Summary
Bu yazıda, C. elegans'ı orijinal yetiştirme plakalarında toplu halde hareketsiz hale getirmek için bir soğutma aşaması inşa etmek ve işletmek için protokoller açıklanmaktadır.
Abstract
Yüksek çözünürlüklü in vivo mikroskopi yaklaşımları, model hayvan Caenorhabditis elegans (C. elegans) içindeki ince bilgileri ve ince ayrıntıları ortaya çıkarabilir, ancak görüntülerde hareket bulanıklığını önlemek için güçlü hayvan immobilizasyonu gerektirir. Ne yazık ki, en güncel immobilizasyon tekniklerinin çoğu, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi düşük verimli hale getiren önemli miktarda manuel çaba gerektirir. C. elegans'ın immobilizasyonu, tüm popülasyonları doğrudan yetiştirme plakalarında kolayca hareketsiz hale getirebilen bir soğutma yaklaşımı kullanılarak büyük ölçüde basitleştirilmiştir. Soğutma aşaması, yetiştirme plakası üzerinde eşit bir dağılıma sahip çok çeşitli sıcaklıklar oluşturabilir ve koruyabilir. Bu makalede, soğutma aşamasını inşa etme sürecinin tamamı belgelenmiştir. Amaç, tipik bir araştırmacının bu protokolü takiben laboratuvarlarında zorlanmadan operasyonel bir soğutma aşaması oluşturabilmesidir. Üç protokolü takip eden soğutma aşamasının kullanımı gösterilmiştir ve her protokolün farklı deneyler için avantajları vardır. Ayrıca, son sıcaklığına yaklaşırken sahnenin örnek bir soğutma profili ve soğutma immobilizasyonunun kullanılmasında bazı yararlı ipuçları da gösterilmiştir.
Introduction
Yüksek çözünürlüklü optik mikroskopi, hücre altı düzeyde in vivo biyolojik yapıları incelemek için vazgeçilmez bir araç sağlar. Birçok biyolojik çalışma, nöron morfolojisi 1,2, membran yapısı 3,4 ve protein lokalizasyonu 5,6 dahil olmak üzere ince anatomik detayları çözmek için mikron altı çözünürlüklü görüntüleme gerektirir. Yüksek çözünürlüklü bir görüntü, görüntüleme yöntemine veprob 7,8'e bağlı olarak birkaç milisaniye ila saniye arasında bir pozlama süresi gerektirir. En iyi sonuçları elde etmek için, mikroskopi tabanlı deneyleri dikkatlice planlamak ve yürütmek önemlidir. Bu çaba için çok önemli olan, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi kolaylaştıran etkili bir hayvan hazırlama yöntemidir.
Nematod C. elegans, birçok biyolojik süreci incelemek için yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır9. Bu küçük hayvan tipik olarak nematod büyüme ortamı (NGM) agar plakaları üzerinde yetiştirilir ve kendi kendine döllenme yoluyla hızla çoğalırlar, bu da onları büyük ölçekli çalışmalar için çok uygun hale getirir. Şeffaflıkları ve çok çeşitli etiketleme teknikleri, iç anatomilerinin10,11 doğrudan görselleştirilmesini sağlar. C. elegans'taki ince yapılar, nöron rejenerasyonu12, nöron dejenerasyonu 13 ve hücre bölünmesi14 gibi hücre altı seviyedeki biyolojik süreçleri incelemek için idealdir. Bu tür çalışmalar, mikron altı çözünürlükte görüntüleme ve görüntü bulanıklığını önleyecek kadar güçlü hayvan immobilizasyonu gerektirir. Güçlü immobilizasyon, 3D görüntü yığınları (yani z-yığınları) ve hızlandırılmış görüntüleme gibi uzay veya zamanda birden fazla görüntü içeren teknikler için özellikle çok önemlidir. Pozlamalar arasındaki herhangi bir hayvan hareketi sonucu gizleyebilir. C. elegans için, güçlü immobilizasyon tipik olarak bireysel hayvanların manuel manipülasyonunu ve anestezik bir15,16 ile slaytlara monte edilmesini içerir. Bu zaman ve emek yoğun prosedürler, büyük ölçekli deneyleri çok zorlaştırır. Hayvanların orijinal yetiştirme plakalarında doğrudan ve geri dönüşümlü olarak hareketsiz hale getirildiği bir immobilizasyon stratejisi, yüksek verimli yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi mümkün kılabilir.
C. elegans'ın soğutma immobilizasyonu birkaç çalışmada gösterilmiştir, ancak yaygın olarak kullanılmamaktadır. Genellikle hayvanları daha da kısıtlamak için mikroakışkan bir cihazla birleştirilir17,18,19. Bununla birlikte, mikroakışkan cihazlar karmaşıktır, önemli operasyonel eğitim gerektirir ve C. elegans deneylerinin tipik katı yetiştirme iş akışlarıyla kolayca entegre edilemez. Bu nedenle, mikroakışkanlar C. elegans immobilizasyonu için yaygın olarak kullanılmamaktadır. Burada, Chung Laboratuvarı'nın son yayını20 ile birlikte, bu eksiklikleri gidermek için termoelektrik bir soğutma aşaması (Şekil 1) kullanan yeni bir soğutma immobilizasyon yaklaşımının tanıtılması sunulmaktadır. Soğutma aşaması ile, tipik bir 60 mm polistiren yetiştirme plakası, -8 ° C ile oda sıcaklığı arasındaki herhangi bir hedef sıcaklığa (Tseti) soğutulabilir. Bu soğutma aşaması yaklaşımı, minimum kullanıcı çabasıyla tüm hayvan popülasyonunu kolayca ve geri dönüşümlü olarak hareketsiz hale getirebilir ve hayvan işleme süresinin% 98'ini ortadan kaldırabilir20.
Aşağıda, sıfırdan bir soğutma aşaması oluşturma prosedürleri açıklanmaktadır. Parçaların işlenmesi ve 3D baskı dışında, tüm prosedürün özel takımlar veya uzmanlık gerektirmeden 4 saat sürmesi bekleniyor. Daha sonra, değişen soğutma hızlarına sahip üç farklı soğutma stratejisi ve tipik bir dik mikroskopta C. elegans'ı hareketsiz hale getirmek için kullanıcı çabaları daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Tercih edilen strateji, kullanıcı uygulamasına bağlı olabilir. Bu üç soğutma immobilizasyon stratejisi için protokoller ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Protocol
1. Soğutma aşamasının her bir bileşeninin imalatı ve hazırlanması
NOT: Soğutma aşaması birkaç bileşenden oluşur (bkz. Bileşenlerin çoğu kullanıma hazırdır. Safir pencere özel bir sipariş gerektirirken, bakır plaka, tutma braketi ve izolasyon plakası bir bilgisayar sayısal kontrol değirmeni veya 3D yazıcı ile yerinde üretilebilir. İlk üretimden sonra, daha sonraki montaj işlemi yaklaşık 2-3 saat sürer.
- Bakır levhayı 170 mm x 120 mm x 3 mm, %99,9 saf bakır sacdan işlemek için bir bilgisayarlı sayısal kontrol değirmeni kullanın (Şekil 2A). Bu üretim için 2B çizim Ek Dosya 1'de sağlanmıştır. Keskin kenarları ve kirli kalıntıları gidermek için ince kumlu zımpara kağıdı kullanın.
- Tutma braketini ve izolasyon plakasını üretmek için, bir 3D yazıcı ve 1,75 mm çapında polilaktik asit (PLA) filamenti kullanın (Şekil 2B, C). Daha iyi kalite için, 3B yazıcı 0,2 mm'den daha ince bir katman yüksekliği sağlamalıdır.3D modeller Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3'te sağlanmıştır.
2. Su soğutma tertibatının inşası
- Su soğutma tertibatını oluşturmak için platin kürlü silikon tüpü, pompa tankını, bakır soğutma bloğunu ve radyatörü (Şekil 3A) hazırlayın. Kullanıma hazır bir tıraş bıçağı, makas ve altıgen anahtar hazırlayın. Montaj sırasında su kullanımından kaynaklanan elektriksel tehlikelerin farkında olun.
- Silikon tüpü önerilen uzunlukları 40 cm, 50 cm ve 80 cm olan üç bölüme ayırın. Gerektiğinde uzunluğu ayarlayın.
- Silikon boru bölümlerini adım 2.2'den itibaren radyatör, pompa tankı ve bakır soğutma bloğunun bağlantı noktalarına Şekil 3B'de gösterildiği gibi takın. Tüm bağlantıların su geçirmez olduğundan emin olun. Su soğutma tertibatı şimdi inşa edildi.
- Su soğutma tertibatını, 12 V güç kaynağını, üç kırmızı ve üç siyah jumper teli, bir breadboard ve 500 mL arıtılmış suyu hazırlayın.
- Elektrik güvenliği için tezgahın sıvıdan arındırılmış olduğundan emin olun.
- Pompa tanklarını ve radyatör kablolarını breadboard üzerinden 12 V güç kaynağına bağlayın (Şekil 3C). Breadboard kolaylık sağlamak için kullanılır.
NOT: Daha kalıcı ve güvenli bir bağlantı için, araştırmacılar breadboard'u lehimleme telleriyle değiştirebilirler. - Pompa deposu kapağını düz başlı bir tornavida kullanarak açın. Pompa tankı yaklaşık% 80 dolana kadar su eklemek için bir huni kullanın (Şekil 3D). Bu dolumdan sonra pompa deposunu kapatmayın.
- Su soğutma tertibatını 12 V güç kaynağını takarak veya açarak (bir anahtar varsa) çalıştırın. Açıldıktan sonra, su düzeneğin içine akacak ve radyatör üzerindeki fanlar üflenmelidir.
- Pompa tankından gelen su akışı nedeniyle, tanktaki sıvı seviyesi düşecektir. Pompa deposuna yaklaşık 2/3 dolulukta stabilize olana kadar daha fazla su ekleyin (Şekil 3E).
- Hava kabarcıklarından kurtulmak için radyatörü sallayın ve ardından soğutma tankını kapatın.
- Sonraki adıma geçmeden önce güç kaynağını kapatın.
3. Peltier soğuk ve sıcak yüzeylerin test edilmesi
NOT: Soğutma aşamasının önemli bir bileşeni olan Peltier, ısıyı bir taraftan diğer tarafaaktaran katı hal aktif bir ısı pompasıdır 21. Peltier'in bir yüzeyi ısınır, diğer yüzeyi ise elektrik gücü sağlarken soğur. Varsayılan olarak, Peltier üreticileri soğuk yüzeyi satmadan önce işaretler, ancak montajdan önce manuel olarak test etmek yine de yararlıdır.
- Ayarlanabilir güç kaynağını ve Peltier'i Şekil 4A'da gösterildiği gibi hazırlayın.
- Olası elektrik tehlikelerini önlemek için ayarlanabilir güç kaynağının kapalı olduğundan emin olun.
- Peltier'in kırmızı telini pozitif çıkışa ve siyah teli ayarlanabilir güç kaynağının negatif çıkışına, güç kaynağıyla birlikte verilen timsah klipsleriyle bağlayın (Şekil 4B).
- Ayarlanabilir güç kaynağını açın ve güç kaynağının üst sırasındaki voltaj ve akım düğmelerini modüle ederek yaklaşık 2 V'a ayarlayın. Peltier'in iki yüzeyini hissetmek için hemen çıplak parmağınızı kullanın. Bir yüzey birkaç saniye içinde soğur.
- Hangi yüzeyin soğuk olduğunu belirledikten sonra, hemen güç kaynağını kapatın ve Peltier'in bağlantısını kesin.
- Gelecekteki montaj için soğuk yüzeyi belirtmek üzere bir işaretleyici kullanın.
4. Su soğutma tertibatı kullanarak Peltier'i soğutmak için tertibatı inşa etmek
- Şekil 4A'da gösterildiği gibi, kapatılmış su soğutma tertibatını, Peltier'i (soğuk yüzey işaretli) ve termal macunu (gelişmiş termal iletim için) hazırlayın.
- Bakır soğutma bloğunun tüm yüzeylerini su soğutma tertibatında% 70 etanol (veya başka bir temiz çözelti) ile temizleyin.
- Bakır su soğutma bloğunun bir yüzeyine yaklaşık 0,4 g termal macun uygulayın ve bu yüzey oryantasyonunun tüplerin aşağı bakarken geçmesini veya bükülmesini önleyeceğinden emin olun. Cildi korumak için bir eldiven kullanın ve termal macunu ince ve eşit bir şekilde dağıtmaya çalışın (Şekil 4C).
- Benzer şekilde, Peltier'in sıcak yüzeyini temizleyin, ardından termal macunu yüzeye uygulayın (Şekil 4D).
- Peltier sıcak yüzeyini bakır soğutma bloğu yüzeyine termal macunla bağlayın. Güvenli olduğundan emin olmak için basınç uygulayın. Peltier üzerindeki tellerin ve bakır soğutma bloğunun borularının yönünü Şekil 4E'de gösterildiği gibi takip edin. Fazla termal macunu temizleyin.
- Hem 12 V güç kaynağını hem de ayarlanabilir güç kaynağını kapalı tutun. Peltier'i bölüm 3'te olduğu gibi ayarlanabilir güç kaynağına bağlayın.
- Hem elektrik hem de su soğutmalı montaj bağlantılarını yeniden kontrol edin ve ardından 12 V güç kaynağını ve ayarlanabilir güç kaynağını sırayla açın.
- Ayarlanabilir güç kaynağını kademeli olarak 12 V'a çevirin. Önerilen Peltier ile, akım 7.3 A civarında olmalıdır.
- 2 dakika bekleyin; Peltier soğuk yüzeyinin sıcaklığı -35 ° C'den daha soğuk olmalıdır. Bu sıcaklığı kızılötesi termometre ile ölçün (Şekil 4F). Ellerin yaralanmasını önlemek için soğuk yüzeye dokunmayın.
- Sıcaklık -30 ° C'nin altına ulaşamıyorsa tüm bağlantıları ve bileşenleri kontrol edin. Su soğutma tertibatının içindeki hava kabarcıkları, optimum olmayan soğutma performansının olası bir nedenidir.
- Sonraki adımlarda güvenliği sağlamak için ayarlanabilir güç kaynağını kapatın, 1 dakika bekleyin ve ardından 12 V güç kaynağını kapatın.
5. Bakır levha ve safir pencere montajı yapımı
- Bakır plakayı, 80 mm çapında safir pencereyi, termal macunu, 4 inç genişliğinde bir bandı ve kesme için keskin bir bıçağı hazırlayın (Şekil 5A).
- Bakır plakayı ve safir pencereyi %70 etanol ile dikkatlice temizleyin ve pürüzlü yüzeyleri pürüzsüzleştirmek için ince kumlu zımpara kağıdı kullanın.
- Termal macunu Şekil 5B'de gösterildiği gibi üç iç yüzeye uygulayın. Termal macunun üç yüzey alanını da kapsadığından ancak çok kalın olmadığından, yaklaşık 0,5 mm olduğundan emin olun.
- Bakır plakayı yazıcı kağıdı ile korunan tezgahın üzerine yerleştirin. Kağıt, daha sonraki temizliği kolaylaştırır.
- Safir pencereyi bakır levha deliğine yerleştirin (Şekil 5C). Termal macunun diğer alanlara hareket etmesini önlemek için safirin yerleştirme sırasında dönmediğinden emin olun. Fazla termal macunu çıkarın.
- 4 inç genişliğindeki bandı bakır levha-safir pencere tertibatının üst yüzeyine yapıştırın ( Şekil 5D'de gösterildiği gibi kare çöküntü alanına sahip yüzey). Yapışmayı yavaşça bir taraftan diğerine yönlendirerek yapıştırma sırasında bant ve bakır yüzeyler arasındaki hava kabarcıklarından kaçının.
- Şekil 5E'yi izleyerek keskin bir bıçak kullanarak bandın belirtilen mavi kesikli alanlarını kesin. Kesme, safir pencerenin iki diş deliğini, kare çöküntüsünü ve 70 mm çapındaki alanını ortaya çıkarır.
- Bakır levha-safir pencere tertibatının alt yüzeyini bantlayın ve ardından Şekil 5F'de gösterildiği gibi bu yüzeyde kesme işlemini (yalnızca safir alan) tekrarlayın.
NOT: Şimdi, safir pencere bakır levhaya sabitlenir ve bakır yüzeyler paslanmaya karşı korunur.
6. Soğutma aşaması son montajı
- Tüm gerekli alt montaj ve bileşenlerin hazır olduğundan emin olun.
- Bakır plakanın kare çöküntüsüne yaklaşık 0.4 g termal macun uygulayın (Şekil 6A).
- Peltier'in soğuk yüzeyine yaklaşık 0.4 g termal macun uygulayın. Peltier'in bakır soğutma bloğuna zaten bağlı olduğunu unutmayın (Şekil 6B).
- Peltier soğuk yüzeyini bakır levha çöküntüsüne aşağı doğru basınçla bağlayın. Tüm fazla termal macunları temizleyin (Şekil 6C).
- 3D baskılı braketi bakır soğutma bloğunun üstüne monte edin ve ardından braketi bakır plakaya sabitlemek için iki adet 8-32, 0,5 inç uzunluğunda vidayı sıkmak için bir altıgen anahtar kullanın (Şekil 6D). Peltier'den bakıra doğru termal iletimi sağlamak için basılı braketin kırılmaması veya deforme olmaması için düşük torklu sıkma kullanın.
- Çalışma sırasında tezgah üstü veya mikroskop tabanından termal izolasyon için bakır plakayı 3D baskılı izolasyon tabanına yerleştirin (Şekil 6D).
- Soğutma aşaması monte edilmiş ve kullanıma hazırdır (Şekil 6E).
- Mikroskopi için, tamamlanmış soğutma aşamasını dik bir mikroskop platformuna yerleştirin (Şekil 7A).
- Soğutma aşamasının montajı tamamlandı. Daha fazla ayrıntı, Chung Laboratuvarı'nın ayrıntılı stratejileri ve hayvan hareketini tam olarak karakterize eden eşlik eden yayınından edinilebilir20.
NOT: Aşağıdaki bölümlerde, yavaş, hızlı ve ani soğutma protokolleri ele alınmıştır. Aşağıdaki verileri üretmek için L4 veya genç erişkin yaştaki N2 hermafroditleri kullanılmıştır. Yavaş soğutma stratejisi, 20 °C ekili N2 hayvanlarını 6 °C'de hareketsiz hale getirmek için kullanışlıdır; 15 °C ekili N2 hayvanları en güçlü şekilde 1 °C20'de hareketsiz hale getirilir. Bu üç soğutma protokolü arasındaki kısa bir karşılaştırma Tablo 1'de gösterilmiştir.
7. Yavaş soğutma immobilizasyon protokolü
- Yetiştirme plakasını kapağı açık bir şekilde 4 °C'lik bir buzdolabına taşıyın.
- Yetiştirme plakasını buzdolabına taşıdıktan sonra, soğutma aşamasının 12 V güç kaynağını açın ve ayarlanabilir güç kaynağı voltajını 5,5 V'a ayarlayın.
- Kapaklı yetiştirme plakası 4 °C buzdolabında 1 saat bekledikten sonra, plakayı hemen soğutma aşamasına geçirin ve kapağı çıkarın (Şekil 7A). Bu tür yetiştirme plakaları genellikle 6 °C civarındadır. Önceden soğutulmuş aşama, agar yüzeyini 6 ° C'de tutacak kadar kararlı ve soğuktur.
- Agar yüzey sıcaklığı ölçüldüğü gibi veya hayvan hareketine dikkat ederek değişirse, voltajı 6 ° C'de stabilize olana kadar hafifçe ayarlayın.
- Hayvanlar transfer sırasında uygun şekilde hareketsiz hale getirilir.
8. Hızlı soğutma immobilizasyon protokolü
NOT: Hızlı soğutma stratejisi en temel immobilizasyon yöntemidir (bakınız Film 1); Bununla birlikte, agar plakaları Tsetine ulaşırken sahneyi uzun süre boşta tutar. Ayrıca, güçlü bir immobilizasyon gerektiğinde ve Tseti 6 ° C olduğunda, boşta kalma süresi yaklaşık 1 saat20'ye uzatılır.
- Soğutma aşamasının 12 V güç kaynağını açın ve ayarlanabilir güç kaynağı voltajını yaklaşık 12 V'a ayarlayın.
- İnkübatöründen doğrudan soğutma aşamasına bir yetiştirme plakası getirin ve kapağı çıkarın.
- Agar yüzey sıcaklığı (Tseti + ΔT) °C'ye düştüğünde, ayarlanabilir güç kaynağını Vsetine ayarlayın ve agar Tsetine ulaşana kadar bekleyin. Vseti, agar'ı Tsetinde stabilize etmek için uygun voltajdır. ΔT, aşırı soğutmayı önleyen bir değişkendir. Tkümesi, ΔT ve Vkümesinin kombinasyonu için Tablo 2'ye bakın.
NOT: Tablo 2'de sunulan veriler özellikle Chung Laboratuvarı ile ilgilidir ve bu nedenle deneysel parametrelerin her bir deneyin kendine özgü çevresel ve kullanım koşullarına bağlı olarak değişebileceği unutulmamalıdır. - Agar Tsetine ulaştığında hayvanlar hareketsiz hale getirilir. İmmobilizasyon, soğutmanın başlamasından ~ 50 dakika sonrasına kadar zamanla iyileşir.
9. Ani soğutma immobilizasyon protokolü
NOT: Ani soğutma stratejisi en fazla kullanıcı zamanını tüketir, ancak hayvanları yetiştirme sıcaklıklarından en hızlı şekilde hareketsiz hale getirir.
- Soğutma aşamasının 12 V güç kaynağını açın ve ayarlanabilir güç kaynağı voltajını yaklaşık 12 V'a çevirin.
- Boş bir agar plakasını soğutma aşamasına getirin. Agar yüzey sıcaklığını Tsetinde stabilize etmek için hızlı soğutma immobilizasyon protokolündeki adım 8.3'ü kullanın.
- Hayvanları orijinal yetiştirme plakalarından soğutma aşamasında oturan soğutulmuş plakaya taşıyın.
- Küçük hayvan büyüklüğüne bağlı olarak, hayvanların saniyeler içinde Tsetine soğuması ve hareketsiz hale getirilmesi beklenir. İmmobilizasyon, soğutmanın başlamasından ~ 50 dakika sonrasına kadar zamanla iyileşir.
10. Soğutma immobilizasyonundan sonra hayvanların canlanması
- Soğutulmuş kültür plakasını orijinal inkübatöre veya oda sıcaklığına geri taşıyın.
- Plakadaki tüm solucanlar normal tarama ve beslenme davranışlarına dönene kadar 20 dakika ila 1 saat bekleyin.
Representative Results
Soğutma sıcaklığı ölçümü
İlk soğutma immobilizasyon deneyleri için, hayvanların uygun şekilde hareketsiz hale getirilebilmesini sağlamak için agar yüzey sıcaklığını izlemek önemlidir. İlkinden kopyalanan gelecekteki deneyler, genellikle sık sık sıcaklık takibi olmadan, aynı parametreleri kullanabilir. Sıcaklık ölçümü için, termometrenin termokupl ucu,% 70 etanol çözeltisi kullanılarak sterilize edilir ve kullanmadan önce etanol tamamen buharlaşana kadar beklenir. Daha sonra, doğru bir sıcaklık okuması sağlamak için termokupl ucu NGM agarına 1 mm yerleştirilir. Termometre ucu bir kelepçe tutucu veya diğer tutucular kullanılarak tutulur (Şekil 7B).
Kızılötesi kamera ile sıcaklık ölçümü
Soğutma aşaması, plakanın merkezi 40 mm çapındaki alanındaki sıcaklık dağılımının eşit olmasını sağlamak için tasarlanmıştır. Agar yüzeyindeki sıcaklık dağılımını görüntülemek için ileriye dönük bir kızılötesi (FLIR) kamera kullanılır. Tseti 1, 3 veya 6 °C olduğunda maksimum sıcaklık farkı 1 °C civarındadır (Şekil 8A).
Hızlı soğutma stratejisi ile soğutma hızının değerlendirilmesi
Hızlı soğutma stratejisi, bir aşamanın soğutma hızını 12 V'ta karakterize etmek için kullanılır. Soğutma aşamasına 20 ° C'lik bir plaka yerleştirilir ve yüzey sıcaklığını izlemek için bir termokupl termometre kullanılır. Aşama, 20 ° C plakaları 6 dakikada 6 ° C'ye, 10 dakika içinde 1 ° C'ye soğutur ve sonunda yaklaşık 40 dakika içinde -7 ° C'nin altına stabilize eder (Şekil 8B).
Soğutma aşamasını dik mikroskop platformunda kullanma
Dik bir mikroskop tipik olarak görüntüleme için bir hedef, numune tutma ve aydınlatma için bir aşama içerir. Bu soğutma aşaması, kolay takılıp çıkarılabilen tipik bir dik mikroskop aşamasında kullanılmak üzere tasarlanmıştır (Şekil 8C). Görüntüleme veya tarama için soğutma immobilizasyonu gerektiğinde, soğutma aşaması kurulumu bitirmek için mikroskop aşamasına yerleştirilir ve bunun tersi de geçerlidir.
Solucanların soğutma plakası üzerindeki hareketsizliği Film 1'de gösterilmiştir.
Resim 1: Soğutma aşaması aparatının 3 boyutlu modeli. Elektronik bağlantılar netlik için gösterilmez. Bir tank, sahneye gömülü Peltier tarafından aktarılan ısıyı gidermek için soğutma bloğundan su pompalar. Tipik bir 60 mm polistiren yetiştirme plakası, şeffaf safir pencereye oturabilir ve aşama aşama soğutulabilir. Solidworks'te oluşturulan model. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Üretilecek bileşenlerin 3D modelleri. (A) Bakır levha. (B) 3D baskılı tutma braketi. (C) 3D baskılı izolasyon plakası. SolidWorks'te oluşturulan modeller. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Su soğutma tertibatı . (A) Münferit bileşenler. Borular belirtilen uzunluklarda kesilir. (B) Bağlı su soğutma bileşenleri. (C) Pompa tankını ve radyatörü 12 V güç kaynağına bağlayan teller. Genel olarak, kırmızı teller pozitif uca bağlanır ve siyah teller negatif uca bağlanır. (D) Pompaya dökülen arıtılmış su. (E) Optimum pompa verimliliği için deponun üçte ikisinden fazlasına kadar doldurulması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Peltier ve su soğutma tertibatının bağlanması. (A) Peltier'i çalıştırmak için bileşenler. (B) Peltier'in sıcak ve soğuk taraflarını belirlemek için ayarlanabilir güç kaynağının kullanılması. Güvenlik için 2 V'tan fazla kullanılmaz. (C) Bakır blok yüzeyine termal macun uygulanması bile. (D) Peltier sıcak yüzeyine termal macun uygulanması bile. (E) Peltier'in sıcak tarafı, termal macunla bakır blok üzerine bastırılır. (F) Peltier soğuk yüzey sıcaklığını ölçmek için kullanılan kızılötesi termometre. İdeal olarak, soğuk sıcaklık -35 ° C'ye yakın olabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 5: Bakır levha ve safir pencerenin montajı . (A) Gerekli bileşenler. (B) Safir pencerenin temas edeceği bakır levhanın üç iç yüzeyine uygulanan termal macun. Bakır levhanın aşağı bakan iki görünümü, üç yüzeyin yerini gösterir. (C) Bakır levha deliğinde safir pencere. (D) Montajın üst yüzeyine uygulanan bant. (E) Üst taraf: Mavi kesikli çizgiler, bandın kesileceği ve çıkarılacağı yerleri gösterir: kare çöküntü, iki delik ve 70 mm çapında safir alan. (F) Alt taraf: Bant gösterildiği gibi kesilir ve çıkarılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Soğutma aşaması son montajı . (A) Bakır levhanın çöküntüsüne uygulanan termal macun. (B) Peltier'in soğuk tarafına uygulanan termal macun. (C) Peltier'in çöküntüye bağlı soğuk yüzeyi. (D) Vidalar kullanılarak bakır levhaya sabitlenmiş bakır soğutma bloğu. İzolasyon tabanında soğutma aşaması. (E) Tamamlanmış soğutma aşaması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Mikroskop üzerinde soğutma aşaması ve termokupl ölçümü . (A) Görüntüleme için mikroskop tabanına yerleştirilen soğutma aşaması. Safir pencere şeffaftır ve transilluminatiyona izin verir. (B) NGM agar yüzey sıcaklığını ölçmek için kullanılan termokupl termometre. Uç, NGM agarına yaklaşık 1 mm yerleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Soğutma aşaması karakterizasyonu ve kullanımı . (A) Agar yüzeyinin 1, 3 ve 6 °C'ye soğutulduğunu gösteren termal görüntüler. Merkezi 40 mm'lik alanda eşit sıcaklık dağılımı (beyaz kesikli daire). (B) NGM agar yüzeyinin soğutma aşamasında zaman içindeki sıcaklığı 12 V'dir. NGM agar yüzeyi -7 °C'nin altında soğutulabilir. Şekil 7B'deki yöntemle ölçülen sıcaklık. (C) Tipik bir dik mikroskopta kullanılan soğutma aşaması. Soğutma aşaması kolayca takılabilir veya çıkarılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| yavaş soğutma | hızlı soğutma | ani soğutma | |
| sahne mesleği | asgari | uzun | Orta |
| hayvanlar hareketsiz hale gelene kadar geçen süre | uzun | Orta | çok kısa |
| immobilizasyon mukavemeti | kuvvetli | Orta | Orta |
| Kullanıcı Çabası | asgari | minimumdan biraz daha fazla | maksimum |
Tablo 1: Soğutma stratejileri karşılaştırması.
| Tseti (°C) | ΔT (°C) | Vseti (V) |
| 1 | 2 | 8 |
| 2 | 3 | 7.4 |
| 3 | 4.5 | 7 |
| 4 | 5.5 | 6.5 |
| 5 | 6 | 5.9 |
| 6 | 6 | 5.5 |
Tablo 2: Hızlı soğutma stratejisinde istenen sıcaklığa ulaşmak için parametreler.
Ek Dosya 1: Metrik bakır levha. Bakır plakayı işlemek için A2D çizim. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: Tutma braketi. SolidWorks tarafından açılabilen veya değiştirilebilen ve 3B yazdırma yazılımına verilebilen bir tutma braketinin 3B teknik resmi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 3: İzolasyon plakası. SOLIDWORKS tarafından açılabilen veya değiştirilebilen ve 3B yazdırma yazılımına verilebilen bir yalıtım plakasının 3B teknik resmi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: Soğutma videosu. 2 °C'de NGM agar plakası üzerinde immobilizasyon solucanları. Plaka oda sıcaklığından 2 ° C'ye soğutuldu ve birkaç dakika boyunca 2 ° C'de kaldı. Daha sonra, soğutma aşaması kapatıldı ve plakalar doğal olarak oda sıcaklığına ısınmaya başladı. Video, 1 saatlik bir videoyu 6 dakikada sığdırmak için 10 kat hızlandırılır. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Fiyat tahmini Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Soğutma aşaması imalatı, montajı ve kullanımı bu makalede gösterilmiştir. Bileşenlerin çoğu, çevrimiçi olarak satın alınabilen hazır ürünlerdir. Bakır levha ve safir pencere gibi bazı bileşenlerin özel bir siparişe ihtiyacı vardır ve üretilmesi 1 ay kadar sürebilir. 3D basılabilen diğer bileşenler çoğu araştırma kurumunda kolayca üretilmektedir (Ek Tablo 1). Montaj işlemi sadece birkaç alete ihtiyaç duyar ve uzman olmayan biri tarafından birkaç saat içinde hızlı bir şekilde yapılabilir. Bu nedenle, çoğu biyolojik laboratuvar bu cihazı kolayca uygulayabilmelidir.
Soğutma aşaması ve soğutma immobilizasyon yaklaşımı, orijinal yayın20'de dikkatlice detaylandırılan mevcut immobilizasyon yöntemlerine göre birkaç önemli iyileştirmeye sahiptir. Kısacası, soğutma aşaması, embriyolar ve dauerler de dahil olmak üzere her yaştan büyük C. elegans popülasyonlarının , standart mikroskopi iş akışları altında tipik kültür plakaları üzerinde güçlü bir şekilde hareketsiz hale getirilmesini sağlar. Mikroakışkanlar gibi karmaşık donanım kurulumlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırırken, daha güçlü bir immobilizasyon etkisi sağlar. Ek olarak, benzer bir immobilizasyon etkisi sağlarken, hiçbir kimyasal madde kullanılmadığı için hayvanlara ve araştırmacılara olası toksik kimyasal maruziyeti en aza indirir. Bu teknik yetenekler, bu cihazın geniş çapta uygulanmasını ve çok sayıda hayvan üzerinde yüksek çözünürlüklü in vivo mikroskopi gerektiren birçok deneye yaklaşılmasını sağlar.
Cihazın yapımı sırasında, tüm termal macun uygulaması ve safir pencereyi cooper plakasına sabitlemek için geniş bant dahil olmak üzere bazı kritik adımlar vardır. Termal macun, boşlukları düşük termal dirençli bir malzeme ile değiştirerek güçlü termal iletkenlik sağlar. İstenilen soğutma performansını elde etmek için, macunun Peltier soğuk yüzeyinden bakır plakaya, Peltier sıcak yüzeyinden bakır soğutma bloğuna ve bakır plakadan safir pencereye kadar tüm abutting/temas yüzeyleri arasına düzgün bir şekilde yerleştirilmesi gerekir. Sahneye uygulanan geniş bant, havadan ısınmayı ve paslanmaya neden olan yoğuşmayı önlemek için bakır plakayı izole eder. Ayrıca safir pencere ile bakır levha arasındaki bağlantıyı güçlendirir. Bu nedenle, hem termal macun hem de geniş bant uygulamak ekstra özen gerektirir.
Gerçek bir soğutma immobilizasyon deneyinde, bu makalede sağlanan voltajlar ve zamanlar gibi parametreler, plakalardaki agar miktarı, aşamanın verimliliği ve ortam sıcaklığı ve nemi gibi yetiştirme plakalarının ve aşamasının spesifik özelliklerine bağlıdır. Gelecekteki modifikasyonlarda, istenen sıcaklığa ulaşmak ve stabilize etmek için voltaj girişini soğutma aşamasına aktif olarak ayarlamak için orantılı-integral-türev (PID) gibi bir geri besleme kontrolörü kurulabilir.
Bu soğutma aşaması immobilizasyonunun, orijinal yayın20'de dikkatlice detaylandırılan birkaç sınırlaması vardır. Kısacası, farklı sıcaklıklarda yetiştirilen hayvanlar, ekstra ince ayar gerektirebilecek farklı derecelerde hareketsiz hale getirilir. Ayrıca, bu mevcut soğutma aşaması ters çevrilmiş bir mikroskop için tasarlanmamıştır. Ayrıca, doğrudan bir yetiştirme plakasında görüntüleme veya tarama, plakaya kontaminasyona neden olabilir.
Bileşik dik mikroskoplar ve ters mikroskoplar dahil olmak üzere farklı görüntüleme platformları için uygun soğutma aşamasının yeni versiyonlarını tasarlıyoruz. Bu yeni tasarımlar, bu platformlarda görüntüleme sırasında kültür plakaları üzerinde doğrudan hayvan soğutma immobilizasyonuna izin verecektir. Bu soğutma aşamalarındaki görüntüleme, dik konfigürasyona benzer şekilde uzun çalışma mesafesi hava daldırma hedeflerini kullanacaktır. Günümüzde, havaya daldırma hedefleri, yeşil floresan protein görüntülemesi için yaklaşık 300 nm çözünürlük sağlayan 0.9'a kadar sayısal bir açıklığa sahip olabilir. Bu nedenle, yeni bir soğutma aşamasının mikroskopla kombinasyonu, rutin olarak mikron altı çözünürlüklü floresan görüntülemeye izin verebilir.
Deneyimlerimize göre soğutma aşamasını kullanmak için bazı yararlı ipuçları da sunuyoruz. Örneğin, bireyler su soğutma tertibatının içinde herhangi bir hava kabarcığı olup olmadığını kontrol etmelidir. Hava kabarcıkları soğutmayı Peltier sıcak yüzeyine indirger, böylece soğutma aşamasının soğutma etkinliğini düşürür. Hava kabarcıkları varsa, su akışını sağlamak için 12 V güç kaynağı açılmalı ve su akışının tüm bileşenleri çalkalanmalıdır. Hava kabarcıkları sıkışmış alanlardan dışarı atılabilir ve pompa tankı tarafından havalandırılabilir. Araştırmacılar, su soğutma tertibatını monte ederken su akış borusunun bükülmediğinden veya çaprazlanmadığından emin olmalıdır. Tüp bükme veya geçiş, yeterli su akışını engelleyebilir ve soğutma etkinliğini azaltabilir. Tüp bağlantıları uygun şekilde oturtulmalı ve sıkı olmalıdır. Gerekirse, sızdırmazlığı sağlamak için farklı çapta yumuşak bir tüp kullanılabilir. Bağlantı yeterince sıkı olmasa bile macun uygulanmamalıdır, çünkü macun gelecekteki kullanım sırasında tıkanmaya neden olabilir. Oda nemi soğutma performansını etkiler ve soğutma aşamasında yoğuşma ve buz oluşturur. Soğutma aşamasına bir yetiştirme plakası yerleştirmeden önce, yoğuşmayı gidermek için bir kağıt mendil kullanılması veya safir pencerede oluşan buzu hızlı bir şekilde çıkarmak için bir soğutucu kullanılması önerilir. Pompa tankı ve radyatör fanları aynı masada çalışırlarsa mikroskopta küçük titreşimlere neden olabilirler. Mikroskop titreşimi elde edilen görüntüyü bulanıklaştırır ve bu nedenle kaçınılmalıdır. Tankı ve radyatörü mekanik olarak yalıtmak için bir yastık kullanılabilir veya yakındaki ayrı bir masaya yerleştirilebilir. Soğutma aşaması, Peltier'e elektrik bağlantısını tersine çevirerek bir ısıtma aşaması haline gelebilir.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar veya diğer çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bakır levha işleme için Noah Joseph'e (Kuzeydoğu Biyomühendislik Bölümü) teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-V power supply | ANYTITI | ledpower00 | output DC 12V +/-0.5V, 5A power 60W |
| 8-32 screw | arbitrary | for bracket fixation | |
| bracket | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| breadboard | DEYUE | 7545924028 | 400 pin solderless board kit for DIY electric connection |
| copper cooling block | Kalolary | Kalolary-Heatsink001 | 40*40mm internal fin thickness 0.5mm |
| copper plate | arbitrary | N/A | Machined from a 170x120x3 mm 99.9% pure copper sheet. See supplementary for 2D drawing for manufacturing. |
| digital thermocouple thermometer | Proster | 4333090752 | dual channel thermometer with two K-type thermocouple probes measuring range -50-300°C accuracy ±1.5% resolution 0.1°C /°F < 1000° |
| isolation base | N/A | N/A | 3D printed using 1.75mm PLA filament. See supplementary for 3D model. |
| jumper wires | arbitrary | for electronic connection | |
| multistage peltier | DigiKey | TEC1-12706 | thermoelectric cooling device size 40*40*7.05 mm Umax 16.1 V Imax 8.5 A ΔTmax @ Th 85°C @ 27°C Qmax @ Th 51.6W @ 27°C resistance 1.65 Ω |
| Nalgene 50 Platinum-Cured Silicone Tubing | ThermoScientific | 14-176-332E | ultrasoft tube durometer hardness Shore A, 50 inner diameter 1/4 in outer diameter 9.5 mm |
| packaging tape | arbitrary | 4 inch wide to cover the copper plate | |
| pump tank | Yosoo | SC-300T | input power DC 12V flow rate 300L/h max |
| radiator | DIYhzWater | 10463 | 12 pipe aluminum heat exchanger cooling water drain row with two 120mm fans |
| sapphire window | Altos Photonics, Inc. | N/A | Contact Altos for custom order size Ø 80mm, 3mm thick surface quality 60-40s/d uncoated |
| thermal paste | Corsair | XTM50 | reduce thermal impedance between surfaces thermal conductivity 5.0W/mK |
| tunable power supply | Kungber | DY-SPS3010B | voltage range 0 – 30V current range 0 – 10A linear Power Supply with 4-Digits coarse and fine adjustments with alligator leads |
References
- Wearne, S. L., et al. New techniques for imaging, digitization and analysis of three-dimensional neural morphology on multiple scales. Neuroscience. 136 (3), 661-680 (2005).
- Zhou, Z., Sorensen, S., Zeng, H., Hawrylycz, M., Peng, H. Adaptive image enhancement for tracing 3D morphologies of neurons and brain vasculatures. Neuroinformatics. 13 (2), 153-166 (2015).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Optical techniques for imaging membrane topography. Cell Biochemistry and Biophysics. 41 (3), 391-414 (2004).
- Chan, C. Y., Faragalla, Y., Wu, L. -G. Illuminating membrane structural dynamics of fusion and endocytosis with advanced light imaging techniques. Biochemical Society Transactions. 50 (4), 1157-1167 (2022).
- Chen, Y., Periasamy, A. Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization. Microscopy Research and Technique. 63 (1), 72-80 (2004).
- Chen, Y., Mills, J. D., Periasamy, A. Protein localization in living cells and tissues using FRET and FLIM. Differentiation. 71 (9-10), 528-541 (2003).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M.
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 311-318 (2012).
- Brenner, S.
- Hobert, O., Loria, P.
- Emmons, S. W., Yemini, E., Zimmer, M. Methods for analyzing neuronal structure and activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 218 (4), (2021).
- Chung, S. H., et al. Novel DLK-independent neuronal regeneration in Caenorhabditis elegans shares links with activity-dependent ectopic outgrowth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), E2852-E2860 (2016).
- Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A.
- Pintard, L., Bowerman, B. Mitotic cell division in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (1), 35-73 (2019).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L.
- Chung, K. H., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nature Communications. 2, 271 (2011).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Wang, Y. L., Grooms, N. W. F., Jaklitsch, E. L., Schulting, L. G., Chung, S. H. High-throughput submicron-resolution microscopy of Caenorhabditis elegans populations under strong immobilization by cooling cultivation plates. iScience. 26 (2), 105999 (2023).
- Zhao, D., Tan, G. A review of thermoelectric cooling: Materials, modeling and applications. Applied Thermal Engineering. 66 (1-2), 15-24 (2014).
