Summary
이 논문은 C. elegans 를 원래 재배 플레이트에 한꺼번에 고정시키기 위한 냉각 단계를 구성하고 작동하기 위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
고해상도 생체 내 현미경 접근 방식은 모델 동물 예쁜꼬 마선충(예쁜 꼬마선충) 내부의 미묘한 정보와 미세한 세부 사항을 드러낼 수 있지만 이미지의 모션 블러를 방지하기 위해 강력한 동물 고정이 필요합니다. 안타깝게도 대부분의 최신 고정 기술은 상당한 수작업이 필요하므로 고해상도 이미징 처리량이 낮습니다. 예쁜꼬마선충 의 고정화는 전체 개체군을 재배 플레이트에 직접 쉽게 고정할 수 있는 냉각 접근 방식을 사용하여 크게 단순화됩니다. 냉각 단계는 재배 플레이트에 균일한 분포로 광범위한 온도를 설정하고 유지할 수 있습니다. 이 기사에서는 냉각 단계를 구축하는 전체 프로세스를 문서화합니다. 목표는 일반적인 연구원이 이 프로토콜에 따라 어려움 없이 실험실에서 작동 냉각 단계를 구축할 수 있도록 하는 것입니다. 세 가지 프로토콜에 따른 냉각 단계의 활용이 표시되며 각 프로토콜은 서로 다른 실험에 이점이 있습니다. 또한 최종 온도에 접근할 때의 스테이지의 냉각 프로파일과 냉각 고정을 사용하는 데 도움이 되는 몇 가지 팁이 나와 있습니다.
Introduction
고해상도 광학 현미경은 세포 내 수준에서 생체 내 생물학적 구조를 연구하는 데 없어서는 안될 도구를 제공합니다. 많은 생물학적 연구는 뉴런 형태 1,2, 막 구조 3,4 및 단백질 국소화 5,6을 포함한 미묘한 해부학적 세부 사항을 해결하기 위해 서브미크론 해상도 이미징을 필요로 합니다. 고해상도 이미지는 이미징 양식과 프로브 7,8에 따라 수 밀리 초에서 몇 초의 노출 시간이 필요합니다. 최적의 결과를 얻으려면 현미경 기반 실험을 신중하게 계획하고 수행하는 것이 중요합니다. 이러한 노력에 중요한 것은 고해상도 이미징을 용이하게 하는 효율적인 동물 준비 방법입니다.
선충 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 많은 생물학적 과정을 연구하기 위해 널리 사용되는 모델 유기체이다9. 이 작은 동물은 일반적으로 선충 성장 배지(NGM) 한천 플레이트에서 재배되며 자가 수정을 통해 빠르게 번식하므로 대규모 연구에 적합합니다. 이들의 투명성과 다양한 라벨링 기술을 통해 내부 해부학10,11을 간단하게 시각화할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충의 미세 구조는 뉴런 재생(neuron regeneration)12, 뉴런 변성(neuron degeneration)13, 세포 분열(cell division)14과 같은 세포 내 수준에서 생물학적 과정을 연구하는 데 이상적이다. 이러한 연구는 서브미크론 해상도의 이미징과 이미지 흐림을 방지할 수 있을 만큼 충분히 강력한 동물 고정을 필요로 합니다. 강력한 고정화는 3D 이미지 스택(즉, z-스택) 및 타임랩스 이미징과 같이 공간 또는 시간에서 여러 이미지를 포함하는 기술에 특히 중요합니다. 노출 사이의 동물 움직임은 결과를 모호하게 할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충의 경우, 강력한 고정화는 일반적으로 개별 동물을 수동으로 조작하고 마취제를 사용하여 슬라이드에 장착하는 것을 포함합니다15,16. 이러한 시간과 노동 집약적인 절차는 대규모 실험을 매우 어렵게 만듭니다. 동물이 원래 재배 플레이트에 직접적이고 가역적으로 고정되는 고정화 전략은 고처리량 고해상도 이미징을 가능하게 할 수 있습니다.
예쁜꼬마선충의 냉각 고정화는 몇 가지 연구에서 밝혀졌지만 널리 활용되지는 않습니다. 그것은 일반적으로 동물17,18,19을 더 억제하기 위해 미세 유체 장치와 결합된다. 그러나 미세유체 장치는 복잡하고 상당한 작동 교육이 필요하며 예쁜꼬마선충 실험의 일반적인 고체 배양 워크플로와 쉽게 통합할 수 없습니다. 따라서 미세 유체 공학은 C. elegans 고정화에 널리 사용되지 않습니다. 여기에서 제시된 것은 Chung Laboratory의 최근 간행물20과 함께 이러한 단점을 해결하기 위해 열전 냉각 단계(그림 1)를 사용하는 새로운 냉각 고정 접근 방식의 도입입니다. 냉각 단계를 통해 일반적인 60mm 폴리스티렌 배양 플레이트는 -8°C에서 실온 사이의 목표 온도(T세트)로 냉각될 수 있습니다. 이러한 냉각 단계 접근법은 최소한의 사용자 노력으로 전체 동물 개체군을 쉽고 가역적으로 고정시킬 수 있으며, 동물 처리 시간(20)의 98%를 제거할 수 있다.
아래에서는 처음부터 냉각 단계를 구축하는 절차에 대해 설명합니다. 부품 가공 및 3D 프린팅을 제외하고 전체 절차는 특별한 도구나 전문 지식 없이 4시간이 소요될 것으로 예상됩니다. 그런 다음 다양한 냉각 속도를 가진 세 가지 다른 냉각 전략과 일반적인 정립 현미경에서 예쁜꼬마선충 을 고정시키려는 사용자의 노력에 대해 자세히 설명합니다. 기본 설정 전략은 사용자 응용 프로그램에 따라 달라질 수 있습니다. 이러한 세 가지 냉각 고정화 전략에 대한 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.
Protocol
1. 냉각 단계의 각 구성 요소 제조 및 준비
알림: 냉각 stage는 여러 구성 요소로 구성됩니다( 재료 표 참조). 대부분의 구성 요소는 기성품입니다. 사파이어 창은 맞춤 주문이 필요하며 동판, 홀딩 브래킷 및 격리 플레이트는 컴퓨터 수치 제어 밀 또는 3D 프린터로 현장에서 제조할 수 있습니다. 초기 제조 후 이후 조립 공정에는 약 2-3시간이 소요됩니다.
- 컴퓨터 수치 제어 밀을 사용하여 170mm x 120mm x 3mm, 99.9% 순수 구리 금속판에서 구리판을 가공합니다(그림 2A). 이 제조에 대한 2D 도면은 보충 파일 1에 나와 있습니다. 입자가 미세한 사포를 사용하여 날카로운 모서리와 더러운 잔여물을 제거합니다.
- 고정 브래킷과 격리 플레이트를 제조하려면 3D 프린터와 1.75mm 직경의 폴리락트산(PLA) 필라멘트를 사용합니다(그림 2B, C). 더 나은 품질을 위해 3D 프린터는 0.2mm보다 미세한 레이어 높이를 제공해야 .3D 모델은 보충 파일 2 및 보충 파일 3에 제공됩니다.
2. 수냉식 조립체 구성
- 수냉식 어셈블리를 구축하기 위해 백금 경화 실리콘 튜브, 펌프 탱크, 구리 냉각 블록 및 라디에이터(그림 3A)를 준비합니다. 사용할 수 있도록 면도날, 가위, 육각 키를 준비합니다. 조립 전반에 걸쳐 물 사용으로 인한 전기적 위험에 유의하십시오.
- 실리콘 튜브를 40cm, 50cm, 80cm의 권장 길이로 세 부분으로 자릅니다. 필요한 경우 길이를 조정하십시오.
- 그림 2.2B와 같이 단계 3의 실리콘 튜브 섹션을 라디에이터, 펌프 탱크 및 구리 냉각 블록의 포트에 꽂습니다. 모든 연결이 방수인지 확인하십시오. 이제 수냉식 어셈블리가 제작되었습니다.
- 수냉식 어셈블리, 12V 전원 공급 장치, 빨간색 점퍼 와이어 3개 및 검은색 점퍼 와이어 3개, 브레드 기판 및 정제수 500mL를 준비합니다.
- 전기 안전을 위해 작업대에 액체가 없는지 확인하십시오.
- 브레드 기판을 통해 펌프 탱크와 라디에이터의 전선을 12V 전원 공급 장치에 연결합니다(그림 3C). 브레드보드는 편의를 위해 사용됩니다.
알림: 보다 영구적이고 안전한 연결을 위해 연구원은 브레드 기판을 납땜 와이어로 교체할 수 있습니다. - 일자 드라이버를 사용하여 펌프 탱크 캡을 엽니다. 깔때기를 사용하여 펌프 탱크가 약 80% 채워질 때까지 물을 추가합니다(그림 3D). 이 충전 후 펌프 탱크를 막지 마십시오.
- 12V 전원 공급 장치를 연결하거나 전원을 켜서(스위치가 있는 경우) 수냉식 어셈블리의 전원을 켭니다. 전원을 켠 후 물이 어셈블리 내부로 흐르고 라디에이터의 팬이 끊어져야 합니다.
- 펌프 탱크의 물 흐름으로 인해 탱크의 액체 레벨이 떨어집니다. 펌프 탱크가 거의 2/3로 안정화될 때까지 펌프 탱크에 물을 더 추가합니다(그림 3E).
- 라디에이터를 흔들어 기포를 제거한 다음 냉각 탱크를 막습니다.
- 다음 단계로 이동하기 전에 전원 공급 장치를 끄십시오.
3. 펠티에 차갑고 뜨거운 표면 테스트
알림: 냉각 단계의 핵심 구성 요소인 Peltier는 한쪽에서 다른 쪽으로 열을 전달하는 고체 능동 히트 펌프입니다21. 펠티에의 한 표면은 뜨거워지고 다른 표면은 전력을 공급할 때 차가워집니다. 기본적으로 Peltier 제조업체는 판매하기 전에 차가운 표면을 표시하지만 조립하기 전에 수동으로 테스트하는 것이 여전히 유용합니다.
- 그림 4A와 같이 조정 가능한 전원 공급 장치와 Peltier를 준비합니다.
- 가능한 전기 위험을 방지하기 위해 조정 가능한 전원 공급 장치가 꺼져 있는지 확인하십시오.
- 전원 공급 장치와 함께 제공되는 악어 클립을 사용하여 Peltier의 빨간색 와이어를 양극 출력에 연결하고 검은색 와이어를 조정 가능한 전원 공급 장치의 음극 출력에 연결합니다(그림 4B).
- 조정 가능한 전원 공급 장치를 켜고 전원 공급 장치의 맨 윗줄에 있는 전압 및 전류 손잡이를 모두 변조하여 약 2V로 설정합니다. 즉시 맨손가락을 사용하여 펠티에의 두 표면을 만져보십시오. 한 표면은 몇 초 안에 차가워집니다.
- 어느 표면이 차갑지 않은지 확인한 후 즉시 전원 공급 장치를 끄고 Peltier를 분리하십시오.
- 마커를 사용하여 향후 조립을 위해 차가운 표면을 나타냅니다.
4. 수냉식 어셈블리를 사용하여 펠티어를 냉각하기 위한 어셈블리 구성
- 그림 4A와 같이 스위치가 꺼진 수냉식 어셈블리, Peltier(차가운 표면 표시) 및 열 페이스트(열 전도 개선용)를 준비합니다.
- 수냉식 어셈블리에서 70% 에탄올(또는 기타 더 깨끗한 용액)로 구리 냉각 블록의 모든 표면을 청소합니다.
- 구리 수냉식 블록의 한 표면에 약 0.4g의 열 페이스트를 바르고 이 표면 방향이 아래를 향할 때 튜브가 교차하거나 구부러지는 것을 방지하는지 확인합니다. 장갑을 사용하여 피부를 보호하고 열 페이스트를 얇고 고르게 분배하십시오(그림 4C).
- 마찬가지로 Peltier의 뜨거운 표면을 청소한 다음 열 페이스트를 표면에 바릅니다(그림 4D).
- 열 페이스트를 사용하여 Peltier 뜨거운 표면을 구리 냉각 블록 표면에 연결합니다. 안전한지 확인하기 위해 압력을 가하십시오. 그림 4E와 같이 Peltier의 전선과 구리 냉각 블록의 튜브 방향을 따르십시오. 여분의 열 페이스트를 청소하십시오.
- 12V 전원 공급 장치와 조정 가능한 전원 공급 장치를 모두 꺼진 상태로 유지하십시오. 섹션 3과 같이 Peltier를 조정 가능한 전원 공급 장치에 연결합니다.
- 전기 및 수냉식 어셈블리 연결을 모두 다시 확인한 다음 12V 전원 공급 장치와 조정 가능한 전원 공급 장치를 순차적으로 켭니다.
- 조정 가능한 전원 공급 장치를 점차적으로 12V로 돌립니다. 제안된 펠티에를 사용하면 전류는 약 7.3A가 되어야 합니다.
- 2분 동안 기다립니다. 펠티에 차가운 표면의 온도는 -35 °C보다 낮아야 합니다. 적외선 온도계로 이 온도를 측정합니다(그림 4F). 손 부상을 방지하기 위해 차가운 표면을 만지지 마십시오.
- 온도가 -30 °C 이하로 도달할 수 없는 경우 모든 연결부와 구성 요소를 확인하십시오. 수냉식 어셈블리 내부의 기포는 냉각 성능이 최적화되지 않는 원인일 수 있습니다.
- 이후 단계에서 안전을 보장하려면 조정 가능한 전원 공급 장치를 끄고 1분 정도 기다린 다음 12V 전원 공급 장치를 끕니다.
5. 동판 및 사파이어 창 조립 시공
- 구리판, 직경 80mm의 사파이어 창, 열 페이스트, 4인치 너비의 테이프 및 절단용 날카로운 날을 준비합니다(그림 5A).
- 구리판과 사파이어 창을 70% 에탄올로 조심스럽게 청소하고 고운 사포를 사용하여 거친 표면을 매끄럽게 합니다.
- 그림 5B와 같이 세 개의 내부 표면에 열 페이스트를 적용합니다. 열 페이스트가 세 가지 표면적을 모두 덮지만 약 0.5mm로 너무 두껍지 않은지 확인합니다.
- 프린터 용지로 보호된 벤치 탑에 구리판을 놓습니다. 종이를 사용하면 나중에 더 쉽게 정리할 수 있습니다.
- 사파이어 창을 구리판 구멍에 삽입합니다(그림 5C). 열 페이스트가 다른 영역으로 이동하는 것을 방지하기 위해 삽입하는 동안 사파이어가 회전하지 않는지 확인하십시오. 과도한 열 페이스트를 제거하십시오.
- 4인치 너비의 테이프를 구리판-사파이어 창 어셈블리의 상단 표면( 그림 5D와 같이 정사각형 함몰 영역이 있는 표면)에 부착합니다. 접착력을 한쪽에서 다른 쪽으로 천천히 안내하여 붙이는 동안 테이프와 구리 표면 사이에 기포가 생기지 않도록 하십시오.
- 그림 5E에 따라 날카로운 칼날을 사용하여 테이프의 지정된 파란색 점선 영역을 잘라냅니다. 절단하면 두 개의 나사 구멍, 정사각형 함몰 및 사파이어 창의 직경 70mm 영역이 노출됩니다.
- 동판-사파이어 창 어셈블리의 바닥면에 테이프를 붙인 다음 그림 5F와 같이 이 표면에서 절단 절차(사파이어 영역만 해당)를 반복합니다.
알림: 이제 사파이어 창이 동판에 고정되고 구리 표면이 녹슬지 않도록 보호됩니다.
6. 냉각 단계 최종 조립
- 모든 필수 하위 어셈블리 및 구성 요소가 준비되었는지 확인합니다.
- 약 0.4g의 열 페이스트를 구리판의 사각 함몰부에 적용합니다(그림 6A).
- 약 0.4g의 열 페이스트를 펠티에의 차가운 표면에 바릅니다. Peltier는 이미 구리 냉각 블록에 부착되어 있습니다(그림 6B).
- 펠티에 차가운 표면을 아래쪽 압력으로 구리판 함몰부에 연결합니다. 초과 써멀 페이스트를 모두 청소합니다(그림 6C).
- 구리 냉각 블록 상단에 3D 프린팅 브래킷을 장착한 다음 육각 키를 사용하여 8-32, 0.5인치 길이의 나사 2개를 조여 브래킷을 구리판에 고정합니다(그림 6D). 펠티에에서 구리로의 적절한 열 전도를 보장하기 위해 인쇄된 브래킷이 파손되거나 변형되지 않도록 낮은 토크 조임을 사용하십시오.
- 작동 중 벤치탑 또는 현미경 베이스에서 열 절연을 위해 3D 프린팅된 절연 베이스에 구리판을 놓습니다(그림 6D).
- 냉각 stage가 조립되어 사용할 준비가 되었습니다(그림 6E).
- 현미경 검사의 경우 완성된 냉각 단계를 수직 현미경 플랫폼에 놓습니다(그림 7A).
- 냉각 단계의 조립이 완료되었습니다. 더 자세한 내용은 정 연구소의 동반 간행물에서 확인할 수 있으며, 이 간행물은 상세한 전략과 동물 움직임을 완전히 특징짓고 있다20.
알림: 다음 섹션에서는 느림, 빠름 및 갑작스러운 냉각 프로토콜에 대해 설명합니다. L4 또는 젊은 성인 연령의 N2 자웅동체를 사용하여 다음 데이터를 생성했습니다. 서냉 전략은 6°C에서 20°C 배양된 N2 동물을 고정시키는데 유용합니다. 15°C-배양된 N2 동물은 1°C에서20°C에서 가장 강하게 고정화된다. 이 세 가지 냉각 프로토콜 간의 간략한 비교가 표 1에 나와 있습니다.
7. 느린 냉각 고정 프로토콜
- 뚜껑이 있는 재배 접시를 4°C 냉장고로 옮깁니다.
- 재배판을 냉장고로 옮긴 후 냉각을 켜십시오.tage의 12V 전원 공급 장치를 켜고 조정 가능한 전원 공급 장치 전압을 5.5V로 설정합니다.
- 뚜껑이 있는 재배 플레이트를 4°C 냉장고에 1시간 동안 머무른 후, 플레이트를 즉시 냉각 단계로 옮기고 뚜껑을 제거한다(도 7A). 이러한 재배 플레이트는 일반적으로 약 6°C입니다. 예냉 단계는 한천 표면을 6°C로 유지하기에 충분히 안정적이고 차갑습니다.
- 한천 표면 온도가 측정되거나 동물의 움직임을 관찰하여 변하면 6°C에서 안정화될 때까지 전압을 약간 조정합니다.
- 동물은 이송 시 적절하게 고정되어 있습니다.
8. 빠른 냉각 고정 프로토콜
알림: 급속 냉각 전략은 가장 기본적인 고정 방법입니다(동영상 1 참조). 그러나 한천 플레이트는 T세트에 도달하는 동안 장시간 동안 무대를 유휴 상태로 차지합니다. 또한, 강력한 고정화가 필요하고 T세트 가 6°C인 경우 유휴 시간은 약 1시간20분으로 연장됩니다.
- 냉각 s를 켭니다.tage의 12V 전원 공급 장치를 설정하고 조정 가능한 전원 공급 장치 볼륨을 약 12V로 설정합니다.tage 약 10분 동안 기다립니다.
- 배양 플레이트를 인큐베이터에서 냉각 단계로 직접 가져와 뚜껑을 제거합니다.
- 한천 표면 온도가 (Tset + ΔT) °C로 감소하면 조정 가능한 전원 공급 장치를 V 세트로 조정하고 한천이 T세트에 도달할 때까지 기다립니다. V 세트는 T세트에서 한천을 안정화시키기에 적합한 전압이다. ΔT는 과냉각을 방지하는 변수입니다. T세트, ΔT, 및 V세트의 조합에 대해서는 표 2를 참조한다.
참고: 표 2 에 제시된 데이터는 특히 정 실험실과 관련이 있으므로 실험 매개변수는 각 개별 실험의 고유한 환경 및 사용 조건에 따라 달라질 수 있습니다. - 동물은 한천이 T세트에 도달하면 고정됩니다. 고정화는 냉각 시작 후 ~50분까지 시간이 지남에 따라 향상됩니다.
9. 급격한 냉각 고정 프로토콜
알림: 갑작스러운 냉각 전략은 가장 많은 사용자 시간을 소비하지만 재배 온도에서 동물을 가장 빠르게 움직이지 못하게 합니다.
- 냉각 s를 켭니다.tage의 12V 전원 공급 장치 및 조정 가능한 전원 공급 장치 볼륨을 약 12V로 전환합니다.tage를 약 10분 동안 유지합니다.
- 비어 있는 한천 플레이트를 냉각 단계로 가져옵니다. 고속 냉각 고정화 프로토콜의 단계 8.3을 사용하여 T세트에서 한천 표면 온도를 안정화시킨다.
- 동물을 원래 재배 접시에서 냉각 단계에 있는 냉각된 접시로 옮깁니다.
- 작은 동물 크기에 따라 동물은 몇 초 안에 T세트 로 냉각되고 고정될 것으로 예상됩니다. 고정화는 냉각 시작 후 ~50분까지 시간이 지남에 따라 향상됩니다.
10. 냉각 고정 후 동물의 부활
- 냉각된 배양 플레이트를 원래 인큐베이터 또는 실온으로 다시 이동합니다.
- 접시에 있는 모든 벌레가 정상적인 크롤링 및 먹이 행동으로 돌아올 때까지 20분에서 1시간 동안 기다리십시오.
Representative Results
냉각 온도 측정
초기 냉각 고정 실험의 경우 동물이 적절하게 고정될 수 있도록 한천 표면 온도를 추적하는 것이 중요합니다. 초기 실험에서 복제되는 향후 실험은 일반적으로 빈번한 온도 추적 없이 동일한 매개변수를 사용할 수 있습니다. 온도 측정을 위해 온도계의 열전대 팁은 70% 에탄올 용액을 사용하여 멸균되며 사용하기 전에 에탄올이 완전히 증발할 때까지 기다립니다. 그런 다음 열전대 팁을 NGM 한천에 1mm 삽입하여 정확한 온도 판독을 보장합니다. 온도계 팁은 cl을 사용하여 고정됩니다.amp 홀더 또는 기타 홀더(그림 7B).
적외선 카메라로 온도 측정
냉각 stage는 플레이트 중앙 직경 40mm 영역의 온도 분포가 균일하도록 설계되었습니다. 전방 적외선(FLIR) 카메라는 한천 표면의 온도 분포를 이미지화하는 데 사용됩니다. T세트 가 1, 3 또는 6°C일 때 최대 온도 차이는 약 1°C입니다(그림 8A).
급속 냉각 전략으로 냉각 속도 평가
고속 냉각 전략은 12V에서 스테이지의 냉각 속도를 특성화하는 데 사용됩니다. 20°C 플레이트를 냉각 스테이지에 놓고 열전대 온도계를 사용하여 표면 온도를 추적합니다. 스테이지는 20°C 플레이트를 6분 안에 6°C로, 10분 안에 1°C로 냉각시키고, 결국 약 40분 후에 -7°C 이하로 안정화합니다(그림 8B).
정립 현미경 플랫폼에서 냉각 스테이지 사용
정립 현미경은 일반적으로 이미징을 위한 대물렌즈, 샘플 보유를 위한 스테이지 및 조명으로 구성됩니다. 이 냉각 스테이지는 일반적인 정립 현미경 스테이지에서 사용하도록 설계되었으며 삽입 및 제거가 용이합니다(그림 8C). 이미징 또는 스크리닝을 위해 냉각 고정이 필요한 경우 냉각 단계를 현미경 단계에 놓기만 하면 설치를 완료하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
냉각판에 웜이 고정되는 모습은 동영상 1에 나와 있습니다.
그림 1: 냉각 스테이지 장치의 3D 모델. 명확성을 위해 전자 연결은 표시되지 않습니다. 탱크는 냉각 블록을 통해 물을 펌핑하여 스테이지에 내장된 펠티에에 의해 전달되는 열을 제거합니다. 일반적인 60mm 폴리스티렌 재배 플레이트는 투명한 사파이어 창에 놓고 단계별로 냉각할 수 있습니다. Solidworks에서 생성된 모델입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 제조할 부품의 3D 모델. (A) 동판. (B) 3D 프린팅 홀딩 브래킷. (C) 3D 프린팅 격리 플레이트. Solidworks에서 생성된 모델. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 수냉식 어셈블리 . (A) 개별 구성 요소. 튜브는 지정된 길이로 절단됩니다. (B) 수냉식 구성 요소가 연결되었습니다. (C) 펌프 탱크와 라디에이터를 12V 전원 공급 장치에 연결하는 전선. 일반적으로 빨간색 전선은 양극 끝에 연결되고 검은색 전선은 음극 끝에 연결됩니다. (D) 펌프에 정제수를 붓습니다. (E) 최적의 펌프 효율을 위해 탱크를 2/3 이상 채웠습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 펠티에와 수냉식 어셈블리 연결. (A) 펠티에를 작동하기 위한 구성 요소. (B) 조정 가능한 전원 공급 장치를 사용하여 펠티에의 뜨거운면과 저온면을 결정합니다. 안전을 위해 2V 이하가 사용됩니다. (C) 구리 블록의 표면에 열 페이스트를 도포하는 것. (D) 펠티에 뜨거운 표면에 열 페이스트를 균일하게 도포합니다. (E) 펠티어의 뜨거운면을 열 페이스트로 구리 블록에 눌렀습니다. (F) 펠티에 저온 표면 온도를 측정하는 데 사용되는 적외선 온도계. 이상적으로는 저온 온도가 -35 °C 근처에 도달할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 구리판과 사파이어 창 조립 . (A) 필요한 구성 요소. (B) 사파이어 창이 접촉하는 구리판의 세 가지 내부 표면에 열 페이스트를 도포합니다. 세 표면의 위치를 보여주는 구리판의 두 가지 아래쪽 보기. (C) 동판 구멍의 사파이어 창. (D) 어셈블리의 상단 표면에 테이프를 붙입니다. (E) 윗면: 파란색 점선은 테이프를 자르고 제거할 위치를 나타냅니다: 정사각형 함몰부, 두 개의 구멍 및 70mm 직경의 사파이어 영역. (F) 바닥면: 그림과 같이 테이프를 자르고 제거합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 냉각 단계 최종 조립 . (A) 동판의 함몰부에 적용된 열 페이스트. (B) 펠티에의 차가운 쪽에 적용된 열 페이스트. (C) 함몰부에 연결된 펠티에의 차가운 표면. (D) 나사를 사용하여 구리판에 고정된 구리 냉각 블록. 냉각 stage절연 베이스에서. (E) 냉각 단계 완료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 냉각 stage, 현미경 및 열전대 측정. (A) 이미징을 위해 현미경 베이스에 배치된 냉각 단계. 사파이어 창은 투명하여 투과가 가능합니다. (B) NGM 한천 표면 온도를 측정하는 데 사용되는 열전대 온도계. 팁은 NGM 한천에 약 1mm 삽입되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 냉각 단계 특성 분석 및 사용 . (A) 1, 3 및 6°C로 냉각된 한천 표면을 보여주는 열화상. 중앙 40mm 영역 내의 균일한 온도 분포(흰색 점선). (B) 12V에서 냉각 단계에서 시간 경과에 따른 NGM 한천 표면의 온도. NGM 한천 표면은 -7°C 이하로 냉각될 수 있습니다. 도 7B의 방법에 의해 측정된 온도. (C) 일반적인 정립 현미경에서 사용되는 냉각 단계. 냉각 stage는 쉽게 설치하거나 제거할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 느린 냉각 | 빠른 냉각 | 갑작스런 냉각 | |
| 무대 점령 | 최소 | 오래 | 보통 |
| 동물이 움직이지 않을 때까지의 시간 | 오래 | 보통 | 매우 짧음 |
| 고정 강도 | 강하다 | 보통 | 보통 |
| 사용자 노력 | 최소 | 최소값보다 약간 더 많음 | 최대 |
표 1: 냉각 전략 비교.
| T세트 (°C) | ΔT (°C) | V세트 (V) |
| 1 | 2 | 8 |
| 2 | 3 | 7.4 |
| 3 | 4.5 | 7 |
| 4 | 5.5 | 6.5 |
| 5 | 6 | 5.9 |
| 6 | 6 | 5.5 |
표 2: 급속 냉각 전략에서 원하는 온도를 달성하기 위한 매개변수.
보충 파일 1: 미터법의 동판. 동판 가공을 위한 A2D 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 고정 브래킷. Solidworks에서 열거나 수정하고 3D 프린팅 소프트웨어로 내보낼 수 있는 고정 브래킷의 3D 도면입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3: 격리 플레이트. Solidworks에서 열거나 수정하고 3D 프린팅 소프트웨어로 내보낼 수 있는 격리 플레이트의 3D 도면입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 1: 냉각 비디오. 2°C에서 NGM 한천 플레이트에 고정화 웜. 플레이트를 실온에서 2°C로 냉각시키고, 2°C에서 수 분 동안 머물렀다. 이어서, 냉각 스테이지를 끄고 플레이트를 자연적으로 실온으로 예열하기 시작했다. 동영상은 6분 안에 1시간 동영상에 맞게 10배 빨라집니다. 이 동영상을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 가격 추정 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
냉각 단계 제조, 조립 및 사용법이 이 원고에 나와 있습니다. 대부분의 구성 요소는 온라인으로 구입할 수 있는 기성품입니다. 동판 및 사파이어 창과 같은 일부 구성 요소는 맞춤 주문이 필요하며 제작하는 데 최대 1개월이 소요될 수 있습니다. 3D 프린팅이 가능한 다른 구성 요소는 대부분의 연구 기관에서 쉽게 제작할 수 있습니다(보충 표 1). 조립 공정은 몇 가지 도구만 있으면 되며 비전문가도 몇 시간 안에 신속하게 완료할 수 있습니다. 따라서 대부분의 생물학 실험실은 이 장치를 쉽게 구현할 수 있어야 합니다.
냉각 단계 및 냉각 고정화 접근법은 기존 고정화 방법에 비해 몇 가지 중요한 개선 사항을 가지고 있으며, 이는 원래 간행물20에 자세히 설명되어 있습니다. 간단히 말해서, 냉각 단계는 배아와 다우어를 포함한 모든 연령대의 많은 C. elegans 개체군을 표준 현미경 워크플로 하에서 일반적인 배양 플레이트에 강력하게 고정할 수 있도록 합니다. 미세 유체 공학과 같은 복잡한 하드웨어 설정이 필요하지 않으며 더 강력한 고정 효과를 제공합니다. 또한 화학 물질을 사용하지 않기 때문에 동물과 연구자에 대한 독성 화학 물질 노출을 최소화하는 동시에 유사한 고정 효과를 제공합니다. 이러한 기술적 기능을 통해 이 장치를 광범위하게 적용할 수 있으며 많은 수의 동물에 대한 고해상도 생체 내 현미경이 필요한 많은 실험에 접근할 수 있습니다.
장치를 만드는 동안 모든 열 페이스트 적용과 사파이어 창을 쿠퍼 플레이트에 고정하기 위한 넓은 테이프를 포함하여 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 열 페이스트는 틈을 낮은 열 저항 재료로 대체하여 강력한 열 전도성을 보장합니다. 원하는 냉각 성능을 달성하려면 구리판에 대한 Peltier 저온 표면, 구리 냉각 블록에 대한 Peltier 고온 표면, 사파이어 창에 대한 동판을 포함하여 모든 맞닿는/접촉 표면 사이에 페이스트를 적절하게 도입해야 합니다. 무대에 적용된 넓은 테이프는 구리판을 격리하여 공기와 결로로 인한 가열을 방지하여 녹을 유발합니다. 또한 사파이어 창과 구리판 사이의 연결을 강화합니다. 따라서 열 페이스트와 와이드 테이프를 적용하는 경우 모두 각별한 주의가 필요합니다.
실제 냉각 고정 실험에서 전압 및 시간과 같은 이 원고에 제공된 매개변수는 플레이트 내 한천의 양, 스테이지의 효율성, 주변 온도 및 습도와 같은 배양 플레이트 및 스테이지의 특정 특성에 따라 달라집니다. 향후 수정에서는 PID(Proportional-Integral-Derivative)와 같은 피드백 컨트롤러를 설치하여 냉각 단계에 입력되는 전압을 능동적으로 조정하여 원하는 온도를 달성하고 안정화할 수 있습니다.
이러한 냉각 단계 고정화에는 몇 가지 한계가 있으며, 이는 최초 간행물20에 자세히 설명되어 있다. 간단히 말해서, 다른 온도에서 자란 동물은 다른 정도로 고정되어 추가 미세 조정이 필요할 수 있습니다. 또한 이 전류 냉각 stage는 도립 현미경용으로 설계되지 않았습니다. 또한, 배양 플레이트 상의 이미징 또는 스크리닝은 플레이트에 오염을 도입할 수 있다.
우리는 복합 정립 현미경 및 도립 현미경을 포함한 다양한 이미징 플랫폼에 적합한 새로운 버전의 냉각 스테이지를 설계하고 있습니다. 이러한 새로운 디자인은 이러한 플랫폼에서 이미징하는 동안 배양 플레이트에 직접 동물 냉각 고정을 허용합니다. 이러한 냉각 단계의 이미징은 직립 구성과 유사한 긴 작동 거리의 공기 침수 대물렌즈를 사용합니다. 오늘날 공기 침지 대물렌즈는 최대 0.9의 개구수를 가질 수 있으며, 이는 녹색 형광 단백질 이미징을 위한 약 300nm 해상도를 제공합니다. 따라서 새로운 냉각 단계와 현미경의 조합은 서브미크론 해상도의 형광 이미징을 일상적으로 허용할 수 있습니다.
또한 경험에 따라 냉각 단계를 사용하는 데 도움이 되는 몇 가지 팁을 제공합니다. 예를 들어, 개인은 수냉식 어셈블리 내부에 기포가 있는지 확인해야 합니다. 기포는 펠티에 고온 표면으로의 냉각을 저하시켜 냉각 단계의 냉각 효율을 저하시킵니다. 기포가 있는 경우 12V 전원 공급 장치를 켜서 물이 흐르도록 하고 물 흐름의 모든 구성 요소를 흔들어야 합니다. 갇힌 영역에서 기포를 배출하고 펌프 탱크에서 배출할 수 있습니다. 연구원은 수냉식 어셈블리를 조립할 때 물 흐름 튜브가 구부러지거나 교차되지 않도록 해야 합니다. 튜브가 구부러지거나 교차하면 물의 적절한 흐름을 방해하고 냉각 효율이 감소할 수 있습니다. 튜브 연결은 적절하게 맞고 조여져야 합니다. 필요한 경우 기밀성을 보장하기 위해 직경이 다른 부드러운 튜브를 대신 사용할 수 있습니다. 연결이 충분히 빡빡하지 않더라도 페이스트는 나중에 사용하는 동안 막힐 수 있으므로 적용해서는 안 됩니다. 실내 습도는 냉각 성능에 영향을 미치고 냉각 단계에 응결과 얼음을 유발합니다. 냉각 단계에 재배 판을 놓기 전에 종이 티슈를 사용하여 결로를 제거하거나 방열판을 사용하여 사파이어 창에 형성된 얼음을 빠르게 제거하는 것이 좋습니다. 펌프 탱크와 라디에이터 팬은 동일한 테이블에서 작동하는 경우 현미경에 작은 진동을 일으킬 수 있습니다. 현미경 진동은 획득한 이미지를 흐리게 하므로 피해야 합니다. 쿠션을 사용하여 탱크와 라디에이터를 기계적으로 단열하거나 별도의 근처 테이블에 놓을 수 있습니다. 냉각 stage는 가열 stage가 될 수 있습니다.tage 펠티에에 대한 전기 연결을 반대로 합니다.
Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이나 기타 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 동판 가공에 대해 Noah Joseph (Northeastern Bioengineering Department)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
| 8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
| bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
| copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
| copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
| digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
| isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
| multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
| Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
| packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
| pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
| radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
| sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
| thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
| tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |
References
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