Summary
Questo documento descrive i protocolli per la costruzione e il funzionamento di una fase di raffreddamento per immobilizzare in massa C. elegans sulle loro piastre di coltivazione originali.
Abstract
Gli approcci di microscopia in vivo ad alta risoluzione possono rivelare informazioni sottili e dettagli fini all'interno dell'animale modello Caenorhabditis elegans (C. elegans), ma richiedono una forte immobilizzazione animale per prevenire la sfocatura del movimento nelle immagini. Sfortunatamente, la maggior parte delle attuali tecniche di immobilizzazione richiede un notevole sforzo manuale, rendendo l'imaging ad alta risoluzione a bassa produttività. L'immobilizzazione di C. elegans è notevolmente semplificata utilizzando un approccio di raffreddamento che può facilmente immobilizzare intere popolazioni direttamente sui loro piatti di coltivazione. La fase di raffreddamento può stabilire e mantenere un ampio intervallo di temperature con una distribuzione uniforme sulla piastra di coltivazione. In questo articolo, l'intero processo di costruzione della fase di raffreddamento è documentato. L'obiettivo è che un tipico ricercatore possa costruire una fase di raffreddamento operativa nel proprio laboratorio seguendo questo protocollo senza difficoltà. Viene mostrato l'utilizzo della fase di raffreddamento seguendo tre protocolli e ogni protocollo presenta vantaggi per diversi esperimenti. Viene inoltre mostrato un esempio di profilo di raffreddamento dello stadio mentre si avvicina alla sua temperatura finale e alcuni suggerimenti utili nell'utilizzo dell'immobilizzazione del raffreddamento.
Introduction
La microscopia ottica ad alta risoluzione fornisce uno strumento indispensabile per lo studio delle strutture biologiche in vivo a livello subcellulare. Molti studi biologici richiedono l'imaging con risoluzione submicronica per risolvere dettagli anatomici sottili, tra cui la morfologia neuronale 1,2, la struttura della membrana3,4 e la localizzazione proteica 5,6. Un'immagine ad alta risoluzione richiede un tempo di esposizione da diversi millisecondi a secondi, a seconda della modalità di imaging e della sonda 7,8. Per ottenere risultati ottimali, è essenziale pianificare attentamente e condurre esperimenti basati sulla microscopia. Fondamentale per questo sforzo è un metodo di preparazione animale efficiente che faciliti l'imaging ad alta risoluzione.
Il nematode C. elegans è un organismo modello ampiamente utilizzato per lo studio di molti processi biologici9. Questo piccolo animale è tipicamente coltivato su piastre di agar con terreno di crescita nematode (NGM) e si riproduce rapidamente per autofecondazione, rendendoli adatti per studi su larga scala. La loro trasparenza e una vasta gamma di tecniche di etichettatura consentono la visualizzazione diretta della loro anatomia interna10,11. Le strutture fini di C. elegans sono ideali per studiare i processi biologici a livello subcellulare, come la rigenerazione neuronale12, la degenerazione neuronale13 e la divisione cellulare14. Tali studi richiedono l'imaging con risoluzione submicronica e l'immobilizzazione animale abbastanza forte da prevenire la sfocatura dell'immagine. L'immobilizzazione forte è particolarmente cruciale per le tecniche che coinvolgono più immagini nello spazio o nel tempo, come gli stack di immagini 3D (cioè z-stack) e l'imaging time-lapse. Qualsiasi movimento animale tra le esposizioni può oscurare il risultato. Per C. elegans, l'immobilizzazione forte comporta tipicamente la manipolazione manuale di singoli animali e il loro montaggio su vetrini con un anestetico15,16. Queste procedure ad alta intensità di tempo e lavoro rendono molto difficili gli esperimenti su larga scala. Una strategia di immobilizzazione in cui gli animali sono immobilizzati direttamente e reversibilmente sulle loro piastre di coltivazione originali potrebbe consentire immagini ad alta risoluzione ad alto rendimento.
L'immobilizzazione da raffreddamento di C. elegans è stata dimostrata in alcuni studi, ma non è ampiamente utilizzata. Di solito è combinato con un dispositivo microfluidico per trattenere ulteriormente gli animali17,18,19. Tuttavia, i dispositivi microfluidici sono complessi, richiedono una formazione operativa significativa e non possono essere facilmente integrati con i tipici flussi di lavoro di coltivazione solida degli esperimenti di C. elegans. Pertanto, la microfluidica non è ampiamente utilizzata per l'immobilizzazione di C. elegans. Presentato qui, in concomitanza con la recente pubblicazione20 del Chung Laboratory, è l'introduzione di un nuovo approccio di immobilizzazione del raffreddamento utilizzando uno stadio di raffreddamento termoelettrico (Figura 1) per affrontare queste carenze. Con la fase di raffreddamento, una tipica piastra di coltivazione in polistirene da 60 mm può essere raffreddata a qualsiasi temperatura target(set T) compresa tra -8 °C e temperatura ambiente. Questo approccio alla fase di raffreddamento può immobilizzare prontamente e reversibilmente un'intera popolazione animale con il minimo sforzo da parte dell'utente, eliminando il 98% del tempo di lavorazione degli animali20.
Di seguito, vengono descritte le procedure per costruire una fase di raffreddamento da zero. Ad eccezione della lavorazione di parti e della stampa 3D, l'intera procedura dovrebbe richiedere 4 ore senza la necessità di strumenti speciali o competenze. Quindi, vengono ulteriormente descritte tre diverse strategie di raffreddamento con diverse velocità di raffreddamento e sforzi dell'utente per immobilizzare C. elegans su un tipico microscopio verticale. La strategia preferita può dipendere dall'applicazione utente. I protocolli per queste tre strategie di immobilizzazione del raffreddamento sono descritti in dettaglio.
Protocol
1. Produzione e preparazione di ogni componente della fase di raffreddamento
NOTA: La fase di raffreddamento comprende diversi componenti (vedere la tabella dei materiali). La maggior parte dei componenti sono pronti all'uso. La finestra in zaffiro richiede un ordine personalizzato, mentre la piastra di rame, la staffa di supporto e la piastra di isolamento possono essere prodotte in loco con un mulino a controllo numerico computerizzato o una stampante 3D. Dopo la produzione iniziale, il successivo processo di assemblaggio richiede circa 2-3 ore.
- Utilizzare una fresa a controllo numerico computerizzato per lavorare la lastra di rame da una lamiera di rame puro al 99,9% di 170 mm x 120 mm x 3 mm (Figura 2A). Il disegno 2D per questa fabbricazione è fornito nel file supplementare 1. Utilizzare carta vetrata a grana fine per rimuovere eventuali spigoli vivi e residui sporchi.
- Per fabbricare la staffa di supporto e la piastra di isolamento, utilizzare una stampante 3D e un filamento di acido polilattico (PLA) di 1,75 mm di diametro (Figura 2B, C). Per una migliore qualità, la stampante 3D dovrebbe fornire un'altezza dello strato più fine di 0,2 mm.3D i modelli sono forniti nel file supplementare 2 e nel file supplementare 3.
2. Costruzione del gruppo di raffreddamento ad acqua
- Preparare il tubo in silicone polimerizzato al platino, il serbatoio della pompa, il blocco di raffreddamento in rame e il radiatore (Figura 3A) per la costruzione del gruppo di raffreddamento ad acqua. Preparare una lama di rasoio, forbici e chiave esagonale pronti per l'uso. Essere consapevoli dei rischi elettrici dovuti all'uso di acqua durante il montaggio.
- Tagliare il tubo di silicone in tre sezioni con lunghezze suggerite di 40 cm, 50 cm e 80 cm. Regolare la lunghezza quando necessario.
- Collegare le sezioni del tubo di silicone dal punto 2.2 alle porte del radiatore, del serbatoio della pompa e del blocco di raffreddamento in rame, come mostrato nella Figura 3B. Assicurarsi che tutte le connessioni siano a tenuta stagna. Il gruppo di raffreddamento ad acqua è ora costruito.
- Preparare il gruppo di raffreddamento ad acqua, un alimentatore da 12 V, tre fili jumper rossi e tre neri, una breadboard e 500 ml di acqua purificata.
- Assicurarsi che il banco di lavoro sia privo di liquidi per la sicurezza elettrica.
- Collegare i serbatoi della pompa e i fili del radiatore all'alimentazione a 12 V attraverso la breadboard (Figura 3C). La breadboard viene utilizzata per comodità.
NOTA: Per una connessione più permanente e sicura, i ricercatori possono sostituire la breadboard con fili di saldatura. - Aprire il tappo del serbatoio della pompa utilizzando un cacciavite a testa piatta. Utilizzare un imbuto per aggiungere acqua fino a quando il serbatoio della pompa è pieno per circa l'80% (Figura 3D). Non tappare il serbatoio della pompa dopo questo riempimento.
- Accendere il gruppo di raffreddamento ad acqua collegando l'alimentatore a 12 V o accendendolo (se è presente un interruttore). Dopo l'accensione, l'acqua scorrerà all'interno del gruppo e le ventole sul radiatore dovrebbero soffiare.
- A causa del flusso d'acqua dal serbatoio della pompa, il livello del liquido nel serbatoio diminuirà. Aggiungere altra acqua al serbatoio della pompa fino a quando non si stabilizza a quasi 2/3 di pieno (Figura 3E).
- Agitare il radiatore per eliminare le bolle d'aria e quindi tappare il serbatoio di raffreddamento.
- Spegnere l'alimentatore prima di andare al passaggio successivo.
3. Test delle superfici fredde e calde di Peltier
NOTA: Il Peltier, un componente chiave della fase di raffreddamento, è una pompa di calore attiva a stato solido che trasferisce calore da un lato all'altro21. Una superficie del Peltier diventa calda e l'altra superficie diventa fredda quando fornisce energia elettrica. Per impostazione predefinita, i produttori Peltier marcano la superficie fredda prima della vendita, ma è comunque utile testarla manualmente prima dell'assemblaggio.
- Preparare l'alimentatore sintonizzabile e il Peltier, come mostrato nella Figura 4A.
- Assicurarsi che l'alimentazione sintonizzabile sia spenta per evitare possibili rischi elettrici.
- Collegare il filo rosso del Peltier all'uscita positiva e il filo nero all'uscita negativa dell'alimentatore sintonizzabile con clip a coccodrillo, fornite con l'alimentatore (Figura 4B).
- Accendere l'alimentatore sintonizzabile e impostarlo su circa 2 V modulando sia le manopole di tensione che di corrente sulla fila superiore dell'alimentatore. Utilizzare immediatamente un dito nudo per sentire le due superfici del Peltier. Una superficie diventa fredda in pochi secondi.
- Dopo aver identificato quale superficie è fredda, spegnere immediatamente l'alimentazione e scollegare il Peltier.
- Utilizzare un pennarello per indicare la superficie fredda per l'assemblaggio futuro.
4. Costruzione dell'assieme per raffreddare il Peltier utilizzando il gruppo di raffreddamento ad acqua
- Come mostrato nella Figura 4A, preparare il gruppo di raffreddamento ad acqua spento, il Peltier (superficie fredda marcata) e la pasta termica (per una migliore conduzione termica).
- Pulire tutte le superfici del blocco di raffreddamento in rame con etanolo al 70% (o altra soluzione più pulita) nel gruppo di raffreddamento ad acqua.
- Applicare circa 0,4 g di pasta termica su una superficie del blocco di raffreddamento ad acqua in rame e assicurarsi che questo orientamento superficiale impedisca ai tubi di incrociarsi o piegarsi quando sono rivolti verso il basso. Utilizzare un guanto per proteggere la pelle e cercare di distribuire la pasta termica in modo sottile e uniforme (Figura 4C).
- Allo stesso modo, pulire la superficie calda del Peltier, quindi applicare la pasta termica sulla superficie (Figura 4D).
- Collegare la superficie calda Peltier alla superficie del blocco di raffreddamento in rame con pasta termica. Esercitare pressione per assicurarsi che sia sicuro. Seguire l'orientamento dei fili sul Peltier e sui tubi del blocco di raffreddamento in rame, come mostrato nella Figura 4E. Pulire la pasta termica in eccesso.
- Tenere spenta sia l'alimentazione a 12 V che l'alimentatore sintonizzabile. Collegare il Peltier all'alimentatore sintonizzabile, come nella sezione 3.
- Ricontrollare i collegamenti elettrici e del gruppo di raffreddamento ad acqua, quindi accendere l'alimentatore a 12 V e l'alimentatore sintonizzabile in sequenza.
- Ruotare gradualmente l'alimentazione sintonizzabile a 12 V. Con il Peltier suggerito, la corrente dovrebbe essere intorno a 7,3 A.
- Attendere 2 minuti; la temperatura della superficie fredda di Peltier dovrebbe diventare più fredda di -35 °C. Misurare questa temperatura con un termometro a infrarossi (Figura 4F). Non toccare la superficie fredda per evitare lesioni alle mani.
- Controllare tutti i collegamenti e i componenti se la temperatura non può scendere al di sotto di -30 °C. Le bolle d'aria all'interno del gruppo di raffreddamento ad acqua sono una possibile ragione per prestazioni di raffreddamento non ottimali.
- Per garantire la sicurezza nei passaggi successivi, spegnere l'alimentatore sintonizzabile, attendere 1 minuto, quindi spegnere l'alimentazione a 12 V.
5. Costruzione di lastre di rame e assemblaggio di finestre in zaffiro
- Preparare la lastra di rame, la finestra di zaffiro di 80 mm di diametro, la pasta termica, un nastro largo 4 pollici e una lama affilata per il taglio (Figura 5A).
- Pulire accuratamente la lastra di rame e la finestra in zaffiro con etanolo al 70% e utilizzare carta vetrata a grana fine per levigare superfici ruvide.
- Applicare la pasta termica su tre superfici interne, come mostrato nella Figura 5B. Assicurarsi che la pasta termica copra tutte e tre le superfici ma non sia troppo spessa, circa 0,5 mm.
- Posare la lastra di rame sul piano di lavoro protetta con carta per stampanti. La carta facilita la successiva pulizia.
- Inserire la finestra di zaffiro nel foro della lastra di rame (Figura 5C). Assicurarsi che lo zaffiro non ruoti durante l'inserimento per evitare che la pasta termica si sposti in altre aree. Rimuovere la pasta termica in eccesso.
- Far aderire il nastro largo 4 pollici alla superficie superiore del gruppo finestra in lastre di rame-zaffiro (la superficie che ha l'area di depressione quadrata, come mostrato nella Figura 5D). Evitare bolle d'aria tra il nastro e le superfici di rame durante l'incollaggio guidando lentamente l'adesione da un lato all'altro.
- Ritagliare le aree tratteggiate blu specificate del nastro utilizzando una lama affilata, seguendo la Figura 5E. Il taglio espone i due fori di filettatura, la depressione quadrata e l'area di 70 mm di diametro della finestra in zaffiro.
- Fissare la superficie inferiore dell'assieme finestra lastre-zaffiro di rame, quindi ripetere la procedura di taglio (solo area di zaffiro) su questa superficie, come mostrato nella Figura 5F.
NOTA: Ora, la finestra in zaffiro è fissata alla piastra di rame e le superfici in rame sono protette dalla ruggine.
6. Assemblaggio finale della fase di raffreddamento
- Assicurati che tutti i sottoassiemi e i componenti essenziali siano pronti.
- Applicare circa 0,4 g di pasta termica sulla depressione quadrata della piastra di rame (Figura 6A).
- Applicare circa 0,4 g di pasta termica sulla superficie fredda del Peltier. Si noti che il Peltier è già collegato al blocco di raffreddamento in rame (Figura 6B).
- Collegare la superficie fredda di Peltier alla depressione della piastra di rame con pressione verso il basso. Pulire tutta la pasta termica in eccesso (Figura 6C).
- Montare la staffa stampata in 3D sulla parte superiore del blocco di raffreddamento in rame, quindi utilizzare una chiave esagonale per stringere due viti lunghe 8-32, 0,5 pollici per fissare la staffa alla piastra di rame (Figura 6D). Utilizzare un serraggio a bassa coppia in modo che la staffa stampata non si rompa o si deformi per garantire una corretta conduzione termica dal Peltier al rame.
- Posizionare la piastra di rame nella base di isolamento stampata in 3D per l'isolamento termico dalla base del piano di lavoro o del microscopio durante il funzionamento (Figura 6D).
- Lo stadio di raffreddamento è assemblato e pronto all'uso (Figura 6E).
- Per la microscopia, posizionare la fase di raffreddamento completata su una piattaforma di microscopio verticale (Figura 7A).
- L'assemblaggio della fase di raffreddamento è completato. Ulteriori dettagli sono disponibili dalla pubblicazione complementare del Chung Laboratory, che caratterizza pienamente le strategie dettagliate e il movimento degli animali20.
NOTA: nelle sezioni seguenti vengono illustrati i protocolli di raffreddamento lento, veloce e brusco. N2 ermafroditi in età L4 o giovane adulta sono stati utilizzati per produrre i seguenti dati. La strategia del raffreddamento lento è utile per immobilizzare animali N2 coltivati a 20 °C a 6 °C; Gli animali N2 coltivati a 15 °C sono fortemente immobilizzati a 1 °C20. Un breve confronto tra questi tre protocolli di raffreddamento è mostrato nella Tabella 1.
7. Protocollo di immobilizzazione a raffreddamento lento
- Spostare la piastra di coltivazione con coperchio su un frigorifero a 4 °C.
- Dopo aver spostato la piastra di coltivazione sul frigorifero, accendere l'alimentazione a 12 V dello stadio di raffreddamento e impostare la tensione di alimentazione sintonizzabile su 5,5 V.
- Dopo che la piastra di coltivazione con coperchio è rimasta nel frigorifero a 4 °C per 1 ora, trasferire immediatamente la piastra nella fase di raffreddamento e rimuovere il coperchio (Figura 7A). Tali piastre di coltivazione sono generalmente intorno ai 6 °C. Lo stadio pre-raffreddato è stabile e sufficientemente freddo da mantenere la superficie dell'agar a 6 °C.
- Se la temperatura superficiale dell'agar cambia, come misurato o notando il movimento degli animali, regolare leggermente la tensione fino a stabilizzarsi a 6 °C.
- Gli animali sono adeguatamente immobilizzati al momento del trasferimento.
8. Protocollo di immobilizzazione del raffreddamento rapido
NOTA: La strategia di raffreddamento rapido è il metodo di immobilizzazione più semplice (vedere Filmato 1); tuttavia, le piastre di agar occupano pigramente il palcoscenico per un tempo prolungato mentre raggiungono ilset T. Inoltre, quando è necessaria una forte immobilizzazione e ilset T è di 6 °C, il tempo di inattività viene esteso a circa 1 h20.
- Accendere l'alimentatore a 12 V dello stadio di raffreddamento e impostare la tensione di alimentazione sintonizzabile su circa 12 V. Attendere 10 minuti.
- Portare una piastra di coltivazione dalla sua incubatrice direttamente alla fase di raffreddamento e rimuovere il coperchio.
- Una volta che la temperatura superficiale dell'agar diminuisce a (T set + ΔT) °C, regolare l'alimentazione sintonizzabile su V set e attendere che l'agar raggiunga Tset. L'insieme V è la tensione appropriata per stabilizzare l'agar alset T. Il ΔT è una variabile che impedisce il raffreddamento eccessivo. Vedere la Tabella 2 per la combinazione diinsieme T, ΔT e Vinsieme.
NOTA: I dati presentati nella Tabella 2 riguardano specificamente il Laboratorio Chung, e pertanto va notato che i parametri sperimentali possono variare in base alle condizioni ambientali e di utilizzo uniche di ogni singolo esperimento. - Gli animali sono immobilizzati quando l'agar raggiunge ilset T. L'immobilizzazione migliora con il tempo fino a ~ 50 minuti dopo l'inizio del raffreddamento.
9. Protocollo di immobilizzazione del raffreddamento improvviso
NOTA: La strategia di raffreddamento brusco consuma la maggior parte del tempo dell'utente, ma immobilizza gli animali più rapidamente dalla loro temperatura di coltivazione.
- Accendere l'alimentazione a 12 V dello stadio di raffreddamento e ruotare la tensione di alimentazione sintonizzabile a circa 12 V. Conservare per 10 minuti.
- Portare una piastra di agar non occupata alla fase di raffreddamento. Utilizzare il punto 8.3 del protocollo di immobilizzazione a raffreddamento rapido per stabilizzare la temperatura superficiale dell'agar alset T.
- Spostare gli animali dalla loro piastra di coltivazione originale alla piastra raffreddata seduta sul palco di raffreddamento.
- In base alle piccole dimensioni dell'animale, ci si aspetta che gli animali si raffreddino a Timpostato in pochi secondi e vengano immobilizzati. L'immobilizzazione migliora con il tempo fino a ~ 50 minuti dopo l'inizio del raffreddamento.
10. Risveglio degli animali dopo l'immobilizzazione da raffreddamento
- Spostare nuovamente la piastra di coltura raffreddata sull'incubatore originale o a temperatura ambiente.
- Attendere da 20 minuti a 1 ora fino a quando tutti i vermi sul piatto si rianimano al loro normale comportamento di gattonamento e alimentazione.
Representative Results
Misurazione della temperatura di raffreddamento
Per gli esperimenti iniziali di immobilizzazione del raffreddamento, è importante monitorare la temperatura superficiale dell'agar per garantire che gli animali possano essere immobilizzati correttamente. Gli esperimenti futuri che vengono replicati da quello iniziale possono utilizzare gli stessi parametri, di solito senza frequenti monitoraggi della temperatura. Per la misurazione della temperatura, la punta della termocoppia del termometro viene sterilizzata utilizzando una soluzione di etanolo al 70%, aspettando che l'etanolo evapori completamente prima dell'uso. Quindi, la punta della termocoppia viene inserita 1 mm nell'agar NGM per garantire una lettura accurata della temperatura. La punta del termometro viene tenuta utilizzando un portamorsetto o altri supporti (Figura 7B).
Misurazione della temperatura con una termocamera
Lo stadio di raffreddamento è progettato per garantire che la distribuzione della temperatura nell'area centrale di 40 mm di diametro della piastra sia uniforme. Una termocamera a infrarossi (FLIR) frontale viene utilizzata per visualizzare la distribuzione della temperatura sulla superficie dell'agar. La differenza massima di temperatura è di circa 1 °C quando ilset T è 1, 3 o 6 °C (Figura 8A).
Valutazione della velocità di raffreddamento con la strategia di raffreddamento rapido
La strategia di raffreddamento rapido viene utilizzata per caratterizzare la velocità di raffreddamento di uno stadio a 12 V. Una piastra a 20 °C viene posizionata sullo stadio di raffreddamento e un termometro a termocoppia viene utilizzato per monitorare la temperatura superficiale. Lo stadio raffredda le piastre da 20 °C a 6 °C in 6 minuti, a 1 °C in 10 minuti e infine si stabilizza al di sotto di -7 °C in circa 40 minuti (Figura 8B).
Utilizzo dello stadio di raffreddamento su una piattaforma di microscopio verticale
Un microscopio verticale comprende tipicamente un obiettivo per l'imaging, un palcoscenico per la conservazione del campione e l'illuminazione. Questo stadio di raffreddamento è progettato per l'uso su un tipico stadio per microscopio verticale con facile inserimento e rimozione (Figura 8C). Quando è necessaria l'immobilizzazione del raffreddamento per l'imaging o lo screening, la fase di raffreddamento viene semplicemente posizionata sullo stadio del microscopio per terminare la rata e viceversa.
L'immobilizzazione dei vermi sulla piastra di raffreddamento è mostrata nel filmato 1.
Figura 1: Modello 3D dell'apparato dello stadio di raffreddamento. Le connessioni elettroniche non vengono mostrate per chiarezza. Un serbatoio pompa acqua attraverso il blocco di raffreddamento per rimuovere il calore trasferito dal Peltier incorporato nel palco. Una tipica piastra di coltivazione in polistirene da 60 mm può essere posizionata sulla finestra di zaffiro trasparente ed essere raffreddata dal palco. Modello generato in Solidworks. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Modelli 3D dei componenti da produrre. (A) Lastra di rame. (B) Staffa di supporto stampata in 3D. (C) Piastra di isolamento stampata in 3D. Modelli generati in Solidworks. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Gruppo raffreddamento ad acqua . (A) Singoli componenti. Tubi tagliati a lunghezze specificate. (B) Componenti di raffreddamento ad acqua collegati. (C) Fili che collegano il serbatoio della pompa e il radiatore all'alimentazione a 12 V. In generale, i fili rossi si collegano all'estremità positiva e i fili neri all'estremità negativa. (D) Acqua purificata versata nella pompa. (E) Il serbatoio riempito a più di due terzi per un'efficienza ottimale della pompa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Collegamento del gruppo Peltier e del raffreddamento ad acqua. (A) Componenti per il funzionamento del Peltier. (B) Utilizzando l'alimentatore sintonizzabile per determinare i lati caldi e freddi del Peltier. Per sicurezza, non viene utilizzato più di 2 V. (C) Applicazione uniforme della pasta termica sulla superficie del blocco di rame. (D) Applicazione uniforme della pasta termica sulla superficie calda di Peltier. (E) Lato caldo del Peltier premuto sul blocco di rame con pasta termica. (F) Termometro a infrarossi utilizzato per misurare la temperatura superficiale fredda di Peltier. Idealmente, la temperatura fredda può raggiungere quasi -35 ° C. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Assemblaggio della lastra di rame e della finestra in zaffiro . (A) Componenti richiesti. (B) Pasta termica applicata su tre superfici interne della lastra di rame in cui la finestra di zaffiro entrerà in contatto. Due viste verso il basso della lastra di rame che mostrano la posizione delle tre superfici. (C) Finestra di zaffiro nel foro della lastra di rame. (D) Nastro applicato sulla superficie superiore dell'assieme. (E) Lato superiore: le linee tratteggiate blu indicano le posizioni in cui tagliare e rimuovere il nastro: depressione quadrata, due fori e un'area di zaffiro di 70 mm di diametro. (F) Lato inferiore: il nastro viene tagliato e rimosso come mostrato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Assemblaggio finale della fase di raffreddamento . (A) Pasta termica applicata alla depressione della lastra di rame. (B) Pasta termica applicata sul lato freddo del Peltier. (C) Superficie fredda del Peltier collegata alla depressione. (D) Blocco di raffreddamento in rame fissato alla piastra di rame mediante viti. Fase di raffreddamento nella base di isolamento. (E) Fase di raffreddamento completata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Stadio di raffreddamento al microscopio e misurazione della termocoppia. (A) Stadio di raffreddamento posto sulla base del microscopio per l'imaging. La finestra in zaffiro è trasparente, consentendo la transilluminazione. (B) Termometro a termocoppia utilizzato per misurare la temperatura superficiale dell'agar NGM. La punta inserita circa 1 mm nell'agar NGM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Caratterizzazione e utilizzo della fase di raffreddamento . (A) Immagini termiche che mostrano la superficie dell'agar raffreddata a 1, 3 e 6 °C. Distribuzione uniforme della temperatura all'interno dell'area centrale di 40 mm (cerchio tratteggiato bianco). (B) Temperatura della superficie dell'agar NGM nel tempo sullo stadio di raffreddamento a 12 V. La superficie dell'agar NGM può essere raffreddata al di sotto di -7 °C. Temperatura misurata con il metodo di cui alla figura 7B. (C) Stadio di raffreddamento in uso su un tipico microscopio verticale. Lo stadio di raffreddamento può essere facilmente installato o rimosso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| raffreddamento lento | raffreddamento rapido | raffreddamento improvviso | |
| Occupazione scenica | minimo | lungo | Medio |
| tempo fino a quando gli animali sono immobilizzati | lungo | Medio | molto breve |
| forza di immobilizzazione | forte | Medio | Medio |
| Sforzo dell'utente | minimo | leggermente più del minimo | massimo |
Tabella 1: Confronto delle strategie di raffreddamento.
| Tset (°C) | ΔT (°C) | Insieme V (V) |
| 1 | 2 | 8 |
| 2 | 3 | 7.4 |
| 3 | 4.5 | 7 |
| 4 | 5.5 | 6.5 |
| 5 | 6 | 5.9 |
| 6 | 6 | 5.5 |
Tabella 2: Parametri per raggiungere la temperatura desiderata nella strategia di raffreddamento rapido.
File supplementare 1: Lastra di rame in metrica. Disegno A2D per la lavorazione della lastra di rame. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: staffa di tenuta. Un disegno 3D di una staffa di tenuta che può essere aperta o modificata da Solidworks ed esportata nel software di stampa 3D. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 3: Piastra di isolamento. Un disegno 3D di una lastra di isolamento che può essere aperta o modificata da Solidworks ed esportata nel software di stampa 3D. Clicca qui per scaricare questo file.
Filmato 1: Video di raffreddamento. Vermi di immobilizzazione sulla piastra di agar NGM a 2 °C. La piastra è stata raffreddata da temperatura ambiente a 2 °C e rimasta a 2 °C per diversi minuti. Quindi, la fase di raffreddamento è stata disattivata e le piastre hanno iniziato a riscaldarsi a temperatura ambiente in modo naturale. Il video è accelerato di 10x per adattarsi a un video di 1 ora in 6 minuti. Clicca qui per scaricare questo film.
Tabella supplementare 1: Stima dei prezzi Clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
La fase di raffreddamento, l'assemblaggio e l'utilizzo sono mostrati in questo manoscritto. La maggior parte dei componenti sono articoli pronti all'uso che possono essere acquistati online. Alcuni componenti, come la lastra di rame e la finestra in zaffiro, necessitano di un ordine personalizzato e potrebbero richiedere fino a 1 mese per la fabbricazione. Altri componenti che possono essere stampati in 3D sono facilmente fabbricati nella maggior parte degli istituti di ricerca (Tabella supplementare 1). Il processo di assemblaggio richiede solo pochi strumenti e può essere eseguito rapidamente da un non esperto in poche ore. Pertanto, la maggior parte dei laboratori biologici dovrebbe essere in grado di implementare facilmente questo dispositivo.
La fase di raffreddamento e l'approccio di immobilizzazione del raffreddamento possiedono diversi miglioramenti significativi rispetto ai metodi di immobilizzazione esistenti, accuratamente dettagliati nella pubblicazione originale20. In breve, la fase di raffreddamento consente la forte immobilizzazione di grandi popolazioni di C. elegans di tutte le età, compresi embrioni e dauers, sulle loro tipiche piastre di coltura sotto flussi di lavoro di microscopia standard. Elimina la necessità di configurazioni hardware complesse, come la microfluidica, fornendo al contempo un effetto di immobilizzazione più forte. Inoltre, riduce al minimo la possibile esposizione chimica tossica agli animali e ai ricercatori poiché non vengono utilizzate sostanze chimiche, fornendo al contempo un effetto di immobilizzazione simile. Queste capacità tecniche consentono l'ampia applicazione di questo dispositivo e l'approccio a molti esperimenti che richiedono microscopia in vivo ad alta risoluzione su un gran numero di animali.
Ci sono alcuni passaggi critici durante la costruzione del dispositivo, tra cui tutte le applicazioni di pasta termica e l'ampio nastro per fissare la finestra di zaffiro alla piastra di bottaio. La pasta termica garantisce una forte conduttività termica sostituendo gli spazi vuoti con un materiale a bassa resistenza termica. Per ottenere le prestazioni di raffreddamento desiderate, la pasta deve essere introdotta correttamente tra tutte le superfici adiacenti / di contatto, compresa la superficie fredda Peltier sulla piastra di rame, la superficie calda Peltier sul blocco di raffreddamento in rame e la piastra di rame sulla finestra di zaffiro. L'ampio nastro applicato al palco isola la piastra di rame per evitare il riscaldamento dall'aria e dalla condensa, che porta alla ruggine. Rafforza anche la connessione tra la finestra in zaffiro e la lastra di rame. Pertanto, sia l'applicazione della pasta termica che il nastro largo richiedono particolare attenzione.
In un vero esperimento di immobilizzazione del raffreddamento, i parametri forniti in questo manoscritto, come le tensioni e i tempi, dipendono dalle proprietà specifiche delle piastre e dello stadio di coltivazione, come la quantità di agar nelle piastre, l'efficienza dello stadio e la temperatura e l'umidità ambiente. Nelle modifiche future, potrebbe essere installato un controller di retroazione, come una derivata integrale proporzionale (PID), per regolare attivamente l'ingresso della tensione allo stadio di raffreddamento per raggiungere la temperatura desiderata e stabilizzarla.
Ci sono diverse limitazioni di questa immobilizzazione dello stadio di raffreddamento, accuratamente dettagliate nella pubblicazione originale20. In breve, gli animali allevati a temperature diverse sono immobilizzati a diversi livelli, il che potrebbe richiedere una messa a punto extra. Inoltre, questo stadio di raffreddamento della corrente non è progettato per un microscopio invertito. Inoltre, l'imaging o lo screening su una piastra di coltivazione direttamente possono introdurre contaminazione nella piastra.
Stiamo progettando nuove versioni dello stadio di raffreddamento adatte a diverse piattaforme di imaging, tra cui microscopi verticali composti e microscopi invertiti. Questi nuovi design consentiranno l'immobilizzazione diretta del raffreddamento degli animali sulle piastre di coltura durante l'imaging su queste piattaforme. L'imaging su questi stadi di raffreddamento utilizzerà obiettivi di immersione in aria a lunga distanza di lavoro, simili alla configurazione verticale. Al giorno d'oggi, gli obiettivi di immersione in aria possono avere un'apertura numerica fino a 0,9, che fornisce una risoluzione di circa 300 nm per l'imaging delle proteine a fluorescenza verde. Pertanto, la combinazione di un nuovo stadio di raffreddamento con un microscopio potrebbe consentire l'imaging a fluorescenza con risoluzione submicronica di routine.
Forniamo anche alcuni consigli utili per l'utilizzo della fase di raffreddamento in base alla nostra esperienza. Ad esempio, le persone dovrebbero verificare se ci sono bolle d'aria all'interno del gruppo di raffreddamento ad acqua. Le bolle d'aria degradano il raffreddamento sulla superficie calda di Peltier e quindi degradano l'efficacia di raffreddamento dello stadio di raffreddamento. Se sono presenti bolle d'aria, l'alimentatore a 12 V deve essere acceso per far fluire l'acqua e tutti i componenti del flusso d'acqua devono essere scossi. Le bolle d'aria possono essere espulse dalle aree intrappolate e scaricate dal serbatoio della pompa. I ricercatori dovrebbero assicurarsi che il tubo del flusso d'acqua non sia piegato o incrociato durante l'assemblaggio del gruppo di raffreddamento ad acqua. La flessione o l'attraversamento del tubo possono impedire l'adeguato flusso d'acqua e ridurre l'efficacia del raffreddamento. Le connessioni dei tubi devono essere adeguatamente adattate e strette. Se necessario, è possibile utilizzare invece un tubo morbido con un diametro diverso per garantire la tenuta. La pasta non deve essere applicata, anche se la connessione non è abbastanza stretta, poiché la pasta potrebbe introdurre intasamenti durante l'uso futuro. L'umidità della stanza influisce sulle prestazioni di raffreddamento e introduce condensa e ghiaccio sullo stadio di raffreddamento. Prima di posizionare una piastra di coltivazione sulla fase di raffreddamento, si consiglia di utilizzare un fazzoletto di carta per rimuovere la condensa o utilizzare un dissipatore di calore per rimuovere rapidamente il ghiaccio che si è formato sulla finestra di zaffiro. Il serbatoio della pompa e le ventole del radiatore possono causare piccole vibrazioni nel microscopio se lavorano sullo stesso tavolo. La vibrazione del microscopio offusca l'immagine acquisita e quindi dovrebbe essere evitata. Un cuscino può essere utilizzato per isolare meccanicamente il serbatoio e il radiatore, oppure possono essere posizionati su un tavolo vicino separato. Lo stadio di raffreddamento può diventare uno stadio di riscaldamento invertendo il collegamento elettrico al Peltier.
Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Riconosciamo Noah Joseph (Northeastern Bioengineering Department) per la lavorazione delle lastre di rame.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
| 8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
| bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
| copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
| copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
| digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
| isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
| multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
| Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
| packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
| pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
| radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
| sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
| thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
| tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |
References
- Wearne, S. L., et al. New techniques for imaging, digitization and analysis of three-dimensional neural morphology on multiple scales. Neuroscience. 136 (3), 661-680 (2005).
- Zhou, Z., Sorensen, S., Zeng, H., Hawrylycz, M., Peng, H. Adaptive image enhancement for tracing 3D morphologies of neurons and brain vasculatures. Neuroinformatics. 13 (2), 153-166 (2015).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Optical techniques for imaging membrane topography. Cell Biochemistry and Biophysics. 41 (3), 391-414 (2004).
- Chan, C. Y., Faragalla, Y., Wu, L. -G. Illuminating membrane structural dynamics of fusion and endocytosis with advanced light imaging techniques. Biochemical Society Transactions. 50 (4), 1157-1167 (2022).
- Chen, Y., Periasamy, A. Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 72-80 (2004).
- Chen, Y., Mills, J. D., Periasamy, A. Protein localization in living cells and tissues using FRET and FLIM. Differentiation. 71 (9-10), 528-541 (2003).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 311-318 (2012).
- Brenner, S.
- Hobert, O., Loria, P.
- Emmons, S. W., Yemini, E., Zimmer, M. Methods for analyzing neuronal structure and activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 218 (4), (2021).
- Chung, S. H., et al. Novel DLK-independent neuronal regeneration in Caenorhabditis elegans shares links with activity-dependent ectopic outgrowth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), E2852-E2860 (2016).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A.
- Pintard, L., Bowerman, B. Mitotic cell division in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (1), 35-73 (2019).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Chung, K. H., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nature Communications. 2, 271 (2011).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Wang, Y. L., Grooms, N. W. F., Jaklitsch, E. L., Schulting, L. G., Chung, S. H. High-throughput submicron-resolution microscopy of Caenorhabditis elegans populations under strong immobilization by cooling cultivation plates. iScience. 26 (2), 105999 (2023).
- Zhao, D., Tan, G. A review of thermoelectric cooling: Materials, modeling and applications. Applied Thermal Engineering. 66 (1-2), 15-24 (2014).
