Summary
Этот протокол описывает полуавтоматическое выделение стромально-васкулярной фракции (SVF) из жировой ткани мыши для получения преадипоцитов и достижения дифференцировки адипоцитов in vitro. Использование тканевого диссоциатора для расщепления коллагеназы уменьшает экспериментальную изменчивость и повышает воспроизводимость.
Abstract
Исследование дифференцировки белых, коричневых и бежевых адипоцитов in vitro позволяет исследовать клеточно-автономные функции адипоцитов и их механизмы. Иммортализированные белые клеточные линии преадипоцитов находятся в открытом доступе и широко используются. Тем не менее, появление бежевых адипоцитов в белой жировой ткани в ответ на внешние сигналы трудно повторить в полной мере с использованием общедоступных клеточных линий белых адипоцитов. Выделение стромально-васкулярной фракции (SVF) из жировой ткани мыши обычно выполняется для получения первичных преадипоцитов и дифференцировки адипоцитов. Однако измельчение и переваривание жировой ткани коллагеназой вручную может привести к экспериментальным изменениям и подвержено загрязнению. Здесь мы представляем модифицированный полуавтоматический протокол, в котором используется тканевый диссоциатор для расщепления коллагеназы для достижения более легкой изоляции SVF с целью уменьшения экспериментальных вариаций, уменьшения загрязнения и повышения воспроизводимости. Полученные преадипоциты и дифференцированные адипоциты могут быть использованы для функционального и механистического анализа.
Introduction
Биология жировой ткани привлекает все большее внимание из-за растущей распространенности ожирения и диабета 2 типа во всем мире1. Адипоциты хранят избыточную энергию в виде липидных капель, которые высвобождаются при голодании. Кроме того, жировая ткань поддерживает системный энергетический гомеостаз, выступая в качестве эндокринного органа и сообщаясь с другими тканями 2,3. Интересно, что как избыток жировой ткани (ожирение), так и потеря жира (липодистрофия) связаны с резистентностью к инсулину и диабетом1. Адипоциты делятся на три типа: белые, коричневые и бежевые1. Белые адипоциты в основном хранят избыточную энергию в виде липидов, тогда как коричневые и бежевые адипоциты рассеивают энергию в виде тепла через митохондриальный разъединяющий белок-1 (Ucp1)1,4. Примечательно, что бежевые адипоциты (также называемые «индуцируемыми» коричневыми адипоцитами) появляются в белой жировой ткани в ответ на холодную или симпатическую стимуляцию и демонстрируют паттерны экспрессии генов, которые перекрываются, но отличаются от таковых у «классических» коричневых адипоцитов5. В последнее время коричневые и бежевые адипоциты стали потенциальными мишенями для лечения ожирения и диабета, направленного на «усиление рассеивания энергии», а не на «подавление потребления энергии»4. Кроме того, сообщается, что аллель риска варианта ожирения FTO rs1421085 у людей, который демонстрирует самую сильную связь с более высоким индексом массы тела (ИМТ) среди распространенных вариантов6,7 и демонстрирует различные взаимодействия генов и окружающей среды8,9, отрицательно регулирует дифференцировку и функцию бежевых адипоцитов10. Рецептор γ, активируемый пролифератором пероксисом (PPARγ), известен как главный транскрипционный регулятор адипогенеза и необходим и достаточен для дифференцировки адипоцитов11. Регуляторы транскрипции, такие как гомологичный домен PRD1-BF1-RIZ1, содержащий 16 (PRDM16), ранний фактор В-клеток 2 (EBF2) и ядерный фактор I-A (NFIA), имеют решающее значение для дифференцировки и функции адипоцитов коричневого и бежевого цвета 12,13,14,15,16,17,18. С другой стороны, программирование генов белых адипоцитов требует регуляторов транскрипции, таких как трансдуциноподобный энхансерный белок 3 (TLE3) и белок цинкового пальца 423 (ZFP423)19,20,21.
Модельные системы in vitro позволяют проводить молекулярные исследования, направленные на улучшение понимания механизма (механизмов), лежащего в основе функций и дисфункций адипоцитов. Хотя существуют общедоступные и иммортализированные клеточные линии преадипоцитов, такие как 3T3-L1 и 3T3-F442A22,23,24, культура первичных преадипоцитов и дифференцировка в адипоциты были бы более подходящей моделью для изучения адипогенеза in vivo. Выделение стромально-васкулярной фракции (СВФ) из жировой ткани мышей является известным методом получения первичных преадипоцитов25,26. Однако коллагеназное расщепление жировой ткани, которое обычно выполняется с помощью бактериального шейкера с трубчатой стойкой, может привести к экспериментальным изменениям и подвержено загрязнению27,28. Здесь мы описываем альтернативный протокол, в котором используется мягкий диссоциатор тканей с магнитно-активированной клеточной сортировкой (MACS) для расщепления коллагеназы для достижения более легкой изоляции SVF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Токийского университета и выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами Токийского университета.
1. Приготовление ферментного раствора и среды
- Поместите обе стороны паховой белой жировой ткани (правая и левая сторона, примерно 150 мг) от 7-8-недельной мыши и 2,5 мл раствора фермента в пробирку С диссоциатора.
- Восстановите фермент D с помощью 3 мл модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) / F12 без эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) или антибиотиков, фермент R с 2,7 мл DMEM / F12 без FBS или антибиотиков и фермент A с 1 мл буфера A.
- Приготовьте 2,5 мл раствора фермента, добавив 100 мкл фермента D, 50 мкл фермента R, 12,5 мкл фермента A и 2,35 мл DMEM/F12 без FBS или антибиотиков в пробирку C. Установите пробирку C с раствором фермента на лед.
2. Изоляция жировой ткани
- Усыпить 7-8-недельных самцов мышей C57BL/6J (примерно 20 г) при вывихе шейки матки.
- На чистой скамье, чтобы изолировать паховую белую жировую ткань, разрежьте кожу тупыми/острыми ножницами на животе и по направлению к нижним конечностям. Изолируйте жировую ткань с внутренней стороны бедер с помощью острых/острых ножниц. Одна сторона паховой жировой ткани содержит ~ 75 мг.
- Поместите изолированную жировую ткань в пробирку C с раствором фермента на льду и держите трубку в пределах чистой скамьи для поддержания стерильности.
3. Измельчение и переваривание жировой ткани
- На чистом столе добавьте 2,5 мл раствора фермента в пробирку С.
- Жировую ткань измельчить на мелкие кусочки, разрезав острыми/острыми ножницами 50 раз. Разрежьте жировую ткань на ~2 мм2 части.
- Плотно закройте колпачок трубки С, переверните трубку вверх дном и прикрепите ее к рукаву диссоциатора тканей колпачком. Затем переваривайте образец в течение ~40 минут при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовался диссоциатор gentleMACS Octo с нагревателями (Miltenyi Biotec 130-096-427) и предустановленная программа «37C_mr_ATDK_1».
4. Фильтрация клеточной суспензии
- Предварительно подогрейте DMEM/F12, содержащий 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, до 37 °C.
- Отсоедините трубку C от тканевого диссоциатора и остановите пищеварение, добавив 5 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, и осторожно пипетируя четыре раза.
- Центрифуга при 700 x g в течение 10 мин при 20 °C.
- Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу.
- Ресуспендируйте гранулу, добавив 10 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, и осторожно пипетируйте пять раз.
- Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный сетчатый фильтр диаметром 70 мкм, помещенный в новую пробирку объемом 50 мл.
- Центрифугу при 250 x g в течение 5 мин и ресуспендировать гранулу в 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
5. Обшивка ячеек
- Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу, добавив 10 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, и десять раз пипетируя.
- Поместите клеточную суспензию на 10-сантиметровую чашку, покрытую коллагеном, и поместите посуду в инкубатор клеточных культур (37 °C, 5% CO 2) на1-2 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Посуда с коллагеновым покрытием не является абсолютной необходимостью. Однако, основываясь на опыте, чашки, покрытые коллагеном, действительно помогают прилипать к преадипоцитам и, таким образом, увеличивают выживаемость клеток. - Аспирируйте среду и дважды промойте клетки 3 мл PBS за стирку.
- Добавьте 10 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, и верните посуду в инкубатор клеточных культур (37 ° C, 5% CO2).
6. Пассаж преадипоцитов
- На следующий день аспирируйте среду (клетки будут адгезивными, и, таким образом, среда может быть аспирирована), дважды промойте клетки 3 мл PBS на промывку и добавьте 10 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина.
- Когда клетки достигают 80% слияния (обычно через 4 дня после выделения SVF), разделите клетки на четыре 10-сантиметровые чашки, покрытые коллагеном.
- В частности, аспирируют среду, промывают клетки PBS (комнатная температура [RT]), добавляют 1 мл предварительно подогретого 0,05% трипсина и инкубируют в течение 5 мин в инкубаторе клеточных культур.
- Добавьте 10 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, чтобы погасить активность трипсина. После пипетки центрифугу при 440 х г в течение 5 мин.
- Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клетки, добавив 40 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, и поместите клетки в четыре чашки с коллагеновым покрытием по 10 см.
- Пройдите клетки снова, когда они достигнут 80% слияния.
7. Подготовка ретровируса, экспрессирующего большой Т-антиген SV40, для иммортализации преадипоцитов (опционально)
- Не менее чем за 3 дня до иммортализации планшет Platinum-E (Plat-E) упаковываетклетки 29 плотностью 3,0 х 10,5 клеток/мл в 2 мл DMEM с 10% FBS без антибиотиков. Используйте гемацитометр для подсчета клеток.
- На следующий день трансфицируйте 4 мкг pBABE-neo largeTcDNA (добавьте ген плазмиды #1780) с использованием Lipofectamine 2000, согласно инструкциям производителя.
- Через 24 ч аспирировать среду и добавить 2 мл ДМЭМ с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином.
- На следующий день заготавливайте ретровирусную надосадочную жидкость. Ретровирус можно использовать для иммортализации сразу или хранить при -80 °C.
8. Иммортализация преадипоцитов большим Т-антигеном SV40 (опционально)
- Прохождение и расширение преадипоцитов дважды после выделения SVF.
- Планшетируют клетки в 6-луночные планшеты с плотностью 0,5-1,0 х 104 клеток/мл в 2 мл DMEM/F12 с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином. Используйте гемацитометр для подсчета клеток.
- На следующий день приготовьте 250 мкл свежего или размороженного ретровируса, экспрессирующего большой Т-антиген SV40, на лунку 6-луночных планшетов. Центрифугу при 440 x g в течение 5 мин и поместите надосадочную жидкость в новую пробирку.
- Добавьте 750 мкл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, и 1 мкл полибрена на 250 мкл ретровирусной надосадочной жидкости, чтобы сделать рабочий вирус.
- Аспирируйте среду и добавьте 1000 мкл рабочего ретровируса в каждую лунку, содержащую преадипоциты.
- Добавьте 1 мл DMEM/F12 с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином через 4 часа.
- На следующий день разделите инфицированные преадипоциты в 10-сантиметровую чашку и отберите инфицированные клетки с помощью DMEM/F12, содержащего 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина и 500 мкг/мл неомицина. Чтобы следить за подбором антибиотиков, приготовьте блюдо из неинфицированных клеток с неомицином.
- Продолжайте вводить инфицированные клетки неомицином до тех пор, пока все неинфицированные клетки в чашке монитора не умрут.
9. Дифференцировка адипоцитов
- Тарелка ячеек. Для 12-луночных планшетов планшетируют клетки с плотностью 4,0 x 104 клеток/мл в 1 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина.
- Когда преадипоциты становятся сливающимися (через 48-72 ч после нанесения покрытия), аспирируют среду и заменяют ее дифференцировочной средой (см. Таблицу 1 для состава).
- На 2-й день дифференцировки (т.е. через 48 ч после индукции дифференцировки) замените среду поддерживающей средой (состав см. в таблице 1 ). После этого меняйте среду для обслуживания каждые 2 дня. Терминальная дифференциация достигается на 7-й день дифференциации.
- Масляное красное окрашивание
- Для окрашивания в масляный красный цвет аспирируйте среду и промойте клетки 1 мл PBS на лунку. Зафиксируйте клетки, добавив 1 мл 4% формальдегида на лунку, и инкубируйте клетки в течение 15 минут при RT.
- Во время инкубации разбавляют 0,5%-ный масляный красный раствор (в изопропиловом спирте) до 0,3% с помощьюddH2Oи фильтруют рабочий раствор с помощью фильтровальной бумаги.
- После 15 мин инкубации удалить формальдегид, промыть клетки 60% изопропиловым спиртом, добавить 1 мл отфильтрованного масла красного или рабочего раствора и инкубировать в течение 1 ч при ЛТ.
- После инкубации промойте клетки проточной водой. Затем наблюдайте за липидными адипоцитами под перевернутым микроскопом (увеличение: 20-кратный объектив и 10-кратный окуляр).
- Анализ экспрессии мРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу 2 для списка праймеров, использованных в этом исследовании.- Аспирируйте среду и добавьте в лунку 1 мл/лунку тризола.
- Инкубируют в течение 15 мин при ЛТ, отделяют клетки пипеткой и собирают образцы в пробирки объемом 1,5 мл. Образцы можно хранить при -80 °C до экстракции РНК.
- Разморозьте замороженный образец до RT, добавьте в образец 200 мкл хлороформа и энергично встряхните в течение 15 с.
- Инкубируют образец при RT в течение 3 мин, а затем отжимают при 20 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
- Осторожно удалите водную фазу (верхнюю, бесцветную) и переложите в новые пробирки. Никогда не переносите белковую фазу (среднюю, белую) или фенольную/хлороформную фазу (нижнюю, розовую).
- Медленно добавьте равный объем 70% EtOH и аккуратно перемешайте. Не вихревые.
- Загрузите образец (до 700 мкл) в спиновую колонку РНК, расположенную в пробирке для сбора. Обязательно включите любой осадок, который мог образоваться.
- Отжим при 9 000 x g в течение 30 с при 4 ° C, а затем выбросьте проточку.
- Добавьте 700 мкл буфера RW1, отжимайте при 9 000 x g в течение 30 с при 4 ° C, а затем откажитесь от проточного потока.
- Перенесите колонку в новую сборную пробирку и добавьте 500 мкл буферного RPE.
- Отжим при 9 000 x g в течение 30 с при 4 °C, а затем выбросьте проточку.
- Добавьте 500 мкл буферного RPE, отжимайте при 9000 x g в течение 2 мин при 4 °C, а затем откажитесь от проточного потока.
- Перенесите колонку в новую сборную трубку и отжимайте (колонки без буфера) при 9 000 x g в течение 1-2 мин при 4 °C.
- Перенесите колонку в новую сборную пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 30 мкл воды, не содержащей РНКазы, непосредственно на мембрану колонки.
- Инкубируйте образец при ЛТ в течение 1-2 мин. Затем вращайте при 9,000 x g в течение 1 минуты при 4 ° C, чтобы разбавить РНК.
- Проверьте концентрацию РНК с помощью флуороспектрометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь рекомендуется выровнять концентрацию. - Выполните обратную транскрипцию с использованием ~ 200 нг шаблона РНК. Используйте коммерческий набор для количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР-ОТ) и следуйте протоколу производителя. После реакции разбавьте кДНК в 20 раз до 200 мкл.
- Добавьте 2,0 мкл кДНК, 3,0 мкл Power Sybr Green Master Mix, 0,018 мкл 100 мкМ прямого праймера кПЦР, 0,018 мкл обратного праймера 100 мкМ кПЦР и 0,96 мкл ddH2O в каждую лунку 384-луночного планшета.
- Запустите кПЦР (стадия выдержки: 50 ° C в течение 2 мин и 95 ° C в течение 2 мин; Стадия ПЦР: 40 циклов при 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 1 мин; стадия кривой плавления: 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 1 мин и 95 °C в течение 15 с). Используйте метод стандартной кривой для количественной оценки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол дает полностью дифференцированные, насыщенные липидами адипоциты через 7 дней после индуцирования дифференцировки адипоцитов. Степень дифференцировки адипоцитов можно оценить с помощью окрашивания триглицеридов и липидов масляным красным цветом (рис. 1А) или анализа экспрессии мРНК с использованием кПЦР-ЛТ генов адипоцитов, таких как главный регулятор адипогенеза Pparg и его мишень Fabp4 (рис. 1B). Чтобы индуцировать дифференцировку бежевых адипоцитов in vitro, можно использовать класс тиазолидиндионов агонистов PPARγ, таких как росиглитазон. Действительно, в экспериментах с росиглитазоном мы наблюдаем дозозависимое влияние концентраций до 1 мкМ на уровни экспрессии генов, специфичных для бурых жиров, таких как Ucp1 и Ppargc1a. С другой стороны, влияние росиглитазона на Fabp4 насыщено при концентрации 0,1 мкМ (рис. 1С).
Дифференцированные адипоциты, полученные по этому протоколу, могут быть использованы для различных функциональных и механистических анализов, таких как анализ скорости потребления кислорода (OCR)16,30 (рис. 2А) и иммунопреципитация хроматина 31 (ХИП; Рисунок 2В). Иммортализированные преадипоциты могут храниться в системе хранения клеток жидкого азота без потери жизнеспособности и могут быть разморожены в любое время для использования в экспериментах.
Рисунок 1: Дифференцировка преадипоцитов в липидные адипоциты. (A) SVF из паховой белой жировой ткани (iWAT) мышей дикого типа окрашивали масляным красным o на 0-й или 7-й день дифференцировки адипоцитов. (B) уровни экспрессии мРНК Pparg и Fabp4 на 0-й и 7-й день дифференцировки адипоцитов (среднее ± стандартная ошибка среднего значения [S.E.M.]; N = 3). (C) экспрессия мРНК общего маркера адипоцитов Fabp4 и специфических для бурого жира генов Ucp1 и Ppargc1a в адипоцитах, полученных из SVF, обработанных росиглитазоном 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкМ, вместе с средой для дифференцировки и поддержания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Примеры функционального и механистического анализа с дифференцированными адипоцитами. (A) OCR-анализ адипоцитов, полученных из iWAT SVF (N = 10). (B) ChIP-qPCR для H3K27Ac в адипоцитах, полученных из Nfia flox/flox iWAT SVF, на 0-й и 7-й день дифференцировки. Сайты Ins-0,4 КБ и Fabp4-13 КБ отображаются как фоновые сайты (среднее значение ± S.E.M.; N = 2). В обоих экспериментах росиглитазон добавляли 1,0 мкМ вместе с дифференцировочной и поддерживающей средой, чтобы индуцировать дифференцировку бежевых адипоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Состав дифференциации и поддерживающей среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Список праймеров, использованных в данном исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали протокол выделения SVF из жировой ткани мыши для получения преадипоцитов и выполнения дифференцировки адипоцитов in vitro. Использование тканевого диссоциатора для переваривания коллагеназы уменьшило экспериментальные вариации, снизило риск загрязнения и повысило воспроизводимость. Хотя эта процедура является критическим шагом в рамках представленного протокола, процесс высоко автоматизирован и оптимизация не требуется. Однако, в зависимости от возраста мыши и депо жировой ткани, может потребоваться оптимизация измельчения, например, размер кусочков или время нарезки.
SVF известен как гетерогенная популяция, состоящая из преадипоцитов, иммунных клеток, таких как макрофаги, эндотелиальных клеток и других клеток. Поскольку преадипоциты прилипают к культуральной посуде и устойчивы к промывке и изменениям среды, они обогащаются клеточной популяцией во время пассажа. Однако резонно предположить, что «преадипоциты», полученные по этому протоколу, все же неоднородны. Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) с использованием антител против ранее зарегистрированных поверхностных маркеров преадипоцитов, таких как PDGFRα32 , потребуется для получения более чистой популяции преадипоцитов.
Таким образом, мы описали здесь протокол выделения SVF с использованием тканевого диссоциатора для расщепления коллагеназы. Этот протокол обеспечивает более легкую изоляцию SVF по сравнению с обычным протоколом с использованием бактериального шейкера с пробирочной стойкой и обеспечивает меньшую экспериментальную вариацию, снижение загрязнения и повышенную воспроизводимость16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один из авторов не имеет конкурирующего финансового интереса, связанного с этой работой.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Такахито Вада и Сайко Йошида (Токийский университет, Токио, Япония) за экспериментальную помощь. Эта работа финансировалась за счет следующих грантов Y.H.: исследовательский грант от Программы отличных молодых исследователей Токийского университета; Грант Японского общества содействия развитию науки (JSPS) KAKENHI для начинающих ученых, грант No 19K17976; грант для Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) от Японского фонда прикладной энзимологии, грант No 17F005; грант Фонда фармакологических исследований; грант Мемориального фонда медицинских и фармацевтических исследований Мочиды; грант MSD Life Science Foundation; грант от Daiwa Securities Health Foundation; грант Токийского фонда биохимических исследований; Грант на исследования в области наук о жизни от Научного фонда Такеда; и грант Фонда медицинских исследований SENSSHIN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
