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Genetics

एस्चेरिचिया कोलाई के साथ दीर्घकालिक विकास प्रयोग में दैनिक स्थानांतरण, आबादी को संग्रहीत करना और फिटनेस को मापना

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65342
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,4, 1, 1, 2,3, 2,5
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin, 2BEACON Center for the Study of Evolution in Action, Michigan State University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 4Department of Integrative Biology, Michigan State University, 5Biological Sciences Program, Michigan State University

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि एस्चेरिचिया कोलाई लॉन्ग-टर्म इवोल्यूशन एक्सपेरिमेंट (एलटीईई) को इसके दैनिक हस्तांतरण और आवधिक फ्रीज-डाउन करके कैसे बनाए रखा जाए और विकसित बैक्टीरिया में फिटनेस सुधार को मापने के लिए प्रतियोगिता परख कैसे आयोजित की जाए। ये प्रक्रियाएं अपने स्वयं के माइक्रोबियल विकास प्रयोगों को शुरू करने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक टेम्पलेट के रूप में काम कर सकती हैं।

Abstract

दीर्घकालिक विकास प्रयोग (एलटीईई) ने एस्चेरिचिया कोलाई की बारह आबादी का पालन किया है क्योंकि उन्होंने 35 से अधिक वर्षों और 77,000 जीवाणु पीढ़ियों के लिए एक सरल प्रयोगशाला वातावरण के लिए अनुकूलित किया है। एलटीईई में उपयोग किए जाने वाले सेटअप और प्रक्रियाएं माइक्रोबियल विकास का अध्ययन करने के लिए विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों का प्रतीक हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम पहले वर्णन करते हैं कि एलटीईई आबादी को प्रत्येक दिन ताजा माध्यम और सुसंस्कृत में कैसे स्थानांतरित किया जाता है। फिर, हम वर्णन करते हैं कि एलटीईई आबादी को नियमित रूप से संदूषण के संभावित संकेतों के लिए कैसे जांचा जाता है और बाद के अध्ययन के लिए एक स्थायी जमे हुए "जीवाश्म रिकॉर्ड" प्रदान करने के लिए संग्रहीत किया जाता है। इन प्रक्रियाओं में शामिल कई सुरक्षा उपायों को संदूषण को रोकने, विभिन्न समस्याओं का पता लगाने और प्रयोग की प्रगति को पर्याप्त रूप से वापस स्थापित किए बिना व्यवधानों से उबरने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एक तरीका यह है कि एलटीईई में विकासवादी परिवर्तनों की समग्र गति और चरित्र की निगरानी प्रयोग से आबादी और उपभेदों की प्रतिस्पर्धी फिटनेस को मापकर की जाती है। हम वर्णन करते हैं कि सह-संस्कृति प्रतियोगिता परख कैसे आयोजित की जाती है और परिणामों से सापेक्ष फिटनेस की गणना के लिए एक स्प्रेडशीट और एक आर पैकेज (फिटनेसआर) दोनों प्रदान करते हैं। एलटीईई के दौरान, कुछ आबादी के व्यवहार दिलचस्प तरीकों से बदल गए हैं, और पूरे जीनोम अनुक्रमण जैसी नई तकनीकों ने यह जांचने के लिए अतिरिक्त रास्ते प्रदान किए हैं कि आबादी कैसे विकसित हुई है। हम इस बात पर चर्चा करके समाप्त करते हैं कि इन परिवर्तनों को समायोजित करने या लाभ उठाने के लिए मूल एलटीईई प्रक्रियाओं को कैसे अपडेट किया गया है। यह प्रोटोकॉल उन शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी होगा जो विकास और आनुवंशिकी, आणविक जीव विज्ञान, सिस्टम जीव विज्ञान और पारिस्थितिकी के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में एलटीईई का उपयोग करते हैं। अधिक व्यापक रूप से, एलटीईई उन लोगों के लिए एक आजमाया हुआ और सच्चा टेम्पलेट प्रदान करता है जो नए रोगाणुओं, वातावरण और प्रश्नों के साथ अपने स्वयं के विकास प्रयोगों की शुरुआत कर रहे हैं।

Introduction

फरवरी 1988 में, रिचर्ड लेंसकी ने कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन1 में एस्चेरिचिया कोलाई के क्लोनल कल्चर के साथ एक परिभाषित ग्लूकोज-सीमित विकास माध्यम वाले बारह फ्लास्क लगाए। अगले दिन, उन्होंने प्रत्येक फ्लास्क से संस्कृति का 1% नए फ्लास्क के एक सेट में स्थानांतरित कर दिया जिसमें ताजा विकास माध्यम था। इस 1: 100 कमजोर पड़ने से बैक्टीरिया की आबादी को उपलब्ध ग्लूकोज को समाप्त करने से पहले 100 गुना विस्तार करने की अनुमति मिली, जो कोशिका विभाजन की लगभग 62/3 पीढ़ियों के अनुरूप थी। इस प्रक्रिया को अगले दिन दोहराया गया था और तब से हर दिन कुछ रुकावटों के साथ किया गया है। ये दैनिक स्थानांतरण जारी रहे हैं, यहां तक कि प्रयोग को स्थानांतरित करने के बाद भी, पहले 1992 में मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी में, और फिर 2022 में ऑस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय में। हर समय, नए उत्परिवर्तन ने इन ई कोलाई आबादी में लगातार आनुवंशिक भिन्नता उत्पन्न की है और प्राकृतिक चयन ने विकसित कोशिकाओं को अपने पूर्वजों से आगे बढ़ा दिया है।

लेंसकी ने इस प्रयोग को डिजाइन किया, जिसे अब दीर्घकालिक विकास प्रयोग (एलटीईई) के रूप में जाना जाता है, विकास की गतिशीलता और पुनरावृत्ति की जांच करने के लिए। इन सवालों के जवाब देने के लिए, उन्होंने प्रयोगात्मक सेटअप और इसके प्रोटोकॉल2 के डिजाइन में कई महत्वपूर्ण विशेषताओं को शामिल किया। इन विशेषताओं में से एक मॉडल जीव का सावधानीपूर्वक विकल्प था। मूल बारह आबादी सभी एकल उपनिवेशों से शुरू हुई थी जो एक तत्काल सामान्य पूर्वज, एस्चेरिचिया कोलाई बी स्ट्रेन आरईएल 606 को साझा करते थे। इस तनाव को चुना गया था क्योंकि यह पहले से ही आमतौर पर प्रयोगशाला सेटिंग्स में उपयोग किया जाता था, पूरी तरह से अलैंगिक रूप से पुन: पेश किया गया था, और इसमें कोई प्लास्मिड या बरकरार प्रोफेज 3,4 नहीं था - जिनमें से सभी इसके विकास का अध्ययन सरल बनाते हैं। प्रयोग को सरल बनाने वाला एक और विकल्प विकास के बाद प्रत्येक फ्लास्क में कोशिकाओं के घनत्व को सीमित करने के लिए विकास माध्यम में ग्लूकोज की बहुत कम सांद्रता का उपयोग करना था। कम सेल घनत्व का उपयोग करने का उद्देश्य आबादी के भीतर पारिस्थितिक बातचीत के विकास की क्षमता को कम करके जनसंख्या फिटनेस में परिवर्तन का विश्लेषण करना आसान बनाना था (उदाहरण के लिए, क्रॉस-फीडिंग द्वारा)5।

आरईएल 606 एआरएए जीन में एक बिंदु उत्परिवर्तन के कारण कार्बन और ऊर्जा स्रोत (आरा-) के रूप में ओ-अरबिनोज का उपयोग करने में असमर्थ है। एलटीईई शुरू करने से पहले, आरईएल 607 नामक एक पुनर्स्थापित एआरएए अनुक्रम के साथ एक सहज उत्परिवर्ती को आरईएल 6066 से अलग किया गया था। आरईएल 607 अरबीनोज़ (आरा +) पर बढ़ने में सक्षम है। आरईएल 606 का उपयोग एलटीईई आबादी में से छह को शुरू करने के लिए किया गया था, और आरईएल 607 का उपयोग अन्य छह को शुरू करने के लिए किया गया था। एलटीईई के दौरान उपयोग किए जाने वाले विकास माध्यम में अरबीनोज़ मौजूद नहीं है, इसलिए आरईएल 607 इन स्थितियों के तहत आरईएल 606 के समान व्यवहार करता है। हालांकि, जब टेट्राज़ोलियम अरबीनोज़ (टीए) आगर पर चढ़ाया जाता है, तो आरा − और आरा + कोशिकाएं क्रमशः लाल और सफेद कॉलोनियां बनाती हैं। दो पैतृक ई कोलाई उपभेदों और उनके वंशजों के बीच भेदभाव करने की यह विधि काफी उपयोगी है। इसका उपयोग एलटीईई आबादी के बीच क्रॉस-संदूषण का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यह एक आरा + के सापेक्ष आरा - स्ट्रेन या आबादी की फिटनेस को मापने में भी सहायता करता है जब वे एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा करते हैं। फिटनेस को विपरीत रूप से चिह्नित प्रतियोगियों की सह-संस्कृति स्थापित करके मापा जाता है और फिर निगरानी की जाती है कि लाल और सफेद कॉलोनियों की आवृत्तियों (टीए प्लेटों पर संस्कृति के कमजोर पड़ने से प्राप्त) कैसे बदलती हैं जब प्रतियोगियों को शुरू में मिश्रित किया जाता है और एलटीईई के समान परिस्थितियों में एक या अधिक विकास चक्रों के बाद। प्रत्येक विकास चक्र के दौरान अधिक फिट सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व बढ़ेगा।

एलटीईई की एक और महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि विकसित आबादी के नमूने समय-समय पर संग्रहीत किए जाते हैं। जब ग्लिसरॉल जैसे क्रायोप्रोटेक्टेंट के साथ मिलाया जाता है, तो ई कोलाई कोशिकाओं को जमे हुए और बाद मेंपुनर्जीवित किया जा सकता है। एलटीईई प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में, हर 75 वें दिन (जो लगभग 500 पीढ़ियों के बराबर है), प्रत्येक आबादी का एक हिस्सा जिसे एक नए फ्लास्क में स्थानांतरित नहीं किया गया था, उसे ग्लिसरॉल के साथ मिलाया जाता है, कई शीशियों के बीच विभाजित किया जाता है, और फ्रीजर में संग्रहीत किया जाता है। इस जमे हुए "जीवाश्म रिकॉर्ड" ने शोधकर्ताओं को एलटीईई के पहले अध्ययन करने में सक्षम बनाया, जिसमें उन्होंने विभिन्न समय बिंदुओं से विकसित ई कोलाई आबादी को पुनर्जीवित किया और उन्हें पैतृक उपभेदों के खिलाफ प्रतिस्पर्धा की ताकि यह पता लगाया जा सके कि फिटनेस कितनी तेजीसे बढ़ रही थी। फिटनेस विकास को समय-समय पर फिर से मापा गया है क्योंकि जमे हुए "जीवाश्म रिकॉर्ड" के अधिक "स्तर" को संरक्षित किया गया है। इन मापों से समग्र निष्कर्ष यह है कि फिटनेस आज भी एलटीईई में सुधार जारी है, यहां तक कि एक ही वातावरण में विकास की इतनी पीढ़ियों के बाद भी 8,9,10।

एलटीईई को इतने लंबे समय तक जारी रखने की अनुमति किसने दी है? कई समान विशेषताएं जिन्होंने इसके मूल प्रश्नों को पूछने और उत्तर देने में सक्षम बनाया, ने बुरी किस्मत, मानवीय त्रुटि और दुनिया की घटनाओं के कारण अपरिहार्य व्यवधानों के खिलाफ सुरक्षा उपायों और असफल-सुरक्षा के रूप में भी काम किया है। हर दिन, जब संस्कृतियों को ताजा विकास माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है, तो शोधकर्ता आरा − और आरा + आबादी के बीच स्थानांतरण करता है। फिर, जब आबादी जमी हुई होती है, तो उन्हें चयनात्मक और संकेतक आगर पर चढ़ाया जा सकता है ताकि यह जांचा जा सके कि क्या कोई "पड़ोसी" आबादी गलती से क्रॉस-दूषित या मिश्रित हो गई है (उदाहरण के लिए, सफेद कॉलोनियां ऐसी आबादी में हैं जिन्हें केवल लाल उपनिवेश बनाना चाहिए) या विदेशी रोगाणुओं (जैसे, अप्रत्याशित कॉलोनी आकृति विज्ञान या सेल घनत्व) से दूषित हैं। इस घटना में कि एक आबादी से समझौता किया गया है, इसके पूर्वज को फ्रीजर से पुनर्जीवित किया जा सकता है और इसके स्थान पर आगे बढ़ाया जा सकता है। आरा मार्कर और जमे हुए संग्रह इस प्रकार प्रयोगात्मक संसाधनों और सुरक्षा उपायों दोनों के रूप में दोहरे उद्देश्यों की सेवा करते हैं।

क्योंकि इसका इतिहास इतनी अच्छी तरह से संरक्षित और आसानी से सुलभ है, एलटीईई नमूनों का अध्ययन उन प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके किया गया है जो प्रयोग शुरू होने पर मौजूद नहीं थे। उदाहरण के लिए, एलटीईई आबादी 11,12,13,14,15 में उत्परिवर्तन की गतिशीलता की जांच करने के लिए पूरे जीनोम अनुक्रमण का उपयोग किया गया है, और जीन अभिव्यक्ति 16,17 में परिवर्तन की जांच करने के लिए ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स और राइबोसोमल प्रोफाइलिंग का उपयोग किया गया है। आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग उन उपभेदों के पुनर्निर्माण के लिए किया गया है जो एकल उत्परिवर्तन या कई विकसित उत्परिवर्तनों के संयोजन से भिन्न होते हैं ताकि फिटनेस और विभिन्न फेनोटाइप 18,19,20,21 पर उनके प्रभावों को समझा जा सके। जमे हुए "जीवाश्म रिकॉर्ड" से नमूने आसानी से फिर से भर दिए जाते हैं ताकि प्रयोग के इतिहास के कुछ हिस्सों या पूरी प्रतियों को अन्य प्रयोगशालाओं में भेज दिया जा सके। एलटीईई नमूने अब अंटार्कटिका को छोड़कर सभी महाद्वीपों पर मौजूद हैं, और उनका अध्ययन उन शोधकर्ताओं द्वारा किया जा रहा है जो प्रयोग से छोटे हैं। एलटीईई के मजबूत तरीकों और विकसित ई कोलाई नमूनों और इसके ऐतिहासिक रिकॉर्ड से उपभेदों ने अन्य प्रश्नों और वातावरण 22,23,24,25,26,27,28,29 की जांच करने वाले विकास प्रयोगों के लिए शुरुआती बिंदुओं के रूप में भी काम किया है।

Figure 1
चित्र 1: एलटीईई प्रक्रियाओं का अवलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यहां, हम ई कोलाई दीर्घकालिक विकास प्रयोग (चित्रा 1) में उपयोग किए जाने वाले तीन कोर प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। हम वर्णन करते हैं: (1) दैनिक स्थानान्तरण कैसे करें, (2) जनसंख्या के नमूने और क्लोनल आइसोलेट्स को कैसे संग्रहीत करें, और (3) फिटनेस मतभेदों को मापने के लिए सह-संस्कृति प्रतियोगिता परख का प्रदर्शन और विश्लेषण कैसे करें। हमारी आशा है कि ये प्रोटोकॉल एलटीईई संसाधनों के निरंतर उपयोग को बढ़ावा देते हैं और नए माइक्रोबियल विकास प्रयोगों के डिजाइन को सूचित करते हैं।

Protocol

1. एलटीईई आबादी का दैनिक हस्तांतरण

नोट: बारह एलटीईई आबादी को पिछले दिन के फ्लास्क से 1% संस्कृतियों के साथ ताजा माध्यम को शामिल करके दैनिक रूप से स्थानांतरित किया जाता है। इस प्रक्रिया के चरणों को चित्रा 1 में संक्षेपित किया गया है। आरईएल 606 स्ट्रेन से शुरू होने वाली छह आरा - आबादी को ए -1 से ए -6 नामित किया गया है, और आरईएल 607 स्ट्रेन से शुरू होने वाली छह आरा + आबादी को ए + 1 से ए + 6 नामित किया गया है। सड़न रोकनेवाला तकनीक का सख्ती से पालन और आबादी को स्थानांतरित करने के लिए एक अनुसूची और आदेश संदूषण और अन्य व्यवधानों के जोखिम को कम करता है।

  1. उस सतह को कीटाणुरहित करें जिस पर एलटीईई स्थानांतरण 70% इथेनॉल या 10% ब्लीच समाधान के साथ पोंछकर आयोजित किया जाएगा। एक स्थानीय अपड्राफ्ट बनाने और ग्लासवेयर के ज्वलंत को सक्षम करने के लिए एक बन्सन बर्नर जलाएं।
    नोट: संदूषण को रोकने के लिए प्रयोगशाला दस्ताने पहनें। एक खुली लौ के आसपास सुरक्षा के लिए, केवल दस्ताने का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो नाइट्राइल जैसी सामग्री से बने होते हैं जो ज्वलनशील नहीं होते हैं।
  2. तेरह 50 एमएल बोरोसिलिकेट एर्लेनमेयर फ्लास्क तैयार करें जो 20 एमएल बोरोसिलिकेट या पॉलीप्रोपाइलीन बीकर से ढके हुए हैं जिन्हें ऑटोक्लेविंग द्वारा धोया और निष्फल किया गया है। दिखाई देने वाले मलबे के लिए फ्लास्क की जांच करें और किसी भी ऐसे को बदलें जो पूरी तरह से साफ नहीं हैं।
  3. लाल मार्कर का उपयोग करके छह फ्लास्क ए -1 से ए -6 तक लेबल करें और अन्य छह फ्लास्क ए + 1 से ए + 6 एक काले मार्कर का उपयोग करके। अंतिम शेष फ्लास्क को लेबल करें, जो खाली होगा, महीने / दिन प्रारूप और सप्ताह के दिन में तारीख के साथ।
  4. 13 फ्लास्क में से प्रत्येक को 9.9 एमएल डीएम 25 माध्यम के साथ एक बाँझ 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके भरें। बीकर को हटाने के बाद और बीकर को बदलने से पहले प्रत्येक फ्लास्क के मुंह को लौएं। प्रत्येक फ्लास्क को भरने के बीच पिपेट की नोक को लौएं।
    नोट: डीएम 25 बनाने के लिए निर्देश ऑनलाइन उपलब्ध हैं30. यदि प्लास्टिक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग कर रहे हैं, तो प्लास्टिक को पिघलने से बचने के लिए इसकी नोक को ज्वलंत करना छोड़ दें या लौ में समय को सीमित करें।
  5. हिलने वाले इनक्यूबेटर से पूर्व दिन के एलटीईई फ्लास्क को हटा दें।
  6. प्रत्येक फ्लास्क को उसकी टर्बिडिटी और रंग का आकलन करने के लिए प्रकाश तक पकड़कर जांचें, फ्लास्क अखंडता की जांच करें, और विदेशी पदार्थ की उपस्थिति की तलाश करें।
    नोट: नग्न आंखों के लिए, सभी आरा - और आरा + संस्कृतियां खाली की तुलना में थोड़ी कमजोर दिखेंगी, ए -3 को छोड़कर, जो माध्यम में साइट्रेट पर वृद्धि के कारण दूसरों की तुलना में ~ 10 गुना अधिक खराब होगी। कई बाहरी माइक्रोबियल संदूषक भी साइट्रेट पर बढ़ने में सक्षम हैं, इसलिए ए -3 के अलावा अन्य आबादी में बढ़ी हुई मैलापन संभवतः संदूषण को इंगित करता है। स्थानांतरण से पहले LTEE संस्कृतियों की छवियों के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें।
  7. वैकल्पिक: पुष्टि करें कि प्रत्येक एलटीईई संस्कृति में 1 एमएल रिक्त और 1 एमएल प्रत्येक संस्कृति को 1 सेमी प्लास्टिक क्यूवेट में पाइप करके और उपकरण को खाली करने के बाद स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 600 एनएम (ओडी 600) पर ऑप्टिकल घनत्व रीडिंग लेकर अपेक्षित टर्बिडिटी है।
    नोट: यह अतिरिक्त कदम उन शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है जो एलटीईई के साथ काम करने के लिए नए हैं और आंखों से मैलापन का आकलन करने के साथ-साथ संदिग्ध विसंगतियों के दस्तावेजीकरण और जांच के बारे में अनिश्चित हैं। नए फ्लास्क (निम्नलिखित चरणों) में दिन के सामान्य स्थानांतरण को पूरा करने के बाद ही पूर्व दिन के फ्लास्क से ओडी 600 को मापने के लिए नमूने लें ताकि सेल आबादी को दूषित करने के जोखिम को कम किया जा सके जो ओडी 600 मान अपेक्षित होने पर प्रसारित होते रहेंगे। LTEE संस्कृतियों के लिए विशिष्ट OD600 मानों के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें।
  8. बाँझ फ़िल्टर टिप के साथ पी 200 माइक्रोपिपेटर का उपयोग करके, प्रत्येक एलटीईई फ्लास्क से 100 μL कल्चर को ताजा डीएम 25 युक्त संबंधित फ्लास्क में स्थानांतरित करें। A-1 से शुरू करें, फिर A+1 स्थानांतरित करें। उसके बाद, − और + आबादी के बीच बारी-बारी से जारी रखें। यह ट्रैक रखने के लिए कि किन संस्कृतियों को स्थानांतरित किया गया है, फ्लास्क को उनसे या उन पर पाइप करने के बाद बाईं ओर शिफ्ट करें।
    नोट: आरा - और आरा + आबादी के बीच स्थानांतरण और परिवर्तन का सख्त क्रम क्रॉस-संदूषण और मिश्रण को रोकने और पता लगाने में सहायता करता है। सख्त सड़न रोकनेवाली तकनीक का पालन करें: प्रत्येक स्थानांतरण के लिए एक ताजा पिपेट टिप का उपयोग करें, अनकैपिंग के तुरंत बाद और रीकैपिंग से पहले फ्लास्क के मुंह को लौएं, और प्रत्येक हस्तांतरण के बीच 70% इथेनॉल के साथ नम लिंट-फ्री पेपर वाइप के साथ माइक्रोपिपेटर के बैरल और इजेक्टर को पोंछ दें। ब्लीच का उपयोग कभी भी माइक्रोपिपेटर्स को कीटाणुरहित करने के लिए नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि यहां तक कि ट्रेस मात्रा भी संस्कृतियों को मार सकती है।
  9. नए लगाए गए फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 ± 1 घंटे के लिए 120 आरपीएम ऑर्बिटल हिलाने के साथ 1 इंच व्यास पर इनक्यूबेट करें।
  10. पिछले दिन की संस्कृतियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। दो दिनों के लिए इन बैकअप संस्कृतियों को बनाए रखें। पुरानी संस्कृतियों को छोड़ दें जो इस समय तीन दिन पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर सहेजे गए थे।
    नोट: पिछले दो दिनों की संस्कृतियां बैकअप के दो पूर्ण सेट प्रदान करती हैं, जिसके साथ प्रयोग को फिर से शुरू करना है, यदि आवश्यक हो, तो कोई समस्या या दुर्घटना होती है, या यदि स्थानांतरण से पहले पिछले दिन की संस्कृतियों के संदूषण की खोज की जाती है (उदाहरण के लिए, विषम रंग या अप्रत्याशित कण)।
  11. स्थानांतरण करने वाले शोधकर्ता का समय, तिथि, स्थानांतरण संख्या, नाम या आद्याक्षर दर्ज करें, संस्कृतियां ठीक थीं या नहीं, और स्थानांतरण लॉग नोटबुक में कोई अन्य प्रासंगिक जानकारी। यदि निम्न में से कोई भी स्थिति उत्पन्न होती है, तो चरण 1.12-1.14 पर जाएं: (1) पिछले दिन का रिक्त स्थान दूषित है, (2) एक फ्लास्क या उसका ढक्कन फटा हुआ या टूटा हुआ है, (3) एक फ्लास्क में विदेशी सामग्री होती है, (4) स्थानांतरण के दौरान एक फ्लास्क को डुबोया या गिरा दिया जाता है, या (5) कोई अन्य घटना या अवलोकन होता है जो इन फ्लास्क से जारी रखने को संदिग्ध बनाता है।
  12. यदि पिछले दिन की एलटीईई संस्कृतियों के साथ कोई समस्या, दुर्घटना, या संदूषण का संदेह है, तो उनसे स्थानांतरित न करें। इसके बजाय, बाद की परीक्षा और आगे के लक्षण वर्णन के लिए बारह संस्कृतियों के पूरे सेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  13. बैकअप संस्कृतियों वाले फ्लास्क को पुनः प्राप्त करें जिन्हें एक दिन पहले से स्थानांतरित किया गया था और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। कमरे के तापमान पर गर्म करने के लिए उन्हें बेंचटॉप पर रखें। कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए प्रत्येक फ्लास्क को धीरे से घुमाएं।
  14. बैकअप फ्लास्क से ताजा माध्यम वाले फ्लास्क के नए सेट में स्थानांतरित करें और चरण 1.6-1.11 में वर्णित प्रयोग को सामान्य रूप से जारी रखें। स्थानांतरण लॉग में एक नोट करें कि बैकअप संस्कृतियों का उपयोग किया गया था और एक दिन पहले के समान स्थानांतरण संख्या रिकॉर्ड करें।
    नोट: भले ही कोई समस्या केवल एक आबादी के फ्लास्क में नोट की गई हो, बैकअप फ्लास्क से सभी बारह आबादी को स्थानांतरित करें ताकि सभी आबादी में बीतचुकी पीढ़ियों की संख्या चरण में रहे। यदि 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत बैकअप फ्लास्क में संदूषण नोट किया जाता है, तो प्रभावित एलटीईई आबादी को जनसंख्या के नमूनों के लिए चरण 3.1-3.2 में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके जमे हुए स्टॉक से फिर से शुरू किया जाना चाहिए। एलटीईई के लिए स्थानांतरण संख्या को तब तक नहीं बढ़ाया जाना चाहिए जब तक कि पुनरुद्धार के बाद डीएम 25 में पहली संस्कृतियों का विकास न हो।

2. एलटीईई आबादी को संग्रहीत करना

नोट: एलटीईई आबादी के नमूने हर 75 स्थानांतरण में जमे हुए हैं। 100 गुना स्थानांतरण कमजोर पड़ने के बाद आबादी हर दिन ~ 6 2/3 पीढ़ियों में बढ़ती है, इसलिए यह अवधि ~ 500 पीढ़ियों से मेल खाती है। संग्रह के दौरान, एलटीईई आबादी को संदूषण की जांच के लिए विभिन्न प्रकार के आगर मीडिया पर भी चढ़ाया जाता है। वैकल्पिक रूप से, प्रतिनिधि क्लोन इन प्लेटों से उठाए जा सकते हैं और इस समय संग्रहीत किए जा सकते हैं। इन चरणों को चित्रा 1 में संक्षेपित किया गया है।

  1. नियोजित फ्रीज-डाउन से पहले दिन या कुछ दिन पहले, तीन प्रकार की आगर प्लेटें तैयार करें: न्यूनतम ग्लूकोज (एमजी), न्यूनतम अरबीनोज (एमए), और टेट्राज़ोलियम अरबिनोज़ (टीए)। प्रत्येक प्रकार के आगर की बारह प्लेटें बनाएं, साथ ही कुछ अतिरिक्त। इसके अलावा 0.85% (डब्ल्यू / वी) बाँझ खारा का कम से कम 250 एमएल और 80% (वी / वी) बाँझ ग्लिसरॉल का 50 एमएल तैयार करें।
    नोट: सभी मीडिया और समाधान के लिए व्यंजनों ऑनलाइन उपलब्ध हैं30. एलटीईई के नियमित संग्रह कार्यक्रम के लिए 500 के गुणक तक पहुंचने से एक दिन पहले, पिछले फ्रीज-डाउन के बाद से 74वां दिन होता है, साथ ही समस्याओं का पता चलने या संदिग्ध होने पर 4 डिग्री सेल्सियस बैकअप फ्लास्क से स्थानांतरण के कारण जोड़े गए किसी भी दिन होता है।
  2. वैकल्पिक: यदि एलटीईई आबादी से क्लोनल आइसोलेट्स को संग्रहीत करना, तो अतिरिक्त आपूर्ति तैयार करें: प्रत्येक आबादी से तीन क्लोन ों को अलग करने के लिए 72 मिलीग्राम प्लेटों, 80% (वी / वी) ग्लिसरॉल के 80 एमएल और डीएम 1000 के 370 एमएल की आवश्यकता होती है।
  3. नियोजित फ्रीज-डाउन से पहले दिन दैनिक एलटीईई स्थानांतरण के चरण 1.2 का प्रदर्शन करते समय बारह फ्लास्क का एक अतिरिक्त सेट तैयार करें। लाल मार्कर का उपयोग करके xA-6 के माध्यम से अतिरिक्त फ्लास्क xA-1 में से छह को लेबल करें, और अन्य छह xA + 1 को xA + 6 के माध्यम से एक काले मार्कर का उपयोग करके लेबल करें।
    नोट: "एक्स" इंगित करता है कि फ्लास्क के अतिरिक्त सेट का उपयोग संग्रह के लिए किया जाएगा और उन्हें फ्लास्क के अन्य सेट से अलग करता है जिसका उपयोग समानांतर में एलटीईई के दैनिक हस्तांतरण को जारी रखने के लिए किया जाएगा।
  4. दैनिक एलटीईई स्थानांतरण के चरण 1.4 का प्रदर्शन करते समय 25 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके डीएम 25 के 14.85 एमएल के साथ संग्रह करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक अतिरिक्त फ्लास्क को भरें।
  5. चरण 1.5−1.11 में वर्णित के रूप में सामान्य एलटीईई स्थानांतरण पूरा करें। फिर, चरण 1.8 के निर्देशों को दोहराएं, लेकिन इस बार पिछले दिन के एलटीईई संस्कृतियों में से प्रत्येक से 150 μL को 14.85 एमएल ताजा डीएम 25 के अतिरिक्त फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसका उपयोग संग्रह के लिए किया जाएगा।
    नोट: इस और बाद के सभी चरणों में, इन दिशानिर्देशों का पालन करके संदूषण और मिश्रण से बचें। जनसंख्या A-1 से शुरू करें, फिर A + 1 को स्थानांतरित करें, और फिर वैकल्पिक - और + आबादी जारी रखें। आबादी को बदलते समय 70% इथेनॉल के साथ नम लिंट-फ्री पेपर वाइप के साथ माइक्रोपिपेटर के बैरल और इजेक्टर को पोंछें। फ्लास्क और टेस्ट ट्यूब को उनकी ट्रे या रैक में स्थानांतरित करने के बाद या उन पर नज़र रखने के लिए ताकि यह ट्रैक किया जा सके कि कौन से स्थानांतरण पूरे हो गए हैं।
  6. बारह फ्लास्क के सेट को 24 ± 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह करने के लिए इनक्यूबेट करें, जिसमें बारह एलटीईई संस्कृतियों के साथ 1 इंच व्यास पर 120 आरपीएम कक्षीय झटके हों और जैसा कि चरण 1.9 में वर्णित है।
  7. फ्रीज-डाउन के दिन एलटीईई हस्तांतरण किए जाने से कम से कम एक घंटे पहले एलटीईई आबादी को चढ़ाने के लिए आपूर्ति तैयार करें।
    1. बारह एमजी, बारह एमए और बारह टीए एगर प्लेटों का चयन करें। यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक का नेत्रहीन निरीक्षण करें कि इसमें कोई स्पष्ट संदूषण नहीं है।
    2. बारह एलटीईई आबादी (ए -1 से ए + 6) में से प्रत्येक के लिए प्रत्येक प्रकार की प्लेट में से एक को लेबल करें।
      नोट: प्लेटों को लेबल करते समय, पेट्री डिश के तल के किनारों पर लिखें। यह कॉलोनियों को परेशान नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है जब कोई उन्हें आगर के नीचे से जांचना या फोटोग्राफ करना चाहता है। ढक्कन पर न लिखें, क्योंकि इन्हें मिश्रित किया जा सकता है।
    3. एगर प्लेटों को चरण 2.10 में उपयोग करने से पहले उन्हें गर्म करने के लिए कम से कम 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    4. 9.9 एमएल खारा युक्त 24 टेस्ट ट्यूब तैयार करें। उन्हें दो ट्यूबों के बारह सेटों में व्यवस्थित करें।
    5. बारह परीक्षण ट्यूबों के दो सेटों में से प्रत्येक को प्लेटों के समान लेबल करें, एलटीईई जनसंख्या पहचानकर्ता के नीचे "1" या "2" जोड़ें ताकि उस क्रम को निर्दिष्ट किया जा सके जिसमें उनका उपयोग उस आबादी को कमजोर करने के लिए किया जाएगा।
  8. फ्लास्क का उपयोग करके चरण 1.1-1.11 निष्पादित करें जो एलटीईई के दैनिक हस्तांतरण को हमेशा की तरह जारी रखेगा। चरण 1.5 के दौरान, हिलाने वाले इनक्यूबेटर से संग्रह करने के लिए अतिरिक्त संस्कृतियों वाले बारह फ्लास्क को भी हटा दें।
  9. उस एलटीईई आबादी के लिए जोड़ी में खारा की पहली टेस्ट ट्यूब में संग्रहीत करने के लिए बारह अतिरिक्त फ्लास्क में से प्रत्येक से 100 μL संस्कृति का पाइपेट। इन 100 गुना कमजोर पड़ने वाली नलियों के साथ ट्यूबों को अच्छी तरह से भंवर करें। फिर, प्रत्येक से 100 μL को खारा की संबंधित दूसरी ट्यूब में डालें। भंवर अंतिम 10,000 गुना संस्कृति को पूरी तरह से कमजोर करता है।
  10. प्रत्येक ट्यूब से पिपेट 80 μL जिसमें उस आबादी के लिए लेबल टीए, एमजी और एमए प्लेटों में 10,000 गुना कल्चर कमजोर पड़ता है। तरल को एक बाँझ फैलाने वाली रॉड या बाँझ फैलाने वाले मोतियों का उपयोग करके आगर की सतह पर समान रूप से फैलाएं, जैसा कि पसंद किया जाता है। तब तक दोहराएं जब तक कि सभी बारह आबादी को सभी तीन प्रकार के मीडिया पर चढ़ाया न जाए।
  11. यदि आवश्यक हो, तो प्लेटों को सूखने दें जब तक कि आगर पर कोई तरल दिखाई न दे। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट गुरुत्वाकर्षण संवहन इनक्यूबेटर में उल्टा रखें (अगर साइड के साथ)।
    नोट: प्लेटों को उल्टा करने से आगर को सूखने से बचाया जा सकता है और संक्षेपण को आगर की सतह पर टपकने से रोका जा सकता है। इनक्यूबेशन के दौरान अगर की सतह पर तरल में कोशिकाओं की आवाजाही कॉलोनियों को धुंधला कर सकती है और गलत कॉलोनी गिनती पैदा कर सकती है।
  12. संग्रह के लिए निर्धारित बारह अतिरिक्त फ्लास्क में से प्रत्येक में 3 मिलीलीटर बाँझ 80% (वी / वी) ग्लिसरॉल जोड़ें। घूमकर और धीरे-धीरे भंवर बनाकर अच्छी तरह से मिलाएं।
  13. प्रत्येक फ्लास्क से मिश्रण को बाँझ क्रायोवियल में वितरित करें जिन्हें नमूने के लिए एक अद्वितीय पहचानकर्ता के साथ लेबल किया गया है, एलटीईई आबादी जिसमें नमूना है, जिस पीढ़ी पर यह जमे हुए थे, कि यह एक मिश्रित (जनसंख्या) नमूना है, और तारीख। पिपेट 6 एमएल को एक बड़ी शीशी में और 1.25 एमएल को छह छोटी शीशियों में से प्रत्येक में मिलाएं।
    नोट: बड़ी शीशी काम करने वाला स्टॉक है। एक छोटी शीशी एक बैकअप है यदि काम करने वाला स्टॉक समाप्त हो जाता है या दूषित हो जाता है। अन्य पांच छोटी शीशियां प्रतियां हैं जिन्हें अन्य प्रयोगशालाओं में भेजा जा सकता है।
  14. -80 डिग्री सेल्सियस पर भरी हुई शीशियों को फ्रीज करें।
  15. 24 घंटे और 48 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद टीए, एमजी और एमए प्लेटों पर कॉलोनियों की वृद्धि और आकृति विज्ञान की जांच और दस्तावेजीकरण करें।
    नोट: आरईएल 606 और आरईएल 607 पूर्वजों और बारह एलटीईई आबादी में से प्रत्येक द्वारा गठित कॉलोनियों की छवियों और विवरणों के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें जब उन्हें 76,000 पीढ़ियों पर चढ़ाया गया था।
  16. वैकल्पिक: क्लोनल आइसोलेट्स को संग्रहीत करते समय निम्न चरणों का पालन करें।
    1. एमजी प्लेटों से प्रत्येक एलटीईई आबादी के लिए तीन क्लोनल आइसोलेट्स (कॉलोनियां) चुनें, प्रत्येक को एक नई एमजी प्लेट पर अलग-अलग घुमाएं, और इन प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 16-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि विभिन्न आकृति विज्ञान वाली कॉलोनियां मौजूद हैं, तो एलटीईई में मानक अभ्यास पहले सबसे आम प्रकार को चुनकर अधिकतम विविधता के लिए नमूना लेना है, फिर अल्पसंख्यक प्रकारों से आगे की कॉलोनियों का चयन करना है। कोशिकाओं को फैलाने से पहले पेट्री डिश के तल के नीचे बिंदुओं को चिह्नित करके और फिर विकास के बाद प्रत्येक निशान के पास पृथक कॉलोनी को चुनकर एक यादृच्छिक नमूना रणनीति का भी उपयोग किया जा सकता है।
    2. अगले दिन, एक नई एमजी प्लेट पर प्रत्येक प्लेट से एक प्रतिनिधि कॉलोनी खींचें और इन प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 16-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. अगले दिन, प्रत्येक एमजी प्लेट से एक अलग कॉलोनी को एक फ्लास्क में टीका लगाएं जिसमें 10 एमएल ताजा डीएम 1000 हो। इसके अलावा, मीडिया संदूषण के परीक्षण के लिए एक अरक्षित रिक्त स्थान के रूप में सेवा करने के लिए डीएम 1000 के 10 एमएल के साथ एक अतिरिक्त फ्लास्क भरें।
    4. फ्लास्क को 16-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 120 आरपीएम कक्षीय झटकों के साथ 1 इंच व्यास पर इनक्यूबेट करें।
    5. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक फ्लास्क में बाँझ 80% (वी / वी) ग्लिसरॉल के 2 मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण करने के लिए घुमाएं।
    6. प्रत्येक फ्लास्क से 1.25 एमएल एलिकोट को छोटे, बाँझ शीशियों में वितरित करें, जो प्रत्येक क्लोन, इसकी एलटीईई आबादी और उत्पत्ति की पीढ़ी के लिए एक अद्वितीय पहचानकर्ता के साथ लेबल किए गए हैं, कि यह एक क्लोनल नमूना है, और तारीख।
    7. -80 डिग्री सेल्सियस पर भरी हुई शीशियों को फ्रीज करें।

3. प्रतिस्पर्धी फिटनेस परख

नोट: एलटीईई में, प्रजनन फिटनेस को दोगुना की सापेक्ष संख्या के संदर्भ में निर्धारित किया जाता है जो विभिन्न बैक्टीरिया दैनिक हस्तांतरण के समान स्थितियों के तहत एक या अधिक 24 घंटे के संस्कृति चक्र प्राप्त करते हैं। विशेष रूप से, एक प्रतियोगी की दूसरे प्रतियोगी की सापेक्ष फिटनेस उनकी वास्तविक दोगुनी दर का अनुपात है जब वे सह-संस्कृति में आमने-सामने प्रतिस्पर्धा करते हैं। एक जोड़ी में प्रत्येक प्रतियोगी एक पूर्ण आबादी या एक क्लोनल आइसोलेट हो सकता है जिसे पहले एलटीईई के जमे हुए "जीवाश्म रिकॉर्ड" के हिस्से के रूप में संग्रहीत किया गया था। वैकल्पिक रूप से, एक या दोनों प्रतियोगी एक क्लोन हो सकते हैं जिन्हें आनुवंशिक रूप से उनके प्रभावों का परीक्षण करने के लिए विशिष्ट उत्परिवर्तन को जोड़ने या हटाने के लिए संशोधित किया गया है। दो प्रतियोगियों के पास विपरीत आरा + / आरा - राज्य होना चाहिए क्योंकि इस परख के दौरान उन्हें अलग करने के लिए इस आनुवंशिक मार्कर का उपयोग किया जाता है। एक प्रतियोगिता परख के लिए समग्र वर्कफ़्लो चित्रा 2 में दिखाया गया है। सह-संवर्धन चरण की अवधि को एक से तीन (या अधिक) दिनों तक बढ़ाया जा सकता है ताकि प्रतियोगियों के बीच मतभेदों के लिए परीक्षण करते समय फिटनेस अनुमानों की सटीकता में सुधार हो सके जो लगभग समान रूप से मेल खाते हैं। इस प्रोटोकॉल के अन्य महत्वपूर्ण विचारों और संभावित संशोधनों के लिए विश्लेषण देखें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतियोगिता परख फ्लोचार्ट। एक दिवसीय प्रतियोगिता परख के लिए पूरी प्रक्रिया दिखाई गई है। तीन दिवसीय प्रक्रिया दिन 1 और दिन 2 पर वैकल्पिक मार्ग के साथ जारी रहती है, जब तक कि दिन 3 पर प्लेटिंग उसी तरह से नहीं होती है जैसा कि एक दिवसीय प्रतियोगिता के दिन 1 के लिए चित्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. आपूर्ति तैयार करें
    1. तय करें कि कितने प्रतियोगी एलटीईई उपभेदों और / या आबादी का उपयोग किया जाएगा और प्रतियोगियों की प्रत्येक जोड़ी के लिए कितने प्रतिकृति प्रतियोगिता परीक्षण किए जाएंगे। निम्नलिखित चरणों में वर्णित के रूप में आवश्यक आपूर्ति तैयार करें।
      नोट: सभी मीडिया और समाधान के लिए व्यंजनों ऑनलाइन उपलब्ध हैं30. प्रतियोगिता प्रयोग के सभी दिनों के लिए आवश्यक फ्लास्क और टेस्ट ट्यूब ों को पहले से या आवश्यकतानुसार उन दिनों में भरा जा सकता है जब उनका उपयोग किया जाएगा। यदि फ्लास्क और टेस्ट ट्यूब समय से पहले भरे जाते हैं, तो वाष्पीकरण को कम करने के लिए उन्हें अंधेरे में कमरे के तापमान पर स्टोर करें। टीए प्लेटों को कम से कम दो दिन पहले तैयार करने की आवश्यकता होती है कि उनका उपयोग कब किया जाएगा ताकि वे संस्कृति को कमजोर करने की अनुमति देने के लिए डाले जाने के बाद पर्याप्त सूख सकें। हमेशा कुछ अतिरिक्त फ्लास्क, टेस्ट ट्यूब और टीए प्लेटें तैयार करें ताकि पाइपिंग गलतियां, दूषित प्लेटें या अन्य छोटी दुर्घटनाएं होने पर एक प्रयोग जारी रह सके।
    2. पुनरुद्धार दिवस (दिन -2) के लिए, एक बाँझ 50 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क को 20 एमएल बीकर के साथ भरें जिसमें 9.9 एमएल डीएम 1000 या लिसोजेनी ब्रोथ (एलबी) प्रति स्ट्रेन या ई कोलाई की आबादी है जिसे प्रतियोगी के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। एक और फ्लास्क को उसी माध्यम के 9.9 एमएल के साथ भरें ताकि एक बिना टीकाकरण वाले रिक्त स्थान के रूप में काम किया जा सके।
    3. पूर्व शर्त वाले दिन (दिन -1) के लिए, एक टेस्ट ट्यूब को प्रति प्रतियोगी 0.85% (डब्ल्यू / वी) बाँझ खारा के 9.9 मिलीलीटर के साथ भरें, प्रतिस्पर्धियों की एक जोड़ी के बीच 9.9 एमएल डीएम 25 प्रति प्रतिकृति परख के साथ दो फ्लास्क, और एक रिक्त स्थान के लिए 9.9 एमएल डीएम 25 के साथ एक और फ्लास्क।
    4. जिस दिन प्रतियोगिता शुरू होती है (दिन 0), डीएम 25 के 9.9 एमएल के साथ एक फ्लास्क भरें, 0.85% (डब्ल्यू / वी) बाँझ खारा के 9.9 एमएल के साथ एक टेस्ट ट्यूब भरें, और प्रति प्रतियोगिता परख प्रतिकृति के लिए एक टीए प्लेट तैयार करें। रिक्त स्थान के रूप में सेवा करने के लिए डीएम 25 के 9.9 एमएल के साथ एक और फ्लास्क भरें।
    5. वैकल्पिक: पहले से पहले बहु-दिवसीय प्रतियोगिता के प्रत्येक दिन के लिए, एक फ्लास्क को 9.9 एमएल डीएम 25 प्रति प्रतियोगिता प्रतिकृति के साथ भरें और एक खाली स्थान के लिए 9.9 एमएल डीएम 25 के साथ एक और फ्लास्क भरें।
    6. प्रतियोगिता के अंतिम दिन (उदाहरण के लिए, दिन 1 या दिन 3), 0.85% (डब्ल्यू / वी) बाँझ खारा के 9.9 एमएल के साथ दो टेस्ट ट्यूब भरें और प्रति प्रतियोगिता प्रतिकृति एक टीए प्लेट तैयार करें।
  2. दिन -2: डीएम 1000 या एलबी में अलग से प्रतियोगियों को पुनर्जीवित करें
    1. प्रत्येक प्रतियोगी के लिए, DM1000 या LB के 9.9 मिलीलीटर से भरे फ्लास्क को लेबल करें। संदूषण का परीक्षण करने के लिए एक ही बैच से 9.9 मिलीलीटर से भरे एक अतिरिक्त फ्लास्क को लेबल करें।
      नोट: क्रायोसंरक्षित कोशिकाओं की अधिक समान और अनुमानित वसूली के लिए एलबी या डीएम 1000 में जमे हुए स्टॉक को पुनर्जीवित किया जाता है। क्रायोप्रोटेक्टेंट के रूप में उपयोग किए जाने वाले ग्लिसरॉल को ई कोलाई द्वारा चयापचय किया जा सकता है, जिससे डीएम 25 में नमूने पुनर्जीवित होने पर अपेक्षा से अधिक सेल घनत्व होगा। एलबी और डीएम 1000 इतने उच्च सेल घनत्व के विकास का समर्थन करते हैं कि यह जटिलता नगण्य हो जाती है।
    2. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से प्रतिस्पर्धी उपभेदों के जमे हुए स्टॉक वाले क्रायोवियल ्स को लें। शीशियों का उपयोग करते समय उन्हें बर्फ की बाल्टी में ठंडा रखें।
    3. प्रत्येक जमे हुए स्टॉक के पिघलने के बाद, ई कोलाई कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए इसे अच्छी तरह से भंवर करें। यदि क्लोन को पुनर्जीवित किया जाता है, तो जमे हुए स्टॉक के 12 μL के साथ ताजा माध्यम वाले फ्लास्क को टीका लगाएं। यदि आबादी को पुनर्जीवित किया जा रहा है, तो फ्लास्क को जमे हुए स्टॉक के 120 μL के साथ टीका लगाएं।
      नोट: जमे हुए स्टॉक की 120 μL मात्रा का उपयोग आबादी के लिए किया जाता है ताकि पुनर्जीवित होने वाली कोशिकाओं की संख्या लगभग दैनिक अड़चन के समान हो जब एलटीईई आबादी का 1% एक नए फ्लास्क में स्थानांतरित हो जाता है। जमे हुए स्टॉक को कई बार पिघलाना और भंवर करना कोशिकाओं को तनाव दे सकता है और समय के साथ स्टॉक की व्यवहार्यता को कम कर सकता है। यदि किसी दिए गए एलटीईई आबादी या क्लोन का उपयोग कई बार प्रतियोगिताओं में किया जा रहा है, तो स्टॉक की कई प्रतियों को फिर से उगाना और फ्रीज करना अच्छा अभ्यास है ताकि कोई भी कई बार पिघल और फिर से जमे हुए न हो।
    4. 1 इंच व्यास पर 120 आरपीएम कक्षीय झटकों के साथ रात भर (16-24 घंटे) 37 डिग्री सेल्सियस पर पुनरुद्धार फ्लास्क और रिक्त स्थान को इनक्यूबेट करें।
  3. दिन -1: डीएम 25 में अलग से पूर्व शर्त प्रतियोगियों
    1. प्रत्येक प्रतियोगी के लिए, 9.9 एमएल खारा से भरी एक टेस्ट ट्यूब लेबल करें। प्रतियोगियों की एक जोड़ी के बीच प्रत्येक प्रतिकृति प्रतियोगिता परख के लिए, डीएम 25 के 9.9 एमएल से भरे दो 50 एमएल फ्लास्क लेबल करें, प्रत्येक प्रतिकृति संख्या और प्रतियोगियों में से एक का नाम के साथ। रिक्त स्थान के रूप में सेवा करने के लिए डीएम 25 के 9.9 एमएल से भरे एक अतिरिक्त फ्लास्क को लेबल करें।
    2. पुनर्जीवित प्रतियोगियों की संस्कृतियों वाले फ्लास्क को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें। आंखों से उनके मैलापन की जांच करें ताकि यह पुष्टि हो सके कि वे बढ़े हैं और कोई स्पष्ट संदूषण नहीं है।
    3. प्रत्येक फ्लास्क से पिपेट 100 μL उस प्रतियोगी के लिए खारा की टेस्ट ट्यूब में।
      नोट: यह कदम संस्कृति को 100 गुना पतला करता है, जो आवश्यक है क्योंकि कोशिकाओं का घनत्व एलटीईई में उपयोग किए जाने वाले डीएम 25 वातावरण की तुलना में एलबी और डीएम 1000 में बहुत अधिक है ( प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
    4. पतला संस्कृति से 100 μL को ताजा DM25 के साथ फ्लास्क में पाइप करने से पहले प्रत्येक तनुकरण ट्यूब को अच्छी तरह से पतला करें। प्रत्येक प्रतिकृति परख के लिए इन पूर्व शर्त फ्लास्क में से दो को टीका लगाएं, प्रत्येक प्रतियोगी के लिए एक।
    5. 1 इंच व्यास पर 120 आरपीएम कक्षीय झटकों के साथ 24 ± 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व शर्त फ्लास्क और रिक्त स्थान को इनक्यूबेट करें।
  4. दिन 0: प्रारंभिक गणना के लिए प्रतियोगियों और प्लेट को मिलाकर प्रतियोगिता शुरू करें
    1. प्रत्येक प्रतियोगिता परख प्रतिकृति के लिए, 9.9 एमएल डीएम 25 से भरा एक फ्लास्क और 9.9 एमएल खारा से भरा एक टेस्ट ट्यूब लेबल करें। फ्लास्क और ट्यूबों को इस तरह से लेबल करें जो प्रतियोगियों की प्रत्येक जोड़ी और प्रतियोगिता परख की प्रतिकृति संख्या को विशिष्ट रूप से पहचानता है। रिक्त स्थान के रूप में सेवा करने के लिए डीएम 25 के 9.9 एमएल से भरे एक अतिरिक्त फ्लास्क को लेबल करें।
    2. पूर्व शर्त फ्लास्क को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें। आंखों से उनके मैलापन की जांच करें ताकि यह पुष्टि हो सके कि वे बढ़े हैं और कोई स्पष्ट संदूषण नहीं है।
    3. आरा- प्रतियोगी के 50 μL को ताजा DM25 से भरे पहले प्रतिकृति प्रतियोगिता फ्लास्क में स्थानांतरित करें। तुरंत, आरा + प्रतियोगी के 50 μL को उसी प्रतियोगिता फ्लास्क में स्थानांतरित करें और इसे धीरे से घुमाकर मिलाएं।
    4. प्रतियोगियों के सभी जोड़े की सभी प्रतिकृतियों के लिए चरण 3.4.3 दोहराएं।
      नोट: प्रतियोगिता फ्लास्क में अब डीएम 25 में उगाई गई ई कोलाई संस्कृतियों का कुल 100 गुना कमजोर होना है, प्रत्येक दैनिक हस्तांतरण के बाद एलटीईई अनुभव में समान स्थिति कोशिकाएं। स्थानान्तरण और मिश्रण करने का क्रम महत्वपूर्ण है। प्रत्येक फ्लास्क में दोनों प्रतियोगियों को तुरंत एक-एक करके जोड़ें ताकि न तो ताजा माध्यम में सिर बढ़ने लगे। उदाहरण के लिए, सभी प्रतियोगिता फ्लास्क में आरा- संस्कृतियों को न जोड़ें और फिर वापस जाएं और सभी आरा + उपभेदों को जोड़ें।
    5. प्रत्येक नए टीकाकृत प्रतियोगिता फ्लास्क से पिपेट 100 μL को उस प्रतियोगिता परख के लिए लेबल किए गए खारे की टेस्ट ट्यूब में दोहराया जाता है ताकि इनमें से प्रत्येक ट्यूब में संयुक्त डीएम 25 संस्कृतियों की पूर्व निर्धारित मात्रा का कुल 10,000 गुना कमजोर होना हो।
    6. प्रतियोगिता फ्लास्क और खाली जगह को हिलाने वाले इनक्यूबेटर में रखें। प्रतियोगिता फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 ± 1 घंटे के लिए 120 आरपीएम कक्षीय झटकों के साथ 1 इंच व्यास पर इनक्यूबेट करें।
    7. उसी दिन, प्रतियोगिता फ्लास्क को इनक्यूबेटर में रखने के तुरंत बाद, चरण 3.4.5 से प्रत्येक टेस्ट ट्यूब को अच्छी तरह से भंवर करें और चरण 2.10 में वर्णित टीए प्लेटों पर इन 10,000 गुना कमजोर पड़ने में से 80 μL फैलाएं। प्रत्येक प्लेट के निचले हिस्से के किनारे को मिश्रित उपभेदों की जोड़ी, प्रतिकृति संख्या और "दिन 0" के साथ लेबल करें ताकि यह इंगित किया जा सके कि इसका उपयोग प्रत्येक प्रतियोगी के प्रारंभिक प्रतिनिधित्व को निर्धारित करने के लिए किया जाएगा।
    8. टीए प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर गुरुत्वाकर्षण संवहन इनक्यूबेटर में उल्टा इनक्यूबेट करें जब तक कि आरा − और आरा + दोनों प्रतियोगियों की कॉलोनियां दिखाई न दें और अलग-अलग न हों। आम तौर पर, यह 16-24 घंटे के भीतर होता है, लेकिन कुछ विकसित उपभेदों के लिए अधिक समय लग सकता है। प्रत्येक प्लेट पर आरा − (लाल) और आरा + (सफेद) कॉलोनियों की संख्या की गणना करें औरपरिणाम रिकॉर्ड करें।
      नोट: टीए प्लेटों पर आरा- और आरा + कॉलोनियों के रंगों के बीच अंतर समय के साथ कम अलग हो जाते हैं, तब भी जब प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, इसलिए इनक्यूबेटर से हटाए जाने के बाद उन्हें जितनी जल्दी हो सके गिना जाना चाहिए। आरा − और आरा + कोशिकाओं द्वारा गठित कॉलोनियों की विशिष्ट उपस्थिति दिखाने वाली टीए प्लेटों की छवियां प्रतिनिधि परिणामों में शामिल हैं। उस खंड में सामान्य "एज केस" कॉलोनियों (जैसे, विभिन्न कॉलोनी प्रकारों के ओवरलैप या आउटग्रोथ) की छवियां भी हैं, और बताती हैं कि उन्हें कैसे गिना जाए। यदि किसी भी प्रतियोगी द्वारा टीए प्लेटों पर गठित कॉलोनियों की वृद्धि दर और आकृति विज्ञान को पहले से चित्रित नहीं किया गया है, तो दिन 0 पर पूर्व शर्त फ्लास्क से खारे में 10,000 गुना कमजोर पड़ने के 80 μL फैलाएं, जब प्रतियोगी अभी भी एक दूसरे से अलग हैं। फिर, 16-24 घंटे या उससे अधिक समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद इन नियंत्रण प्लेटों पर कॉलोनियों की जांच करें।
  5. वैकल्पिक: दिन 1 और 2: तीन दिवसीय प्रतियोगिता जारी रखें
    1. प्रत्येक प्रतियोगिता परख प्रतिकृति के लिए, डीएम 25 के 9.9 एमएल से भरे एक फ्लास्क को लेबल करें। फ्लास्क को इस तरह से लेबल करें जो प्रतियोगियों की प्रत्येक जोड़ी, प्रतिकृति संख्या और प्रतियोगिता परख के दिन को विशिष्ट रूप से पहचानता है। रिक्त स्थान के रूप में सेवा करने के लिए डीएम 25 के 9.9 एमएल से भरे एक अतिरिक्त फ्लास्क को लेबल करें।
    2. पिछले दिन से प्रतियोगिता फ्लास्क को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें। अपेक्षित वृद्धि को सत्यापित करने और संदूषण का पता लगाने के लिए आंखों द्वारा उनके मैलापन की जांच करें।
    3. प्रतियोगिता के अगले दिन के लिए प्रत्येक प्रतियोगिता फ्लास्क से 100 μL को ताजा माध्यम के संबंधित फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
    4. नई प्रतियोगिता फ्लास्क और खाली जगह को हिलाने वाले इनक्यूबेटर में रखें। उन्हें 1 इंच व्यास पर 120 आरपीएम कक्षीय झटकों के साथ 24 ± 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. आगे बढ़ने से पहले प्रतियोगिता के दूसरे दिन चरण 3.5.1-3.5.4 दोहराएं।
  6. दिन 1 या 3: अंतिम गणना के लिए प्रतियोगिता और प्लेट समाप्त करें
    1. प्रत्येक प्रतियोगिता फ्लास्क के लिए, 9.9 एमएल खारा से भरे दो टेस्ट ट्यूब तैयार करें। उन्हें इस तरह से लेबल करें जो प्रतिस्पर्धियों की प्रत्येक जोड़ी, प्रतिकृति संख्या की विशिष्ट पहचान करता है, और क्या वे पहले या दूसरे कमजोर पड़ने के लिए हैं।
    2. प्रतियोगिता फ्लास्क को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें। आंखों से उनके मैलापन की जांच करें ताकि यह पता लगाया जा सके कि वे बढ़े हैं और कोई स्पष्ट संदूषण नहीं था।
    3. प्रत्येक प्रतियोगिता फ्लास्क से पिपेट 100 μL उस प्रतिकृति के लिए खारा की पहली ट्यूब में डालें। परिणामी ट्यूबों में डीएम 25 संस्कृतियों के 100 गुना कमजोर पड़ने होते हैं।
    4. भंवर प्रत्येक 100 गुना कमजोर पड़ने वाली ट्यूब को अच्छी तरह से मिलाने के लिए और उस प्रतिकृति के लिए खारा की दूसरी ट्यूब में 100 μL को पिपेट करें। परिणामी ट्यूबों में डीएम 25 संस्कृतियों के 10,000 गुना कमजोर पड़ने होते हैं।
    5. भंवर प्रत्येक टेस्ट ट्यूब में 10,000 गुना कमजोर पड़ने की अच्छी तरह से होती है और चरण 2.10 में वर्णित टीए प्लेट पर इसके 80 μL फैलते हैं। प्रत्येक प्लेट के निचले हिस्से के किनारे को मिश्रित उपभेदों की जोड़ी, प्रतिकृति संख्या, और एक दिवसीय प्रतियोगिता के लिए "दिन 1" या तीन-दिवसीय प्रतियोगिता के लिए "दिन 3" के साथ लेबल करें ताकि यह इंगित किया जा सके कि इसका उपयोग प्रत्येक प्रतियोगी के अंतिम प्रतिनिधित्व को निर्धारित करने के लिए किया जाएगा।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस पर टीए प्लेटों को इनक्यूबेट करें और चरण 3.4.8 में वर्णित विकास के बाद आरा - और आरा + कॉलोनियों की गणना करें।
      नोट: सभी स्थानांतरण और चढ़ाना चरणों में प्रत्येक प्रतियोगिता परख की प्रतिकृति संख्या का ट्रैक रखें। भ्रमित करने वाली कि अंतिम और प्रारंभिक गणना अलग-अलग प्रतिकृति परखों के बीच मेल खाती है - भले ही एक ही दो प्रतियोगियों को प्रत्येक में मिश्रित किया गया हो - इसके परिणामस्वरूप गलत फिटनेस अनुमान होंगे।
  7. गणना और प्लॉट फिटनेस
    1. यदि सापेक्ष फिटनेस की गणना और प्लॉटिंग के लिए एक्सेल का उपयोग कर रहे हैं, तो एक्सएलएस स्प्रेडशीट (पूरक फ़ाइल 1) डाउनलोड करें। R का उपयोग करते समय, FitnessR पैकेज31 स्थापित करें और अल्पविराम-पृथक मान (CSV) टेम्पलेट (पूरक फ़ाइल 2) डाउनलोड करें या इसके विगनेट में दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए इस फ़ाइल की एक नई प्रतिलिपि उत्पन्न करें।
    2. डाउनलोड की गई फ़ाइल में निर्दिष्ट सेल या कॉलम में आयोजित प्रतियोगिता परख के लिए 100 का "ट्रांसफर डाइल्यूशन" दर्ज करें। दैनिक विकास चक्रों की कुल संख्या दर्ज करें जिसके दौरान प्रतियोगियों को "स्थानान्तरण की संख्या" के रूप में सह-सुसंस्कृत किया गया था (उदाहरण के लिए, तीन दिवसीय प्रतियोगिता के लिए 3)।
    3. प्रतिस्पर्धियों की प्रत्येक जोड़ी के नाम निर्दिष्ट कक्षों या स्तंभों में "प्रतियोगी 1" के रूप में संदर्भ तनाव और परीक्षण तनाव या जनसंख्या को "प्रतियोगी 2" के रूप में दर्ज करें।
    4. प्रत्येक प्रतियोगिता परख प्रतिकृति के लिए, डाउनलोड की गई फ़ाइल के निर्दिष्ट कॉलम में संबंधित प्रारंभिक और अंतिम कॉलोनी गणना दर्ज करें।
    5. यदि एक्सेल स्प्रेडशीट का उपयोग कर रहा है, तो यह अब इस अनुमान पर औसत सापेक्ष फिटनेस मूल्य और 95% आत्मविश्वास सीमा प्रदर्शित करेगा। प्रतिस्पर्धियों के विभिन्न संयोजनों के परिणामों की किसी अन्य पत्रक पर प्रतिलिपि बनाएँ और एक चार्ट बनाएँ जो परिणामों को सारांशित करता है. यदि डेटा का विश्लेषण करने के लिए आर का उपयोग कर रहे हैं, तो इन गणनाओं को करने के लिए फिटनेसआर पैकेज के लिए विगनेट में दिए गए निर्देशों का पालन करें, गणना किए गए मानों के साथ एक सीएसवी फ़ाइल आउटपुट करें, और परिणामों को प्लॉट करें।

Representative Results

एलटीईई संस्कृतियों की उपस्थिति और मैलापन।
डीएम 25 में कम ग्लूकोज एकाग्रता के कारण, पूरी तरह से विकसित एलटीईई आबादी की टर्बिडिटी केवल बारह फ्लास्क में से ग्यारह में मुश्किल से दिखाई देती है। सामान्य विकास और संदूषण के संकेतों (चरण 1.6) के लिए आंखों से एलटीईई संस्कृतियों की जांच करते समय, एलटीईई आबादी वाले प्रत्येक फ्लास्क की तुलना रिक्त स्थान (चित्रा 3 ए) के साथ-साथ की जानी चाहिए। अपवाद जनसंख्या ए -3 है, जो साइट्रेट को अतिरिक्त कार्बन और ऊर्जा स्रोत के रूप में उपयोग करने के लिए विकसित हुआ है और इसलिए एक उच्च सेल घनत्व32 तक पहुंचता है। आरईएल 606 और आरईएल 607 पूर्वज उपभेदों की डीएम 25 संस्कृतियों की टर्बिडिटी एक विशिष्ट विकसित आबादी के समान है (चित्रा 3 बी)। एलटीईई उपभेदों और आबादी ग्लूकोज की उच्च सांद्रता और एलबी में बहुत अधिक घनत्व के कारण डीएम 1000 में उच्च घनत्व तक बढ़ती है(चित्रा 3 बी)। A-3 LTEE जनसंख्या की DM25 संस्कृतियों का घनत्व DM25 और DM1000 (चित्रा 3C) में REL606 की संस्कृतियों के घनत्व के बीच मध्यवर्ती है।

Figure 3
चित्रा 3: एलटीईई संस्कृतियों की उपस्थिति। (ए) डीएम 25 में 24 घंटे की वृद्धि के बाद बारह एलटीईई आबादी वाले फ्लास्क जिस दिन प्रयोग 76,253 तक पहुंच गया था, 1/3 पीढ़ियों को रिक्त स्थान के साथ चित्रित किया गया है। (बी) डीएम 25, डीएम 1000 और एलबी में 24 घंटे के लिए उगाए गए आरईएल 606 और आरईएल 607 पूर्वजों की संस्कृतियों वाले फ्लास्क को मीडिया रिक्त स्थान के साथ चित्रित किया गया है। (सी) उसी फ्लास्क के साथ-साथ ज़ूम किए गए चित्रों में दिखाया गया कि डीएम 25 में ए -3 जनसंख्या फ्लास्क की टर्बिडिटी डीएम 25 और डीएम 1000 में आरईएल 606 पूर्वजों की तुलना में कैसे है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

डीएम 25 (चरण 1.7) में विकसित संस्कृतियों के 600 एनएम (ओडी 600) पर ऑप्टिकल घनत्व के स्पेक्ट्रोफोटोमीटर रीडिंग एलटीईई आबादी (चित्रा 4 ए) और उनके पूर्वजों (चित्रा 4 बी) दोनों के लिए इन दृश्य अवलोकनों से मेल खाते हैं। संदूषण या गलती का संदेह होने पर इन रीडिंग का उपयोग मात्रात्मक रूप से तुलना करने और विकास को दस्तावेज करने के लिए किया जा सकता है। 76,000 और 76,500 पीढ़ियों के बीच एलटीईई आबादी के माप के लिए, हमने पाया कि ए -3 का ओडी 600, साइट्रेट पर बढ़ने के लिए विकसित होने वाली आबादी औसतन 0.223 थी (0.218-0.227, 95% आत्मविश्वास अंतराल)। अन्य ग्यारह आबादी का ओडी 600 औसतन 0.0252 था (0.0239-0.0265, 95% आत्मविश्वास अंतराल)। ग्यारह सामान्य आबादी (एफ 10,88 = 5.1035, पी = 7.5×10−6) के बीच ओडी 600 रीडिंग में मामूली, लेकिन महत्वपूर्ण भिन्नता थी। एलटीईई आबादी लगभग 5-6 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद स्थिर चरण तक पहुंच जाती है। यदि उन्हें सुबह में स्थानांतरित किया जाता है, तो विकास उसी दिन मध्य से देर दोपहर तक दिखाई देगा। रोगाणुओं की कई प्रजातियां साइट्रेट पर एरोबिक रूप से बढ़ने में सक्षम हैं। इसलिए, ए -3 के अलावा अन्य आबादी में बढ़ी हुई टर्बिडिटी संभवतः बाहरी संदूषण का संकेत है।

Figure 4
चित्रा 4: एलटीईई संस्कृतियों का मैलापन। (ए) प्रयोग की 76,000 और 76,500 पीढ़ियों के बीच तीन अलग-अलग दिनों में 24 घंटे के विकास चक्र के बाद बारह एलटीईई आबादी के 600 एनएम (ओडी 600) पर ऑप्टिकल घनत्व। तीन अलग-अलग दिनों में से प्रत्येक पर तीन 1-एमएल एलिकोट के ओडी 600 मूल्यों को बिंदुओं के रूप में प्लॉट किया गया है। एक ही दिन से रिक्त स्थान के तीन अलग-अलग एलिकोट का औसत OD600 मान इन मानों से घटाया गया था। भरी हुई पट्टियाँ औसत दिखाती हैं. त्रुटि पट्टियाँ 95% आत्मविश्वास सीमाएँ हैं. (बी) डीएम 25, डीएम 1000 और एलबी में आरईएल 606 और आरईएल 607 पूर्वजों की संस्कृतियों के ओडी 600। प्रत्येक स्थिति और तनाव के लिए दो अलग-अलग संस्कृतियों के तीन अलग-अलग दिनों में से प्रत्येक पर तीन 1-एमएल एलिकोट के ओडी 600 मूल्यों को बिंदुओं के रूप में प्लॉट किया गया है। एक ही दिन से रिक्त स्थान के तीन अलग-अलग एलिकोट का औसत OD600 मान इन मानों से घटाया गया था। भरी हुई पट्टियाँ औसत दिखाती हैं और त्रुटि पट्टियाँ 95% आत्मविश्वास सीमा एँ हैं. पैनलों के बीच ग्रे छायांकित क्षेत्र दिखाते हैं कि डीएम 25 पैनल और डीएम 1000 और एलबी पैनलों के बीच ओडी 600 अक्ष को कैसे फिर से तैयार किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एलटीईई कॉलोनियों की वृद्धि और आकृति विज्ञान
विभिन्न मीडिया (चरण 2.15) पर चढ़ाकर संदूषण के लिए आबादी की जांच करते समय, आरईएल 606 और आरईएल 607 पूर्वज और सभी विकसित आबादी न्यूनतम ग्लूकोज (एमजी) एगर प्लेटों पर पारभासी और कुछ हद तक अनियमित किनारों के साथ सफेद कॉलोनियां बनाती हैं (चित्रा 5 ए)। एमजी एगर की संरचना दैनिक एलटीईई हस्तांतरण में उपयोग किए जाने वाले डीएम 25 के समान है, ग्लूकोज की उच्च सांद्रता को छोड़कर, इसलिए विकसित एलटीईई आबादी अक्सर पूर्वजों की तुलना में एमजी पर बड़ी कॉलोनियों का निर्माण करती है। डीएम 25 में इसके उच्च सेल घनत्व के कारण, ए -3 आबादी में कई गुना अधिक कॉलोनियां होंगी यदि अन्य आबादी के लिए समान मात्रा में चढ़ाया जाता है, और इससे कॉलोनियों का आकार सीमित हो सकता है। दूषित रोगाणुओं के सबसे आम प्रकार एमजी पर कठोर सफेद, अपारदर्शी और पूरी तरह से गोलाकार कालोनियों का निर्माण करते हैं।

न्यूनतम अरबीनोज़ (एमए) एगर पर, आरईएल 607 पूर्वज और आरा + आबादी आमतौर पर सभी थोड़े पारभासी सफेद उपनिवेश बनाते हैं। यह विशिष्ट विकास पैटर्न 76,000 पीढ़ियों के माध्यम से आरा + आबादी के लिए बना हुआ है, ए + 6 को छोड़कर, जिसने अरबीनोज़ पर विकास में एक दोष विकसित किया है और अब एमए (चित्रा 5 बी) पर उपनिवेश नहीं बनाता है। डीएम 25 में एलटीईई स्थानांतरण के दौरान अरबिनोज़ पर विकास को बनाए रखने के लिए कोई चयन नहीं है, इसलिए अन्य आरा + आबादी भी अंततः एमए आगर प्लेटों पर उपनिवेश बनाना बंद कर सकती है क्योंकि प्रयोग जारी है। ए -3 के अपवाद के साथ, आरा- आबादी एमए आगर पर उपनिवेश नहीं बनाती है, हालांकि बारीकी से जांच से आगर में पोषक तत्वों का पता लगाने के कारण माइक्रोकॉलोनियों का पता चल सकता है। ए -3 आबादी एमए पर कई छोटी कॉलोनियों का निर्माण करती है, क्योंकि ये कोशिकाएं साइट्रेट पर बढ़ सकती हैं जो इस माध्यम में भी मौजूद है। एमए पर दूषित कॉलोनियां दुर्लभ हैं।

Figure 5
चित्रा 5: संदूषण का पता लगाने के लिए एलटीईई आबादी चढ़ाना। आरईएल 606 और आरईएल 607 पूर्वजों और बारह एलटीईई आबादी के कमजोर पड़ने के दिन जब प्रयोग 76,026 तक पहुंच गया था, 2/3 पीढ़ियों को (ए) एमजी, (बी) एमए, और (सी) टीए एगर प्लेटों पर चढ़ाया गया था और 24 घंटे और 48 घंटे के बाद फोटो खिंचवाया गया था। सभी संस्कृतियों के लिए समान कमजोर पड़ने का काम किया गया था, लेकिन पूर्वजों के लिए आधी मात्रा चढ़ाई गई थी जैसा कि एलटीईई आबादी के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित है, ताकि उनके उच्च सेल घनत्व के लिए कुछ हद तक जिम्मेदार हो सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

टेट्राज़ोलियम अरबिनोज़ (टीए) एगर पर, आरईएल 606 पूर्वज और सभी आरा- आबादी को लाल उपनिवेश बनाने की उम्मीद है, जबकि आरईएल 607 पूर्वज और सभी आरा + आबादी को आम तौर पर उन कॉलोनियों का निर्माण करना चाहिए जो सफेद हैं (जिसमें हल्के गुलाबी या आड़ू रंग शामिल हो सकते हैं) (चित्रा 5 सी)। एलटीईई पूर्वज मजबूत कॉलोनियों का निर्माण करते हैं, जो 16-24 घंटों के भीतर टीए आगर पर आरा − और आरा + के रूप में आसानी से पहचाने जा सकते हैं। मूल रूप से, इस अंतर का उपयोग आरा − और आरा + आबादी के बीच क्रॉस-संदूषण का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, टीए एगर में दैनिक हस्तांतरण में उपयोग किए जाने वाले रासायनिक रूप से परिभाषित डीएम 25 माध्यम की तुलना में अधिक जटिल पोषक तत्व संरचना होती है, और इन परिस्थितियों में मजबूत रूप से बढ़ने की क्षमता बनाए रखने के लिए एलटीईई में ई कोलाई के लिए विकासवादी दबाव नहीं रहा है। नतीजतन, कुछ विकसित एलटीईई आबादी अब टीए प्लेटों पर खराब वृद्धि का प्रदर्शन करती है, उपनिवेश बनाने में 48 घंटे लगते हैं या मज़बूती से नहीं बढ़ रहे हैं। विकसित एलटीईई आबादी द्वारा टीए पर गठित कॉलोनियों के रंग और आकृति विज्ञान भी पूर्वजों के सापेक्ष बदल गए हैं और एक दूसरे से अलग हो गए हैं। कुछ असामान्य कॉलोनियों की उपस्थिति हमेशा संदूषण का संकेत नहीं है। सहज उत्परिवर्तन हो सकते हैं जो एलटीईई उपभेदों की आरा मार्कर स्थिति को बदल देते हैं, विशेष रूप से आरा + से आरा तक - अरबीनोज उपयोग को प्रभावित करने वाले हानि-ऑफ-फ़ंक्शन म्यूटेशन की उच्च संभावना के कारण जो एआरए गतिविधि को बहाल करते हैं। आरा मार्कर राज्यों को बदलने वाले उत्परिवर्तन उन आबादी में अधिक आम हैं जिन्होंने हाइपरम्यूटेशन (ए -1, ए -2, ए -3, ए -4, ए + 3, और ए + 6)13 विकसित किया है। टीए एगर पर, अन्य प्रजातियों के दूषित रोगाणु अक्सर (लेकिन हमेशा नहीं) अलग-अलग सफेद सीमाओं से घिरे लाल केंद्रों के साथ छोटी, पूरी तरह से गोलाकार कॉलोनियों का निर्माण करते हैं जो किसी भी एलटीईई उपभेदों या आबादी द्वारा गठित लोगों के विपरीत होते हैं।

सह-संस्कृति प्रतियोगिता के परिणाम
दो एलटीईई पूर्वजों (आरईएल 606 और आरईएल 607, क्रमशः) के सभी आरा - और आरा + जोड़े और 20,000 पीढ़ियों (आरईएल 8597 और आरईएल 8604, क्रमशः) में संग्रहीत ए -5 और ए + 5 जनसंख्या नमूनों के बीच प्रतियोगिताओं से पता चलता है कि विभिन्न आरा मार्कर राज्यों वाली कॉलोनियों को कैसे विभेदित किया जा सकता है और टीए एगर (चरण 3.4.8 और 3.6.6) पर गिना जा सकता है (चित्रा 6)।). डीएम 1000 में पुनरुद्धार के साथ शुरू होने वाले एक दिवसीय और तीन दिवसीय परख से पहले और बाद में प्रतियोगियों की प्रत्येक जोड़ी के लिए कॉलोनियों को छह प्रतिकृति फ्लास्क के लिए गिना गया था (तालिका 1)। एक ही कमजोर पड़ने और वॉल्यूम प्लेटेड के लिए देखी गई कॉलोनियों की कुल संख्या अलग-अलग होती है जिसके साथ प्रतियोगियों को मिश्रित किया गया था क्योंकि विकसित एलटीईई आबादी की संस्कृतियां डीएम 25 में पूर्वजों के उपभेदों की संस्कृतियों की तुलना में कम सेल घनत्व तक पहुंचती हैं। यह अंतर बढ़े हुए सेल आकार के विकास का परिणाम है, जो प्रयोग 8,33 की पहली कुछ हजार पीढ़ियों के दौरान सभी एलटीईई आबादी में हुआ था।

Figure 6
चित्र 6: टीए एगर प्लेटों पर चढ़ाई गई प्रतियोगिता परख। प्रतियोगिता परख से टीए एगर प्लेटों के उदाहरण। आरईएल 606 और आरईएल 607 क्रमशः एलटीईई के आरा − और आरा + पूर्वज हैं। आरईएल 8597 और आरईएल 8604 एलटीईई के जमे हुए "जीवाश्म रिकॉर्ड" से क्रमशः 20,000 पीढ़ी ए -5 और ए + 5 आबादी हैं। प्रतियोगिता के दिन 0, दिन 1 और दिन 3 के लिए उपभेदों की प्रत्येक जोड़ी के बीच एक प्रतिकृति परख के अनुरूप टीए प्लेटें दिखाई जाती हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे की वृद्धि के बाद प्लेटों की तस्वीरें ली गईं। आरईएल 606 और आरईएल 8597 प्रतियोगियों के सेल आरा हैं - और लाल कालोनियों का निर्माण करते हैं। आरईएल 607 और आरईएल 8604 प्रतियोगियों के सेल आरा + हैं और सफेद कॉलोनियों का निर्माण करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक विशिष्ट प्रतियोगिता टीए प्लेट पर अधिकांश कॉलोनियां अच्छी तरह से अलग हो जाएंगी या उन तरीकों से ओवरलैप होंगी जिनके लिए यह गिनना आसान है कि विभिन्न प्रकार की कितनी शुरू में गोलाकार कॉलोनियां एक साथ बढ़ीं (चित्रा 7 ए)। हालांकि, कुछ स्थितियां उत्पन्न हो सकती हैं जिनमें यह स्पष्ट नहीं है कि एक एटिपिकल कॉलोनी या विकास की गणना कैसे की जाए जो दो रंगों का मिश्रण है। सबसे पहले, जब एक सफेद आरा + कॉलोनी और एक लाल आरा - कॉलोनी ओवरलैप होती है, तो आरा + कॉलोनी आरा - कॉलोनी को घेर लेती है। इस स्थिति में, किसी को बड़ी आरा + कॉलोनी में एक छोटे लाल पैच या पारभासी "अंतर" को आरा- कॉलोनी के रूप में गिनना चाहिए (चित्रा 7 बी)। दूसरा, आरा+ उत्परिवर्ती कभी-कभी आरा- कॉलोनियों में उत्पन्न होंगे। ये उत्परिवर्ती आमतौर पर सफेद क्षेत्रों (पैपिले) के रूप में दिखाई देते हैं, जो लाल कॉलोनी के इंटीरियर से अधिक तेज़ी से फैलते हैं क्योंकि वे एक अतिरिक्त पोषक तत्व के रूप में अरबीनोज़ तक पहुंच प्राप्त करने के बाद अधिक तेज़ी से बढ़ते हैं (चित्रा 7 सी)। इन सफेद क्षेत्र वाली कॉलोनियों को एक आरा - कॉलोनी के रूप में गिना जाता है और कोई आरा + कॉलोनी नहीं है। यह स्थिति अधिक सामान्य हो जाती है यदि प्लेटों को 48 घंटे या उससे अधिक समय तक इनक्यूबेट किया जाता है। तीसरा, कभी-कभी पारभासी गुलाबी कालोनियों को देखा जाता है (चित्रा 7 डी)। ये आरा-प्रतियोगी द्वारा बनाए गए हैं। अंत में, अंदरूनी हिस्सों के साथ गोलाकार कॉलोनियों की एक छोटी संख्या जो लाल रंग की थोड़ी अलग छाया होती है, कभी-कभी टीए प्लेटों पर बढ़ती है जब वे एगर की तैयारी के दौरान कुछ बाहरी माइक्रोबियल कोशिकाओं से दूषित होते हैं या उनकी सतहों पर संस्कृति कमजोर पड़ने का प्रसार करते हैं (चित्रा 7 ई)। इन दूषित कॉलोनियों की गिनती नहीं की जानी चाहिए। यदि एक प्रतियोगिता संस्कृति के संदूषण का संदेह है क्योंकि इसकी किसी भी टीए प्लेटों पर कई असामान्य कॉलोनियां हैं, तो उस प्रतिकृति को बाहर रखा जाना चाहिए।

Figure 7
चित्रा 7: टीए एगर पर आरा - और आरा + कॉलोनियों की गिनती करते समय एज मामलों का सामना करना पड़ा। प्रत्येक पैनल में, कुछ आरा − और आरा + कॉलोनियां जिन्हें गिना जाना चाहिए, उन्हें क्रमशः ठोस लाल और काले तीरों के साथ चिह्नित किया जाता है। जिन कॉलोनियों की गिनती नहीं की जानी चाहिए, उन्हें उस प्रकार के अनुरूप धराशायी तीरों के साथ इंगित किया जाता है जो वे दिखाई देते हैं। पैनल सी (ए) सामान्य आरा − और आरा + कॉलोनियों के उदाहरणों को छोड़कर सभी तस्वीरें 24 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद ली गई थीं। (बी) आरा- कॉलोनियों के पास आरा + कॉलोनियों के अधिक बढ़ने के उदाहरण, जिनमें से एक केवल सफेद कॉलोनी के बाहर एक पारदर्शी अंतर के रूप में मुश्किल से दिखाई देता है। इन मामलों में से प्रत्येक को दो उपनिवेशों के रूप में गिनें, प्रत्येक प्रकार का एक। (ग) आरा+ उत्परिवर्ती क्षेत्रों को जन्म देने वाली आरा-कालोनियों के उदाहरण। प्रत्येक मामले को केवल एक आरा- कॉलोनी के रूप में गिनें। सफेद क्षेत्र (पैपिला) जो उत्पन्न होता है वह कॉलोनी के भीतर उत्पन्न होने वाले आरा + उत्परिवर्ती के कारण होता है। कॉलोनियों के एक ही क्षेत्र को 24 घंटे, 48 घंटे और 72 घंटे की वृद्धि के बाद दिखाया गया है। (डी) पारभासी गुलाबी कॉलोनी का उदाहरण। इसे आरा के रूप में गिनें। (ई) एक माइक्रोब द्वारा बाहरी संदूषण द्वारा बनाई गई कॉलोनियों के उदाहरण जो ई कोलाई नहीं है। ये लाल लेकिन छोटे और पूरी तरह से गोलाकार होते हैं जिनकी एक अलग सफेद सीमा होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक्सेल स्प्रेडशीट (पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग करके या सीएसवी टेम्पलेट (पूरक फ़ाइल 2) में दर्ज कॉलोनी गणना ओं पर आर में फिटनेसआर पैकेज फ़ंक्शंस चलाकर इन प्रतियोगिताओं से कॉलोनी की गणना का विश्लेषण करने से पता चलता है कि दो पूर्वज परख की सटीकता के भीतर अपनी फिटनेस के मामले में अप्रभेद्य हैं, कि 20,000-पीढ़ी ए -5 और ए + 5 आबादी दोनों पूर्वजों की तुलना में काफी अधिक फिट हैं, और यह कि न तो विकसित आबादी दूसरे की तुलना में काफी अधिक फिट है (वेल्च के टी-टेस्ट, पी > 0.05) (चित्रा 8)। सापेक्ष फिटनेस अनुमान की सटीकता में तीन-दिवसीय प्रतियोगिताओं बनाम एक दिवसीय प्रतियोगिताओं में निकटता से मेल खाने वाले जोड़े (आरईएल 606 बनाम आरईएल 607) में से एक के लिए सुधार होता है। यदि वांछित हो तो अधिक विकास चक्रों के साथ लंबी प्रतियोगिताओं का आयोजन करके इन मापों की सटीकता को और बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, बहु-दिवसीय प्रतियोगिताओं के परिणाम जानकारीपूर्ण नहीं होते हैं जब एक प्रतियोगी प्रतियोगिता के अतिरिक्त दिनों के बाद दूसरे के सापेक्ष इतना प्रचुर मात्रा में हो जाता है कि दो उपभेदों के अनुपात को सटीक रूप से निर्धारित नहीं किया जा सकता है क्योंकि गिनती के लिए कम-फिट प्रकार की बहुत कम कॉलोनियां नहीं हैं। यह विकसित 20,000 पीढ़ी की आबादी (आरईएल 606 बनाम आरईएल 8604 और आरईएल 607 बनाम आरईएल 8597) के खिलाफ पूर्वजों की तीन दिवसीय प्रतियोगिताओं का मामला है (चित्रा 6 और तालिका 1)।

तालिका 1: कॉलोनी प्रतिस्पर्धी फिटनेस परख से गिना जाता है। दो आरा - और दो आरा + प्रतियोगियों के सभी जोड़ीवार संयोजनों के लिए छह प्रतिकृतियों के साथ एक दिवसीय और तीन-दिवसीय प्रतियोगिता परीक्षण किए गए थे। आरईएल 606 और आरईएल 607 क्रमशः एलटीईई के आरा − और आरा + पूर्वज हैं। आरईएल 8597 और आरईएल 8604 एलटीईई के जमे हुए "जीवाश्म रिकॉर्ड" से क्रमशः 20,000-पीढ़ी ए -5 और ए + 5 आबादी हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: सापेक्ष फिटनेस प्रतियोगिता परख का उपयोग करके मापा जाता है। एलटीईई पूर्वजों और 20,000 पीढ़ी ए -5 और ए + 5 एलटीईई आबादी के बीच एक और तीन दिवसीय प्रतियोगिता के परिणाम। बाईं ओर का आरेख चार जोड़ीवार प्रतियोगिताओं को रंग-कोडित दोहरे सिर वाले तीर ों के रूप में दिखाता है। दो आरा − (लाल लेबल) और दो आरा + (ब्लैक लेबल) प्रतियोगियों के प्रत्येक संयोजन को छह गुना प्रतिकृति के साथ परीक्षण किया गया था। तालिका 1 से कॉलोनी की गणना का विश्लेषण फिटनेसआर पैकेज31 का उपयोग करके आर में किया गया था, और परिणामों को ggplot2 पैकेज (संस्करण 3.4.0)34 का उपयोग करके प्लॉट किया गया था। फिटनेस को प्रतियोगी के रूप में प्रदर्शित किया जाता है लेबल में तीर उस प्रतियोगी के सापेक्ष जा रहा है जिससे तीर आ रहा है (उदाहरण के लिए, आरईएल 606 के सापेक्ष आरईएल 8604)। प्रत्येक प्रतियोगिता परख प्रतिकृति (अंक) के लिए कॉलोनी गणना से अनुमानित सापेक्ष फिटनेस मान, प्रतिस्पर्धियों की जोड़ी के लिए औसत सापेक्ष फिटनेस मान (आरेख के समान रंग-कोडिंग से भरे सलाखों), और 95% आत्मविश्वास अंतराल (त्रुटि सलाखों) दिखाए जाते हैं। पूर्वजों और विकसित आबादी के बीच तीन दिवसीय प्रतियोगिताओं के लिए सापेक्ष फिटनेस मूल्यों को निर्धारित (एनडी) नहीं किया जा सका क्योंकि दिन 3 प्लेटों पर पूर्वजों की शून्य या बहुत कम कॉलोनियां थीं ( तालिका 1 देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1. सापेक्ष फिटनेस की गणना के लिए एक्सेल स्प्रेडशीट फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2. फिटनेसआर पैकेज का उपयोग करके आर में सापेक्ष फिटनेस की गणना के लिए अल्पविराम-अलग मान इनपुट फ़ाइल टेम्पलेट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एलटीईई और इसके तरीकों का दीर्घकालिक लचीलापन
ई कोलाई लॉन्ग-टर्म इवोल्यूशन एक्सपेरिमेंट (एलटीईई) अब अपने चौथे दशक में है। किसी भी अवधि के माइक्रोबियल विकास प्रयोग के लिए, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वातावरण को बनाए रखना, संदूषण से बचना, नमूने संग्रहीत करना और फिटनेस को सटीक रूप से मापना महत्वपूर्ण है। एलटीईई इन उद्देश्यों को प्राप्त करने के लिए कई समय-परीक्षण की गई रणनीतियों को प्रदर्शित करता है, जिसमें अच्छी तरह से हिला हुआ फ्लास्क का उपयोग शामिल है जो एक समरूप वातावरण और एक रासायनिक रूप से परिभाषित विकास माध्यम बनाता है जो कम सेल घनत्व का समर्थन करता है। इसके अलावा, एलटीईई पूर्वज उपभेदों को नियोजित करता है जो एक आनुवंशिक मार्कर में भिन्न होते हैं जो एक फेनोटाइप (कॉलोनी रंग) देता है जो विकास वातावरण में आसानी से जांच और चुनिंदा रूप से तटस्थ होता है। यह प्रयोगात्मक डिजाइन सुविधा आंतरिक और बाहरी संदूषण की पहचान करने का एक साधन प्रदान करती है और फिटनेस को मापने की सुविधा प्रदान करती है। हालांकि, 1988 के बाद से एलटीईई द्वारा उपयोग की जाने वाली सभी प्रक्रियाएं और सुरक्षा उपाय समान रूप से मजबूत साबित नहीं हुए हैं। एलटीईई शुरू होने पर विश्वसनीय कुछ तरीके कम प्रभावी हो गए हैं क्योंकि ई कोलाई आबादी विकसित हुई है। सौभाग्य से, इन समस्याग्रस्त तरीकों को अब प्रयोग की शुरुआत के बाद से विकसित प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके बढ़ाया या प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

संदूषण का पता लगाना
एलटीईई के लिए संदूषण का पता लगाना महत्वपूर्ण है। संदूषण दो प्रकार का हो सकता है: एलटीईई आबादी (क्रॉस-संदूषण) और पर्यावरण से रोगाणुओं के साथ (बाहरी संदूषण)। अधिकांश भाग के लिए, मीडिया की तैयारी और दैनिक स्थानान्तरण के दौरान सड़न रोकनेवाली तकनीकों का सावधानीपूर्वक उपयोग और करीबी ध्यान दोनों प्रकार के संदूषण को रोकता है, लेकिन वे होते हैं। प्रयोग की शुरुआत में, टीए एगर पर चढ़ाना का उपयोग क्रॉस-संदूषण के उदाहरणों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है क्योंकि स्थानांतरण हमेशा आरा - और आरा + आबादी के बीच वैकल्पिक होता है। कुछ बैक्टीरियोफेज के लिए इन ई कोलाई की संवेदनशीलता और प्रतिरोध के फिंगरप्रिंट का उद्देश्य एक डिजाइन विशेषता भी था जो एलटीईई आबादी को आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले ई कोलाई प्रयोगशाला उपभेदों से अलग कर सकता हैजो उन्हें दूषित कर सकते हैं। हालांकि, ये आनुवंशिक मार्कर अविश्वसनीय हो गए हैं क्योंकि प्रयोग आगे बढ़ गया है (उदाहरण के लिए, कुछ आबादी अब टीए एगर पर उपनिवेश नहीं बनाती है)10,35। सौभाग्य से, आबादी आनुवंशिक रूप से अलग हो गई है क्योंकि उन्होंने प्रयोग के दौरान अलग-अलग विकासवादी इतिहास का अनुभव किया है, जिसने नए आनुवंशिक मार्कर बनाए हैं जिनका उपयोग अब क्रॉस-संदूषण का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रत्येक आबादी ने पाइकेएफ और एनएडीआर जीन 14,36,37 में उत्परिवर्तन का एक अनूठा संयोजन विकसित किया है। हम कभी-कभी पीसीआर इन दो जीनों को बढ़ाते हैं और सेंगर अनुक्रमित करते हैं ताकि यह परीक्षण किया जा सके कि असामान्य आकृति विज्ञान या रंगों वाली कॉलोनियां क्रॉस-संदूषण के कारण हैं या नहीं। चूंकि पूरे जीनोम और पूरी आबादी के अनुक्रमण की लागत में गिरावट जारी है, एलटीईई आबादी का नियमित अनुक्रमण जल्द ही संभव हो सकता है, जिससे संदूषण के संकेतों के लिए उनकी निगरानी करने के नए अवसर पेश किए जा सकते हैं।

प्रतिस्पर्धी फिटनेस को मापना
एक और मामला जिसमें एलटीईई ने अपने मूल तरीकों को पीछे छोड़ दिया है, वह यह है कि विकसित ई कोलाई की फिटनेस प्रयोगात्मक वातावरण में इस हद तक बढ़ गई है कि कोई भी यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके अपने पूर्वजों के सापेक्ष आज की आबादी की फिटनेस को सीधे नहीं माप सकता है। विकसित आबादी पूर्वजों को इस हद तक पछाड़ ती है कि एक दिवसीय प्रतियोगिता के बाद कुछ ही पूर्वज उपनिवेश ों की गिनती नहीं रह जाती है। इस बड़े फिटनेस अंतर से निपटने के लिए एक दृष्टिकोण उपभेदों के असमान शुरुआती अनुपात का उपयोग करना है, प्रारंभिक संस्करणों को भारित करना जो कम-फिट प्रतियोगी (जैसे, 90 μL पूर्वज और 10 μL विकसित प्रतियोगी) की ओर मिश्रित हैं। एक दूसरा दृष्टिकोण एक विकसित आरा- क्लोन की पहचान करना है जिसमें एलटीईई पूर्वज की तुलना में अधिक फिटनेस है, एमए एगर पर चयन करके इसके एक सहज आरा + प्रत्यावर्ती उत्परिवर्ती को अलग करें, और फिर सत्यापित करें कि प्रत्यावर्तित तनाव में प्रतियोगिता परख 6,38 का उपयोग करके अपने माता-पिता के समान फिटनेस है। इस नए आरा-/आरा + जोड़ी को आरईएल 606/आरईएल 607 के बदले आम प्रतियोगी उपभेदों के एक सेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। आदर्श रूप से, एक सामान्य प्रतियोगी (और इसके आरा + रिवर्टेंट) के रूप में चुने गए विकसित आरा- क्लोन में एक प्रयोग में रुचि के सभी उपभेदों के सापेक्ष मध्यवर्ती फिटनेस होगी। एलटीईई की पहली 50,000 पीढ़ियों में, इन दो दृष्टिकोणों (असमान शुरुआती अनुपात या एक सामान्य प्रतियोगी का उपयोग करके) ने विशिष्ट दृष्टिकोण39 के मुकाबले सार्थक रूप से अलग फिटनेस माप का उत्पादन नहीं किया।

प्रतियोगिता प्रोटोकॉल में ये संशोधन कुछ सरल धारणाएं बनाते हैं जो हमेशा सच नहीं हो सकते हैं। एक यह है कि फिटनेस माप सकर्मक हैं। यही है, यदि हम दो आबादी बनाम एक सामान्य प्रतियोगी तनाव के खिलाफ अलग-अलग प्रतिस्पर्धा करते हैं, तो हम एक दूसरे के लिए दो आबादी की सापेक्ष फिटनेस का अनुमान लगा सकते हैं। यह संबंध एलटीईई40 के लिए सही पाया गया है, अधिकांश भाग के लिए, लेकिन यह अन्य प्रयोगोंके लिए नहीं है। इस विसंगति का एक कारण नकारात्मक आवृत्ति-निर्भर फिटनेस प्रभावों का विकास हो सकता है। यह स्थिति तब होती है जब एलटीईई की आबादी ए -2 से दो अलग-अलग वंशों से अलग उपभेदों कोएक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा की जाती है। क्रॉस-फीडिंग के कारण दुर्लभ होने पर प्रत्येक का एक फायदा होता है, जो उनके सह-अस्तित्व को स्थिर करता है। उत्परिवर्तन के विभिन्न सेटों के साथ वंशावली के दीर्घकालिक सह-अस्तित्व को दिखाने वाले अनुक्रमण डेटा से पता चलता है कि इसी तरह की बातचीत अन्य एलटीईई आबादी14,43 में भी उत्पन्न हो सकती है, हालांकि यह स्पष्ट नहीं है कि क्या वे फिटनेस अनुमानों को बदलने के लिए पर्याप्त मजबूत हैं। अंत में, एलटीईई32 की आबादी ए -3 में साइट्रेट पर एरोबिक विकास के विकास का मतलब है कि इन कोशिकाओं की फिटनेस अब "निजी" संसाधन के उपयोग को शामिल करती है जब वे उन कोशिकाओं के खिलाफ प्रतिस्पर्धा करते हैं जो साइट्रेट का उपयोग नहीं कर सकते हैं, जो इन परिणामों की व्याख्या को जटिल बनाता है। इन अपवादों के बावजूद, कम ग्लूकोज एकाग्रता और अच्छी तरह से हिला हुआ वातावरण के उपयोग ने निस्संदेह एलटीईई उपभेदों और आबादी के बीच फिटनेस तुलना करना सरल बना दिया है।

बाद की पीढ़ियों में, एलटीईई आबादी में से कुछ अब टीए एगर पर उपनिवेश नहीं बनाते हैं, जो संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रतियोगिता प्रयोगों को करना मुश्किलया असंभव बनाता है। वैकल्पिक तरीके जिन्हें कॉलोनी विकास की आवश्यकता नहीं होती है, उनका उपयोग संभावित रूप से दो प्रतियोगियों के सापेक्ष प्रतिनिधित्व को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि एफआरईक्यू-सेक जो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करता है ताकि एम्पलीकॉन44 में दो वैकल्पिक एलील वाले रीड के अनुपात की गणना की जा सके। इस विधि या इसी तरह के एक का उपयोग संभावित रूप से आरा एलील्स के साथ या नए विकसित उत्परिवर्तनों के साथ किया जा सकता है, जैसे कि पाइकेएफ और एनएडीआर में, बनाम पैतृक अनुक्रम। आनुवंशिक संशोधन करना जो अन्य प्रकार के तटस्थ मार्करों को पेश करते हैं, का उपयोग सापेक्ष फिटनेस को मापने के लिए भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन को एलटीईई ऑफशूट प्रयोगों में कोशिकाओं के गुणसूत्रों में डाला गया है ताकि फ्लो साइटोमेट्री45 का उपयोग करके प्रतियोगियों की गिनती की जा सके। एक अन्य दृष्टिकोण, जो एक ही प्रतियोगिता फ्लास्क में दो से अधिक उपभेदों को एक साथ मिलाने की संभावना को खोलता है, बारकोड डालना है जिसे पीसीआर प्रवर्धित किया जा सकता है और विभिन्न प्रतियोगियों के जीनोम में अनुक्रमित किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग विकास प्रयोगों में वंश अनुरेखण के लिए किया गयाहै। फ्लो साइटोमेट्री और बारकोड अनुक्रमण दोनों दो उपभेदों बनाम कॉलोनी गिनती के अधिक चरम अनुपात को सटीक रूप से माप सकते हैं (क्योंकि वे 10,000 कोशिकाओं / जीनोम बनाम < 500 के > क्वेरी कर सकते हैं जिन्हें एक आगर प्लेट पर गिना जा सकता है), इसलिए इन विधियों का उपयोग फिटनेस मतभेदों के संदर्भ में गतिशील सीमा को बढ़ाने का भी वादा करता है जिसे एक सामान्य प्रतियोगी के सापेक्ष मापा जा सकता है।

दीर्घकालिक माइक्रोबियल विकास प्रयोगों के लिए वैकल्पिक डिजाइन।
अपने सभी गुणों के लिए, एलटीईई सही नहीं है। इसके डिजाइन के कुछ पहलू इसे श्रम गहन और मानव त्रुटि के लिए अतिसंवेदनशील बनाते हैं। उदाहरण के लिए, प्रत्येक दिन एक शोधकर्ता को प्रयोग जारी रखने के लिए एर्लेनमेयर फ्लास्क के बीच प्रयोगशाला और पिपेट में आना चाहिए। प्रतिस्पर्धा प्रयोग भी चुनौतीपूर्ण तार्किक बाधाएं पैदा कर सकते हैं, यह देखते हुए कि बाँझ ग्लासवेयर, मीडिया, इनक्यूबेटर स्पेस और कॉलोनी गिनती की आवश्यकताएं तेजी से बढ़ जाती हैं जब प्रतियोगियों की एक छोटी संख्या को भी मामूली प्रतिकृति के साथ परीक्षण किया जा रहा है। हमसे अक्सर पूछा जाता है कि हम प्रयोगशाला स्वचालन प्रणालियों का लाभ क्यों नहीं उठाते हैं, जैसे कि पाइपिंग रोबोट जो 96-वेल माइक्रोप्लेट्स पर काम करते हैं, या निरंतर संस्कृति प्रणाली, जैसे कि केमोस्टैट्स या टर्बिडोस्टैट्स। जवाब सरल है: एलटीईई, एक अर्थ में, अपने लंबे इतिहास का कैदी है। हम 50 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में एक विशिष्ट गति से हिलने वाली 10 एमएल संस्कृतियों से विचलित होने की हिम्मत नहीं करते हैं क्योंकि इससे प्रयोग को मौलिक रूप से बदलने का खतरा होगा। पर्यावरण के सूक्ष्म पहलू जिनके लिए ये आबादी दशकों से अनुकूल रही है (उदाहरण के लिए, वातन की मात्रा), माइक्रोप्लेट्स या निरंतर संस्कृति प्रणालियों में बदल जाएगी। प्रत्येक हस्तांतरण पर जनसंख्या की अड़चन भी अलग हो सकती है (उदाहरण के लिए, माइक्रोप्लेट्स में छोटी), विकासवादी गतिशीलता को बदल रही है। संक्षेप में, यहां वर्णित विधियों से विचलित होने से एलटीईई एक अलग प्रयोग बन जाएगा, या कम से कम एक अलगाव पेश करने का जोखिम होगा जो विकासवादी प्रक्षेपपथ को बाधित करेगा।

नए विकास प्रयोगों को डिजाइन करने वाले शोधकर्ताओं को माइक्रोबियल आबादी के प्रचार के इन अन्य तरीकों पर विचार करना चाहिए, जबकि उनके संभावित लाभों और कमियों के बारे में पता होना चाहिए। माइक्रोवेल प्लेटों में आबादी को स्थानांतरित करने के लिए पाइपिंग रोबोट का उपयोग करना कुछ मायनों में तार्किक रूप से सरल है और प्रतिकृति आबादी की उच्च संख्या के कारण काफी शक्तिशाली साबित हो सकता है जिसे इस तरह से प्रचारित किया जा सकता है47,48,49। हालांकि, अधिकांश वर्तमान सेटअपों में स्वचालित स्थानांतरण पूरी तरह से बाँझ परिस्थितियों में नहीं होते हैं, जिससे बाहरी संदूषण की संभावना बढ़ जाती है। संदूषण को रोकने के लिए, विकास माध्यम को अक्सर एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक किया जाता है, जो विकास को प्रभावित करने वाले पर्यावरण की एक विशेषता बन जाता है। माइक्रोवेल प्लेटों में स्थानांतरण भी क्रॉस-संदूषण घटनाओं के लिए अधिक प्रवण हैं। अंत में, माइक्रोवेल प्लेटों का वातावरण - खासकर यदि वे हिलते नहीं हैं - दीवार के विकास, एकत्रीकरण और अन्य घटनाओं के लिए चयन करते हैं जो एक कुएं में कई जगह बनाकर विकास को जटिल कर सकते हैं। छोटे कुओं में आबादी के आकार को बड़ा रखने के लिए समृद्ध मीडिया या पोषक तत्वों की उच्च सांद्रता का उपयोग करने से इन जटिलताओं को बढ़ाने की संभावना है। यदि इस तरह की बातचीत उत्पन्न होती है, तो वे फिटनेस को मापने और व्याख्या करने को और अधिक कठिन बना सकते हैं।

माइक्रोबियल विकास के लिए निरंतर संस्कृति प्रणालियों में केमोस्टैट्स शामिल हैं, जिसमें ताजा माध्यम को लगातार पंप किया जाता है और संस्कृति को बाहर निकाला जाता है, और टर्बिडोस्टैट्स, जिसमें संस्कृतियों को समय-समय पर कोशिकाओं को निरंतर विकास की स्थिति में बनाए रखने के लिए स्वचालित संवेदन और पंपिंग के माध्यम से पतला किया जाता है। ये प्रणालियां बहुत उपयोगी होती हैं जब कोई माइक्रोबियल फिजियोलॉजी और विकास को मॉडल करना चाहता है क्योंकि वे विकास और भुखमरी के बीच रोगाणुओं के संक्रमण से बचते हैं, उन्हें ऐसे वातावरण में रखते हैं जिसमें हमेशा पोषक तत्वहोते हैं। यहां तक कि सेंसर भी जोड़ सकते हैं जो ऑप्टिकल घनत्व, ओ2 खपत, पीएच और संस्कृति के पर्यावरण और विकास के अन्य पहलुओं के वास्तविक समय माप करते हैं। हालांकि, वर्तमान निरंतर संस्कृति प्रणालियों को कस्टम सेटअप51,52,53,54 बनाने के लिए या तो महंगे उपकरण खरीद या विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, दीवार विकास, जिसमें कोशिकाएं संस्कृति कक्ष का पालन करके कमजोर पड़ने से बच जाती हैं, निरंतर संस्कृति प्रणालियों में विकासवादी गतिशीलता को बाधित करती हैं जब तक कि उन्हें समय-समय पर निष्फल नहीं किया जाता है। इन बाधाओं के कारण, आज तक अधिकांश केमोस्टैट और टर्बिडोस्टैट विकास प्रयोग सीमित अवधि के रहे हैं और / या सीरियल ट्रांसफर विकास प्रयोगों की तुलना में अपेक्षाकृत कम स्वतंत्र रूप से विकसित आबादी शामिल हैं।

समाप्ति
एलटीईई के लिए हम यहां जिन तरीकों का प्रदर्शन करते हैं, वे इसके अद्वितीय ऐतिहासिक रिकॉर्ड का अध्ययन करने और इन ई कोलाई आबादी के खुले विकास को जारी रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। वे उन लोगों के लिए एक प्रारंभिक बिंदु भी प्रदान करते हैं जो नए विकास प्रयोगों पर विचार कर रहे हैं जो प्रयोगशाला स्वचालन का लाभ उठा सकते हैं या प्राकृतिक वातावरण में पाई जाने वाली जटिलता के विभिन्न तत्वों को वापस जोड़ सकते हैं जिन्हें एलटीईई से उद्देश्यपूर्ण रूप से छोड़ दिया गया था। 1988 के बाद से, प्रयोगात्मक विकास एक क्षेत्र के रूप में विकसित हुआ है। इस समय के दौरान, दुनिया भर की प्रयोगशालाओं में शोधकर्ताओं ने विकास का अध्ययन करने, रचनात्मक प्रयोगात्मक डिजाइन पेश करके और नई प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके परिणामों की निगरानी करके नवाचार करने के लिए इस दृष्टिकोण के विशाल लचीलेपन का प्रदर्शन किया है। एलटीईई के तरीके एक समापन बिंदु का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, लेकिन हमें उम्मीद है कि वे भविष्य में क्षेत्र के लिए प्रेरणा और आधार प्रदान करना जारी रखेंगे।

Disclosures

हितों के टकराव की कोई घोषणा नहीं की गई।

Acknowledgments

हम रिचर्ड लेंसकी और कई शोधकर्ताओं को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने ई कोलाई के साथ दीर्घकालिक विकास प्रयोग को बनाए रखने में अध्ययन और योगदान दिया है, जिसमें विशेष रूप से नीरजा हजेला शामिल हैं। एलटीईई वर्तमान में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (डीईबी -1951307) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma-Aldrich T8877
20 mL Glass Beaker Sigma-Aldrich CLS100020
50 mL Erlenmeyer Flasks Sigma-Aldrich CLS498050
Agar Sigma-Aldrich A1296
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich AX1385
Antifoam Sigma-Aldrich A5757
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
Freezer Box (2") VWR 82007-142
Freezer Box (3") VWR 82007-144
Freezer Box Cell Divider (49-place) VWR 82007-150
Freezer Box Cell Divider (81-place) VWR 82007-154
Freezer Vials (1/2-Dram) VWR  66009-816 
Freezer Vials (2-Dram) VWR  66010-560 
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glycerol Fisher Scientific G33
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Metal Tray Winco SPJP-202
Petri Dish Fisher Scientific FB0875712
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P5379
Sodium Chloride Sigma-Aldrich M7506
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate Sigma-Aldrich C7254
Test Tube Cap (18mm) VWR 10200-142
Test Tube Rack (18mm, steel) Adamas-Beta N/A Test Tube Racks Stainless Steel Grid Arrangement 72 Holes (17-19 mm)
Test Tubes (18 x 150 mm) VWR 47729-583
Thiamine, Hydrochloride Millipore 5871
Tryptone Gibco 211705
Yeast Extract Gibco 212750

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References

  1. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  2. Fox, J. W., Lenski, R. E. From here to eternity-the theory and practice of a really long experiment. PLoS Biology. 13 (6), e1002185 (2015).
  3. Daegelen, P., Studier, F. W., Lenski, R. E., Cure, S., Kim, J. F. Tracing ancestors and relatives of Escherichia coli B, and the derivation of B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 634-643 (2009).
  4. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12 genomes. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 653-680 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Lenski, R. E. Experimental studies of pleiotropy and epistasis in Escherichia coli. II. Compensation for maladaptive pleiotropic effects associated with resistance to virus T4. Evolution. 42 (3), 425-432 (1988).
  7. Calcott, P. H., Gargett, A. M. Mutagenicity of freezing and thawing. FEMS Microbiology Letters. 10 (2), 151-155 (1981).
  8. Lenski, R. E., Travisano, M. Dynamics of adaptation and diversification: a 10,000-generation experiment with bacterial populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (15), 6808-6814 (1994).
  9. Wiser, M. J., Ribeck, N., Lenski, R. E. Long-term dynamics of adaptation in asexual populations. Science. 342 (6164), New York, N.Y. 1364-1367 (2013).
  10. Lenski, R. E., et al. Sustained fitness gains and variability in fitness trajectories in the long-term evolution experiment with Escherichia coli. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1821), 20152292 (2015).
  11. Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  12. Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
  13. Tenaillon, O., et al. Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment. Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).
  14. Good, B. H., McDonald, M. J., Barrick, J. E., Lenski, R. E., Desai, M. M. The dynamics of molecular evolution over 60,000 generations. Nature. 551 (7678), 45-50 (2017).
  15. Consuegra, J., et al. Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria. Nature Communications. 12 (1), 980-980 (2021).
  16. Cooper, T. F., Rozen, D. E., Lenski, R. E. Parallel changes in gene expression after 20,000 generations of evolution in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (3), 1072-1077 (2003).
  17. Favate, J. S., Liang, S., Cope, A. L., Yadavalli, S. S., Shah, P. The landscape of transcriptional and translational changes over 22 years of bacterial adaptation. eLife. 11, e81979 (2022).
  18. Khan, A. I., Dinh, D. M., Schneider, D., Lenski, R. E., Cooper, T. F. Negative epistasis between beneficial mutations in an evolving bacterial population. Science. 332 (6034), 1193-1196 (2011).
  19. Plucain, J., et al. Epistasis and allele specificity in the emergence of a stable polymorphism in Escherichia coli. Science. 343 (6177), 1366-1369 (2014).
  20. Quandt, E. M., Deatherage, D. E., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Recursive genomewide recombination and sequencing reveals a key refinement step in the evolution of a metabolic innovation in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2217-2222 (2014).
  21. Leon, D., D'Alton, S., Quandt, E. M., Barrick, J. E. Innovation in an E. coli evolution experiment is contingent on maintaining adaptive potential until competition subsides. PLoS Genetics. 14 (4), e1007348 (2018).
  22. Bennett, A. F., Lenski, R. E., Mittler, J. E. Evolutionary adaptation to temperature. I. Fitness responses of Escherichia coli to changes in its thermal environment. Evolution. 46 (1), 16-30 (1992).
  23. Kibota, T. T., Lynch, M. Estimate of the genomic mutation rate deleterious to overall fitness in E. coli. Nature. 381 (6584), 694-696 (1996).
  24. Friesen, M. L., Saxer, G., Travisano, M., Doebeli, M. Experimental evidence for sympatric ecological diversification due to frequency-dependent competition in Escherichia coli. Evolution. 58 (2), 245-260 (2004).
  25. Cooper, T. F. Recombination speeds adaptation by reducing competition between beneficial mutations in populations of Escherichia coli. PLoS Biology. 5 (9), e225 (2007).
  26. Cooper, T. F., Lenski, R. E. Experimental evolution with E. coli in diverse resource environments. I. Fluctuating environments promote divergence of replicate populations. BMC Evolutionary Biology. 10, 11 (2010).
  27. Quan, S., et al. Adaptive evolution of the lactose utilization network in experimentally evolved populations of Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), e1002444 (2012).
  28. Deatherage, D. E., Kepner, J. L., Bennett, A. F., Lenski, R. E., Barrick, J. E. Specificity of genome evolution in experimental populations of Escherichia coli evolved at different temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1904-E1912 (2017).
  29. Izutsu, M., Lake, D. M., Matson, Z. W. D., Dodson, J. P., Lenski, R. E. Effects of periodic bottlenecks on the dynamics of adaptive evolution in microbial populations. BioRixv. , 4457 (2021).
  30. Chavarria-Palma, J. E., Blount, Z. D., Barrick, J. E. LTEE Media Recipes. , (2022).
  31. Barrick, J. E., Lake, D. M. fitnessR: fitnessR-v1.0.0. barricklab. , (2023).
  32. Blount, Z. D., Borland, C. Z., Lenski, R. E. Historical contingency and the evolution of a key innovation in an experimental population of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (23), 7899-7906 (2008).
  33. Grant, N. A., Magid, A. A., Franklin, J., Dufour, Y., Lenski, R. E. Changes in cell size and shape during 50,000 generations of experimental evolution with Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 203 (10), 22 (2021).
  34. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
  35. Meyer, J. R., et al. Parallel changes in host resistance to viral infection during 45,000 generations of relaxed selection. Evolution. 64 (10), 3024-3034 (2010).
  36. Woods, R., Schneider, D., Winkworth, C. L., Riley, M. A., Lenski, R. E. Tests of parallel molecular evolution in a long-term experiment with Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (24), 9107-9712 (2006).
  37. Barrick, J. E., Deatherage, D. E., D'Alton, S. LTEE-Ecoli: genomics resources for the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. , Available from: https://github.com/barricklab/LTEE-Ecoli (2022).
  38. Izutsu, M., Lenski, R. E. Experimental test of the contributions of initial variation and new mutations to adaptive evolution in a novel environment. Frontiers in Ecology and Evolution. 10, 958406 (2022).
  39. Wiser, M. J., Lenski, R. E. A comparison of methods to measure fitness in Escherichia coli. PLoS One. 10 (5), 0126210 (2015).
  40. de Visser, J. A. G. M., Lenski, R. E. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. XI. Rejection of non-transitive interactions as cause of declining rate of adaptation. BMC Evolutionary Biology. 2 (1), 19 (2002).
  41. Paquin, C. E., Adams, J. Relative fitness can decrease in evolving asexual populations of S. cerevisiae. Nature. 306 (5941), 368-371 (1983).
  42. Rozen, D. E., Lenski, R. E. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. VIII. Dynamics of a balanced polymorphism. The American Naturalist. 155 (1), 24-35 (2000).
  43. Quandt, E. M., Gollihar, J., Blount, Z. D., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Fine-tuning citrate synthase flux potentiates and refines metabolic innovation in the Lenski evolution experiment. eLife. 4, e09696 (2015).
  44. Chubiz, L. M., Lee, M. -C., Delaney, N. F., Marx, C. J. FREQ-Seq: a rapid, cost-effective, sequencing-based method to determine allele frequencies directly from mixed populations. PLoS One. 7 (10), e47959 (2012).
  45. Gallet, R., Cooper, T. F., Elena, S. F., Lenormand, T. Measuring selection coefficients below 10-3: method, questions, and prospects. Genetics. 190 (1), 175-186 (2012).
  46. Levy, S. F., et al. Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking. Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).
  47. Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
  48. Frenkel, E. M., et al. Crowded growth leads to the spontaneous evolution of semistable coexistence in laboratory yeast populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (36), 11306-11311 (2015).
  49. Jordt, H., et al. Coevolution of host-plasmid pairs facilitates the emergence of novel multidrug resistance. Nature Ecology and Evolution. 4 (6), 863-869 (2020).
  50. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  51. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and use of multiplexed chemostat arrays). Journal of Visualized Experiments. (72), e50262 (2013).
  52. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  53. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  54. Ekkers, D. M., Branco Dos Santos, F., Mallon, C. A., Bruggeman, F., Van Doorn, G. S. The omnistat: A flexible continuous-culture system for prolonged experimental evolution. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 932-942 (2020).

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जेनेटिक्स अंक 198
<em>एस्चेरिचिया कोलाई</em> के साथ दीर्घकालिक विकास प्रयोग में दैनिक स्थानांतरण, आबादी को संग्रहीत करना और फिटनेस को मापना
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Barrick, J. E., Blount, Z. D., Lake, … More

Barrick, J. E., Blount, Z. D., Lake, D. M., Dwenger, J. H., Chavarria-Palma, J. E., Izutsu, M., Wiser, M. J. Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. J. Vis. Exp. (198), e65342, doi:10.3791/65342 (2023).

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