Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

העברות יומיות, אחסון אוכלוסיות בארכיון ומדידת כושר בניסוי האבולוציה ארוך הטווח עם Escherichia coli

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65342
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,4, 1, 1, 2,3, 2,5
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin, 2BEACON Center for the Study of Evolution in Action, Michigan State University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 4Department of Integrative Biology, Michigan State University, 5Biological Sciences Program, Michigan State University

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לשמור על ניסוי האבולוציה לטווח ארוך של Escherichia coli (LTEE) על ידי ביצוע ההעברות היומיות והקפאות תקופתיות שלו, וכיצד לבצע מבחני תחרות למדידת שיפורי כושר בחיידקים מפותחים. הליכים אלה יכולים לשמש כתבנית לחוקרים המתחילים ניסויים משלהם באבולוציה מיקרוביאלית.

Abstract

ניסוי האבולוציה לטווח ארוך (LTEE) עקב אחר שתים עשרה אוכלוסיות של Escherichia coli כפי שהם הסתגלו לסביבת מעבדה פשוטה במשך יותר מ -35 שנים ו -77,000 דורות חיידקים. ההגדרה והנהלים המשמשים ב- LTEE מגלמים שיטות אמינות וניתנות לשחזור לחקר אבולוציה מיקרוביאלית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים תחילה כיצד אוכלוסיות LTEE מועברות למדיום טרי ולתרבית מדי יום. לאחר מכן, אנו מתארים כיצד אוכלוסיות LTEE נבדקות באופן קבוע עבור סימנים אפשריים של זיהום ומאוחסנות בארכיון כדי לספק "תיעוד מאובנים" קפוא קבוע למחקר מאוחר יותר. אמצעי הגנה מרובים הכלולים בנהלים אלה נועדו למנוע זיהום, לזהות בעיות שונות כאשר הן מתרחשות ולהתאושש משיבושים מבלי לעכב באופן ניכר את התקדמות הניסוי. אחת הדרכים שבהן הקצב והאופי הכולל של השינויים האבולוציוניים מנוטרים ב-LTEE היא על ידי מדידת הכושר התחרותי של אוכלוסיות וזנים מהניסוי. אנו מתארים כיצד נערכות מבחני תחרות תרבות משותפת ומספקים הן גיליון אלקטרוני והן חבילת R (fitnessR) לחישוב כושר יחסי מהתוצאות. במהלך ה-LTEE, ההתנהגויות של אוכלוסיות מסוימות השתנו בדרכים מעניינות, וטכנולוגיות חדשות כמו ריצוף גנום שלם סיפקו דרכים נוספות לחקור כיצד האוכלוסיות התפתחו. נסיים בדיון כיצד עודכנו נהלי LTEE המקוריים כדי להתאים לשינויים אלה או לנצל אותם. פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור חוקרים המשתמשים ב- LTEE כמערכת מודל לחקר קשרים בין אבולוציה וגנטיקה, ביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה של מערכות ואקולוגיה. באופן רחב יותר, ה-LTEE מספק תבנית בדוקה עבור אלה שמתחילים את ניסויי האבולוציה שלהם עם מיקרואורגניזמים, סביבות ושאלות חדשות.

Introduction

בפברואר 1988, ריצ'רד לנסקי חיסן שתים עשרה צלוחיות המכילות מדיום גדילה מוגבל גלוקוז מוגדר עם תרביות שיבוט של Escherichia coli באוניברסיטת קליפורניה, אירווין1. למחרת, הוא העביר 1% מהתרבית מכל בקבוק לקבוצה של צלוחיות חדשות המכילות מצע גידול טרי. דילול זה בקנ"מ 1:100 איפשר לאוכלוסיות החיידקים להתרחב פי 100 לפני מיצוי הגלוקוז הזמין, המקביל לכ-62/3 דורות של חלוקות תאים. הליך זה חזר על עצמו למחרת ומאז הוא כל יום, עם כמה הפרעות. העברות יומיות אלה נמשכו, גם כאשר הניסוי הועבר, תחילה לאוניברסיטת מישיגן סטייט בשנת 1992, ולאחר מכן לאוניברסיטת טקסס באוסטין בשנת 2022. כל אותו הזמן, מוטציות חדשות יצרו ללא הרף שונות גנטית באוכלוסיות E. coli אלה, והברירה הטבעית הובילה לתאים מפותחים שהתחרו באבותיהם.

לנסקי תכנן את הניסוי הזה, הידוע כיום בשם ניסוי האבולוציה לטווח ארוך (LTEE), כדי לחקור את הדינמיקה והחזרתיות של האבולוציה. כדי לענות על שאלות אלה, הוא כלל כמה תכונות חשובות בתכנון מערך הניסוי והפרוטוקולים שלו2. אחד המאפיינים האלה היה בחירה זהירה של אורגניזם מודל. שתים-עשרה האוכלוסיות המקוריות נוצרו כולן ממושבות בודדות שחלקו אב קדמון משותף מיידי, זן Escherichia coli B REL606. זן זה נבחר מכיוון שהוא כבר היה נפוץ בסביבות מעבדה, שוכפל באופן א-מיני לחלוטין, ולא הכיל פלסמידים או פרופג'ים שלמים 3,4 – כל אלה הופכים את חקר האבולוציה שלו לפשוט יותר. בחירה נוספת שפישטה את הניסוי הייתה להשתמש בריכוז נמוך מאוד של גלוקוז במדיום הגידול כדי להגביל את צפיפות התאים בכל בקבוק לאחר הגדילה. שימוש בצפיפות תאים נמוכה נועד להקל על ניתוח שינויים בכושר האוכלוסייה על ידי הפחתת הפוטנציאל לאבולוציה של אינטראקציות אקולוגיות בתוך אוכלוסיות (למשל, על ידי הזנה צולבת)5.

REL606 אינו מסוגל להשתמש ב-ʟ-arabinose כמקור פחמן ואנרגיה (Ara−) עקב מוטציה נקודתית בגן araA . לפני הפעלת ה-LTEE, מוטנט ספונטני עם רצף araA משוחזר, המכונה REL607, בודד מ-REL6066. REL607 מסוגל לגדול על ʟ-arabinose (Ara+). REL606 שימש כדי להתחיל שש מאוכלוסיות LTEE, ו- REL607 שימש כדי להתחיל את שש האחרות. ארבינוז אינו קיים במדיום הגידול המשמש במהלך LTEE, ולכן REL607 מתנהג כמו REL606 בתנאים אלה. עם זאת, כאשר הם מצופים על אגר טטרזוליום ערבינוז (TA), תאי Ara− ו- Ara+ יוצרים מושבות אדומות ולבנות, בהתאמה. שיטה זו להבחנה בין שני זני E. coli הקדומים וצאצאיהם שימושית למדי. ניתן להשתמש בו כדי לזהות זיהום צולב בין אוכלוסיות LTEE. הוא גם מסייע במדידת הכושר של זן או אוכלוסייה של ערה ביחס לזן ערה+ כאשר הם מתחרים זה בזה. כושר נמדד על ידי הקמת תרבות משותפת של מתחרים מסומנים מנוגדים ולאחר מכן מעקב אחר האופן שבו התדרים של מושבות אדומות ולבנות (המתקבלות על ידי פיזור דילול של התרבות על לוחות ת"א) משתנים בין כאשר המתחרים מעורבים תחילה ולאחר מחזור צמיחה אחד או יותר באותם תנאים כמו LTEE. הייצוג של סוג התא המתאים יותר יגדל במהלך כל מחזור גידול.

מאפיין קריטי נוסף של LTEE הוא שדגימות של האוכלוסיות המתפתחות מאוחסנות מעת לעת בארכיון. כאשר מעורבב עם cryoprotectant כגון גליצרול, תאי E. coli ניתן להקפיא ולאחר מכן להחיות 7. כחלק מפרוטוקול LTEE, בכל יום 75 (השווה לכ-500 דורות), חלק מכל אוכלוסייה שלא הועבר לבקבוק חדש מעורבב עם גליצרול, מפוצל בין בקבוקונים מרובים ומאוחסן במקפיא. "תיעוד מאובנים" קפוא זה איפשר לחוקרים לבצע את המחקרים הראשונים של LTEE, שבהם הם החיו את אוכלוסיות האי-קולי המפותחות מנקודות זמן שונות והתחרו בהן מול הזנים הקדומים כדי לעקוב אחרמהירות העלייה בכושר 1. אבולוציית הכושר נמדדה מחדש מעת לעת ככל שנשמרו יותר "שכבות" של "תיעוד המאובנים" הקפוא. המסקנה הכללית ממדידות אלה היא שהכושר ממשיך להשתפר ב-LTEE עד עצם היום הזה, אפילו אחרי כל כך הרבה דורות של אבולוציה באותה סביבה 8,9,10.

מה איפשר ל-LTEE להמשיך כל כך הרבה זמן? רבות מאותן תכונות שאפשרו לשאול ולענות על שאלותיו המקוריות שימשו גם כאמצעי בטיחות וכאמצעי כשל מפני שיבושים בלתי נמנעים עקב מזל רע, טעויות אנוש ואירועים עולמיים. בכל יום, כאשר התרביות מועברות למדיום גידול טרי, החוקר המבצע את ההעברות עובר לסירוגין בין אוכלוסיות Ara− ו- Ara+. לאחר מכן, כאשר האוכלוסיות קפואות, ניתן לצפות אותן על אגר סלקטיבי ואינדיקטור כדי לבדוק אם אוכלוסיות "שכנות" כלשהן זוהמו או עורבבו בטעות (למשל, מושבות לבנות נמצאות באוכלוסייה שאמורה ליצור מושבות אדומות בלבד) או זוהמו במיקרובים זרים (למשל, מורפולוגיות מושבות בלתי צפויות או צפיפות תאים). במקרה שאוכלוסייה נפגעה, ניתן להחיות את אביה מהמקפיא ולהמשיך הלאה במקומו. סמני ערה והארכיון הקפוא משמשים אפוא למטרות כפולות הן כמשאבים ניסיוניים והן כאמצעי בטיחות.

מכיוון שההיסטוריה שלו שמורה היטב ונגישה בקלות, דגימות LTEE נחקרו באמצעות טכנולוגיות שלא היו קיימות כאשר הניסוי החל. לדוגמה, ריצוף גנום שלם שימש לבחינת הדינמיקה של מוטציות באוכלוסיות LTEE 11,12,13,14,15, ושעתוק ופרופיל ריבוזומלי שימשו לבחינת שינויים בביטוי גנים 16,17. כלים גנטיים שימשו לשחזור זנים הנבדלים זה מזה במוטציות בודדות או בשילובים של מספר מוטציות מפותחות כדי להבין את השפעתם על הכושר ופנוטיפים שונים 18,19,20,21. דגימות מ"תיעוד המאובנים" הקפוא מתחדשות בקלות, כך שניתן לשלוח חלקים או עותקים שלמים של ההיסטוריה של הניסוי למעבדות אחרות. דגימות LTEE קיימות כיום בכל היבשות למעט אנטארקטיקה, והן נחקרות על ידי חוקרים צעירים יותר מהניסוי עצמו. השיטות החזקות של LTEE ודגימות וזני E. coli שהתפתחו מהתיעוד ההיסטורי שלו שימשו גם כנקודות מוצא לניסויי אבולוציה הבוחנים שאלות וסביבות אחרות 22,23,24,25,26,27,28,29.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של הליכי LTEE. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כאן אנו מדגימים שלושה פרוטוקולי ליבה ששימשו בניסוי האבולוציה לטווח ארוך של E. coli (איור 1). אנו מתארים: (1) כיצד לבצע את ההעברות היומיות, (2) כיצד לאחסן בארכיון דגימות אוכלוסייה ומבודדי שבטים, ו-(3) כיצד לבצע ולנתח מבחני תחרות של תרבות משותפת כדי למדוד הבדלי כושר. תקוותנו היא שפרוטוקולים אלה יעודדו את המשך השימוש במשאבי LTEE ויסייעו לתכנן ניסויים חדשים באבולוציה מיקרוביאלית.

Protocol

1. העברות יומיות של אוכלוסיות LTEE

הערה: 12 אוכלוסיות LTEE מועברות מדי יום על ידי חיסון מדיום טרי עם 1% מהתרביות מהצלוחיות של היום הקודם. השלבים בתהליך זה מסוכמים באיור 1. שש אוכלוסיות Ara− שהתחילו מזן REL606 מסומנות A−1 עד A−6, ושש אוכלוסיות Ara+ שהתחילו מזן REL607 מסומנות A+1 עד A+6. הקפדה על טכניקה אספטית ועל לוח זמנים וסדר להעברת אוכלוסיות ממזערת את הסיכון לזיהום ושיבושים אחרים.

  1. יש לחטא את המשטח שעליו יועברו ה-LTEE על ידי ניגובו בתמיסת אתנול 70% או 10% אקונומיקה. הדליקו מבער בונזן כדי ליצור טיוטה מקומית ולאפשר להבעיר כלי זכוכית.
    הערה: יש ללבוש כפפות מעבדה למניעת זיהום. לבטיחות סביב להבה פתוחה, חשוב להשתמש רק בכפפות העשויות מחומר כמו ניטריל שאינו דליק.
  2. הכינו 13 צלוחיות בורוסיליקט ארלנמאייר של 50 מ"ל עם כוסות בורוסיליקט או פוליפרופילן של 20 מ"ל שנשטפו ועוקרו על ידי אוטוקלאבינג. בדוק את הצלוחיות עבור לכלוך גלוי ולהחליף כל אלה שאינם נקיים לחלוטין.
  3. סמן שש צלוחיות A−1 עד A−6 באמצעות סמן אדום ואת שש הצלוחיות האחרות A+1 עד A+6 באמצעות סמן שחור. סמן את הצלוחיות האחרונות שנותרו, שיהיו ריקות, עם התאריך בתבנית חודש/יום והיום בשבוע.
  4. מלאו כל אחת מ-13 הצלוחיות ב-9.9 מ"ל של מדיום DM25 באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית של 10 מ"ל. יש להבעיר את פיו של כל בקבוק לאחר הסרת הכד המשמש כמכסה ולפני החלפת הכד. מבעירים את קצה הפיפטה בין מילוי כל צלוחית.
    הערה: הוראות להכנת DM25 זמינות באינטרנט30. אם אתם משתמשים בפיפט סרולוגי מפלסטיק, וותרו על הבערת קצהו או הגבילו את הזמן בלהבה כדי למנוע המסת הפלסטיק.
  5. הסירו את צלוחיות ה-LTEE של היום הקודם מאינקובטור הרעידה.
  6. בחנו כל בקבוק על ידי הצמדתו לאור כדי להעריך את עכירותו וצבעו, בדקו את שלמות הבקבוק וחפשו נוכחות של חומר זר.
    הערה: לעין בלתי, כל תרבויות Ara− ו- Ara+ ייראו מעט עכורות בהשוואה לחסר, למעט A−3, שיהיה ~ פי 10 יותר עכור מהאחרות בגלל צמיחה על ציטראט בתווך. מזהמים מיקרוביאליים חיצוניים רבים מסוגלים גם הם לגדול על ציטראט, כך שעכירות מוגברת באוכלוסיות שאינן A-3 מצביעה ככל הנראה על זיהום. עיין בסעיף תוצאות מייצגות לקבלת תמונות של תרביות LTEE לפני העברה.
  7. אופציונלי: ודא שלכל תרבית LTEE יש את העכירות הצפויה על ידי צנרת של 1 מ"ל של הריק ו- 1 מ"ל של כל תרבית לתוך קוביות פלסטיק של 1 ס"מ וביצוע קריאות צפיפות אופטית ב- 600 ננומטר (OD600) באמצעות ספקטרופוטומטר לאחר ריקון המכשיר.
    הערה: צעד נוסף זה יכול להיות שימושי עבור חוקרים חדשים בעבודה עם LTEE ואינם בטוחים לגבי שיפוט העכירות על פי העין, כמו גם לתיעוד וחקירה של חריגות חשודות. קח דגימות למדידת OD600 מהצלוחיות של היום הקודם רק לאחר השלמת ההעברות הרגילות של היום לצלוחיות חדשות (השלבים הבאים) כדי למזער את הסיכון לזיהום אוכלוסיות התאים שימשיכו להתפשט אם ערכי OD600 הם כצפוי. עיין בסעיף תוצאות מייצגות לקבלת ערכי OD600 אופייניים עבור תרביות LTEE.
  8. באמצעות מיקרופיפטור P200 עם קצה מסנן סטרילי, העבירו 100 מיקרוליטר של תרבית מכל בקבוק LTEE לבקבוק המתאים המכיל DM25 טרי. התחל עם A−1, ולאחר מכן העבר A+1. לאחר מכן, המשך לסירוגין בין אוכלוסיות -ו-+. כדי לעקוב אחר התרבויות שהועברו, הזיזו את הצלוחיות שמאלה לאחר הפיפטינג מהן או אליהן.
    הערה: הסדר הקפדני של העברות וחילופים בין אוכלוסיות Ara− ו- Ara+ מסייע במניעה ואיתור של זיהום צולב ותערובות. שימו לב לטכניקה אספטית קפדנית: השתמשו בקצה פיפטה טרי לכל העברה, הבעירו את פיות הצלוחיות מיד לאחר פתיחת המכסה ולפני הסיכום, ונגבו את החבית והמפלט של המיקרופיפטור עם מגבון נייר ללא סיבים רטוב באתנול 70% בין כל העברה. לעולם אין להשתמש באקונומיקה לחיטוי מיקרופיפטורים, מכיוון שאפילו כמויות זעירות יכולות להרוג את התרביות.
  9. דגרו על הצלוחיות החדשות שחוסנו בטמפרטורה של 37°C למשך 24 ± שעה אחת עם רעידות מסלוליות של 120 סל"ד בקוטר של 1 אינץ'.
  10. אחסן את התרביות מהיום הקודם ב 4 °C (75 °F). שמור תרביות גיבוי אלה למשך יומיים. השליכו תרביות ישנות יותר שנשמרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס שלושה ימים קודם לכן בשלב זה.
    הערה: התרביות של היומיים הקודמים מספקות שני סטים שלמים של גיבויים שבעזרתם ניתן להפעיל מחדש את הניסוי, במידת הצורך, אם מתרחשת בעיה או תאונה, או אם מתגלה זיהום של התרביות של היום הקודם לפני ההעברה (למשל, צבע מוזר או חלקיקים בלתי צפויים).
  11. הזן את השעה, התאריך, מספר ההעברה, השם או ראשי התיבות של החוקר שביצע את ההעברות, האם התרבויות היו תקינות או לא, וכל מידע רלוונטי אחר במחברת יומן ההעברות. עבור לשלבים 1.12-1.14 אם אחד מהמצבים הבאים מתרחש: (1) הריק מהיום הקודם מזוהם, (2) בקבוק או המכסה שלו סדוק או שבור, (3) בקבוק מכיל חומר זר, (4) בקבוק מתהפך או נופל במהלך העברות, או (5) יש כל אירוע או תצפית אחרים שהופכים את המשך הצלוחיות האלה למוטל בספק.
  12. אם יש בעיות, תאונות או חשדות לזיהום בתרביות LTEE של היום הקודם, אין להעביר מהן. במקום זאת, אחסנו את כל קבוצת שתים עשרה התרביות בטמפרטורה של 4°C לבחינה מאוחרת יותר ואפיון נוסף.
  13. אחזר את הצלוחיות המכילות את תרביות הגיבוי שהועברו מיום קודם ואוחסנו ב -4 מעלות צלזיוס. הניחו אותם על הספסל כדי להתחמם לטמפרטורת החדר. מערבלים בעדינות כל בקבוק כדי להשעות מחדש את התאים.
  14. העבר מצלוחיות הגיבוי לקבוצה החדשה של צלוחיות המכילות תווך טרי והמשך את הניסוי כרגיל כמתואר בשלבים 1.6-1.11. רשום ביומן ההעברות שנעשה שימוש בתרביות הגיבוי ורשום את אותו מספר העברה כמו ביום הקודם.
    הערה: גם אם מתגלה בעיה בצלוחיות של אוכלוסייה אחת בלבד, העבר את כל שתים עשרה האוכלוסיות מצלוחיות הגיבוי כך שמספר הדורות שחלפו בכל האוכלוסיות יישאר בשלב. אם זיהום מצוין בצלוחיות הגיבוי המאוחסנות ב -4 מעלות צלזיוס, יש להפעיל מחדש את אוכלוסיות ה- LTEE המושפעות ממלאי קפוא באמצעות ההליך המתואר בשלבים 3.1-3.2 עבור דגימות אוכלוסייה. אין להגדיל את מספר ההעברה עבור LTEE עד לצמיחת התרביות הראשונות ב- DM25 לאחר התחייה.

2. ארכוב אוכלוסיות LTEE

הערה: דגימות של אוכלוסיות LTEE מוקפאות כל 75 העברות. האוכלוסיות גדלות ~ 6 2/3 דורות בכל יום לאחר דילול ההעברה פי 100, כך שתקופה זו מתאימה ל~500 דורות. במהלך הארכיון, אוכלוסיות LTEE מצופות גם על סוגים שונים של מדיה אגר כדי לבדוק זיהום. לחלופין, ניתן לבחור שיבוטים מייצגים מצלחות אלה ולאחסן אותם בארכיון בשלב זה. שלבים אלה מסוכמים באיור 1.

  1. יום לפני ההקפאה המתוכננת או כמה ימים לפני, הכינו שלושה סוגים של צלחות אגר: גלוקוז מינימלי (MG), ארבינוז מינימלי (MA) וטטרזוליום ארבינוז (TA). הכינו שתים עשרה צלחות מכל סוג אגר, ועוד כמה תוספות. כמו כן, הכינו לפחות 250 מ"ל של 0.85% (w/v) מלוחים סטריליים ו-50 מ"ל של 80% (v/v) גליצרול סטרילי.
    הערה: מתכונים לכל המדיה והפתרונות זמינים באינטרנט30. היום לפני שה-LTEE מגיע לדור שהוא מכפלה של 500 עבור לוח הזמנים הרגיל לאחסון בארכיון הוא היוםה-74 מאז ההקפאה האחרונה בתוספת כל הימים שנוספו עקב העברות מצלוחיות הגיבוי של 4 מעלות צלזיוס כאשר התגלו בעיות או חשדו בהן.
  2. אופציונלי: אם אחסון בארכיון של שיבוט מבודד מאוכלוסיות LTEE, הכינו אספקה נוספת: בידוד שלושה שיבוטים מכל אוכלוסייה דורש 72 מ"ג צלחות, 80 מ"ל של 80% (v/v) גליצרול ו-370 מ"ל DM1000.
  3. הכינו סט נוסף של שתים עשרה צלוחיות בעת ביצוע שלב 1.2 של העברות LTEE יומיות ביום שלפני ההקפאה המתוכננת. סמן שש מהצלוחיות הנוספות xA−1 עד xA−6 באמצעות סמן אדום, ואת שש האחרות xA+1 עד xA+6 באמצעות סמן שחור.
    הערה: ה- "x" מציין שקבוצת הצלוחיות הנוספת תשמש לאחסון בארכיון ומבדיל אותן מקבוצת הצלוחיות האחרות שישמשו להמשך ההעברות היומיות של ה- LTEE במקביל.
  4. מלא כל אחת מהצלוחיות הנוספות שישמשו לאחסון בארכיון עם 14.85 מ"ל DM25 באמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מ"ל בעת ביצוע שלב 1.4 של העברות LTEE יומיות.
  5. השלם את העברת LTEE הרגילה כמתואר בשלבים 1.5-1.11. לאחר מכן, חזור על ההוראות לשלב 1.8, אך הפעם העבר 150 μL מכל אחת מתרביות LTEE של היום הקודם לצלוחיות נוספות של 14.85 מ"ל של DM25 טרי שישמשו לארכיון.
    הערה: בצעד זה ובכל השלבים הבאים, הימנע מזיהום ותערובות על-ידי ביצוע הנחיות אלה. התחל עם אוכלוסייה A−1, לאחר מכן העבר A+1, ולאחר מכן המשך לסירוגין - ו + אוכלוסיות. נגבו את החבית ואת המפלט של המיקרופיפטור עם מגבון נייר ללא סיבים טבול באתנול 70% בעת החלפת אוכלוסיות. העבר צלוחיות ומבחנות במגשים או במדפים שלהם לאחר הפיפט מהם או אליהם כדי לעקוב אחר ההעברות שהושלמו.
  6. לדגור על סט של שתים עשרה צלוחיות לאחסון ב 37 ° C במשך 24 ± 1 שעה עם 120 סל"ד מסלול רועד על קוטר 1 אינץ 'לצד שתים עשרה תרביות LTEE ואת הריק כמתואר בשלב 1.9.
  7. הכינו אספקה לציפוי אוכלוסיות ה-LTEE לפחות שעה לפני ביצוע העברות ה-LTEE ביום ההקפאה.
    1. בחר שתים עשרה מ"ג, שתים עשרה MA ושתים עשרה צלחות אגר ת"א. בדוק חזותית כל אחד מהם כדי להיות בטוח שאין לו זיהום ברור.
    2. סמן צלחת אחת מכל סוג עבור כל אחת משתים-עשרה אוכלוסיות LTEE (A−1 עד A+6).
      הערה: בעת סימון צלחות, כתוב על הצדדים של תחתית צלחת הפטרי. זה חשוב כדי לא לטשטש מושבות כאשר רוצים לבחון או לצלם אותן מתחת לאגר. אל תכתוב על העפעפיים, מכיוון שניתן לערבב אותם.
    3. הניחו את צלחות האגר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות כדי לחמם אותן לפני השימוש בהן בשלב 2.10.
    4. הכינו 24 מבחנות המכילות 9.9 מ"ל מי מלח. סדרו אותם בשנים-עשר סטים של שני צינורות כל אחד.
    5. תייגו כל אחת משתי הקבוצות של שתים-עשרה מבחנות באותו אופן כמו הלוחות, והוסיפו "1" או "2" מתחת למזהה האוכלוסייה של LTEE כדי לציין את הסדר שבו הן ישמשו לביצוע דילולים של אותה אוכלוסייה.
  8. בצע את שלבים 1.1-1.11 באמצעות הצלוחיות שימשיכו את ההעברות היומיות של LTEE כרגיל. במהלך שלב 1.5, הסר גם את שתים עשרה הצלוחיות המכילות את התרביות הנוספות לארכיון מאינקובטור הרעידה.
  9. פיפטה 100 μL של התרבית מכל אחת משנים עשר הצלוחיות הנוספות לאחסון במבחנה הראשונה של מי מלח בזוג עבור אוכלוסיית LTEE זו. מערבלים את הצינורות עם דילולים אלה פי 100 ביסודיות. לאחר מכן, פיפטה 100 μL מכל אחד לצינור השני המתאים של מלוחים. מערבלים את דילול התרביות הסופי פי 10,000 ביסודיות.
  10. פיפטה 80 μL מכל אחד מהצינורות המכילים דילול תרבית פי 10,000 ללוחות TA, MG ו- MA המסומנים עבור אוכלוסייה זו. פזרו את הנוזל באופן אחיד על פני משטח האגר באמצעות מוט פיזור סטרילי או חרוזי פיזור סטריליים, לפי העדפה. חזור על הפעולה עד שכל שתים-עשרה האוכלוסיות יהיו מצופות על כל שלושת סוגי המדיה.
  11. במידת הצורך, הניחו לצלחות להתייבש עד שלא נראה נוזל על האגר. מניחים את הלוחות הפוכים (עם צד האגר למעלה) באינקובטור הסעת כבידה המוגדר ל 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: דגירה הפוכה של צלחות שומרת על האגר מפני התייבשות ומונעת מעיבוי לטפטף על משטח האגר. תנועה של תאים בנוזל על פני האגר במהלך הדגירה עלולה למרוח מושבות ולהניב ספירת מושבות שגויה.
  12. הוסף 3 מ"ל של גליצרול סטרילי 80% (v/v) לכל אחת מ-12 הצלוחיות הנוספות המיועדות לאחסון בארכיון. מערבבים היטב על ידי ערבול ומערבולות עדינות.
  13. יש לפזר את התערובת מכל בקבוק לקריביאלים סטריליים שסומנו במזהה ייחודי לדגימה, לאוכלוסיית ה-LTEE שאליה שייכת הדגימה, לדור שבו הוקפאה, לעובדה שמדובר בדגימה מעורבת (אוכלוסייה) ולתאריך. פיפטה 6 מ"ל לתוך בקבוקון אחד גדול ו 1.25 מ"ל לתוך כל אחד משישה בקבוקונים קטנים.
    הערה: הבקבוקון הגדול הוא המלאי העובד. בקבוקון קטן אחד הוא גיבוי למקרה שהמלאי התקין אזל או הזדהם. חמשת הבקבוקונים הקטנים האחרים הם עותקים שניתן לשלוח למעבדות אחרות.
  14. מקפיאים את הבקבוקונים המלאים ב -80 מעלות צלזיוס.
  15. לבחון ולתעד את הצמיחה והמורפולוגיה של מושבות על לוחות TA, MG ו-MA לאחר 24 שעות ו-48 שעות של דגירה.
    הערה: עיין בסעיף תוצאות מייצגות לקבלת תמונות ותיאורים של מושבות שנוצרו על ידי אבותיהם הקדמונים של REL606 ו- REL607 וכל אחת משתים-עשרה אוכלוסיות LTEE כאשר הן היו מצופות ב- 76,000 דורות.
  16. אופציונלי: בצע את השלבים הבאים בעת אחסון מבודדי שיבוט בארכיון.
    1. בחר שלושה מבודדים שבטיים (מושבות) עבור כל אוכלוסיית LTEE מתוך לוחות MG, פסים כל אחד בנפרד על צלחת MG חדשה, ודגור על לוחות אלה במשך 16-24 שעות ב 37 ° C.
      הערה: אם קיימות מושבות עם מורפולוגיות שונות, הנוהג המקובל ב- LTEE הוא לדגום מגוון מרבי על ידי בחירת הסוג הנפוץ ביותר, ולאחר מכן בחירת מושבות נוספות מסוגי מיעוטים. ניתן גם להשתמש באסטרטגיית דגימה אקראית על ידי סימון נקודות בחלק התחתון של תחתית צלחת הפטרי לפני פיזור התאים ולאחר מכן בחירת המושבה המבודדת הקרובה ביותר לכל סימן לאחר הצמיחה.
    2. למחרת, פזרו מושבה מייצגת מכל צלחת על צלחת MG חדשה ודגרו על צלחות אלה במשך 16-24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. למחרת, חסן מושבה מבודדת אחת מכל צלחת MG לתוך בקבוק המכיל 10 מ"ל של DM1000 טרי. כמו כן, מלא בקבוק אחד נוסף עם 10 מ"ל של DM1000 כדי לשמש ריק לא מחוסן כדי לבדוק זיהום מדיה.
    4. לדגור על הצלוחיות ב 37 ° C במשך 16-24 שעות עם 120 סל"ד מסלול רועד מעל קוטר 1 אינץ '.
    5. לאחר הדגירה, יש להוסיף 2 מ"ל גליצרול סטרילי 80% (v/v) לכל בקבוק ולערבב.
    6. פזרו 1.25 מ"ל אליציטוטים מכל בקבוק לבקבוקונים קטנים וסטריליים המסומנים במזהה ייחודי לכל שיבוט, אוכלוסיית ה-LTEE שלו ודור המוצא שלו, שהוא דגימת שיבוט והתאריך.
    7. מקפיאים את הבקבוקונים המלאים ב -80 מעלות צלזיוס.

3. מבחני כושר תחרותיים

הערה: ב- LTEE, כושר הרבייה מכומת במונחים של המספר היחסי של הכפלות שחיידקים שונים משיגים במהלך מחזור תרבית אחד או יותר של 24 שעות באותם תנאים כמו ההעברות היומיות. באופן ספציפי, הכושר היחסי של מתחרה אחד למשנהו הוא היחס בין שיעורי ההכפלה הממומשים שלהם כאשר הם מתחרים ראש בראש בתרבות משותפת. כל מתחרה בזוג עשוי להיות אוכלוסייה מלאה או מבודד שבט שאורכב בעבר כחלק מ"תיעוד המאובנים" הקפוא של LTEE. לחלופין, אחד המתחרים או שניהם עשויים להיות שיבוט שעבר הנדסה גנטית כדי להוסיף או להסיר מוטציות ספציפיות כדי לבדוק את השפעתן. שני המתחרים חייבים להיות במצבים מנוגדים של Ara+/Ara− מכיוון שסמן גנטי זה משמש כדי להבדיל ביניהם במהלך בדיקה זו. זרימת העבודה הכוללת עבור בדיקת תחרות מוצגת באיור 2. ניתן להאריך את משך שלב הטיפוח המשותף מיום אחד לשלושה (או יותר) כדי לשפר את הדיוק של הערכות הכושר בעת בדיקת הבדלים בין מתחרים התואמים כמעט באופן שווה. ראה Disussion עבור שיקולים קריטיים אחרים ושינויים אפשריים של פרוטוקול זה.

Figure 2
איור 2: תרשים זרימה של מבחני תחרות. ההליך המלא לבדיקת תחרות בת יום אחד מוצג. ההליך בן שלושת הימים ממשיך עם המסלול החלופי ביום 1 וביום 2 עד לציפוי ביום 3 באותו אופן שבו הוא מתואר ביום 1 של התחרות החד-יומית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הכנת חומרים מתכלים
    1. החלט בכמה זני LTEE מתחרים ו/או אוכלוסיות ישמשו וכמה מבחני תחרות משוכפלים יבוצעו עבור כל זוג מתחרים. הכן את הציוד הדרוש כמתואר בשלבים הבאים.
      הערה: מתכונים לכל המדיה והפתרונות זמינים באינטרנט30. את הצלוחיות והמבחנות הנדרשות לכל ימי הניסוי בתחרות ניתן למלא מראש או לפי הצורך בימים בהם נעשה בהם שימוש. אם ממלאים צלוחיות ומבחנות מראש, אחסנו אותן בטמפרטורת החדר בחושך כדי למזער את האידוי. יש להכין את צלחות ת"א לפחות יומיים לפני מועד השימוש בהן כדי שיוכלו להתייבש מספיק לאחר המזיגה כדי לאפשר פיזור דילול תרבית. הכינו תמיד כמה צלוחיות נוספות, מבחנות וצלחות TA כדי שהניסוי יוכל להמשיך אם יש טעויות צנרת, צלחות מזוהמות או תקלות קלות אחרות.
    2. ליום התחייה (יום -2), מלאו בקבוק Erlenmeyer סטרילי אחד של 50 מ"ל מכוסה בכוס 20 מ"ל עם 9.9 מ"ל של DM1000 או מרק ליזוגני (LB) לכל זן או אוכלוסייה של E. coli שישמשו כמתחרה. ממלאים בקבוק אחד נוסף עם 9.9 מ"ל של אותו מדיום כדי לשמש ריק לא מחוסן.
    3. עבור יום טרום ההתניה (יום −1), מלא מבחנה אחת עם 9.9 מ"ל של 0.85% (w/v) מלוחים סטריליים לכל מתחרה, שתי צלוחיות עם 9.9 מ"ל DM25 לכל בדיקה משוכפלת בין זוג מתחרים, ועוד בקבוק אחד עם 9.9 מ"ל DM25 עבור ריק.
    4. עבור יום תחילת התחרות (יום 0), מלא בקבוק אחד עם 9.9 מ"ל של DM25, מלא מבחנה אחת עם 9.9 מ"ל של 0.85% (w/v) מלוחים סטריליים, והכן צלחת TA אחת לכל שכפול מבחן התחרות. מלא בקבוק אחד נוסף עם 9.9 מ"ל של DM25 לשמש ריק.
    5. חלופה: עבור כל יום של תחרות רב-יומית מעבר לראשון, מלא בקבוק אחד עם 9.9 מ"ל DM25 לכל תחרות משוכפל ומלא בקבוק אחד נוסף עם 9.9 מ"ל DM25 עבור ריק.
    6. ביום האחרון של התחרות (למשל, יום 1 או יום 3), מלאו שתי מבחנות במי מלח סטריליים במינון 9.9 מ"ל של 0.85% (w/v) מלוחים סטריליים והכינו צלחת TA אחת לכל שכפול תחרות.
  2. יום −2: החיו מתחרים בנפרד ב-DM1000 או LB
    1. עבור כל אחד מהמתחרים, תייג בקבוק מלא ב- 9.9 מ"ל של DM1000 או LB. תייג בקבוק נוסף מלא ב- 9.9 מ"ל מאותה אצווה של מדיום כדי לשמש ריק לא מחוסן לבדיקת זיהום.
      הערה: מלאי קפוא קם לתחייה ב-LB או DM1000 להתאוששות אחידה וצפויה יותר של תאים שמורים בהקפאה. הגליצרול המשמש כמגן קריוגני יכול להיות מטבוליזם על ידי E. coli, מה שיוביל לצפיפויות תאים גבוהות מהצפוי אם הדגימות יקומו לתחייה ב- DM25. LB ו- DM1000 תומכים בצמיחה לצפיפויות תאים כה גבוהות עד כי סיבוך זה הופך זניח.
    2. הוציאו את הקריובלים המכילים את המלאי הקפוא של הזנים המתחרים מהמקפיא בטמפרטורה של 80°C. שמרו את הבקבוקונים צוננים בדלי קרח בזמן השימוש בהם.
    3. לאחר שכל מלאי קפוא הפשיר, מערבלים אותו ביסודיות כדי להשעות מחדש את תאי E. coli. אם מחיים שיבוט, לחסן את הבקבוק המכיל מדיום טרי עם 12 μL של מלאי קפוא. אם מחיים אוכלוסייה, לחסן את הבקבוק עם 120 μL של מלאי קפוא.
      הערה: נפח 120 μL של המלאי הקפוא משמש לאוכלוסיות, כך שמספר התאים שקמים לתחייה זהה בערך לצוואר הבקבוק היומי כאשר 1% מאוכלוסיית LTEE מועבר לצלוחית חדשה. הפשרה וערבול של מלאי קפוא מספר פעמים עלולים לגרום ללחץ על התאים ולהפחית את הכדאיות של המלאי לאורך זמן. אם אוכלוסיית LTEE נתונה או שיבוט עומדים לשמש בתחרויות מספר פעמים, זה נוהג טוב לגדל מחדש ולהקפיא עותקים מרובים של המלאי, כך שאף אחד מהם לא מופשר ומוקפא מחדש פעמים רבות.
    4. לדגור את צלוחיות התחייה ואת הריק ב 37 ° C בלילה (16-24 שעות) עם 120 סל"ד מסלול רועד מעל 1 אינץ 'קוטר.
  3. יום −1: תנאים מוקדמים למתחרים בנפרד ב-DM25
    1. עבור כל מתחרה, תווית מבחנה מלאה 9.9 מ"ל של מלוחים. עבור כל מבחן תחרות משוכפל בין זוג מתחרים, תייגו שתי צלוחיות 50 מ"ל מלאות ב- 9.9 מ"ל DM25, כל אחת עם מספר השכפול ושם אחד המתחרים. יש לסמן בקבוק אחד נוסף מלא ב-9.9 מ"ל DM25 כדי לשמש ריק.
    2. הוציאו מהחממה את הצלוחיות המכילות את תרביות המתחרים שקמו לתחייה. בדקו את העכירות שלהם בעין כדי לוודא שהם גדלו ושאין זיהום ברור.
    3. פיפטה 100 μL מכל בקבוק לתוך מבחנה של מלוחים עבור אותו מתחרה.
      הערה: שלב זה מדלל את התרבית פי 100, דבר הכרחי מכיוון שצפיפות התאים גבוהה בהרבה ב- LB וב- DM1000 מאשר בסביבת DM25 המשמשת ב- LTEE (ראה תוצאות מייצגות).
    4. מערבלים כל צינור דילול ביסודיות ממש לפני הפיפט 100 μL מהתרבית המדוללת לתוך בקבוק עם DM25 טרי. חסנו שתיים מהצלוחיות הללו עבור כל ניסוי משוכפל, אחת עבור כל אחד מהמתחרים.
    5. לדגור על צלוחיות המיזוג המוקדם והריק ב 37 ° C במשך 24 ± 1 שעה עם 120 סל"ד אורביטלי רועד על קוטר 1 אינץ '.
  4. יום 0: התחל את התחרות על ידי ערבוב מתחרים וצלחת לספירה ראשונית
    1. עבור כל שכפול של בדיקת תחרות, יש לסמן בקבוק אחד מלא ב-9.9 מ"ל DM25 ומבחנה אחת מלאה במי מלח במינון 9.9 מ"ל. תייגו את הצלוחיות והצינורות באופן שמזהה באופן ייחודי כל זוג מתחרים ואת המספר המשוכפל של מבחן המתחרים. יש לסמן בקבוק אחד נוסף מלא ב-9.9 מ"ל DM25 כדי לשמש ריק.
    2. הוציאו את צלוחיות המיזוג המוקדמות מהאינקובטור. בדקו את העכירות שלהם בעין כדי לוודא שהם גדלו ושאין זיהום ברור.
    3. העבירו 50 μL של המתחרה Ara− לבקבוק התחרות המשוכפל הראשון מלא DM25 טרי. מיד, להעביר 50 μL של המתחרה Ara+ לתוך אותו בקבוק התחרות ולערבב אותו על ידי ערבול עדין.
    4. חזור על שלב 3.4.3 עבור כל העותקים המשוכפלים של כל זוגות המתחרים.
      הערה: לצלוחיות התחרות יש כעת דילול כולל של פי 100 של תרביות E. coli הגדלות ב- DM25, אותם תאי מצב בחוויית LTEE לאחר כל העברה יומית. סדר ביצוע ההעברות והערבוב חשוב. הוסף את שני המתחרים לכל בקבוק מיד אחד אחרי השני, כך שאף אחד מהם לא מקבל יתרון להתחיל לצמוח במדיום הטרי. לדוגמה, אל תוסיפו את תרביות Ara− לכל צלוחיות התחרות ואז חזרו והוסיפו את כל זני Ara+ .
    5. פיפטה 100 μL מכל בקבוק תחרות חדש שחוסנו לתוך מבחנה של מי מלח המסומנים עבור אותה בדיקת תחרות משוכפלים כך שכל אחת מהמבחנות הללו מכילה דילול כולל של פי 10,000 של תרביות DM25 המותנות מראש ששולבו.
    6. מניחים את צלוחיות התחרות וריקנות לתוך האינקובטור הרועד. לדגור על צלוחיות התחרות ב 37 ° C במשך 24 ± 1 שעה עם 120 סל"ד מסלול רועד מעל קוטר 1 אינץ '.
    7. באותו היום, מיד לאחר הכנסת צלוחיות התחרות לאינקובטור, מערבלים כל מבחנה משלב 3.4.5 ביסודיות ומפזרים 80 מיקרוליטר מהדילולים הללו פי 10,000 על לוחות ת"א כמתואר בשלב 2.10. תייגו את הצד התחתון של כל צלחת עם זוג הזנים שהיו מעורבבים, מספר המשוכפל ו"יום 0" כדי לציין שהוא ישמש לקביעת הייצוג הראשוני של כל מתחרה.
    8. דוגרים על לוחות TA הפוכים באינקובטור קונבקציה כבידתית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שניתן להבחין בין מושבות של המתחרים Ara− ו- Ara+ . בדרך כלל, זה קורה בתוך 16-24 שעות, אבל זה עשוי לקחת זמן רב יותר עבור כמה זנים מפותחים. ספור את מספרי מושבות Ara− (אדום) ו- Ara+ (לבן) על כל לוח ורשום את התוצאות.
      הערה: ההבדלים בין הצבעים של מושבות Ara- ו- Ara+ על לוחות TA הופכים פחות ברורים עם הזמן, גם כאשר לוחות מאוחסנים ב 4 ° C, ולכן יש לספור אותם מהר ככל האפשר לאחר הוצאתם מהאינקובטור. תמונות של לוחות TA המציגות את המראה האופייני של מושבות שנוצרו על ידי תאי Ara− ו- Ara+ כלולות בתוצאות המייצגות. בחלק זה יש גם תמונות של מושבות "מקרה קצה" נפוצות (למשל, חפיפה או צמיחה של סוגי מושבות שונים), ומסביר כיצד לספור אותן. אם קצבי הצמיחה והמורפולוגיה של מושבות שנוצרו על לוחות ת"א על ידי מי מהמתחרים לא אופיינו קודם לכן, פיזר 80 מיקרוליטר של דילול פי 10,000 במי מלח מצלוחיות המיזוג ביום 0, כאשר המתחרים עדיין נפרדים זה מזה. לאחר מכן, בדוק מושבות על לוחות בקרה אלה לאחר הדגירה ב 37 ° C במשך 16-24 שעות או יותר.
  5. חלופה: ימים 1 ו-2: המשך תחרות בת שלושה ימים
    1. עבור כל שכפול של בדיקת תחרות, יש לסמן בקבוק אחד מלא ב-9.9 מ"ל DM25. תייגו את הצלוחיות באופן שמזהה באופן ייחודי כל זוג מתחרים, את המספר המשוכפל ואת יום מבחן התחרות. יש לסמן בקבוק אחד נוסף מלא ב-9.9 מ"ל DM25 כדי לשמש ריק.
    2. הוציאו את צלוחיות התחרות מהיום הקודם אל מחוץ לחממה. בדוק את העכירות שלהם בעין כדי לאמת את הצמיחה הצפויה ולזהות זיהום.
    3. מעבירים 100 μL מכל בקבוק תחרות לבקבוק המתאים של מדיום טרי ליום המחרת של התחרות.
    4. הניחו את צלוחיות התחרות החדשות וריקנו אותן לתוך החממה המטלטלת. לדגור אותם ב 37 ° C במשך 24 ± 1 שעה עם 120 סל"ד מסלול רועד על קוטר 1 אינץ '.
    5. חזור על שלבים 3.5.1-3.5.4 ביום השני של התחרות לפני שתמשיך.
  6. יום 1 או 3: סיום התחרות והצלחת לספירה סופית
    1. עבור כל בקבוק תחרות, להכין שתי מבחנות מלא 9.9 מ"ל של מלוחים. תייגו אותם באופן שמזהה באופן ייחודי כל זוג מתחרים, את מספר השכפול והאם הם מיועדים לדילול הראשון או השני.
    2. הוציאו את צלוחיות התחרות מהחממה. בדקו את העכירות שלהם בעין כדי לגלות שהם גדלו ולא היה זיהום ברור.
    3. פיפטה 100 μL מכל בקבוק תחרות לתוך הצינור הראשון של מלוחים עבור אותו משוכפל. הצינורות המתקבלים מכילים דילול פי 100 של תרביות DM25.
    4. מערבלים כל צינור דילול פי 100 כדי לערבב אותו ביסודיות ופיפטה 100 μL לצינור השני של מי מלח עבור שכפול זה. הצינורות המתקבלים מכילים דילול פי 10,000 של תרביות DM25.
    5. מערבלים כל מבחנה המכילה דילול של פי 10,000 ביסודיות ומפזרים 80 מיקרוליטר ממנה על צלחת TA כמתואר בשלב 2.10. תייגו את הצד התחתון של כל צלחת עם זוג הזנים שהיו מעורבים, המספר המשוכפל, ו"יום 1" לתחרות של יום אחד או "יום 3" לתחרות של שלושה ימים כדי לציין שהוא ישמש לקביעת הייצוג הסופי של כל מתחרה.
    6. יש לדגור על לוחות TA בטמפרטורה של 37°C ולספור את מושבות Ara− ו-Ara+ לאחר הצמיחה כמתואר בשלב 3.4.8.
      הערה: עקוב אחר המספר המשוכפל של כל מבחן תחרות לאורך כל שלבי ההעברות והציפויים. בלבול בין הספירה הסופית לספירה הראשונית בין מבחני שכפול שונים - גם כאשר אותם שני מתחרים היו מעורבים בכל אחד מהם - יוביל להערכות כושר שגויות.
  7. חישוב וכשירות העלילה
    1. אם אתה משתמש ב- Excel לחישוב והתוויית כושר יחסי, הורד את הגיליון האלקטרוני XLS (קובץ משלים 1). אם אתה משתמש ב- R, התקן את חבילת fitnessR31 והורד את תבנית הערכים המופרדים באמצעות פסיקים (CSV) (קובץ משלים 2) או צור עותק חדש של קובץ זה בהתאם להוראות בקובץ שלו.
    2. הזן "דילול העברה" של 100 עבור מבחני התחרות שנערכו בתא או בעמודה המיועדים בקובץ שהורדת. הזן את המספר הכולל של מחזורי הצמיחה היומיים שבמהלכם המתחרים היו מתורבתים משותפים כ"מספר ההעברות" (למשל, 3 עבור תחרות של שלושה ימים).
    3. הזן את השמות של כל זוג מתחרים בתאים או בעמודות ייעודיים עם זן הייחוס כ- "competitor1" והזן או אוכלוסיית הבדיקה כ- "competitor2".
    4. עבור כל שכפול של בדיקת תחרות, הזן את ספירת המושבה הראשונית והאחרונה בהתאמה בעמודות הייעודיות של הקובץ שהורדת.
    5. אם אתה משתמש בגיליון האלקטרוני של Excel, הוא יציג כעת את ערך הכושר היחסי הממוצע ואת מגבלות הביטחון של 95% בהערכה זו. העתק את התוצאות עבור שילובים שונים של מתחרים לגיליון אחר וצור תרשים המסכם את התוצאות. אם אתה משתמש ב- R כדי לנתח את הנתונים, בצע את ההוראות ב- vignette עבור חבילת fitnessR כדי לבצע חישובים אלה, להפיק קובץ CSV עם הערכים המחושבים ולהתוות את התוצאות.

Representative Results

מראה ועכירות של תרביות LTEE
בשל ריכוז הגלוקוז הנמוך ב- DM25, העכירות של אוכלוסיות LTEE בוגרות במלואן נראית רק בקושי באחת עשרה מתוך שתים עשרה הצלוחיות. כאשר בוחנים את תרביות ה-LTEE לפי עין לגדילה נורמלית וסימני זיהום (שלב 1.6), יש להשוות כל בקבוק המכיל אוכלוסיית LTEE זה לצד זה לריק (איור 3A). יוצאת הדופן היא אוכלוסייה A-3, שהתפתחה להשתמש בציטראט כמקור פחמן ואנרגיה נוסף ולכן מגיעה לצפיפות תאים גבוהה יותר32. העכירות של תרביות DM25 של זני האב הקדמון REL606 ו-REL607 דומה לזו של אוכלוסייה מפותחת טיפוסית (איור 3B). זנים ואוכלוסיות LTEE גדלים לצפיפות גבוהה יותר ב-DM1000 הודות לריכוז גבוה יותר של גלוקוז, וצפיפות הרבה יותר גבוהה ב-LB (איור 3B). צפיפות תרביות DM25 באוכלוסיית A−3 LTEE היא בינונית בין צפיפות התרבויות של REL606 ב-DM25 וב-DM1000 (איור 3C).

Figure 3
איור 3: הופעה של תרביות LTEE. (A) צלוחיות המכילות את שתים-עשרה אוכלוסיות ה-LTEE לאחר 24 שעות של גידול ב-DM25 ביום שבו הניסוי הגיע ל-76,253 1/3 דורות מסומנים לצד החסר. (B) צלוחיות המכילות תרביות של אבות קדמונים מסוג REL606 ו-REL607 שגודלו במשך 24 שעות ב-DM25, DM1000 ו-LB מצולמות לצד ריקי מדיה. (C) תמונות מוגדלות של אותן צלוחיות זו לצד זו, המראות כיצד העכירות של בקבוק אוכלוסיית A-3 ב-DM25 בהשוואה לאב הקדמון REL606 ב-DM25 וב-DM1000. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קריאות ספקטרופוטומטר של הצפיפויות האופטיות ב-600 ננומטר (OD600) של תרביות שגדלו ב-DM25 (שלב 1.7) תואמות את התצפיות החזותיות האלה הן עבור אוכלוסיות LTEE (איור 4A) והן עבור אבותיהן הקדמונים (איור 4B). ניתן להשתמש בקריאות אלה כדי להשוות כמותית ולתעד גדילה כאשר יש חשד לזיהום או טעות. עבור מדידות של אוכלוסיות LTEE בין 76,000 ל -76,500 דורות, מצאנו כי OD600 של A−3, האוכלוסייה שהתפתחה לגדול על ציטראט, היה 0.223 בממוצע (0.218-0.227, 95% רווח בר-סמך). OD600 של 11 האוכלוסיות האחרות היה 0.0252 בממוצע (0.0239-0.0265, 95% רווח בר-סמך). הייתה שונות קלה, אך משמעותית, בקריאות OD600 בקרב אחת עשרה האוכלוסיות הנורמליות (F 10,88 = 5.1035, p = 7.5×10−6). אוכלוסיות ה-LTEE מגיעות לשלב נייח לאחר כ-5-6 שעות דגירה. אם הם מועברים בבוקר, הצמיחה תהיה גלויה עד אמצע עד שעות אחר הצהריים המאוחרות של אותו יום. מינים רבים של מיקרובים מסוגלים לגדול באופן אירובי על ציטראט. לכן, עכירות מוגברת באוכלוסיות שאינן A-3 היא ככל הנראה סימן לזיהום חיצוני.

Figure 4
איור 4: עכירות של תרביות LTEE. (A) צפיפות אופטית ב-600 ננומטר (OD600) של שתים-עשרה אוכלוסיות LTEE לאחר מחזור גידול של 24 שעות בשלושה ימים שונים בין 76,000 ל-76,500 דורות של הניסוי. ערכי OD600 של שלושה aliquots 1-mL בכל אחד משלושת הימים השונים מסומנים כנקודות. הערך הממוצע OD600 של שלושה aliquots שונים של הריק מאותו יום הופחת מערכים אלה. סרגלי מילוי מציגים ממוצעים. קווי שגיאה הם מגבלות ביטחון של 95%. (B) OD600 של תרבויות של אבות קדמונים REL606 ו-REL607 ב-DM25, DM1000 ו-LB. ערכי OD600 של שלושה aliquots 1-mL בכל אחד משלושה ימים שונים של שתי תרביות נפרדות עבור כל מצב וזן מסומנים כנקודות. הערך הממוצע OD600 של שלושה aliquots שונים של הריק מאותו יום הופחת מערכים אלה. סרגלי מילוי מציגים ממוצעים וסרגלי שגיאה הם מגבלות ביטחון של 95%. אזורים אפורים מוצללים בין החלוניות מראים כיצד משנה את קנה המידה של ציר OD600 בין לוח DM25 ללוחות DM1000 ו-LIB. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

גידול ומורפולוגיה של מושבות LTEE
כאשר בודקים את האוכלוסיות לזיהום על-ידי ציפוי שלהן על מדיות שונות (שלב 2.15), האבות הקדמונים REL606 ו-REL607 וכל האוכלוסיות המפותחות יוצרים מושבות לבנות עם קצוות שקופים ומעט לא סדירים על לוחות אגר עם גלוקוז מינימלי (MG) (איור 5A). ההרכב של אגר MG זהה לזה של DM25 המשמש בהעברות LTEE יומיות, למעט עם ריכוז גבוה יותר של גלוקוז, כך שאוכלוסיות LTEE המפותחות יוצרות לעתים קרובות מושבות גדולות יותר על MG מאשר האבות. בשל צפיפות התאים הגבוהה יותר שלה ב- DM25, אוכלוסיית A-3 תהיה בעלת מספר כפול יותר מושבות אם אותו נפח מצופה עבורה כמו עבור אוכלוסיות אחרות, וזה עשוי להגביל את גודל המושבות. הסוגים הנפוצים ביותר של חיידקים מזהמים יוצרים מושבות לבנות עזות, אטומות ומעגליות לחלוטין על MG.

באגר אראבינוז מינימלי (MA), האב הקדמון REL607 ואוכלוסיות Ara+ יוצרות בדרך כלל מושבות לבנות מעט שקופות. דפוס גידול טיפוסי זה נמשך עבור אוכלוסיות Ara+ במשך 76,000 דורות, למעט A+6, שפיתח פגם בגידול על ערבינוז ואינו יוצר עוד מושבות על MA (איור 5B). אין ברירה לשמור על גידול על ארבינוז במהלך העברות LTEE ב- DM25, כך שאוכלוסיות Ara+ אחרות עשויות בסופו של דבר להפסיק ליצור מושבות על לוחות אגר MA ככל שהניסוי נמשך. למעט A−3, אוכלוסיות ארה אינן יוצרות מושבות על אגר MA, אם כי בדיקה מדוקדקת עשויה לגלות מיקרו-מושבות בשל עקבות חומרי מזון באגר. אוכלוסיית A-3 יוצרת מושבות קטנות רבות על MA, שכן תאים אלה יכולים לגדול על ציטראט שנמצא גם בתווך זה. מושבות מזהמים על MA הן נדירות.

Figure 5
איור 5: ציפוי אוכלוסיות LTEE לאיתור זיהום. דילולים של אבות אבותיהם של REL606 ו-REL607 ושל שתים-עשרה אוכלוסיות LTEE ביום שבו הגיע הניסוי ל-76,026 2/3 דורות צופו על לוחות אגר (A) MG, (B) MA ו-(C) TA וצולמו לאחר 24 שעות ו-48 שעות. אותם דילולים נעשו עבור כל התרביות, אך מחצית מהנפח היה מצופה עבור האבות הקדמונים כפי שמתואר בפרוטוקול עבור אוכלוסיות LTEE, כדי להסביר במידת מה את צפיפות התאים הגבוהה יותר שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

על אגר טטרזוליום ערבינוז (TA), האב הקדמון REL606 וכל אוכלוסיות Ara− צפויים ליצור מושבות אדומות, בעוד שהאב הקדמון REL607 וכל אוכלוסיות Ara+ צריכים בדרך כלל ליצור מושבות לבנות (שיכולות לכלול גווני ורוד בהיר או אפרסק) (איור 5C). אבות ה-LTEE יוצרים מושבות חזקות, שניתן לזהות בקלות כ-Ara− ו-Ara+ על אגר TA תוך 16-24 שעות. במקור, ניתן היה להשתמש בהבדל זה כדי לזהות זיהום צולב בין אוכלוסיות Ara− ו- Ara+ . עם זאת, לאגר TA יש הרכב תזונתי מורכב יותר מאשר מדיום DM25 המוגדר כימית המשמש בהעברות היומיות, ולא היה לחץ אבולוציוני עבור E. coli ב- LTEE כדי לשמור על יכולת לגדול בחוזקה בתנאים אלה. כתוצאה מכך, חלק מאוכלוסיות ה-LTEE המפותחות מציגות כיום גידול גרוע על לוחות TA, לוקח להן 48 שעות ליצור מושבות או לא לגדול באופן אמין כלל. הצבעים והמורפולוגיה של מושבות שנוצרו על ת"א על ידי אוכלוסיות LTEE המפותחות השתנו גם הם ביחס לאבות הקדמונים והתפצלו זה מזה. נוכחותן של כמה מושבות חריגות אינה תמיד אינדיקציה לזיהום. יכולות להתרחש מוטציות ספונטניות שמחליפות את מצב סמן Ara של זני LTEE, במיוחד מ- Ara+ ל- Ara - בשל הסבירות הגבוהה יותר למוטציות אובדן תפקוד המשפיעות על ניצול ערבינוז לעומת מוטציות היפוך המחזירות פעילות araA. מוטציות המחליפות מצבי סמן Ara שכיחות יותר באוכלוסיות שפיתחו היפרמוטציה (A−1, A−2, A−3, A−4, A+3 ו- A+6)13. באגר TA, חיידקים מזהמים של מינים אחרים יוצרים לעתים קרובות (אך לא תמיד) מושבות קטנות ועגולות לחלוטין עם מרכזים אדומים המוקפים בגבולות לבנים ברורים שאינם דומים לאלה שנוצרו על ידי זנים או אוכלוסיות LTEE כלשהם.

תוצאות תחרות תרבות משותפת
תחרויות בין כל זוגות Ara− ו-Ara+ של שני האבות הקדמונים של LTEE (REL606 ו-REL607, בהתאמה) ודגימות האוכלוסייה A-5 ו-A+5 שאורכבו ב-20,000 דורות (REL8597 ו-REL8604, בהתאמה) מראות כיצד ניתן להבדיל בין מושבות עם מצבי סמן Ara שונים ולספור אותן על אגר TA (שלבים 3.4.8 ו-3.6.6) (איור 6). מושבות נספרו עבור שש צלוחיות משוכפלות עבור כל זוג מתחרים לפני ואחרי בדיקות של יום אחד ושלושה ימים שהחלו עם תחייה ב- DM1000 (טבלה 1). המספר הכולל של מושבות שנצפו עבור אותו דילול ונפח מצופה משתנה עם המתחרים היו מעורבבים מכיוון שתרביות של אוכלוסיות LTEE מפותחות מגיעות לצפיפויות תאים נמוכות יותר מאשר תרביות של זני האב הקדמון ב- DM25. הבדל זה הוא תוצאה של אבולוציה של הגדלת גודל התא, שהתרחשה בכל אוכלוסיות LTEE במהלך כמה אלפי הדורות הראשונים של הניסוי 8,33.

Figure 6
תרשים 6: מבחני תחרות מצופים על לוחות אגר ת"א. דוגמאות לצלחות אגר ת"א ממבחני תחרות. REL606 ו-REL607 הם אבותיהם הקדמונים של Ara− ו-Ara+ של ה-LTEE, בהתאמה. REL8597 ו-REL8604 הן 20,000 אוכלוסיות דור A-5 ו-A+5, בהתאמה, מ"תיעוד המאובנים" הקפוא של LTEE. לוחות TA המתאימים לבדיקת העתקה אחת בין כל זוג זנים מוצגים ליום 0, יום 1 ויום 3 של התחרות. הצלחות צולמו לאחר 24 שעות של צמיחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. התאים של המתחרים REL606 ו-REL8597 הם Ara− ויוצרים מושבות אדומות. התאים של המתחרים REL607 ו-REL8604 הם Ara+ ויוצרים מושבות לבנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

רוב המושבות על לוח ת"א תחרותי טיפוסי יהיו מופרדות היטב או חופפות בדרכים שבהן קל לספור כמה מושבות מעגליות מסוגים שונים גדלו יחד (איור 7A). עם זאת, מצבים מסוימים עשויים להתעורר שבהם לא ברור איך לספור מושבה לא טיפוסית או צמיחה כי הוא תערובת של שני צבעים. ראשית, כאשר מושבת ערה+ לבנה ומושבת ערה אדומה חופפות, מושבת ערה+ נוטה לגדול יתר על המידה ולעטוף את מושבת ערה. במצב זה, יש לספור כתם אדום קטן או "פער" שקוף במושבת Ara+ הגדולה יותר כמושבת Ara− (איור 7B). שנית, מוטנטים ספונטניים של Ara+ יופיעו מדי פעם במושבות Ara. המוטנטים האלה בדרך כלל מופיעים כסקטורים לבנים (פפילות) שמתפשטים מהר יותר מחוץ לחלק הפנימי של מושבה אדומה מאחר שהם גדלים מהר יותר ברגע שהם מקבלים גישה לערבינוז כחומר מזין נוסף (איור 7C). מושבות אלה במגזר הלבן נספרות כמושבת ערה אחת ולא מושבות ערה+. מצב זה הופך נפוץ יותר אם לוחות מודגרים במשך 48 שעות או יותר. שלישית, לפעמים נצפות מושבות ורדרדות שקופות (איור 7D). אלה נוצרים על ידי המתחרה Ara. לבסוף, מספר קטן של מושבות מעגליות עם פנים בגוון מעט שונה של אדום גדלות לפעמים על לוחות TA כאשר הן מזוהמות על-ידי כמה תאים מיקרוביאליים חיצוניים במהלך הכנת האגר או בעת פיזור דילולי תרבית על פני השטח שלהן (איור 7E). אין לספור מושבות מזהמות אלה. אם יש חשד לזיהום של תרבות תחרות מכיוון שיש מושבות לא טיפוסיות רבות על כל אחת מלוחות TA שלה, יש לשלול את ההעתק הזה.

Figure 7
איור 7: מקרי קצה שנתקלו בהם בעת ספירת מושבות Ara− ו- Ara+ על TA agar. בכל לוח, חלק מהמושבות Ara− ו- Ara+ שיש לספור מסומנות בחצים אדומים ושחורים מלאים, בהתאמה. מושבות שאין לספור מסומנות בחצים מקווקווים המתאימים לסוג שבו הן נראות. כל התמונות צולמו לאחר 24 שעות של דגירה למעט בלוח C. (A) דוגמאות למושבות Ara− ו- Ara+ רגילות. (B) דוגמאות למושבות Ara+ הגדלות יתר על המידה מושבות Ara סמוכות, כולל מושבה שבקושי נראית כפער שקוף בחלק החיצוני של המושבה הלבנה. ספרו כל אחד מהמקרים הללו כשתי מושבות, אחת מכל סוג. (C) דוגמאות למושבות Ara− שהולידו סקטורים מוטנטיים Ara+ . ספרו כל מקרה כמושבה ערה אחת בלבד. המגזר הלבן (פפילה) שנוצר נובע ממוטציה Ara+ המתעוררת בתוך המושבה. אותו שדה מושבות מוצג לאחר 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות של צמיחה. (D) דוגמה למושבה ורודה שקופה. ספרו אותו כערה. (E) דוגמאות למושבות שנוצרו על ידי זיהום חיצוני על ידי חיידק שאינו E. coli. אלה אדומים אך קטנים יותר ועגולים לחלוטין עם גבול לבן ברור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח ספירות המושבה מתחרויות אלה באמצעות גיליון אקסל (קובץ משלים 1) או על ידי הפעלת פונקציות חבילת fitnessR ב-R על ספירות מושבות שהוזנו לתבנית CSV (קובץ משלים 2) מראה כי לא ניתן להבחין בין שני האבות הקדמונים מבחינת כשירותם בדיוק הבדיקה, כי הן אוכלוסיית 20,000 דור A-5 והן אוכלוסיית A+5 מתאימות משמעותית יותר מהאבות הקדמונים, וכי אף אחת מהאוכלוסייה המפותחת אינה מתאימה יותר באופן משמעותי מהשנייה (מבחני t של וולש, עמ' > 0.05) (איור 8). הדיוק של אומדן הכושר היחסי משתפר בתחרויות בנות שלושה ימים לעומת תחרויות חד-יומיות עבור אחד הזוגות הצמודים (REL606 לעומת REL607). ניתן להגדיל עוד יותר את הדיוק של מדידות אלה על ידי ביצוע תחרויות ארוכות יותר עם מחזורי צמיחה רבים יותר, אם תרצה בכך. עם זאת, התוצאות מתחרויות מרובות ימים אינן אינפורמטיביות ברגע שמתחרה אחד הופך להיות כה שופע ביחס לשני לאחר ימי התחרות הנוספים, עד כי לא ניתן לקבוע במדויק את היחס בין שני הזנים מכיוון שיש מעט מאוד מושבות מהסוג הפחות מתאים לספור. זה המקרה עבור תחרויות בנות שלושה ימים של האבות הקדמונים נגד אוכלוסיות הדור המפותח של 20,000 (REL606 לעומת REL8604 ו-REL607 לעומת REL8597) (איור 6 וטבלה 1).

טבלה 1: ספירת מושבות ממבחני כושר תחרותי. מבחני תחרות של יום אחד ושלושה ימים עם שישה עותקים משוכפלים בוצעו עבור כל הצירופים הזוגיים של שני מתחרים Ara− ושני מתחרים Ara+ . REL606 ו-REL607 הם אבותיהם הקדמונים של Ara− ו-Ara+ של ה-LTEE, בהתאמה. REL8597 ו-REL8604 הן 20,000 אוכלוסיות A-5 ו-A+5, בהתאמה, מ"תיעוד המאובנים" הקפוא של LTEE. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Figure 8
תרשים 8: כושר יחסי שנמדד באמצעות מבחני תחרות. תוצאות של מבחני תחרות בני יום ושלושה ימים בין אבות אבות LTEE לבין 20,000 אוכלוסיות A-5 ו-A+5 LTEE. התרשים משמאל מציג את ארבע תחרויות הזוגות כחצים דו-ראשיים מקודדים בצבע. כל שילוב של שני המתחרים Ara− (תוויות אדומות) ושני המתחרים Ara+ (תוויות שחורות) נבדק עם שכפול פי שישה. ספירות מושבות מטבלה 1 נותחו ב-R באמצעות חבילת fitnessR31, והתוצאות שורטטו באמצעות חבילת ggplot2 (גרסה 3.4.0)34. כושר מוצג כמתחרה שהחץ בתווית הולך לקראתו ביחס למתחרה שממנו מגיע החץ (לדוגמה, REL8604 ביחס ל- REL606). מוצגים ערכי כושר יחסיים המוערכים מספירת המושבה עבור כל שכפול של מבחני תחרות (נקודות), ערכי כושר יחסיים ממוצעים עבור זוג המתחרים (עמודות מלאות באותו קידוד צבע כמו הדיאגרמה), ורווחי סמך של 95% (פסי שגיאה). לא ניתן היה לקבוע ערכי כושר יחסיים (N.D.) עבור תחרויות שלושת הימים בין האבות הקדמונים לבין האוכלוסיות המפותחות מכיוון שהיו אפס או מעט מאוד מושבות של האבות הקדמונים על לוחות יום 3 (ראה טבלה 1). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1. קובץ גיליון אלקטרוני של Excel לחישוב כושר יחסי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2. תבנית קובץ קלט ערכים מופרדים באמצעות פסיקים לחישוב כושר יחסי ב- R באמצעות חבילת fitnessR. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

עמידות ארוכת טווח של LTEE ושיטותיו
ניסוי האבולוציה לטווח ארוך של E. coli (LTEE) נמצא כעת בעשור הרביעי שלו. עבור ניסוי אבולוציה מיקרוביאלית בכל משך זמן, חיוני לשמור על סביבה הניתנת לשחזור, להימנע מזיהום, לאחסן דגימות בארכיון ולמדוד במדויק כושר. ה-LTEE מדגים מספר אסטרטגיות שנבדקו בזמן להשגת יעדים אלה, כולל שימוש בצלוחיות מזועזעות היטב היוצרות סביבה הומוגנית ומדיום גידול מוגדר כימית התומך בצפיפות תאים נמוכה. יתר על כן, ה- LTEE משתמש בזני אבות קדמונים הנבדלים זה מזה בסמן גנטי המעניק פנוטיפ (צבע מושבה) שהוא גם קל לסינון וגם ניטרלי סלקטיבי בסביבת האבולוציה. תכונת תכנון ניסוי זו מספקת אמצעי לזיהוי זיהום פנימי וחיצוני ומקלה על מדידת כושר. עם זאת, לא כל הנהלים ואמצעי ההגנה שבהם נעשה שימוש על ידי LTEE מאז 1988 הוכיחו את עצמם כחזקים באותה מידה. כמה שיטות שהיו אמינות כאשר LTEE התחיל הפכו פחות יעיל כמו אוכלוסיות E. coli התפתחו. למרבה המזל, כיום ניתן להרחיב או להחליף את השיטות הבעייתיות הללו באמצעות טכנולוגיות שפותחו מאז תחילת הניסוי.

איתור זיהום
איתור זיהום הוא קריטי ל-LTEE. זיהום יכול להיות משני סוגים: בין אוכלוסיות LTEE (זיהום צולב) ועם מיקרובים מהסביבה (זיהום חיצוני). על פי רוב, שימוש זהיר בטכניקות אספטיות ותשומת לב רבה במהלך הכנת המדיה וההעברות היומיות מונעים את שני סוגי הזיהום, אך הם קורים. בשלב מוקדם של הניסוי, ציפוי על אגר ת"א יכול לשמש לאיתור מקרים של זיהום צולב מכיוון שההעברות תמיד התחלפו לסירוגין בין אוכלוסיות Ara ו- Ara+. טביעת האצבע של רגישות ועמידות של E. coli אלה לבקטריופאג'ים מסוימים נועדה גם להיות תכונה עיצובית שיכולה להבדיל את אוכלוסיות LTEE מזני מעבדה נפוצים של E. coli שעלולים לזהם אותם4. עם זאת, סמנים גנטיים אלה הפכו בלתי אמינים ככל שהניסוי התקדם (למשל, אוכלוסיות מסוימות כבר לא יוצרות מושבות על אגר TA)10,35. למרבה המזל, האוכלוסיות התפצלו גנטית מכיוון שהן חוו היסטוריה אבולוציונית נפרדת במהלך הניסוי, מה שיצר סמנים גנטיים חדשים שכעת ניתן להשתמש בהם כדי לזהות זיהום צולב. לדוגמה, כל אוכלוסייה פיתחה שילוב ייחודי של מוטציות בגנים pykF ו- nadR 14,36,37. לפעמים אנחנו מגבירים ומרצפים את שני הגנים האלה כדי לבדוק אם מושבות עם מורפולוגיות או צבעים יוצאי דופן נובעות מזיהום צולב. ככל שהעלויות של ריצוף גנום שלם ושל אוכלוסייה שלמה ממשיכות לרדת, ריצוף שגרתי של אוכלוסיות LTEE עשוי להיות אפשרי בקרוב, ובכך להציג הזדמנויות חדשות לנטר אותן לאיתור סימני זיהום.

מדידת כושר תחרותי
מקרה נוסף שבו ה-LTEE גדל מעבר לשיטותיו המקוריות הוא שהכושר של האי-קולי המפותח גדל בסביבת הניסוי עד כדי כך שכבר לא ניתן למדוד ישירות את הכושר של האוכלוסיות של היום ביחס לאבותיהן באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן. האוכלוסיות המפותחות מתחרות באבות הקדמונים עד כדי כך שרק מושבות אבות מעטות, אם בכלל, נותרות לספור לאחר תחרות של יום אחד. גישה אחת להתמודדות עם הפרש כושר גדול זה היא להשתמש ביחסי התחלה לא שווים של הזנים, תוך שקלול הנפחים הראשוניים המעורבים כלפי המתחרה הפחות מתאים (למשל, 90 μL אב קדמון ומתחרה מפותח 10 μL). גישה שנייה היא לזהות שיבוט Ara− מפותח שיש לו כושר גבוה יותר מאשר האב הקדמון LTEE, לבודד מוטנט ספונטני Ara+ revertant ממנו על ידי בחירה על MA agar, ולאחר מכן לוודא כי הזן revertant יש את אותו כושר כמו ההורה שלו באמצעות מבחן תחרות 6,38. זוג Ara−/Ara+ חדש זה יכול לשמש כקבוצה של זני מתחרים נפוצים במקום REL606/REL607. באופן אידיאלי, שיבוט Ara המפותח שנבחר כמתחרה משותף (וחוזר Ara+ שלו) יהיה בעל כושר ביניים ביחס לכל הזנים המעניינים בניסוי. במהלך 50,000 הדורות הראשונים של ה-LTEE, שתי גישות אלה (תוך שימוש ביחסי התחלה לא שווים או מתחרה משותף) לא הניבו מדדי כושר שונים באופן משמעותי לעומת הגישה הטיפוסית39.

שינויים אלה בפרוטוקול התחרות מניחים הנחות מפשטות מסוימות שלא תמיד נכונות. האחת היא שמדידות כושר הן טרנזיטיביות. כלומר, אם נתחרה בשתי אוכלוסיות כל אחת מול זן מתחרה משותף בנפרד, נוכל להסיק את ההתאמה היחסית של שתי האוכלוסיות זו לזו. קשר זה נמצא נכון עבור LTEE40, על פי רוב, אבל זה לא עבור ניסויים אחרים41. אחת הסיבות לפער זה יכולה להיות התפתחות של השפעות כושר שליליות תלויות תדר. מצב זה מתרחש כאשר זנים המבודדים משתי שושלות שונות ומפוצלות מאוכלוסייה A-2 של LTEE מתחרים זה בזה 19,42. לכל אחד מהם יש יתרון כאשר נדיר, בשל הזנה צולבת, אשר מייצב את הדו-קיום שלהם. נתוני ריצוף המראים דו-קיום ארוך טווח של שושלות עם קבוצות שונות של מוטציות מצביעים על כך שאינטראקציות דומות עשויות להיווצר גם באוכלוסיות LTEE אחרות14,43, אם כי לא ברור אם הן חזקות מספיק כדי לשנות באופן ניכר את הערכות הכושר. לבסוף, האבולוציה של גידול אירובי על ציטראט באוכלוסייה A-3 של LTEE32 פירושה כי הכושר של תאים אלה משלב כעת את השימוש במשאב "פרטי" כאשר הם מתחרים נגד תאים שאינם יכולים להשתמש ציטראט, אשר מסבך את פירוש תוצאות אלה. למרות חריגים אלה, השימוש בריכוז גלוקוז נמוך ובסביבה מזועזעת היטב ללא ספק פישט את ביצוע השוואות הכושר בין זני LTEE לבין אוכלוסיות.

בדורות מאוחרים יותר, חלק מאוכלוסיות ה-LTEE כבר לא יוצרות מושבות על אגר ת"א, מה שהופך את ביצוע ניסויי התחרות באמצעות פרוטוקולים אפילו מותאמים לקשה או בלתי אפשרי10. שיטות חלופיות שאינן דורשות גידול מושבה יכולות לשמש באופן פוטנציאלי כדי לקבוע את הייצוג היחסי של שני מתחרים, כגון FREQ-seq המשתמש בריצוף הדור הבא כדי לספור את שיעור הקריאות המכילות שני אללים חלופיים באמפליקון44. שיטה זו או דומה לה יכולה לשמש עם אללי ארה או עם מוטציות חדשות שהתפתחו, כגון אלה ב-pykF וב-nadR, לעומת הרצף הקדמון. ביצוע שינויים גנטיים המציגים סוגים אחרים של סמנים ניטרליים יכול לשמש גם כדי למדוד כושר יחסי. לדוגמה, גנים של חלבונים פלואורסצנטיים הוכנסו לכרומוזומים של תאים בניסויים בשלוחת LTEE, כך שניתן לספור מתחרים באמצעות ציטומטריית זרימה45. גישה אחרת, הפותחת את האפשרות לערבב יחד יותר משני זנים באותה צלוחיות תחרות, היא החדרת ברקודים הניתנים להגברה ולריצוף PCR לגנומים של מתחרים שונים. גישה זו שימשה למעקב אחר שושלות בניסויי אבולוציה46. גם ציטומטריית זרימה וגם ריצוף ברקוד יכולים למדוד במדויק יחסים הרבה יותר קיצוניים של שני זנים לעומת ספירת מושבות (מכיוון שהם יכולים לבצע שאילתות > 10,000 תאים/גנומים לעומת 500 < שניתן לספור על צלחת אגר), כך ששימוש בשיטות אלה מבטיח גם להגדיל את הטווח הדינמי במונחים של הבדלי כושר שניתן למדוד ביחס למתחרה משותף.

תכנונים חלופיים לניסויים ארוכי טווח באבולוציה מיקרוביאלית
על כל מעלותיו, ה- LTEE אינו מושלם. היבטים מסוימים של עיצובו הופכים אותו לעבודה אינטנסיבית ורגיש לטעויות אנוש. לדוגמה, בכל יום חוקר חייב להיכנס למעבדה ופיפטה בין צלוחיות ארלנמאייר כדי להמשיך את הניסוי. ניסויים בתחרויות יכולים גם להציב מכשולים לוגיסטיים מרתיעים, בהתחשב בכך שהדרישות לכלי זכוכית סטריליים, מדיה, שטח חממה וספירת מושבות מסלימות במהירות כאשר אפילו מספר קטן של מתחרים נבחנים עם שכפול צנוע. לעתים קרובות אנו נשאלים מדוע איננו מנצלים מערכות אוטומציה במעבדות, כגון רובוטים צנרת הפועלים על מיקרו-צלחות של 96 בארות, או מערכות תרבית רציפה, כגון כימוסטטים או טורבידוסטטים. התשובה פשוטה: ה-LTEE הוא, במובן מסוים, אסיר של ההיסטוריה הארוכה שלו. אנחנו לא מעזים לסטות מתרביות של 10 מ"ל שרועדות במהירות מסוימת בצלוחיות ארלנמאייר של 50 מ"ל כי זה עלול לשנות את הניסוי מן היסוד. היבטים עדינים של הסביבה שאליהם אוכלוסיות אלה מסתגלות במשך עשרות שנים (למשל, כמות האוורור), ישתנו במיקרו-צלחות או במערכות תרבית רציפות. צוואר הבקבוק של האוכלוסייה בכל העברה עשוי גם להיות שונה (קטן יותר במיקרו-צלחות, למשל), ולשנות את הדינמיקה האבולוציונית. בקיצור, חריגה מהשיטות המתוארות כאן תהפוך את ה-LTEE לניסוי אחר, או לכל הפחות תסכן בהחדרת חוסר רציפות שישבש מסלולים אבולוציוניים.

חוקרים המתכננים ניסויי אבולוציה חדשים צריכים לשקול את הדרכים האחרות האלה להתרבות אוכלוסיות מיקרוביות, תוך מודעות ליתרונות ולחסרונות הפוטנציאליים שלהן. השימוש ברובוטים להעברת אוכלוסיות בצלחות מיקרו-באר הוא פשוט יותר מבחינה לוגיסטית במובנים מסוימים ויכול להוכיח עוצמה רבה למדי בשל המספר הגבוה של אוכלוסיות משוכפלות שניתן להפיץ בדרך זו47,48,49. עם זאת, העברות אוטומטיות ברוב ההגדרות הנוכחיות אינן מתבצעות בתנאים סטריליים לחלוטין, מה שמגדיל את הסבירות לזיהום חיצוני. כדי למנוע זיהום, מדיום הגידול הוא לעתים קרובות בתוספת אנטיביוטיקה, אשר הופכים תכונה של הסביבה המשפיעה על האבולוציה. העברות בצלחות מיקרווול גם מועדות יותר לאירועי זיהום צולב. לבסוף, הסביבה של לוחות מיקרו-באר – במיוחד אם הם לא מזועזעים – נוטה לבחור עבור צמיחת קירות, אגרגציה, ותופעות אחרות שיכולות לסבך את האבולוציה על ידי יצירת נישות מרובות בבאר אחת. שימוש במדיה עשירה או בריכוזים גבוהים של חומרים מזינים כדי לשמור על גודל אוכלוסייה גדול בבארות קטנות עלול להחריף את המורכבויות הללו. אם אינטראקציות כאלה מתעוררות, הן יכולות להקשות על מדידה ופירוש של כושר.

מערכות תרבית רציפות לאבולוציה מיקרוביאלית כוללות כימוסטטים, שבהם מדיום טרי נשאב כל הזמן פנימה ותרבית נשאבת החוצה, וטורבידוסטטים, שבהם תרביות מדוללות מעת לעת באמצעות חישה ושאיבה אוטומטיות כדי לשמור על תאים במצב של צמיחה מתמדת. המערכות האלה שימושיות מאוד כשרוצים למדל פיזיולוגיה מיקרוביאלית ואבולוציה, כי הן מונעות ממיקרובים לעבור בין גדילה לרעב על-ידי כך שהן שומרות אותם בסביבה שתמיד יש בה חומרי מזון50. אפשר אפילו להוסיף חיישנים שמבצעים מדידות בזמן אמת של צפיפות אופטית, צריכת O2, pH והיבטים אחרים של הסביבה והצמיחה של תרבות. עם זאת, מערכות התרבות הרציפה הנוכחיות דורשות רכישת ציוד יקר או מומחיות מיוחדת לבניית הגדרות מותאמות אישית51,52,53,54. כמו כן, צמיחת קירות, שבה תאים נמלטים מדילול על ידי היצמדות לתא התרבית, פוגעת בדינמיקה אבולוציונית במערכות תרבית רציפות, אלא אם כן הן מעוקרות מעת לעת. בשל אילוצים אלה, רוב ניסויי האבולוציה של כימוסטט ועכירות עד כה היו בעלי משך זמן מוגבל ו/או כללו אוכלוסיות מעטות יחסית המתפתחות באופן עצמאי בהשוואה לניסויי אבולוציה של העברה סדרתית.

מסקנה
השיטות שאנו מדגימים כאן עבור LTEE הן קריטיות לחקר ההיסטוריה הייחודית שלה ולהמשך האבולוציה הפתוחה של אוכלוסיות E. coli אלה. הם גם מספקים נקודת מוצא לאחרים ששוקלים ניסויי אבולוציה חדשים שעשויים לנצל אוטומציה במעבדה או להוסיף אלמנטים שונים של המורכבות שנמצאו בסביבות טבעיות שהושמטו בכוונה מה- LTEE. מאז 1988, האבולוציה הניסויית פרחה כשדה. במהלך תקופה זו, חוקרים במעבדות ברחבי העולם הוכיחו את הגמישות העצומה של גישה זו לחקר האבולוציה, חדשנות על ידי הצגת עיצובים ניסיוניים יצירתיים וניטור התוצאות באמצעות טכנולוגיות חדשות. השיטות של LTEE אינן מייצגות נקודת קצה, אך אנו מקווים שהן ימשיכו לעורר השראה ולספק בסיס לתחום בעתיד הרחוק.

Disclosures

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לריצ'רד לנסקי ולחוקרים הרבים שחקרו ותרמו לשימור ניסוי האבולוציה ארוך הטווח עם E. coli, כולל במיוחד Neerja Hajela. LTEE נתמך כיום על ידי הקרן הלאומית למדע (DEB-1951307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma-Aldrich T8877
20 mL Glass Beaker Sigma-Aldrich CLS100020
50 mL Erlenmeyer Flasks Sigma-Aldrich CLS498050
Agar Sigma-Aldrich A1296
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich AX1385
Antifoam Sigma-Aldrich A5757
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
Freezer Box (2") VWR 82007-142
Freezer Box (3") VWR 82007-144
Freezer Box Cell Divider (49-place) VWR 82007-150
Freezer Box Cell Divider (81-place) VWR 82007-154
Freezer Vials (1/2-Dram) VWR  66009-816 
Freezer Vials (2-Dram) VWR  66010-560 
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glycerol Fisher Scientific G33
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Metal Tray Winco SPJP-202
Petri Dish Fisher Scientific FB0875712
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P5379
Sodium Chloride Sigma-Aldrich M7506
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate Sigma-Aldrich C7254
Test Tube Cap (18mm) VWR 10200-142
Test Tube Rack (18mm, steel) Adamas-Beta N/A Test Tube Racks Stainless Steel Grid Arrangement 72 Holes (17-19 mm)
Test Tubes (18 x 150 mm) VWR 47729-583
Thiamine, Hydrochloride Millipore 5871
Tryptone Gibco 211705
Yeast Extract Gibco 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  2. Fox, J. W., Lenski, R. E. From here to eternity-the theory and practice of a really long experiment. PLoS Biology. 13 (6), e1002185 (2015).
  3. Daegelen, P., Studier, F. W., Lenski, R. E., Cure, S., Kim, J. F. Tracing ancestors and relatives of Escherichia coli B, and the derivation of B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 634-643 (2009).
  4. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12 genomes. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 653-680 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Lenski, R. E. Experimental studies of pleiotropy and epistasis in Escherichia coli. II. Compensation for maladaptive pleiotropic effects associated with resistance to virus T4. Evolution. 42 (3), 425-432 (1988).
  7. Calcott, P. H., Gargett, A. M. Mutagenicity of freezing and thawing. FEMS Microbiology Letters. 10 (2), 151-155 (1981).
  8. Lenski, R. E., Travisano, M. Dynamics of adaptation and diversification: a 10,000-generation experiment with bacterial populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (15), 6808-6814 (1994).
  9. Wiser, M. J., Ribeck, N., Lenski, R. E. Long-term dynamics of adaptation in asexual populations. Science. 342 (6164), New York, N.Y. 1364-1367 (2013).
  10. Lenski, R. E., et al. Sustained fitness gains and variability in fitness trajectories in the long-term evolution experiment with Escherichia coli. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1821), 20152292 (2015).
  11. Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  12. Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
  13. Tenaillon, O., et al. Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment. Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).
  14. Good, B. H., McDonald, M. J., Barrick, J. E., Lenski, R. E., Desai, M. M. The dynamics of molecular evolution over 60,000 generations. Nature. 551 (7678), 45-50 (2017).
  15. Consuegra, J., et al. Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria. Nature Communications. 12 (1), 980-980 (2021).
  16. Cooper, T. F., Rozen, D. E., Lenski, R. E. Parallel changes in gene expression after 20,000 generations of evolution in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (3), 1072-1077 (2003).
  17. Favate, J. S., Liang, S., Cope, A. L., Yadavalli, S. S., Shah, P. The landscape of transcriptional and translational changes over 22 years of bacterial adaptation. eLife. 11, e81979 (2022).
  18. Khan, A. I., Dinh, D. M., Schneider, D., Lenski, R. E., Cooper, T. F. Negative epistasis between beneficial mutations in an evolving bacterial population. Science. 332 (6034), 1193-1196 (2011).
  19. Plucain, J., et al. Epistasis and allele specificity in the emergence of a stable polymorphism in Escherichia coli. Science. 343 (6177), 1366-1369 (2014).
  20. Quandt, E. M., Deatherage, D. E., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Recursive genomewide recombination and sequencing reveals a key refinement step in the evolution of a metabolic innovation in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2217-2222 (2014).
  21. Leon, D., D'Alton, S., Quandt, E. M., Barrick, J. E. Innovation in an E. coli evolution experiment is contingent on maintaining adaptive potential until competition subsides. PLoS Genetics. 14 (4), e1007348 (2018).
  22. Bennett, A. F., Lenski, R. E., Mittler, J. E. Evolutionary adaptation to temperature. I. Fitness responses of Escherichia coli to changes in its thermal environment. Evolution. 46 (1), 16-30 (1992).
  23. Kibota, T. T., Lynch, M. Estimate of the genomic mutation rate deleterious to overall fitness in E. coli. Nature. 381 (6584), 694-696 (1996).
  24. Friesen, M. L., Saxer, G., Travisano, M., Doebeli, M. Experimental evidence for sympatric ecological diversification due to frequency-dependent competition in Escherichia coli. Evolution. 58 (2), 245-260 (2004).
  25. Cooper, T. F. Recombination speeds adaptation by reducing competition between beneficial mutations in populations of Escherichia coli. PLoS Biology. 5 (9), e225 (2007).
  26. Cooper, T. F., Lenski, R. E. Experimental evolution with E. coli in diverse resource environments. I. Fluctuating environments promote divergence of replicate populations. BMC Evolutionary Biology. 10, 11 (2010).
  27. Quan, S., et al. Adaptive evolution of the lactose utilization network in experimentally evolved populations of Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), e1002444 (2012).
  28. Deatherage, D. E., Kepner, J. L., Bennett, A. F., Lenski, R. E., Barrick, J. E. Specificity of genome evolution in experimental populations of Escherichia coli evolved at different temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1904-E1912 (2017).
  29. Izutsu, M., Lake, D. M., Matson, Z. W. D., Dodson, J. P., Lenski, R. E. Effects of periodic bottlenecks on the dynamics of adaptive evolution in microbial populations. BioRixv. , 4457 (2021).
  30. Chavarria-Palma, J. E., Blount, Z. D., Barrick, J. E. LTEE Media Recipes. , (2022).
  31. Barrick, J. E., Lake, D. M. fitnessR: fitnessR-v1.0.0. barricklab. , (2023).
  32. Blount, Z. D., Borland, C. Z., Lenski, R. E. Historical contingency and the evolution of a key innovation in an experimental population of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (23), 7899-7906 (2008).
  33. Grant, N. A., Magid, A. A., Franklin, J., Dufour, Y., Lenski, R. E. Changes in cell size and shape during 50,000 generations of experimental evolution with Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 203 (10), 22 (2021).
  34. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
  35. Meyer, J. R., et al. Parallel changes in host resistance to viral infection during 45,000 generations of relaxed selection. Evolution. 64 (10), 3024-3034 (2010).
  36. Woods, R., Schneider, D., Winkworth, C. L., Riley, M. A., Lenski, R. E. Tests of parallel molecular evolution in a long-term experiment with Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (24), 9107-9712 (2006).
  37. Barrick, J. E., Deatherage, D. E., D'Alton, S. LTEE-Ecoli: genomics resources for the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. , Available from: https://github.com/barricklab/LTEE-Ecoli (2022).
  38. Izutsu, M., Lenski, R. E. Experimental test of the contributions of initial variation and new mutations to adaptive evolution in a novel environment. Frontiers in Ecology and Evolution. 10, 958406 (2022).
  39. Wiser, M. J., Lenski, R. E. A comparison of methods to measure fitness in Escherichia coli. PLoS One. 10 (5), 0126210 (2015).
  40. de Visser, J. A. G. M., Lenski, R. E. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. XI. Rejection of non-transitive interactions as cause of declining rate of adaptation. BMC Evolutionary Biology. 2 (1), 19 (2002).
  41. Paquin, C. E., Adams, J. Relative fitness can decrease in evolving asexual populations of S. cerevisiae. Nature. 306 (5941), 368-371 (1983).
  42. Rozen, D. E., Lenski, R. E. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. VIII. Dynamics of a balanced polymorphism. The American Naturalist. 155 (1), 24-35 (2000).
  43. Quandt, E. M., Gollihar, J., Blount, Z. D., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Fine-tuning citrate synthase flux potentiates and refines metabolic innovation in the Lenski evolution experiment. eLife. 4, e09696 (2015).
  44. Chubiz, L. M., Lee, M. -C., Delaney, N. F., Marx, C. J. FREQ-Seq: a rapid, cost-effective, sequencing-based method to determine allele frequencies directly from mixed populations. PLoS One. 7 (10), e47959 (2012).
  45. Gallet, R., Cooper, T. F., Elena, S. F., Lenormand, T. Measuring selection coefficients below 10-3: method, questions, and prospects. Genetics. 190 (1), 175-186 (2012).
  46. Levy, S. F., et al. Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking. Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).
  47. Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
  48. Frenkel, E. M., et al. Crowded growth leads to the spontaneous evolution of semistable coexistence in laboratory yeast populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (36), 11306-11311 (2015).
  49. Jordt, H., et al. Coevolution of host-plasmid pairs facilitates the emergence of novel multidrug resistance. Nature Ecology and Evolution. 4 (6), 863-869 (2020).
  50. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  51. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and use of multiplexed chemostat arrays). Journal of Visualized Experiments. (72), e50262 (2013).
  52. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  53. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  54. Ekkers, D. M., Branco Dos Santos, F., Mallon, C. A., Bruggeman, F., Van Doorn, G. S. The omnistat: A flexible continuous-culture system for prolonged experimental evolution. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 932-942 (2020).

Tags

גנטיקה גיליון 198
העברות יומיות, אחסון אוכלוסיות בארכיון ומדידת כושר בניסוי האבולוציה ארוך הטווח עם <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrick, J. E., Blount, Z. D., Lake, … More

Barrick, J. E., Blount, Z. D., Lake, D. M., Dwenger, J. H., Chavarria-Palma, J. E., Izutsu, M., Wiser, M. J. Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. J. Vis. Exp. (198), e65342, doi:10.3791/65342 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter