제시된 예에서 GS-IB4 및 DAPI 항체를 각각 1:200으로 희석하였다. 하나 이상의 단백질에 대해 염색하는 경우, 각 1차 항체가 2차 항체의 교차 반응성을 피하기 위해 다른 숙주를 갖는 한 여러 1차 항체를 동일한 용액에 결합할 수 있습니다. - 약 500μL의 1x PBS를 사용하여 낮은 RPM의 오비탈 셰이커에서 각각 10분 동안 두 번 사용하여 조직에서 1차 항체를 세척합니다.
알림: SV 조직이 용액에 잠기고 웰 측면에 달라붙지 않도록 계속 확인하십시오. - 사용된 특정 항체의 사양에 따라 2차 항체로 염색하고, 일반적으로 낮은 RPM의 오비탈 셰이커 상에서 실온에서 2시간 동안 염색합니다. 형광 태그된 2차 항체가 빛으로부터 보호되도록 24웰 플레이트를 덮습니다.
참고: 하나 이상의 2차 항체가 필요한 경우 2차 항체를 동일한 용액에 결합합니다. 교차 라벨링을 피하십시오. - 약 500 μL의 1x PBS를 사용하여 낮은 RPM의 오비탈 쉐이커에서 각각 5분 동안 4회 조직으로부터 2차 항체를 세척한다. 빛으로부터 보호하기 위해 24웰 플레이트를 덮어 두십시오.
- 25mm 축을 따라 18mm x 18mm 크기의 작은 유리 커버슬립보다 작은 접착제 줄무늬 두 개를 배치하여 더 큰 마이크로슬라이드(75mm x 25mm)를 준비합니다. 접착제 줄무늬 사이에 장착 시약 한 방울(약 50μL)을 놓습니다.
알림: 접착제는 두 번째 커버슬립을 맨 위에 놓을 때 SV 조직 샘플이 안전하게 존재할 수 있지만 제자리에 계속 유지되도록 소량의 수직 공간을 만듭니다. 줄무늬 두께는 30-40 미크론이지만 형태를 보존하기 위해 유리 표면 사이의 조직을 압착하는 것은 피해야 합니다. 대안적으로, 투명 테이프가 또한 사용될 수 있다. - #55 집게를 사용하여 SV의 한쪽 끝에서 가능한 한 적은 조직을 잡고 PBS에서 더 큰 마이크로슬라이드(75mm x 25mm)의 장착 시약 드롭으로 옮깁니다. 작은 유리 커버슬립(18mm x 18mm)의 한쪽 끝을 접착제 한 줄무늬가 놓인 슬라이드에 놓고 기포가 생기지 않도록 부드럽게 놓습니다. 커버슬립은 다른 접착제 줄무늬로 떨어지고 SV 조직을 덮습니다.
- 마운트의 각 모서리에 투명 매니큐어 한 방울을 두드려 마운트를 밀봉합니다. 유리 커버슬립에 그에 따라 표본을 표시하여 시각화 필드에서 멀리 떨어뜨립니다. 이제 컨포칼 현미경 검사를 사용할 준비가 되었습니다(그림 4).
- 해부 현미경을 사용하여 SV 조직을 시각화하여 기포 근처에 있지 않고 평평하게 놓여 있는지 확인합니다. SV 조직의 방향이 올바르지 않은 경우 사용자는 기포를 밀어내거나 더 작은 유리 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 SV의 위치를 변경할 수 있습니다. 유리 커버슬립이 깨지지 않도록 부드럽게 해야 합니다.
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Representative Results
본 발명자들은 sNuc-Seq 또는 면역염색에 사용될 SV를 분리하는 방법을 제시한다. SV와 관련된 달팽이관의 관련 해부학적 구조(그림 1)는 사용자가 SV의 조직과 해부 프로토콜의 단계를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
P30 마우스에서 SV의 미세 해부의 각 단계는 관련 비디오에 자세히 설명되어 있으며, 이 SV 해부 및 분리의 주요 단계에 대한 스냅샷이 그림 2에 나와 있습니다.
sNuc-Seq는 이질적인 SV에서 다양한 세포의 전사 프로파일을 조사하는데 유용하다. 이를 시각화할 수 있는 한 가지 방법은 2D UMAP에서 클러스터링하는 것입니다(그림 3). sNuc-Seq에서 생성된 데이터 세트는 다양한 데이터 분석 기술을 사용하여 평가할 수 있으며, 자세한 내용은 논의에서 설명합니다.
Kcnj10-ZsGreen 형광과 함께 GS-IB4 및 DAPI 면역 표지를 사용한 SV 전체 마운팅이 그림 4에 나와 있습니다. 형광을 사용하여 주변 조직을 제거하고 장착한 후 SV를 시각화할 수 있습니다. 이들 마우스에서, ZsGreen은 SV 중간 세포에서 특히 발현된다. SV의 맥관 구조는 빨간색으로 시각화 할 수 있습니다 (내피 세포, GS-IB4).
그림 1: 선조체 혈관 세포 이질성 및 조직의 개략도. Stria vascularis 세포 이질성 및 조직. stria vascularis (SV)의 개략도와 달팽이관의 구조와의 관계. SV는 3개의 세포층으로 구성되어 있으며 내림프 함유 스칼라 배지에서 EP와 높은 칼륨 농도를 생성하는 역할을 합니다. 변연부, 중간 세포 및 기저 세포 사이의 관계는 변연 및 기저 세포 모두와 교차하는 양방향 세포 투영을 갖는 중간 세포와 교차하기 위한 변연 확장 기저측 돌출부로 입증됩니다. 이들 세포 유형 이외에도, 방추 세포 (황색), 내피 세포, 혈관주위세포 및 대식세포 (나타내지 않음)를 포함하는 다른 세포 유형이 SV에 존재한다. Korrapati et al.30의 허가를 받아 사용함. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 출생 후 30일 이상(P30+)에 성인 마우스 달팽이관을 절개합니다. (A) 3.2단계 동안 주변 측두골에서 내이 추출 중 검체. 내이는 보라색으로 윤곽이 그려져 있습니다. (B) 달팽이관의 표면과 기저 색소 SV를 보여주는 4.2단계 동안의 표본. (C) 4.4 단계 동안 정점 회전에서 뼈가 제거되고 노출된 SV를 보여주는 시편(노란색 화살표). (D) 4.5단계 동안의 검체는 정점 및 중간 회전에서 더 많은 뼈가 제거된 달팽이관을 보여줍니다. (E) 4.5 단계 동안의 시편은 중간 턴을 덮고 있는 뼈의 제거를 보여주고, 밑에 있는 SV를 보여준다(노란색 화살표). (f) 단계 4.10 동안 SV(노란색 화살표) 및 측면 벽(파란색 화살표)의 작은 조각의 예. (G) 나머지 측면 벽이 어둡게 유지되는 동안 형광 ZsGreen SV의 예. KCNJ10-ZsGreen은 특히 SV의 중간 세포에서 발현된다. (H) 4.12 단계에서 분리되는 SV(노란색 화살표)와 측면 벽(파란색)의 더 큰 조각의 예. (i) SV는 단계 4.12 동안 측벽으로부터 완전히 분리된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RNAlater로 처리된 성인 선조체 혈관에서 sNuc-Seq 데이터 세트의 UMAP 플롯. 후속 핵 분리와 함께 성인 SV 조직의 RNAlater 처리로 보존된 샘플은 Leiden 최적화 알고리즘을 사용한 모듈성 기반 클러스터링 방법으로 클러스터링되고 2D UMAP 플롯에 의해 차원 축소 방식으로 시각화되었습니다. 각 점은 단일 세포를 나타내며 유사한 전사 프로필을 가진 세포는 함께 클러스터링됩니다. 세포 유형은 성인 SV 세포 유형에 의해 발현되는 공지된 유전자의 발현에 기초하여 착색된다. 샘플은 6개월 이상 RNAlater에 보관되지 않았습니다. 약 5마리의 CBA/J P30 마우스의 SV를 사용하여 이 데이터 세트를 생성했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. Stria vascular는 P30 Kcnj10-ZsGreen 마우스에서 전체 장착됩니다. 중간 세포, GS-IB4(빨간색) 표지 내피 세포 및 DAPI(흰색) 표지 핵에서 ZsGreen 발현을 보여주는 P30 마우스의 SV 전체 장착의 공초점 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
단일 세포 시퀀싱이 등장하기 전에 많은 연구자들은 벌크 조직 분석을 사용하여 세포 전체에 걸쳐 평균화된 전사체만 분석할 수 있었습니다. 특히, single-cell 및 sNuc-Seq는 각각 단일 세포 또는 단일 핵의 전사체를 분리하는 것을 가능하게 하였다32. 이 경우, 단일핵 전사체는 방추 세포(30) 뿐만 아니라 변연, 중간 및 기저 세포에 대해 확인될 수 있다. 이를 통해 SV 세포 유형 간의 전사 이질성을 조사할 수 있으며, 향후 EP의 생성 및 유지를 포함하여 SV 기능에 대한 이러한 세포 유형의 기여도를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. sNuc-Seq를 사용하여 생성된 데이터 세트는 전체 전사 차이에 대한 이해를 용이하게 하고 UMAP 플롯을 사용하여 다양한 세포 집단을 비교하기 위해 차원적으로 축소된 방식으로 표시할 수 있습니다 그림 4. sNuc-Seq 데이터 세트의 해석을 위해 생물정보학 분석을 수행하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 여기에는 차등 발현 분석(differential expression analysis), 단세포 조절 네트워크 추론 및 클러스터링(single-cell regulatory network inference and clustering, SCENIC), 히트맵 또는 그린 바이올린 플롯 구성(heatmap or grin violin plot construction), 레귤론 분석(regulon analysis)이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다18. 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 추가 계산 분석 기술은 sNuc-Seq와 유사하며 Hwang et al.32, Shafer 33 및 Chen et al.34의 리뷰에서 더 자세히 논의됩니다.
이 해부 기술의 또 다른 주요 응용 분야는 SV 내에서 선택된 구조를 더 잘 연구하기 위한 면역염색입니다. 공초점 현미경을 사용하여 이미지화한 SV 전체 마운트의 설정에서 이를 관찰할 수 있습니다(그림 3). 모든 세포의 핵은 DAPI 라벨링으로 시각화됩니다. 모세혈관은 빨간색으로 GS-IB4를 사용한 내피 세포 염색을 통해 볼 수 있습니다. 이 경우 중간 세포는 ZsGreen을 발현하기 위해 중간 세포 특이적 프로모터를 사용하여 유전적으로 변형되었습니다.
sNuc-Seq의 한계에는 (1) 공간 정보 부족, (2) 면역 세포 집단에 대한 편향, (3) 세포질 RNA의 배제가 포함됩니다. 공간 전사체 기술은 조직 내의 세포 하위집단에 대한 보다 구체적인 정보를 제공할 수 있다35. 조직 해리 및 보관과 같은 sNuc-Seq와 단일 세포 RNA 시퀀싱 간의 프로토콜 차이를 감안할 때, sNuc-Seq 생성 전사 프로파일은 면역 세포에 대해 편향될 수 있지만 부착된 세포 유형을 특성화하는 데 더 강력할 수 있습니다36. 또한 단일 세포 RNA 시퀀싱에는 미토콘드리아 RNA와 같은 세포질 RNA가 포함되지만 sNuc-Seq는 포함되지 않습니다. 두 방법 간의 이러한 전사 차이에도 불구하고, 대체로 sNuc-Seq는 전체 단일 세포 RNA 시퀀싱37, 특히 SV30과 유사한 전사 프로파일을 갖는다는 것이 입증되었습니다.
성공적인 미세 해부를 위해서는 알아야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 처음 몇 단계에서는 밑에 있는 달팽이관이 부서지는 것을 방지하기 위해 내이를 적절하게 추출해야 합니다. 적절한 측두골 추출의 관찰은 도 2A에 나타내었다. 달팽이관이 제대로 노출되면 달팽이관 뼈를 부드럽게 긁고 부러뜨려 밑에 있는 외벽과 SV가 노출되도록 주의해야 합니다. 측면 벽과 SV가 성공적으로 추출되면 사용자는 측면 벽에서 SV를 조심스럽게 분리해야 합니다. 깨지기 쉬운 SV의 손상을 방지하면서 측면 벽에서 SV를 들어 올리기 위해 올바른 평면에 충분한 힘을 가해야 합니다. SV 미세 해부의 경우 "달팽이관에서 SV를 해부하는 것"보다는 "SV에서 다른 구조를 해부하는 것"을 생각하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 다양한 연령의 마우스와 쥐와 같은 다양한 포유류 종에 대해 수정될 수 있습니다. 어린 생쥐의 경우 조직의 질감이 다르고 일반적으로 구조가 더 작아집니다. 다른 포유류 종의 경우 달팽이관 해부학은 비교적 유사하며 동물의 크기가 차이의 대부분을 결정합니다.
일반적으로, 이 프로토콜의 단점은 다른 달팽이관 미세해부 기법과 유사하다38. 섬세한 SV를 분리하는 것은 기술적으로 어려울 수 있으며 더 작은 조각으로 나눌 수 있습니다.
이 기술은 이 프로토콜로 인해 종종 손상되기 때문에 전체 장착을 위해 Corti 기관을 저장하는 데 최적이 아닙니다. 전체 장착 및 면역염색을 위해 Corti의 장기를 보존하기 위한 다른 해부 기법이 존재하지만38, 조직 고정 및 석회질 제거 설정이 아니라 RNA 분해를 피하기 위해 sNuc-Seq를 새로운 샘플로 수행해야 한다는 점을 고려하면 이러한 기술에는 고유한 단점이 있습니다.
시간과 반복을 통해 사용자는 이 SV 미세 해부 프로토콜에 더 익숙해질 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램, NIDCD에서 MH까지 부분적으로 지원되었습니다 (DC000088)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50010-01 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 18 x 18 mm cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | Cover slip to mount SV |
| 30-µm filter (Polyethylenterephthalat) | PluriSelect | #43-50030-03 | Filter tissue during sNuc-Seq |
| 75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide | Daigger | EF15978Z | Microslide to mount SV on |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:000664 | General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV. |
| Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Used for cell counting |
| Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm | Biomedical Research Instruments | 15-1020 | Used to transfer SV |
| Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1 | Chromium | PN-1000141 | Generates single cell 3' gene expression libraries |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Used for sealing SV mount |
| Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well | Corning | 08-772B | Culture dish used to hold specimen during dissection |
| DAPI | Invitrogen | D1306, RRID: AB_2629482 | Stain used for nucleus labeling |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D8938 | Used to homogenize tissue for sNuc-seq |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | General forceps for dissection |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Glue stick | Fisher Scientific | NC0691392 | Used for mounting SV |
| GS-IB4 Antibody | Molecular Probes | I21411, RRID: AB-2314662 | Antibody used for capillary labeling |
| KCNJ10-ZsGreen Mice | n/a | n/a | Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV. |
| MgCl2 | ThermoFisher | AM9530G | Used for steps of sNuc-Seq |
| Mounting reagent | ThermoFisher | #S36940 | Mounting reagent for SV |
| Multiwell 24 well plate | Corning | #353047 | Plate used for immunostaining |
| NaCl | ThermoFisher | AAJ216183 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nonidet P40 | Sigma-Aldrich | 9-16-45-9 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Nuclease free water | ThermoFisher | 4387936 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Orbital shaker | Silent Shake | SYC-2102A | Used for steps of immunostaining |
| PBS | ThermoFisher | J61196.AP | Used for steps of immunostaining and dissection |
| RNA Later | Invitrogen | AM7021 | Used for preservation of SV for sNuc-Seq |
| Scizzors | Fine Science Tools | 14058-09 | Used for splitting mouse skull |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 15506017 | Used for steps of sNuc-Seq |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250061 | Used for cell counting |
| Tween20 | ThermoFisher | AAJ20605AP | Used for steps of sNuc-Seq |
| Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope | Zeiss | n/a | Microscope used for dissections |
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