Summary
이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.
Abstract
흰색, 갈색 및 베이지색 지방세포 분화에 대한 시험관 내 연구를 통해 지방세포의 세포 자율 기능과 그 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 불멸화 된 백색 지방 전구 세포 세포주는 공개적으로 이용 가능하며 널리 사용됩니다. 그러나 외부 신호에 대한 반응으로 백색 지방 조직에서 베이지색 지방세포의 출현은 공개적으로 이용 가능한 백색 지방세포 세포주를 사용하여 완전히 재현하기 어렵습니다. 쥐 지방 조직으로부터 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리는 일반적으로 1 차 지방 전구 세포를 얻고 지방 세포 분화를 수행하기 위해 실행됩니다. 그러나 손으로 지방 조직을 다듬고 콜라게나제를 분해하면 실험적 변형이 발생할 수 있으며 오염되기 쉽습니다. 여기에서 우리는 실험 변형을 줄이고 오염을 줄이며 재현성을 높이기 위해 SVF를 더 쉽게 분리하기 위해 콜라게나제 소화를 위한 조직 해리기를 활용하는 수정된 반자동 프로토콜을 제시합니다. 얻어진 지방전구세포와 분화된 지방세포는 기능적 및 기계론적 분석에 사용할 수 있습니다.
Introduction
지방 조직 생물학은 전 세계적으로 비만과 제2형 당뇨병의 유병률이 증가함에 따라 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다1. 지방 세포는 기아 시 방출되는 지질 방울의 형태로 과도한 에너지를 저장합니다. 또한, 지방 조직은 내분비 기관으로 작용하고 다른 조직과 소통함으로써 전신 에너지 항상성을 유지한다 2,3. 흥미롭게도, 과도한 지방 조직(비만)과 지방 손실(지방이영양증)은 모두 인슐린 저항성 및 당뇨병과 관련이 있습니다1. 지방세포는 흰색, 갈색, 베이지색의 세 가지 유형으로 나뉩니다1. 백색 지방세포는 주로 과잉 에너지를 지질로 저장하는 반면, 갈색 및 베이지색 지방세포는 미토콘드리아 분리 단백질-1(Ucp1)을 통해 열의 형태로 에너지를 발산합니다.1,4. 특히, 베이지색 지방세포("유도성" 갈색 지방세포라고도 함)는 차가운 자극 또는 교감신경 자극에 반응하여 백색 지방세포에 나타나며, "고전적인" 갈색 지방세포와 겹치지만 구별되는 유전자 발현 패턴을 보인다5. 최근, 갈색 및 베이지색 지방세포는 "에너지 섭취 억제"보다는 "에너지 소산 향상"을 목표로 하는 항비만 및 항당뇨병 치료의 잠재적 표적으로 예상되었습니다4. 이를 뒷받침하는 바로는, 인간에서 FTO 비만 변이체 rs1421085의 위험 대립유전자는 일반적인 변이체 6,7 중에서 더 높은 체질량 지수(BMI)와 가장 강한 연관성을 나타내고 다양한 유전자-환경 상호작용8,9을 나타내며, 베이지색 지방세포 분화 및 기능을 음성적으로 조절하는 것으로 보고되었다10. 과산화소체 증식제 활성화 수용체 γ(PPARγ)은 지방생성의 마스터 전사 조절인자로 알려져 있으며, 지방세포 분화에 필요하고 충분하다11. 전사 조절인자, 예컨대 PRD1-BF1-RIZ1 상동 도메인 16 (PRDM16), 초기 b 세포 인자 2 (EBF2) 및 핵 인자 I-A (NFIA)는 갈색 및 베이지색 지방세포 분화 및 기능에 결정적이다 12,13,14,15,16,17,18. 반면에, 백색 지방 세포 유전자 프로그래밍은 트랜스듀신 유사 인핸서 단백질 3 (TLE3) 및 징크 핑거 단백질 423 (ZFP423) 19,20,21과 같은 전사 조절자를 필요로합니다.
체외 모델 시스템을 통해 지방 세포의 기능과 기능 장애의 기초가 되는 메커니즘에 대한 이해를 향상시키는 것을 목표로 하는 분자 연구를 수행할 수 있습니다. 3T3-L1 및 3T3-F442A와 같은 공개적으로 이용 가능하고 불멸화된 지방전구세포 세포주 가 존재하지만22,23,24, 1차 지방전구세포의 배양 및 지방세포로의 분화는 생체내 지방생성을 연구하는 데 더 적합한 모델이 될 것이다. 쥐 지방 조직으로부터 기질 혈관 분획 (SVF)을 분리하는 것은 1 차 지방 전구 세포를 얻는 잘 알려진 방법이다25,26. 그러나 일반적으로 튜브 랙이 있는 박테리아 셰이커를 사용하여 수행되는 지방 조직의 콜라게나제 분해는 실험적 변형을 초래할 수 있으며 오염되기 쉽습니다27,28. 여기에서는 SVF를 더 쉽게 분리하기 위해 콜라게나제 소화를 위해 부드러운 MACS(Magnetic-Activated Cell Sorting) 조직 해리기를 사용하는 대체 프로토콜을 설명합니다.
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Protocol
이 프로토콜에 설명된 모든 동물 실험은 도쿄 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며 도쿄 대학의 기관 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 효소액 및 배지의 제조
- 7-8주령 마우스의 사타구니 백색 지방 조직 양쪽(좌우, 약 150mg)과 효소 용액 2.5mL를 해리기의 튜브 C에 넣습니다.
- 소 태아 혈청(FBS) 또는 항생제가 없는 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)/F12 3mL, FBS 또는 항생제가 없는 DMEM/F12 2.7mL의 효소 R, 완충액 A 1mL로 효소 A를 재구성합니다.
- 효소 D 100μL, 효소 R 50μL, 효소 A 12.5μL, FBS 또는 항생제가 없는 DMEM/F12 2.35mL를 튜브 C에 넣어 효소액 2.5mL를 준비합니다.
2. 지방 조직의 분리
- 7-8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(약 20g)를 자궁경부 탈구로 안락사시킵니다.
- 깨끗한 벤치에서 사타구니 백색 지방 조직을 분리하기 위해 복부와 하지를 향해 뭉툭하고 날카로운 가위로 피부를 자릅니다. 날카롭고 날카로운 가위를 사용하여 허벅지 안쪽에서 지방 조직을 분리합니다. 사타구니 지방 조직의 한쪽은 ~75mg을 사용합니다.
- 분리된 지방 조직을 얼음 위의 효소 용액과 함께 튜브 C에 넣고 튜브를 깨끗한 벤치 내에 보관하여 무균 상태를 유지합니다.
3. 지방 조직의 다듬기 및 소화
- 클린 벤치에서 효소 용액 2.5mL를 튜브 C에 추가합니다.
- 날카롭고 날카로운 가위로 50회 절단하여 지방 조직을 작은 조각으로 다집니다. 지방 조직을 ~2mm2 개로 자릅니다.
- 튜브 C의 캡을 단단히 닫고 튜브를 거꾸로 뒤집어 캡을 씌운 상태에서 조직 해리기의 슬리브에 부착합니다. 그런 다음 37°C에서 ~40분 동안 샘플을 분해합니다.
참고: 이 연구에서는 히터가 있는 gentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec 130-096-427)를 사용했으며 사전 설치된 프로그램 "37C_mr_ATDK_1"를 따랐습니다.
4. 세포 현탁액의 여과
- 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12를 37°C로 예열합니다.
- 조직 해리기에서 튜브 C를 분리하고 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM/F12 5mL를 추가하고 부드럽게 4회 피펫팅하여 분해를 중지합니다.
- 20°C에서 10분 동안 700 x g 로 원심분리합니다.
- 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
- 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 10mL를 넣고 부드럽게 5회 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다.
- 새로운 50mL 튜브에 놓인 직경 70μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과합니다.
- 250 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁합니다.
5. 셀 도금
- 500 x g 에서 5분 동안 원심분리기.
- 상층액을 제거하고 10% FBS와 12% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F10mL를 첨가하고 10회 피펫팅하여 펠렛을 다시 현탁합니다.
- 세포 현탁액을 10 cm 콜라겐 코팅된 접시에 접시에 담고 접시를 세포 배양 배양기(37°C, 5%CO2)에 1-2시간 동안 넣습니다.
참고: 콜라겐 코팅 접시가 반드시 필요한 것은 아닙니다. 그러나 경험에 비추어 볼 때 콜라겐 코팅 접시는 지방전구세포의 부착을 도와 세포의 생존을 증가시킵니다. - 배지를 흡인하고 세척 당 3mL의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
- 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 10mL를 넣고 접시를 세포 배양 배양기(37°C, 5%CO2)로 되돌립니다.
6. 지방전구세포의 패시징
- 다음날, 배지를 흡인하고(세포가 부착되어 배지를 흡인할 수 있음), 세척당 3mL의 PBS로 세포를 두 번 세척하고, 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 10mL의 DMEM/F12를 추가합니다.
- 세포가 80% 합류에 도달하면(보통 SVF 분리 후 4일) 세포를 4개의 10cm 콜라겐 코팅 접시로 나눕니다.
- 구체적으로, 배지를 흡인하고, 세포를 PBS(실온[RT])로 세척하고, 예열된 0.05% 트립신 1mL를 첨가하고, 세포배양 배양기에서 5분 동안 배양한다.
- 10% FBS와 10% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 10mL를 추가하여 트립신 활성을 소멸시킵니다. 피펫팅 후 440 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 40mL를 추가하여 세포를 재현탁하고 10cm 콜라겐 코팅 접시 4개에 세포를 플레이트합니다.
- 세포가 80% 합류에 도달하면 다시 계대합니다.
7. 지방전구세포의 불멸화를 위한 SV40 거대 T 항원을 발현하는 레트로바이러스의 제조(선택사항)
- 불멸화 최소 3일 전에 플레이트 백금-E(Plat-E) 패키징 셀 29를 항생제 없이 10% FBS가 포함된 DMEM2mL 에 3.0 x 105 cells/mL의 밀도로 패키징합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세십시오.
- 다음날, 제조사의 지시에 따라 리포펙타민 2000을 사용하여 pBABE-neo largeTcDNA(유전자 플라스미드 #1780 추가) 4μg을 형질감염시킨다.
- 24시간 후, 배지를 흡인하고 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 2mL를 추가합니다.
- 다음날, 레트로 바이러스 상청액을 수확하십시오. 레트로바이러스는 즉시 불멸화에 사용하거나 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
8. SV40 큰 T 항원을 이용한 지방전구세포의 불멸화(선택 사항)
- SVF 분리 후 지방전구세포를 2회 계대 및 확장시킨다.
- 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신과 함께 2mL의 DMEM/F12에 0.5-1.0 x 104 cells/mL의 밀도로 6웰 플레이트에 세포를 플레이트합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세십시오.
- 다음날, 6-웰 플레이트의 웰 당 SV40 거대 T 항원을 발현하는 신선하거나 해동된 레트로바이러스 250μL를 준비한다. 440 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 새 튜브에 넣습니다.
- 레트로바이러스 상층액 250μL당 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 750μL의 DMEM/F12와 1μL의 폴리브렌을 추가하여 작동하는 바이러스를 만듭니다.
- 배지를 흡인하고 1,000 μL의 작업 레트로 바이러스를 지방 전구 세포가 들어있는 각 웰에 첨가하십시오.
- 4시간 후에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM/F12 1mL를 추가합니다.
- 다음날 감염된 지방전구세포를 10cm 접시에 담아 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 500μg/mL 네오마이신이 함유된 DMEM/F12로 감염된 세포를 선별한다. 항생제 선택을 모니터링하려면 네오 마이신으로 감염되지 않은 세포 접시를 준비하십시오.
- 모니터 접시에 있는 모든 감염되지 않은 세포가 죽을 때까지 감염된 세포를 네오마이신으로 계속 계대배양합니다.
9. 지방세포 분화
- 세포를 플레이트하십시오. 12웰 플레이트의 경우, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 1mL에 4.0 x 104 cells/mL의 밀도로 세포를 플레이트합니다.
- 지방전구세포가 합류하게 되면(도금 후 48-72시간), 배지를 흡인하고 분화 배지로 교체합니다(조성은 표 1 참조).
- 분화 2일째(즉, 분화 유도 후 48시간)에 배지를 유지 배지로 교체합니다(조성에 대해서는 표 1 참조). 그 후 2일마다 유지 보수 매체를 교체하십시오. 말단 분화는 분화 7일째에 달성됩니다.
- 오일 레드 오 염색
- 오일 레드 오 염색의 경우, 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 PBS로 세포를 헹굽니다. 웰 당 4% 포름알데히드 1mL를 첨가하여 세포를 고정하고, RT에서 15분 동안 세포를 배양한다.
- 인큐베이션 동안,ddH2O를 사용하여 0.5% 오일 레드 O 원액(이소프로필 알코올 중)을 0.3%로 희석하고, 여과지를 사용하여 작업 용액을 여과한다.
- 15 분의 배양 후, 포름 알데히드를 제거하고, 60 % 이소 프로필 알코올로 세포를 헹구고, 여과 된 오일 레드 오 작업 용액 1 mL를 첨가하고, RT에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.
- 배양 후 흐르는 물로 세포를 씻으십시오. 그런 다음 도립 현미경(배율: 20x 대물렌즈 및 10x 접안렌즈)으로 지질이 함유된 지방 세포를 관찰합니다.
- mRNA 발현 분석
참고: 이 연구에 사용된 프라이머 목록은 표 2 를 참조하십시오.- 배지를 흡인하고 1mL/웰의 트리졸을 웰에 추가합니다.
- RT에서 15분 동안 배양하고, 피펫팅으로 세포를 분리하고, 1.5mL 튜브에 샘플을 수집합니다. 샘플은 RNA 추출까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
- 냉동 샘플을 RT로 해동하고 200 μL의 클로로포름을 샘플에 첨가하고 15 초 동안 격렬하게 흔든다.
- 샘플을 RT에서 3분 동안 인큐베이션한 다음, 4°C에서 15분 동안 20,000 x g 로 회전시킨다.
- 수성 상 (상단, 무색)을 조심스럽게 제거하고 새 튜브로 옮깁니다. 단백질 상(중간, 흰색) 또는 페놀/클로로포름 상(하단, 분홍색)을 옮기지 마십시오.
- 같은 양의 70% EtOH를 천천히 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 소용돌이치지 마십시오.
- 샘플(최대 700 μL)을 수집 튜브에 장착된 RNA 스핀 컬럼에 로드합니다. 형성되었을 수 있는 침전물을 포함해야 합니다.
- 4°C에서 30초 동안 9,000 x g 로 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다.
- 700μL의 버퍼 RW1을 추가하고 4°C에서 30초 동안 9,000 x g 로 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다.
- 컬럼을 새 수집 튜브로 옮기고 500μL의 버퍼 RPE를 추가합니다.
- 4°C에서 30초 동안 9,000 x g 로 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다.
- 500μL의 버퍼 RPE를 추가하고 4°C에서 2분 동안 9,000 x g 로 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다.
- 컬럼을 새로운 수집 튜브로 옮기고, 4°C에서 1-2분 동안 9,000 x g 로 스핀(완충액이 없는 컬럼)한다.
- 컬럼을 새로운 1.5mL 수집 튜브로 옮기고 30μL의 RNase가 없는 물을 컬럼 멤브레인에 직접 추가합니다.
- 샘플을 RT에서 1-2분 동안 배양합니다. 그런 다음 4°C에서 1분 동안 9,000 x g 로 회전시켜 RNA를 용출시킵니다.
- 형광 분광계를 사용하여 RNA 농도를 확인합니다.
알림: 여기에 농도를 맞추는 것이 좋습니다. - ~200ng의 RNA 템플릿을 사용하여 역전사를 수행합니다. 상용 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR-RT) 키트를 사용하고 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. 반응 후 cDNA를 200 μL로 20배 희석한다.
- 384웰 플레이트의 각 웰에 cDNA 2.0μL, Power Sybr Green Master Mix 3.0μL, 100μM qPCR 정방향 프라이머 0.018μL, 100μM qPCR 역방향 프라이머 0.018μL, ddH2O 0.96μL를 추가합니다.
- qPCR 실행(유지 단계: 50°C에서 2분, 95°C에서 2분; PCR 단계: 95°C에서 15초 동안 및 60°C에서 1분 동안 40주기; 용융 곡선 단계: 95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 95°C에서 15초). 정량화를 위해 표준 곡선 방법을 사용합니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 지방 세포 분화를 유도한 후 7일 후에 완전히 분화된 지질이 함유된 지방 세포를 생성합니다. 지방세포 분화 정도는 트리글리세리드 및 지질의 오일 레드 오 염색(도 1A) 또는 지방세포 생성의 마스터 조절인자인 Pparg 및 이의 표적 Fabp4와 같은 지방세포 유전자의 qPCR-RT를 이용한 mRNA 발현 분석에 의해 평가될 수 있다(도 1B). 시험관 내에서 베이지색 지방세포 분화를 유도하기 위해, 로시글리타존과 같은 PPARγ 작용제의 티아졸리딘디온 부류가 사용될 수 있다. 실제로, 로시글리타존을 사용한 실험에서 우리는 Ucp1 및 Ppargc1a와 같은 갈색 지방 특이적 유전자의 발현 수준에 대해 최대 1μM 농도의 용량 의존적 효과를 관찰합니다. 한편, Fabp4에 대한 로시글리타존의 효과는 0.1 μM의 농도에서 포화된다 (도 1C).
이 프로토콜에 의해 얻어진 분화된 지방세포는 산소 소비율 (OCR) 분석16,30 (도 2A) 및 염색질 면역침전 31 (ChIP; 그림 2B). 불멸화된 지방전구세포는 생존력의 손실 없이 액체 질소 세포 저장 시스템에 저장할 수 있으며 실험에 사용하기 위해 언제든지 해동할 수 있습니다.
그림 1: 지방전구세포가 지질이 함유된 지방세포로의 분화. (A) 야생형 마우스의 사타구니 백색 지방 조직(iWAT)의 SVF를 지방세포 분화 0일 또는 7일에 오일 레드 o로 염색했습니다. (b) 지방세포 분화의 0일 및 7일째에 Pparg 및 Fabp4 의 mRNA 발현 수준 (평균 ± 표준 오차 [S.E.M.]; N = 3)입니다. (c) 분화 및 유지 배지와 함께 0.1, 0.2, 0.5 및 1.0 μM 로시글리타존으로 처리된 SVF 유래 지방세포에서 일반 지방세포 마커 Fabp4 및 갈색 지방 특이적 유전자 Ucp1 및 Ppargc1a 의 mRNA 발현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 분화된 지방세포를 이용한 기능적 및 기계론적 분석의 예. (A) iWAT SVF 유래 지방세포의 OCR 분석(N=10). (B) 분화 0일 및 7일째에 Nfia flox/flox iWAT SVF 유래 지방세포에서 H3K27Ac에 대한 ChIP-qPCR. Ins-0.4 kb 및 Fabp4-13 kb 사이트는 배경 사이트로 표시됩니다(평균 ± SEM; N = 2)입니다. 두 실험 모두에서, 베이지색 지방세포 분화를 유도하기 위해 분화 및 유지 배지와 함께 1.0 μM 로시글리타존을 첨가하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 분화 및 유지 배지의 구성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 본 연구에 사용된 프라이머 목록. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 수행하기 위해 쥐 지방 조직으로부터 SVF를 분리하기 위한 프로토콜을 설명했습니다. 콜라게나제 분해를 위한 조직 해리제의 사용은 실험 변형을 감소시키고 오염 위험을 줄이며 재현성을 증가시켰습니다. 이 절차는 제시된 프로토콜 내에서 중요한 단계이지만 프로세스는 고도로 자동화되어 있으며 최적화가 필요하지 않습니다. 그러나 마우스의 나이와 지방 조직 저장소에 따라 다짐의 최적화(예: 조각 크기 또는 절단 시간)가 필요할 수 있습니다.
SVF는 지방전구세포, 대식세포와 같은 면역 세포, 내피 세포 및 기타 세포로 구성된 이종 집단으로 알려져 있습니다. 지방전구세포는 배양 접시에 달라붙고 세척 및 배지 변화에 내성이 있기 때문에 계대 동안 세포 집단이 풍부해집니다. 그러나, 이 프로토콜에 의해 얻어진 "지방전구세포"가 여전히 이질적이라고 가정하는 것이 합리적이다. PDGFRα32 와 같은 지방전구세포의 이전에 보고된 표면 마커에 대한 항체를 사용하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 보다 순수한 지방전구세포 집단을 얻는 데 필요합니다.
요약하면, 여기에서 콜라게나제 소화를 위한 조직 해리제를 사용한 SVF 분리를 위한 프로토콜을 설명했습니다. 이 프로토콜은 튜브 랙이 있는 박테리아 셰이커를 사용하는 기존 프로토콜에 비해 SVF를 더 쉽게 분리할 수 있도록 하며, 실험 변동 감소, 오염 감소 및 재현성 증가를 제공합니다(16,17,18).
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Disclosures
저자 중 누구도 이 작업과 관련하여 경쟁적인 재정적 이해관계를 가지고 있지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 실험 지원에 대해 Takahito Wada와 Saiko Yoshida (일본 도쿄 도쿄 대학)에게 감사의 말을 전합니다. 이 연구는 Y.H.에 대한 다음과 같은 보조금으로 자금을 지원받았습니다: 도쿄 대학 우수 젊은 연구원 프로그램의 연구 보조금; 일본 과학 진흥회 (JSPS) KAKENHI 초기 경력 과학자 보조금, 보조금 번호 19K17976; 일본 응용 효소학 재단의 미래 당뇨병 연구(FFDR)의 선두주자에 대한 보조금, 보조금 번호 17F005; 약리학 연구 재단의 보조금; 의학 및 제약 연구를 위한 모치다 기념 재단의 보조금; MSD 생명 과학 재단의 보조금; 다이와 증권 건강 재단의 보조금; 도쿄 생화학 연구 재단의 보조금; 다케다 과학 재단 (Takeda Science Foundation)의 생명 과학 연구 보조금; SENSHIN Medical Research Foundation의 보조금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
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