Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65265
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 2, 2
1Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 2Department of Diabetes and Metabolic Diseases, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3The University of Tokyo Excellent Young Researcher Program, The University of Tokyo

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.

Abstract

המחקר במבחנה של התמיינות אדיפוציט לבן, חום ובז' מאפשר לחקור פונקציות אוטונומיות תאיות של אדיפוציטים ומנגנוניהם. קווי תאים קדם-אדיפוציטיים לבנים אימורטליים זמינים לציבור ונמצאים בשימוש נרחב. עם זאת, הופעתם של אדיפוציטים בצבע בז' ברקמת השומן הלבן בתגובה לרמזים חיצוניים קשה לשחזר את מלוא ההיקף באמצעות קווי תאי אדיפוציט לבנים הזמינים לציבור. בידוד של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת שומן מורין מבוצע בדרך כלל כדי להשיג preadipocytes ראשוני ולבצע התמיינות אדיפוציט. עם זאת, טחינה ועיכול collagenase של רקמת שומן ביד יכול לגרום לשינויים ניסיוניים נוטה לזיהום. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חצי אוטומטי שונה המשתמש בדיסוציאטור רקמות לעיכול collagenase כדי להשיג בידוד קל יותר של SVF, במטרה להפחית את השונות הניסיונית, להפחית את הזיהום ולהגדיל את יכולת השחזור. ניתן להשתמש בפראדיפוציטים המתקבלים ובאדיפוציטים מובחנים לניתוחים פונקציונליים ומכניסטיים.

Introduction

ביולוגיה של רקמת השומן מושכת תשומת לב הולכת וגוברת בגלל השכיחות הגוברת של השמנת יתר וסוכרת מסוג 2 ברחבי העולם1. אדיפוציטים מאחסנים אנרגיה עודפת בצורה של טיפות שומנים, אשר משתחררים עם רעב. יתר על כן, רקמת השומן שומרת על הומאוסטזיס אנרגיה מערכתית על ידי משמש כאיבר אנדוקריני ותקשורת עם רקמות אחרות 2,3. באופן מסקרן, גם עודף רקמת שומן (השמנת יתר) וגם אובדן שומן (ליפודיסטרופיה) קשורים לתנגודת לאינסולין ולסוכרת1. אדיפוציטים מחולקים לשלושה סוגים: לבן, חום ובז'1. אדיפוציטים לבנים מאחסנים בעיקר אנרגיה עודפת כשומנים, בעוד שאדיפוציטים חומים ובז' מפזרים אנרגיה בצורה של חום באמצעות חלבון פירוק צימוד מיטוכונדריאלי-1 (Ucp1)1,4. יש לציין כי אדיפוציטים בצבע בז' (המכונים גם אדיפוציטים חומים "מושרים") מופיעים ברקמת השומן הלבנה בתגובה לגירוי קר או סימפתטי ומציגים דפוסי ביטוי גנים החופפים אך נבדלים מאלה של אדיפוציטים חומים "קלאסיים"5. לאחרונה, אדיפוציטים חומים ובז' נחזו כמטרות פוטנציאליות לטיפולים נגד השמנת יתר ונגד סוכרת שמטרתם "לשפר את פיזור האנרגיה" במקום "לדכא את צריכת האנרגיה"4. באופן תומך, אלל הסיכון של וריאנט ההשמנה FTO rs1421085 בבני אדם, אשר מציג את הקשר החזק ביותר עם מדד מסת גוף גבוה יותר (BMI) בקרב וריאנטים נפוצים 6,7 ומציג אינטראקציות גנטיות-סביבתיות שונות 8,9, מדווח לווסת באופן שלילי התמיינות ותפקוד אדיפוציט בז '10. Peroxisome proliferator-activated receptor-active receptor γ (PPARγ) ידוע כמווסת שעתוק ראשי של אדיפוגנזה והוא הכרחי ומספיק להתמיינות אדיפוציטים11. וסתי שעתוק, כגון PRD1-BF1-RIZ1 תחום הומולוגי המכיל 16 (PRDM16), גורם תא B מוקדם 2 (EBF2) וגורם גרעיני I-A (NFIA), חיוניים להתמיינות ותפקוד אדיפוציט חום ובז' 12,13,14,15,16,17,18. מצד שני, תכנות גנים של אדיפוציט לבן דורש מווסתי שעתוק, כגון חלבון משפר דמוי מתמר 3 (TLE3) וחלבון אצבע אבץ 423 (ZFP423)19,20,21.

מערכות מודל במבחנה מאפשרות לבצע מחקרים מולקולריים שמטרתם לשפר את ההבנה של המנגנונים העומדים בבסיס התפקודים והתפקוד הלקוי של אדיפוציטים. למרות שקווי תאים קדם-אדיפוציטיים זמינים לציבור ואימורטליים כגון 3T3-L1 ו- 3T3-F442A קיימים22,23,24, התרבית של קדם-אדיפוציטים ראשוניים והתמיינות לאדיפוציטים תהיה מודל מתאים יותר לחקר אדיפוגנזה in vivo. בידוד של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת שומן murine היא שיטה ידועה להשגת preadipocytes ראשוני25,26. עם זאת, עיכול collagenase של רקמת שומן, אשר מבוצע בדרך כלל באמצעות שייקר חיידקי עם מדף צינור, יכול לגרום לשונות ניסיונית והוא נוטה לזיהום27,28. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול חלופי המשתמש בדיסוצייאטור רקמה עדין המופעל על ידי מגנטית (MACS) לעיכול collagenase כדי להשיג בידוד קל יותר של SVF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת טוקיו ובוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות של אוניברסיטת טוקיו.

1. הכנת תמיסת אנזים ומדיום

  1. שים את שני הצדדים של רקמת שומן לבן מפשעתי (צד ימין וצד שמאל, כ 150 מ"ג) מעכבר בן 7-8 שבועות ו 2.5 מ"ל של תמיסת אנזים לתוך צינור C של dissociator.
  2. Reformed Enzyme D עם 3 מ"ל של מדיום הנשר המעובד (DMEM)/F12 של Dulbecco ללא נסיוב בקר עוברי (FBS) או אנטיביוטיקה, אנזים R עם 2.7 מ"ל של DMEM/F12 ללא FBS או אנטיביוטיקה, ואנזים A עם 1 מ"ל של חיץ A.
  3. הכן 2.5 מ"ל של תמיסת אנזים על ידי הוספת 100 μL של אנזים D, 50 μL של אנזים R, 12.5 μL של אנזים A, ו 2.35 מ"ל של DMEM/F12 ללא FBS או אנטיביוטיקה לתוך צינור C. הגדר צינור C עם תמיסת אנזים על קרח.

2. בידוד רקמת השומן

  1. הרדימו עכברי C57BL/6J זכרים בני 7-8 שבועות (כ-20 גרם) על ידי פריקת צוואר הרחם.
  2. בספסל נקי, כדי לבודד רקמת שומן לבנה מפשעתית, חותכים את העור במספריים קהים/חדים בבטן ולכיוון הגפיים התחתונות. בודדו את רקמת השומן מתוך הירכיים באמצעות מספריים חדים/חדים. צד אחד של רקמת השומן המפשעתית שוקל ~ 75 מ"ג.
  3. הכניסו את רקמת השומן המבודדת לצינור C עם תמיסת אנזים על קרח, ושמרו את הצינור בתוך הספסל הנקי כדי לשמור על סטריליות.

3. טחינה ועיכול של רקמת שומן

  1. בספסל הנקי, הוסף 2.5 מ"ל של תמיסת אנזים לצינור C.
  2. טוחנים את רקמת השומן לחתיכות קטנות על ידי חיתוך במספריים חדים/חדים 50 פעמים. חותכים את רקמת השומן ל~ 2 מ"מ2 חתיכות.
  3. סגור היטב את המכסה של צינור C, להפוך את הצינור הפוך, ולחבר אותו לשרוול של dissociator רקמות עם הכובע על. לאחר מכן, לעכל את הדגימה במשך ~ 40 דקות ב 37 ° C.
    הערה: מחקר זה השתמש ב- gentleMACS Octo Dissociator with Heaters (Miltenyi Biotec 130-096-427), והתוכנית המותקנת מראש "37C_mr_ATDK_1" הייתה במעקב.

4. סינון של השעיית תאים

  1. DMEM/F12 טרום חם המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין עד 37°C.
  2. יש לנתק את צינור C ממפיץ הרקמה ולעצור את העיכול על ידי הוספת 5 מ"ל DMEM/F12 המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין ופיפטומיצין בעדינות ארבע פעמים.
  3. צנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 10 דקות ב 20 ° C.
  4. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא.
  5. יש להשהות מחדש את הגלולה על ידי הוספת 10 מ"ל DMEM/F12 המכילים 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין ופיפטומיצין בעדינות חמש פעמים.
  6. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים בקוטר 70 מיקרומטר המונחת על צינור חדש של 50 מ"ל.
  7. צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות להשעות מחדש את הגלולה ב 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS).

5. ציפוי תאים

  1. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות.
  2. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה על ידי הוספת 10 מ"ל של DMEM/F12 המכיל 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו pipetting עשר פעמים.
  3. מניחים את תרחיף התאים על צלחת מצופה קולגן בקוטר 10 ס"מ ומניחים את הכלים באינקובטור תרבית תאים (37°C, 5% CO 2) למשך1-2 שעות.
    הערה: מנות מצופות קולגן אינן נדרשות לחלוטין. עם זאת, בהתבסס על ניסיון, מנות מצופות קולגן אכן עוזרות להידבקות של preadipocytes ובכך להגדיל את הישרדות התאים.
  4. שואפים את המדיום ושוטפים את התאים פעמיים עם 3 מ"ל PBS לכל שטיפה.
  5. מוסיפים 10 מ"ל DMEM/F12 המכילים 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין ומחזירים את הכלים לאינקובטור תרבית התאים (37°C, 5% CO2).

6. מעבר של preadipocytes

  1. למחרת, שאפו את התווך (התאים יהיו דבוקים, וכך ניתן לשאוף את המדיום), שטפו את התאים פעמיים עם 3 מ"ל PBS בכל שטיפה, והוסיפו 10 מ"ל DMEM/F12 המכילים 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80% (בדרך כלל 4 ימים לאחר בידוד SVF), פצלו את התאים לארבע מנות מצופות קולגן בקוטר 10 ס"מ.
    1. באופן ספציפי, שאפו את המדיום, שטפו את התאים עם PBS (טמפרטורת החדר [RT]), הוסיפו 1 מ"ל של 0.05% טריפסין שחומם מראש, ודגרו במשך 5 דקות באינקובטור תרבית התא.
    2. הוסף 10 מ"ל של DMEM/F12 המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין כדי להרוות את פעילות הטריפסין. לאחר פיפט, צנטריפוגה ב 440 x גרם במשך 5 דקות.
    3. שאפו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים על ידי הוספת 40 מ"ל DMEM/F12 המכילים 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין, והכניסו את התאים לארבע מנות מצופות קולגן בקוטר 10 ס"מ.
  3. עברו שוב את התאים כשהם מגיעים למפגש של 80%.

7. הכנת רטרווירוס המבטא אנטיגן SV40 גדול T להנצחת פרדיפוציטים (אופציונלי)

  1. לפחות 3 ימים לפני ההנצחה, צלחת פלטינה-E (Plat-E) אריזת תאים29 בצפיפות של 3.0 x 105 תאים / מ"ל ב 2 מ"ל של DMEM עם 10% FBS ללא אנטיביוטיקה. השתמש hemacytometer כדי לספור את התאים.
  2. למחרת, transfect 4 מיקרוגרם של pBABE-neo largeTcDNA (להוסיף פלסמיד גן #1780) באמצעות Lipofectamine 2000, על פי הוראות היצרן.
  3. לאחר 24 שעות, לשאוף את המדיום ולהוסיף 2 מ"ל של DMEM עם 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  4. למחרת, קצרו את הסופרנטנט הרטרו-ויראלי. רטרווירוס יכול לשמש להנצחה מיידית או מאוחסן ב -80 ° C.

8. הנצחה של preadipocytes עם אנטיגן T גדול SV40 (אופציונלי)

  1. יש לעבור ולהרחיב את הפראדיפוציטים פעמיים לאחר בידוד SVF.
  2. לוחית את התאים בצלחות 6 בארות בצפיפות של 0.5-1.0 x 104 תאים/מ"ל ב-2 מ"ל DMEM/F12 עם 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. השתמש hemacytometer כדי לספור את התאים.
  3. למחרת, הכינו 250 μL של רטרו-וירוס טרי או מופשר המבטא אנטיגן SV40 גדול T לכל באר של צלחות 6 בארות. צנטריפוגה ב 440 x גרם במשך 5 דקות ומניחים את supernatant בתוך צינור חדש.
  4. הוסף 750 μL של DMEM/F12 המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-1 μL של פוליברן לכל 250 μL של סופרנאטנט רטרו-ויראלי כדי ליצור את וירוס העבודה.
  5. שאפו את המדיום והוסיפו 1,000 מיקרוליטר של רטרו-וירוס עובד לכל באר המכילה פרדיפוציטים.
  6. הוסף 1 מ"ל DMEM/F12 עם 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין 4 שעות מאוחר יותר.
  7. למחרת, להפריד את preadipocytes נגוע לתוך צלחת 10 ס"מ ובחר את התאים הנגועים עם DMEM/F12 המכיל 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 500 מיקרוגרם / מ"ל neomycin. כדי לפקח על בחירת אנטיביוטיקה, להכין צלחת של תאים נגועים עם neomycin.
  8. המשך להעביר את התאים הנגועים עם נאומיצין עד שכל התאים הלא נגועים בצלחת הצג מתים.

9. הבחנה אדיפוציט

  1. צלחת את התאים. עבור לוחות 12 בארות, צלחת התאים בצפיפות של 4.0 x 104 תאים/מ"ל ב 1 מ"ל של DMEM/F12 המכיל 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. כאשר הפרדיפוציטים מתמזגים (48-72 שעות לאחר הציפוי), שואפים את התווך ומחליפים אותו בתווך התמיינות (ראו טבלה 1 להרכב).
  3. ביום השני של הדיפרנציאציה (כלומר, 48 שעות לאחר גרימת ההבחנה), החלף את המדיום בתווך תחזוקה (ראה טבלה 1 להרכב). לאחר מכן, החליפו את אמצעי התחזוקה כל יומיים. בידול מסוף מושג ביום 7 של בידול.
  4. שמן אדום o כתמים
    1. עבור שמן אדום o צביעה, לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS לכל באר. תקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 4% פורמלדהיד לכל באר, ודגר על התאים במשך 15 דקות ב- RT.
    2. במהלך הדגירה, יש לדלל את תמיסת 0.5% שמן אדום o (באיזופרופיל אלכוהול) ל-0.3% באמצעות ddH2O ולסנן את פתרון העבודה באמצעות נייר סינון.
    3. לאחר 15 דקות הדגירה, להסיר את פורמלדהיד, לשטוף את התאים עם 60% אלכוהול איזופרופיל, להוסיף 1 מ"ל של שמן מסונן אדום o פתרון עבודה, לדגור במשך 1 שעה ב RT.
    4. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם מים זורמים. לאחר מכן, צפו באדיפוציטים עמוסי שומנים תחת מיקרוסקופ הפוך (הגדלה: 20x אובייקטיבי ו-10x עינית).
  5. ניתוח ביטוי mRNA
    הערה: עיין בטבלה 2 לרשימת הפריימרים שבהם נעשה שימוש במחקר זה.
    1. שואפים את המדיום ומוסיפים 1 מ"ל/באר של טריזול לבאר.
    2. לדגור במשך 15 דקות ב RT, לנתק את התאים על ידי pipetting, ולאסוף את הדגימות בצינורות 1.5 מ"ל. ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד למיצוי RNA.
    3. הפשירו את הדגימה הקפואה ל-RT, הוסיפו 200 מיקרוליטר כלורופורם לדגימה, ונערו במרץ במשך 15 שניות.
    4. דגרו על הדגימה ב-RT למשך 3 דקות ולאחר מכן סובבו ב-20,000 x גרם במשך 15 דקות ב-4°C.
    5. בזהירות להסיר את השלב המימי (העליון, חסר צבע) ולהעביר צינורות חדשים. לעולם אל תעביר את שלב החלבון (אמצעי, לבן) או את שלב הפנול/כלורופורם (למטה, ורוד).
    6. הוסיפו באיטיות נפח שווה של 70% EtOH וערבבו בעדינות. אין לערבל.
    7. טען את הדגימה (עד 700 μL) לתוך עמוד ספין RNA יושב בתוך צינור איסוף. הקפד לכלול כל משקע שאולי נוצר.
    8. סובב ב- 9,000 x גרם במשך 30 שניות ב- 4 ° C , ולאחר מכן מחק את הזרימה.
    9. הוסף 700 μL של חיץ RW1, סובב ב- 9,000 x גרם למשך 30 שניות ב- 4 ° C ולאחר מכן מחק את הזרימה.
    10. מעבירים את העמוד לצינור איסוף חדש ומוסיפים 500 μL של RPE חיץ.
    11. סובב ב- 9,000 x גרם במשך 30 שניות ב- 4 ° C ולאחר מכן מחק את הזרימה.
    12. הוסף 500 μL של RPE חיץ, סובב ב- 9,000 x גרם למשך 2 דקות ב- 4 ° C ולאחר מכן מחק את הזרימה.
    13. העבר את העמודה לצינור איסוף חדש, וסחרור (עמודות ללא חיץ) ב- 9,000 x גרם למשך 1-2 דקות ב- 4 ° C.
    14. העבירו את העמוד לצינור איסוף חדש של 1.5 מ"ל והוסיפו 30 μL של מים נטולי RNase ישירות לקרום העמודה.
    15. דגרו על הדגימה ב-RT למשך 1-2 דקות. לאחר מכן, סובב ב 9,000 x גרם במשך דקה אחת ב 4 ° C כדי לנטרל את RNA.
    16. בדוק את ריכוז ה- RNA באמצעות פלואורוספקטרומטר.
      הערה: מומלץ ליישר את הריכוז כאן.
    17. בצע שעתוק הפוך באמצעות ~ 200 ng של תבנית RNA. השתמש בערכת תגובת שרשרת פולימראז כמותית מסחרית בזמן אמת (qPCR-RT) ופעל לפי פרוטוקול היצרן. לאחר התגובה, לדלל את cDNA 20 פעמים עד 200 μL.
    18. הוסף 2.0 μL של cDNA, 3.0 μL של Power Sybr Green Master Mix, 0.018 μL של פריימר קדמי qPCR של 100 μM qPCR, 0.018 μL של פריימר הפוך qPCR של 100 μM qPCR, ו- 0.96 μL של ddH2O לכל באר של צלחת 384 באר.
    19. הפעלת qPCR (שלב החזקה: 50°C למשך 2 דקות ו-95°C למשך 2 דקות; שלב PCR: 40 מחזורים של 95 ° C עבור 15 s ו 60 ° C במשך 1 דקה; שלב עקומת ההתכה: 95°C למשך 15 שניות, 60°C למשך דקה אחת ו-95°C למשך 15 שניות). השתמש בשיטת העקומה הסטנדרטית לכימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מניב אדיפוציטים ממוינים לחלוטין ועמוסי שומנים 7 ימים לאחר גרימת התמיינות האדיפוציטים. ניתן להעריך את מידת התמיינות האדיפוציט על-ידי צביעת שמן אדום o של טריגליצרידים ושומנים (איור 1A), או ניתוח ביטוי mRNA באמצעות qPCR-RT של גנים אדיפוציטים, כגון הרגולטור הראשי של אדיפוגנזה Pparg והמטרה שלו Fabp4 (איור 1B). כדי לגרום להתמיינות אדיפוציט בז 'במבחנה, מחלקה thiazolidinediones של אגוניסט PPARγ, כגון rosiglitazone, ניתן להשתמש. ואכן, בניסויים עם רוזיגליטזון, אנו רואים השפעה תלוית מינון של ריכוזים של עד 1 מיקרומטר על רמות הביטוי של גנים ספציפיים לשומן חום, כגון Ucp1 ו- Ppargc1a. מצד שני, ההשפעה של רוזיגליטזון על Fabp4 רוויה בריכוז של 0.1 מיקרומטר (איור 1C).

אדיפוציטים מובחנים המתקבלים על-ידי פרוטוקול זה יכולים לשמש לניתוחים פונקציונליים ומכניסטיים שונים, כגון ניתוח קצב צריכת חמצן (OCR)16,30 (איור 2A) ומשקעים חיסוניים של כרומטין 31 (ChIP; איור 2B). ניתן לאחסן פרדיפוציטים אימורטליים במערכת אחסון תאי חנקן נוזליים ללא אובדן כדאיות וניתן להפשיר אותם בכל עת לשימוש בניסויים.

Figure 1
איור 1: התמיינות של קדם-אדיפוציטים לאדיפוציטים עמוסי שומנים. (A) SVFs מרקמת שומן לבנה מפשעתית (iWAT) של עכברי בר הוכתמו בשמן אדום O ביום 0 או 7 של התמיינות האדיפוציטים. (B) רמות ביטוי mRNA של Pparg ו-Fabp4 ביום 0 וביום 7 של התמיינות אדיפוציטים (ממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע [S.E.M.]; N = 3). (C) ביטוי mRNA של סמן האדיפוציט הכללי Fabp4 והגנים הספציפיים לשומן חום Ucp1 ו-Ppargc1a באדיפוציטים שמקורם ב-SVF שטופלו ברוזיגליטזון 0.1, 0.2, 0.5 ו-1.0 מיקרומטר, יחד עם מדיום ההתמיינות והתחזוקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דוגמאות לניתוחים פונקציונליים ומכניסטיים עם אדיפוציטים מובחנים. (A) ניתוח OCR של אדיפוציטים שמקורם ב-iWAT SVF (N = 10). (B) ChIP-qPCR עבור H3K27Ac באדיפוציטים הנגזרים מ-Nfia flox/flox iWAT SVF ביום 0 ו-7 להתמיינות. אתר Ins-0.4 kb ו- Fabp4-13 kb מוצגים כאתרי רקע (ממוצע ±- S.E.M.; N = 2). עבור שני הניסויים, 1.0 מיקרומטר rosiglitazone נוסף יחד עם אמצעי התמיינות ותחזוקה כדי לגרום התמיינות אדיפוציט בז '. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב אמצעי בידול ותחזוקה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: רשימת הפריימרים ששימשו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, תיארנו פרוטוקול לבידוד של SVF מרקמת שומן מורין כדי לקבל preadipocytes ולבצע התמיינות אדיפוציט במבחנה. השימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז הפחית את השונות הניסיונית, הפחית את הסיכון לזיהום והגדיל את יכולת הרבייה. בעוד הליך זה הוא שלב קריטי בתוך הפרוטוקול המוצג, התהליך הוא אוטומטי מאוד אופטימיזציה אין צורך. עם זאת, בהתאם לגיל העכבר ולמחסן רקמת השומן, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה של טחינה, למשל חתיכות בגודל או זמן חיתוך.

SVF ידוע כאוכלוסייה הטרוגנית המורכבת מפראדיפוציטים, תאי חיסון כגון מקרופאגים, תאי אנדותל ותאים אחרים. מכיוון שהפרדיפוציטים נצמדים לצלחות תרבית ועמידים לשטיפה ולשינויים בינוניים, הם מועשרים באוכלוסיית התאים במהלך המעברים. עם זאת, סביר להניח כי "preadipocytes" המתקבל על ידי פרוטוקול זה הם עדיין הטרוגניים. מיון תאים המופעלים על ידי פלורסנט (FACS) באמצעות נוגדנים כנגד סמנים פני השטח שדווחו בעבר של קדם-אדיפוציטים כגון PDGFRα32 יידרש כדי להשיג אוכלוסיית קדם-אדיפוציט טהורה יותר.

לסיכום, תיארנו כאן פרוטוקול לבידוד SVF באמצעות דיסוצייאטור רקמות לעיכול קולגן. פרוטוקול זה מציע בידוד קל יותר של SVF בהשוואה לפרוטוקול הקונבנציונלי באמצעות שייקר חיידקי עם מדף צינורות, ומספק שונות ניסיונית מופחתת, זיהום מופחת ויכולת שחזור מוגברת16,17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לאף אחד מהמחברים אין אינטרס כלכלי מתחרה הקשור לעבודה זו.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לטקאהיטו ואדה ולסייקו יושידה (אוניברסיטת טוקיו, טוקיו, יפן) על עזרתם בניסוי. עבודה זו מומנה על ידי המענקים הבאים לי.ה.: מענק מחקר מתוכנית החוקרים הצעירים המצטיינים של אוניברסיטת טוקיו; האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) KAKENHI מענק סיוע למדענים בתחילת דרכם, מענק מספר 19K17976; מענק ל-Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) מהקרן היפנית לאנזימולוגיה יישומית, מענק מספר 17F005; מענק מהקרן למחקר פרמקולוגי; מענק מקרן הזיכרון Mochida למחקר רפואי ופרמצבטי; מענק מקרן MSD למדעי החיים; מענק מקרן Daiwa Securities Health; מענק מקרן המחקר הביוכימי של טוקיו; מענק מחקר במדעי החיים מקרן טקדה למדע; ומענק מקרן המחקר הרפואי SENSHIN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm dish Corning 430167
12 well plate Corning 3513
60 mm dish IWAKI 3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat Miltenyi Biotec 130-105-808 contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm BD falcon #352350
Collagen coated dishes, 100 mm BD #356450
Collagen coated dishes, 60 mm BD #354401
Collagen I Coat Microplate 6 well IWAKI 4810-010
Dexamethasone Wako 041-18861
Dissecting Forceps N/A N/A autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp N/A N/A autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp N/A N/A autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco 10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS) N/A N/A
gentleMACS C Tubes Milteny Biotec 130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Humulin R Injection U-100 Eli Lilly 872492
Indomethacin Sigma I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX) Sigma 17018-1G
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019
Neomycin Sulfate Fujifilm 146-08871 
Opti-MEM Invitrogen  31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40) Add gene #1780
PBS tablets Takara T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line cell biolab RV-101
Polybrene Nacalai Tesque 12996-81
Power Sybr Green Master Mix Applied Biosystems 4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO #FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250) QIAGEN 74106
Rosiglitazone Wako 180-02653
T3 Sigma T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%) Gibco 25200-056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
  3. Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
  4. Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
  5. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  6. Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
  7. Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
  8. Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
  9. Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
  10. Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
  11. Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
  12. Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
  13. Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
  14. Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
  15. Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
  16. Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
  17. Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
  18. Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
  19. Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
  20. Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
  21. Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
  22. Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
  23. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  24. Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
  25. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  26. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
  27. Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
  28. Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
  29. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
  30. Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
  31. Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
  32. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).

Tags

ביולוגיה גיליון 195
בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saito, K., Hiraike, Y., Oguchi, M.,… More

Saito, K., Hiraike, Y., Oguchi, M., Yamauchi, T. Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator. J. Vis. Exp. (195), e65265, doi:10.3791/65265 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter