Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Daglige overføringer, arkivering av populasjoner og måling av kondisjon i det langsiktige evolusjonseksperimentet med Escherichia coli

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65342
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,4, 1, 1, 2,3, 2,5
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin, 2BEACON Center for the Study of Evolution in Action, Michigan State University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 4Department of Integrative Biology, Michigan State University, 5Biological Sciences Program, Michigan State University

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan man opprettholder Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) ved å utføre daglige overføringer og periodiske nedfrysninger, og hvordan man gjennomfører konkurranseanalyser for å måle kondisjonsforbedringer i utviklede bakterier. Disse prosedyrene kan tjene som en mal for forskere som starter sine egne mikrobielle evolusjonseksperimenter.

Abstract

Long-Term Evolution Experiment (LTEE) har fulgt tolv populasjoner av Escherichia coli som de har tilpasset seg et enkelt laboratoriemiljø i mer enn 35 år og 77.000 bakteriegenerasjoner. Oppsettet og prosedyrene som brukes i LTEE illustrerer pålitelige og reproduserbare metoder for å studere mikrobiell evolusjon. I denne protokollen beskriver vi først hvordan LTEE-populasjonene overføres til ferskt medium og dyrkes hver dag. Deretter beskriver vi hvordan LTEE-populasjonene regelmessig kontrolleres for mulige tegn på forurensning og arkiveres for å gi en permanent frossen "fossilpost" for senere studier. Flere sikkerhetstiltak som er inkludert i disse prosedyrene, er utformet for å forhindre forurensning, oppdage ulike problemer når de oppstår, og gjenopprette fra forstyrrelser uten å sette tilbake fremdriften i eksperimentet nevneverdig. En måte at det generelle tempoet og karakteren av evolusjonære endringer overvåkes i LTEE, er ved å måle konkurransedyktigheten til populasjoner og stammer fra eksperimentet. Vi beskriver hvordan samkulturkonkurranseanalyser gjennomføres og gir både et regneark og en R-pakke (fitnessR) for beregning av relativ kondisjon fra resultatene. I løpet av LTEE har oppførselen til enkelte populasjoner endret seg på interessante måter, og nye teknologier som helgenomsekvensering har gitt ytterligere veier for å undersøke hvordan populasjonene har utviklet seg. Vi avslutter med å diskutere hvordan de opprinnelige LTEE-prosedyrene har blitt oppdatert for å imøtekomme eller dra nytte av disse endringene. Denne protokollen vil være nyttig for forskere som bruker LTEE som et modellsystem for å studere sammenhenger mellom evolusjon og genetikk, molekylærbiologi, systembiologi og økologi. Mer bredt gir LTEE en prøvd og sann mal for de som begynner sine egne evolusjonseksperimenter med nye mikrober, miljøer og spørsmål.

Introduction

I februar 1988 inokulerte Richard Lenski tolv kolber som inneholdt et definert glukosebegrenset vekstmedium med klonale kulturer av Escherichia coli ved University of California, Irvine1. Dagen etter overførte han 1% av kulturen fra hver kolbe til et sett med nye kolber som inneholdt friskt vekstmedium. Denne 1:100-fortynningen tillot bakteriepopulasjonene å ekspandere 100 ganger før den tilgjengelige glukosen ble uttømt, tilsvarende omtrent 62/3 generasjoner av celledelinger. Denne prosedyren ble gjentatt dagen etter og har vært hver dag siden, med noen få avbrudd. Disse daglige overføringene har fortsatt, selv om eksperimentet ble flyttet, først til Michigan State University i 1992, og deretter til University of Texas i Austin i 2022. Hele tiden har nye mutasjoner kontinuerlig generert genetisk variasjon i disse E. coli-populasjonene , og naturlig utvalg har ført til at utviklede celler utkonkurrerer sine forfedre.

Lenski designet dette eksperimentet, nå kjent som Long-Term Evolution Experiment (LTEE), for å undersøke evolusjonens dynamikk og repeterbarhet. For å svare på disse spørsmålene inkluderte han flere viktige funksjoner i utformingen av det eksperimentelle oppsettet og dets protokoller2. En av disse funksjonene var det forsiktige valget av en modellorganisme. De opprinnelige tolv populasjonene ble alle startet fra enkeltkolonier som delte en umiddelbar felles stamfar, Escherichia coli B-stammen REL606. Denne stammen ble valgt fordi den allerede hadde blitt vanlig brukt i laboratorieinnstillinger, reprodusert helt aseksuelt, og inneholdt ingen plasmider eller intakte profager 3,4 - som alle gjør det enklere å studere utviklingen. Et annet valg som forenklet forsøket var å bruke en svært lav konsentrasjon av glukose i vekstmediet for å begrense tettheten av celler i hver kolbe etter vekst. Bruk av lav celletetthet var ment å gjøre det lettere å analysere endringer i populasjonskondisjon ved å redusere potensialet for utvikling av økologiske interaksjoner i populasjoner (f.eks. ved kryssmating)5.

REL606 kan ikke bruke ʟ-arabinose som karbon- og energikilde (Ara−) på grunn av en punktmutasjon i araA-genet. Før oppstart av LTEE ble en spontan mutant med en gjenopprettet araA-sekvens, betegnet REL607, isolert fra REL6066. REL607 er i stand til å vokse på ʟ-arabinose (Ara+). REL606 ble brukt til å starte seks av LTEE-populasjonene, og REL607 ble brukt til å starte de andre seks. Arabinose er ikke tilstede i vekstmediet som brukes under LTEE, så REL607 oppfører seg på samme måte som REL606 under disse forholdene. Men når de er belagt på tetrazolium arabinose (TA) agar, danner Ara- og Ara+-celler henholdsvis røde og hvite kolonier. Denne metoden for å diskriminere mellom de to forfedre E. coli-stammene og deres etterkommere er ganske nyttig. Den kan brukes til å oppdage krysskontaminering mellom LTEE-populasjoner. Det hjelper også med å måle kondisjonen til en Ara-stamme eller befolkning i forhold til en Ara+ når de konkurrerer mot hverandre. Kondisjon måles ved å sette opp en samkultur av motsatt markerte konkurrenter og deretter overvåke hvordan frekvensene til røde og hvite kolonier (oppnådd ved å spre fortynninger av kulturen på TA-plater) endres mellom når konkurrentene først blandes og etter en eller flere vekstsykluser under samme forhold som LTEE. Representasjonen av den mer tilpassede celletypen vil øke i løpet av hver vekstsyklus.

Et annet kritisk trekk ved LTEE er at prøver av de utviklende populasjonene periodisk arkiveres. Når det blandes med et kryobeskyttelsesmiddel som glyserol, kan E. coli-celler fryses og senere gjenopplives7. Som en del av LTEE-protokollen, hver 75. dag (som tilsvarer omtrent 500 generasjoner), blandes en del av hver populasjon som ikke ble overført til en ny kolbe med glyserol, deles opp mellom flere hetteglass og lagres i en fryser. Denne frosne "fossilposten" gjorde det mulig for forskere å utføre de første studiene av LTEE, der de gjenopplivet de utviklede E. coli-populasjonene fra forskjellige tidspunkter og konkurrerte dem mot forfedrenes stammer for å spore hvor raskt kondisjonen økte1. Kondisjonsutviklingen har blitt målt på nytt med jevne mellomrom etter hvert som flere "lag" av den frosne "fossilposten" har blitt bevart. Den overordnede konklusjonen fra disse målingene er at kondisjonen fortsetter å forbedre seg i LTEE til denne dagen, selv etter så mange generasjoner med evolusjon i samme miljø 8,9,10.

Hva har gjort det mulig for LTEE å fortsette så lenge? Mange av de samme funksjonene som gjorde det mulig å stille og besvare de opprinnelige spørsmålene, har også fungert som sikkerhetstiltak og feilsikring mot uunngåelige forstyrrelser på grunn av uflaks, menneskelig feil og verdenshendelser. Hver dag, når kulturene overføres til et nytt vekstmedium, veksler forskeren som utfører overføringene mellom Ara− og Ara+ populasjoner. Deretter, når populasjonene er frosset, kan de bli belagt på selektiv og indikatoragar for å sjekke om noen "nabo" populasjoner ved et uhell har blitt kryssforurenset eller blandet opp (f.eks. Hvite kolonier er i en populasjon som bare skal danne røde kolonier) eller forurenset med fremmede mikrober (f.eks. Uventede kolonimorfologier eller celletettheter). I tilfelle en befolkning har blitt kompromittert, kan dens forfedre gjenopplives fra fryseren og føres videre på sin plass. Ara-markørene og det frosne arkivet tjener dermed to formål både som eksperimentelle ressurser og sikkerhetstiltak.

Fordi historien er så godt bevart og lett tilgjengelig, har LTEE-prøver blitt studert ved hjelp av teknologier som ikke eksisterte da eksperimentet begynte. For eksempel har helgenomsekvensering blitt brukt til å undersøke dynamikken til mutasjoner i LTEE-populasjonene 11,12,13,14,15, og transkriptomikk og ribosomal profilering har blitt brukt til å undersøke endringer i genuttrykk 16,17. Genetiske verktøy har blitt brukt til å rekonstruere stammer som varierer ved enkeltmutasjoner eller kombinasjoner av flere utviklede mutasjoner for å forstå deres effekter på kondisjon og ulike fenotyper 18,19,20,21. Prøver fra den frosne "fossilposten" blir enkelt etterfylt slik at deler av eller hele kopier av eksperimentets historie kan sendes til andre laboratorier. LTEE-prøver finnes nå på alle kontinenter unntatt Antarktis, og de blir studert av forskere som er yngre enn selve eksperimentet. De robuste metodene til LTEE og utviklede E. coli-prøver og stammer fra dens historiske rekord har også tjent som utgangspunkt for evolusjonseksperimenter som undersøker andre spørsmål og miljøer 22,23,24,25,26,27,28,29.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over LTEE-prosedyrer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Her demonstrerer vi tre kjerneprotokoller brukt i E. coli Long-Term Evolution Experiment (figur 1). Vi beskriver: (1) hvordan man utfører de daglige overføringene, (2) hvordan man arkiverer populasjonsprøver og klonale isolater, og (3) hvordan man utfører og analyserer samarbeidskonkurranseanalyser for å måle kondisjonsforskjeller. Vårt håp er at disse protokollene fremmer fortsatt bruk av LTEE-ressurser og informerer utformingen av nye mikrobielle evolusjonseksperimenter.

Protocol

1. Daglige overføringer av LTEE-populasjoner

MERK: De tolv LTEE-populasjonene overføres daglig ved å inokulere ferskt medium med 1% av kulturene fra forrige dags kolber. Trinnene i denne prosessen er oppsummert i figur 1. De seks Ara− -populasjonene startet fra stamme REL606 er betegnet A-1 til A-6, og de seks Ara + populasjonene startet fra stamme REL607 er betegnet A + 1 til A + 6. Streng overholdelse av aseptisk teknikk og tidsplan og ordre for overføring av populasjonene minimerer risikoen for forurensning og andre forstyrrelser.

  1. Desinfiser overflaten som LTEE-overføringene skal utføres på ved å tørke den med enten 70% etanol eller en 10% blekemiddelløsning. Tenn en Bunsen-brenner for å skape et lokalt opptrekk og muliggjøre flamming av glassvarer.
    MERK: Bruk laboratoriehansker for å forhindre forurensning. For sikkerhet rundt åpen flamme er det viktig å bare bruke hansker som er laget av et materiale som nitril som ikke er brannfarlig.
  2. Forbered tretten 50 ml borosilikatflasker med Erlenmeyer dekket med 20 ml borosilikat- eller polypropylenbeger som er vasket og sterilisert ved autoklavering. Sjekk kolbene for synlig rusk og erstatt alle som ikke er helt rene.
  3. Merk seks flasker A-1 til A-6 ved hjelp av en rød markør og de andre seks kolbene A + 1 til A + 6 ved hjelp av en svart markør. Merk den siste gjenværende kolben, som vil være tom, med datoen i måned/dag-format og ukedag.
  4. Fyll hver av de 13 kolbene med 9,9 ml DM25 ved hjelp av en steril 10 ml serologisk pipette. Flamme munnen på hver kolbe etter å ha fjernet begeret som fungerer som et lokk og før du bytter begeret. Flamme pipettespissen mellom fylling av hver kolbe.
    MERK: Instruksjoner for å lage DM25 er tilgjengelig online30. Hvis du bruker en serologisk plastpipette, må du avstå fra å flamme spissen eller begrense tiden i flammen for å unngå å smelte plasten.
  5. Fjern forrige dags LTEE-kolber fra ristingsinkubatoren.
  6. Undersøk hver kolbe ved å holde den opp mot lyset for å vurdere dens turbiditet og farge, sjekk kolbeintegriteten og se etter tilstedeværelsen av fremmedlegemer.
    MERK: For det blotte øye vil alle Ara- og Ara+-kulturer se litt uklare ut sammenlignet med de tomme, bortsett fra A-3, som vil være ~ 10 ganger mer uklare enn de andre på grunn av vekst på citrat i mediet. Mange eksterne mikrobielle forurensninger er også i stand til å vokse på citrat, så økt turbiditet i andre populasjoner enn A-3 indikerer sannsynligvis forurensning. Se delen Representative resultater for bilder av LTEE-kulturene før en overføring.
  7. VALGFRITT: Bekreft at hver LTEE-kultur har forventet turbiditet ved å pipetere 1 ml av emnet og 1 ml av hver kultur i 1 cm plastkyvetter og ta optiske tetthetsavlesninger ved 600 nm (OD600) ved hjelp av et spektrofotometer etter å ha blanket instrumentet.
    MERK: Dette ekstra trinnet kan være nyttig for forskere som ikke har jobbet med LTEE før og er usikre på å bedømme turbiditeten ved øyet, samt for å dokumentere og undersøke mistenkte avvik. Ta prøver for måling av OD600 fra forrige dags kolber først etter å ha fullført dagens normale overføringer til nye kolber (følgende trinn) for å minimere risikoen for å forurense cellepopulasjonene som vil fortsette å bli forplantet hvis OD600-verdiene er som forventet. Se delen Representative resultater for typiske OD600-verdier for LTEE-kulturer.
  8. Bruk en P200-mikropipettor med en steril filterspiss til å overføre 100 μL kultur fra hver LTEE-kolbe til den tilsvarende kolben som inneholder fersk DM25. Begynn med A-1, og overfør deretter A + 1. Deretter fortsetter du å veksle mellom − og + populasjonene. For å holde oversikt over hvilke kulturer som er overført, skift flasker til venstre etter pipettering fra eller til dem.
    MERK: Den strenge rekkefølgen av overføringer og veksling mellom Ara- og Ara+ -populasjoner hjelper til med å forhindre og oppdage krysskontaminering og blandinger. Følg streng aseptisk teknikk: Bruk en ny pipettespiss for hver overføring, flamme munnen på kolber umiddelbart etter avkapping og før du tar den på igjen, og tørk av sylinderen og ejektoren på mikropipettoren med en lofri papirserviett fuktet med 70 % etanol mellom hver overføring. Blekemiddel bør aldri brukes til å desinfisere mikropipettorer, da selv spormengder kan drepe kulturene.
  9. Inkuber de nylig inokulerte kolbene ved 37 ° C i 24 ± 1 time med 120 o / min orbital risting over en 1-tommers diameter.
  10. Oppbevar kulturene fra dagen før ved 4 °C. Behold disse sikkerhetskopieringskulturene i to dager. Kast eldre kulturer som ble reddet ved 4 °C tre dager før, på dette tidspunktet.
    MERK: De to foregående dagers kulturer gir to komplette sett med sikkerhetskopier for å starte eksperimentet på nytt, om nødvendig, hvis det skulle oppstå et problem eller en ulykke, eller hvis forurensning av gårsdagens kulturer oppdages før overføring (f.eks. merkelig farge eller uventede partikler).
  11. Skriv inn klokkeslett, dato, overføringsnummer, navn eller initialer til forskeren som gjorde overføringene, om kulturene var i orden eller ikke, og annen relevant informasjon i overføringsloggnotatboken. Gå videre til trinn 1.12-1.14 hvis noen av følgende situasjoner oppstår: (1) blanket fra dagen før er forurenset, (2) en kolbe eller lokket er sprukket eller ødelagt, (3) en kolbe inneholder fremmedlegemer, (4) en kolbe veltes eller slippes under overføringer, eller (5) det er noen annen hendelse eller observasjon som gjør det tvilsomt å fortsette fra disse kolbene.
  12. Hvis det er noen problemer, ulykker eller mistanke om forurensning med forrige dags LTEE-kulturer, må du ikke overføre fra dem. I stedet bør du lagre hele settet med tolv kulturer ved 4 °C for senere undersøkelse og videre karakterisering.
  13. Hent ut kolbene med reservekulturer som ble overført fra dagen før og lagret ved 4 °C. Plasser dem på benken for å varme til romtemperatur. Roter hver kolbe forsiktig for å resuspendere cellene.
  14. Overfør fra reservekolbene til det nye settet med kolber som inneholder ferskt medium, og fortsett forsøket som normalt som beskrevet i trinn 1.6-1.11. Noter i overføringsloggen at sikkerhetskopikulturene ble brukt, og registrer samme overføringsnummer som dagen før.
    MERK: Selv om et problem er registrert i bare en populasjons kolbe, overfør alle tolv populasjoner fra reservekolbene slik at antall generasjoner som har gått i alle populasjoner forblir i fase. Hvis det oppdages forurensning i reserveflaskene som er lagret ved 4 °C, må de berørte LTEE-populasjonene startes på nytt fra frosne lagre ved hjelp av prosedyren beskrevet i trinn 3.1-3.2 for populasjonsprøver. Overføringsnummeret for LTEE bør ikke økes før veksten av de første kulturene i DM25 etter vekkelse.

2. Arkivering av LTEE-populasjonene

MERK: Prøver av LTEE-populasjonene fryses hver 75. overføring. Populasjonene vokser ~ 6 2/3 generasjoner hver dag etter 100 ganger overføringsfortynning, så denne perioden tilsvarer ~ 500 generasjoner. Under arkivering blir LTEE-populasjonene også belagt på forskjellige typer agarmedier for å sjekke for forurensning. Eventuelt kan representative kloner plukkes fra disse platene og arkiveres på dette tidspunktet. Disse trinnene er oppsummert i figur 1.

  1. På dagen før den planlagte frysingen eller noen dager før, lag tre typer agarplater: Minimal glukose (MG), minimal arabinose (MA) og tetrazolium arabinose (TA). Lag tolv tallerkener av hver type agar, pluss noen statister. Tilbered også minst 250 ml steril saltoppløsning på 0,85 % (w/v) og 50 ml steril glyserol på 80 % (v/v).
    MERK: Oppskrifter for alle medier og løsninger er tilgjengelig på nett30. Dagen før LTEE når en generasjon som er et multiplum av 500 for den vanlige arkiveringsplanen, er den 74. dagen siden den siste frysingen, pluss eventuelle dager som ble lagt til på grunn av overføringer fra 4 °C reserveflasker når problemer ble oppdaget eller mistenkt.
  2. VALGFRITT: Hvis du arkiverer klonale isolater fra LTEE-populasjonene, må du forberede ytterligere forsyninger: isolering av tre kloner fra hver populasjon krever 72 MG-plater, 80 ml 80% (v / v) glyserol og 370 ml DM1000.
  3. Forbered et ekstra sett med tolv kolber når du utfører trinn 1.2 av de daglige LTEE-overføringene dagen før den planlagte frysingen. Merk seks av de ekstra kolbene xA-1 til xA-6 ved hjelp av en rød markør, og de andre seks xA + 1 til xA + 6 ved hjelp av en svart markør.
    MERK: "X" indikerer at det ekstra settet med kolber vil bli brukt til arkivering og skiller dem fra det andre settet med kolber som vil bli brukt til å fortsette de daglige overføringene av LTEE parallelt.
  4. Fyll hver av de ekstra kolbene som skal brukes til arkivering med 14,85 ml DM25 ved hjelp av en 25 ml serologisk pipette når du utfører trinn 1,4 av de daglige LTEE-overføringene.
  5. Fullfør normal LTEE-overføring som beskrevet i trinn 1.5–1.11. Gjenta deretter instruksjonene for trinn 1.8, men denne gangen overfører du 150 μL fra hver av gårsdagens LTEE-kulturer til de ekstra kolbene på 14,85 ml fersk DM25 som skal brukes til arkivering.
    MERK: I dette og alle påfølgende trinn, unngå forurensning og blandinger ved å følge disse retningslinjene. Begynn med populasjon A-1, overfør deretter A + 1, og fortsett deretter vekslende - og + populasjoner. Tørk av sylinderen og ejektoren på mikropipettoren med en lofri papirserviett fuktet med 70% etanol når du bytter populasjon. Skift flasker og reagensrør over i brettene eller stativene etter pipettering fra eller til dem for å holde oversikt over hvilke overføringer som er fullført.
  6. Inkuber settet med tolv kolber for arkivering ved 37 °C i 24 ± 1 time med 120 o / min orbital risting over en 1-tommers diameter sammen med de tolv LTEE-kulturene og det tomme som beskrevet i trinn 1.9.
  7. Forbered forsyninger for plating av LTEE-populasjonene minst en time før LTEE-overføringene skal utføres på dagen for frysingen.
    1. Velg tolv MG, tolv MA, og tolv TA agar plater. Inspiser hver enkelt visuelt for å være sikker på at den ikke har noen åpenbar forurensning.
    2. Merk én av hver platetype for hver av de tolv LTEE-populasjonene (A-1 til A+6).
      NOTAT: Når du merker tallerkener, skriv på sidene av bunnen av petriskålen. Dette er viktig for ikke å skjule kolonier når man vil undersøke eller fotografere dem fra under agar. Ikke skriv på lokkene, da disse kan blandes sammen.
    3. Legg agarplatene i en 37 °C inkubator i minst 20 minutter for å varme dem før du bruker dem i trinn 2.10.
    4. Klargjør 24 reagensrør som inneholder 9,9 ml saltvann. Ordne dem i tolv sett med to rør hver.
    5. Merk hvert av de to settene med tolv reagensrør på samme måte som platene, og legg til en "1" eller en "2" under LTEE-populasjonsidentifikatoren for å angi rekkefølgen de skal brukes til å lage fortynninger av den populasjonen.
  8. Utfør trinn 1.1-1.11 ved hjelp av kolbene som vil fortsette de daglige overføringene av LTEE som vanlig. I trinn 1.5 fjerner du også de tolv kolbene som inneholder de ekstra kulturene for arkivering fra risteinkubatoren.
  9. Pipette 100 μL av kulturen fra hver av de tolv ekstra kolbene for arkivering i det første reagensrøret av saltvann i paret for den LTEE-populasjonen. Vortex rørene med disse 100 ganger fortynningene grundig. Deretter pipetter 100 μL fra hver til det tilsvarende andre saltvannsrøret. Vortex de siste 10.000 ganger kulturfortynningene grundig.
  10. Pipette 80 μL fra hvert av rørene som inneholder en 10 000 ganger kulturfortynning til de merkede TA-, MG- og MA-platene for den populasjonen. Spre væsken jevnt over agaroverflaten med enten en steril spredningsstang eller sterile spredningsperler, som foretrukket. Gjenta til alle tolv populasjoner har blitt belagt på alle tre typer medier.
  11. La om nødvendig platene tørke til det ikke er synlig væske på agar. Plasser platene opp ned (med agarsiden opp) i en gravitasjonskonveksjonsinkubator satt til 37 °C.
    MERK: Inkuberende plater opp ned holder agar fra å tørke ut og forhindrer kondens fra å dryppe på agaroverflaten. Bevegelse av celler i væske på agaroverflaten under inkubasjon kan smøre kolonier og gi feil kolonitall.
  12. Tilsett 3 ml steril 80% (v/v) glyserol til hver av de tolv ekstra kolbene som er øremerket for arkivering. Bland godt ved å virvle og forsiktig virvle.
  13. Fordel blandingen fra hver kolbe til sterile kryovialer som er merket med en unik identifikator for prøven, LTEE-populasjonen som prøven tilhører, generasjonen der den ble frosset, at det er en blandet (populasjons) prøve og datoen. Pipett 6 ml i ett stort hetteglass og 1,25 ml i hvert av seks små hetteglass.
    MERK: Det store hetteglasset er arbeidsstokken. Ett lite hetteglass er en backup i tilfelle arbeidsmassen er oppbrukt eller blir forurenset. De andre fem små hetteglassene er kopier som kan sendes til andre laboratorier.
  14. Frys de fylte hetteglassene ved −80 °C.
  15. Undersøk og dokumenter vekst og morfologier av kolonier på TA-, MG- og MA-platene etter 24 timer og 48 timer med inkubasjon.
    MERK: Se avsnittet Representative resultater for bilder og beskrivelser av kolonier dannet av REL606- og REL607-forfedrene og hver av de tolv LTEE-populasjonene da de ble belagt på 76 000 generasjoner.
  16. VALGFRITT: Utfør følgende trinn ved arkivering av klonale isolater.
    1. Velg tre klonale isolater (kolonier) for hver LTEE-populasjon fra MG-platene, strek hver enkelt separat på en ny MG-plate, og inkuber disse platene i 16-24 timer ved 37 °C.
      MERK: Hvis kolonier med forskjellige morfologier er til stede, er standard praksis i LTEE å prøve for maksimalt mangfold ved først å velge den vanligste typen, og deretter velge ytterligere kolonier fra minoritetstyper. Man kan også bruke en tilfeldig prøvetakingsstrategi ved å markere prikker på undersiden av bunnen av petriskålen før man sprer celler og deretter plukke den isolerte kolonien nærmest hvert merke etter vekst.
    2. Neste dag, strip en representativ koloni fra hver plate på en ny MG-plate og rug disse platene i 16-24 timer ved 37 ° C.
    3. Dagen etter, inokuler en isolert koloni fra hver MG-plate i en kolbe som inneholder 10 ml fersk DM1000. Fyll også en ekstra kolbe med 10 ml DM1000 for å tjene som et ikke-inokulert emne for å teste for medieforurensning.
    4. Inkuber kolbene ved 37 ° C i 16-24 timer med 120 o / min orbital risting over en 1-tommers diameter.
    5. Etter inkubering, tilsett 2 ml steril 80% (v / v) glyserol til hver kolbe og virvle for å blande.
    6. Fordel 1,25 ml alikoter fra hver kolbe i små, sterile hetteglass merket med en unik identifikator for hver klone, dens LTEE-populasjon og opprinnelsesgenerering, at det er en klonal prøve, og datoen.
    7. Frys de fylte hetteglassene ved −80 °C.

3. Konkurransedyktige fitnessanalyser

MERK: I LTEE kvantifiseres reproduktiv kondisjon i form av det relative antallet doblinger som forskjellige bakterier oppnår over en eller flere 24-timers kultursykluser under de samme forholdene som de daglige overføringene. Spesielt er den relative kondisjonen til en konkurrent til en annen forholdet mellom deres realiserte doblingsrater når de konkurrerer head-to-head i en samkultur. Hver konkurrent i et par kan være en full populasjon eller et klonalt isolat som tidligere ble arkivert som en del av den frosne "fossilposten" til LTEE. Alternativt kan en eller begge konkurrentene være en klon som har blitt genetisk modifisert for å legge til eller fjerne spesifikke mutasjoner for å teste effektene. De to konkurrentene må ha motsatte Ara + / Ara-tilstander fordi denne genetiske markøren brukes til å skille dem under denne analysen. Den overordnede arbeidsflyten for en konkurranseanalyse er vist i figur 2. Varigheten av samkulturfasen kan utvides fra en til tre (eller flere) dager for å forbedre presisjonen av kondisjonsestimater når du tester for forskjeller mellom konkurrenter som er nesten jevnt matchet. Se Disussion for andre kritiske betraktninger og mulige modifikasjoner av denne protokollen.

Figure 2
Figur 2: Flytskjema for konkurranseanalyse. Den fullstendige prosedyren for en en-dags konkurranseanalyse vises. Den tre dager lange prosedyren fortsetter med den alternative banen på dag 1 og dag 2 til plating på dag 3 på samme måte som er avbildet for dag 1 av endagskonkurransen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Forbered forsyninger
    1. Bestem hvor mange konkurrerende LTEE-stammer og / eller populasjoner som skal brukes, og hvor mange replikerende konkurranseanalyser som skal utføres for hvert konkurrentpar. Forbered de nødvendige forsyningene som beskrevet i trinnene nedenfor.
      MERK: Oppskrifter for alle medier og løsninger er tilgjengelig på nett30. Kolbene og reagensrørene som kreves for alle dagene i et konkurranseeksperiment kan fylles på forhånd eller etter behov på dagene de skal brukes. Hvis kolber og reagensrør fylles på forhånd, oppbevar dem ved romtemperatur i mørket for å minimere fordampning. TA-plater må tilberedes minst to dager i forveien når de skal brukes, slik at de kan tørke nok etter å ha blitt hellet for å tillate spredning av kulturfortynninger. Forbered alltid noen ekstra kolber, reagensrør og TA-plater slik at et eksperiment kan fortsette hvis det er pipetteringsfeil, forurensede plater eller andre mindre uhell.
    2. For vekkelsesdagen (dag -2), fyll en steril 50 ml Erlenmeyer-kolbe avkortet med et 20 ml beger med 9,9 ml av enten DM1000 eller Lysogeny Broth (LB) per stamme eller populasjon av E. coli som vil bli brukt som konkurrent. Fyll en kolbe til med 9,9 ml av samme medium for å tjene som et ikke-inokulert emne.
    3. For forkondisjoneringsdagen (dag -1), fyll ett reagensrør med 9,9 ml 0,85% (w / v) sterilt saltvann per konkurrent, to kolber med 9,9 ml DM25 per replikasjonsanalyse mellom et par konkurrenter, og en flaske til med 9,9 ml DM25 for et tomt.
    4. For dagen konkurransen begynner (dag 0), fyll en kolbe med 9,9 ml DM25, fyll ett reagensrør med 9,9 ml 0,85% (w / v) sterilt saltvann, og klargjør en TA-plate per konkurranseanalyse. Fyll en flaske til med 9,9 ml DM25 for å fungere som et tomt.
    5. ALTERNATIV: For hver dag i en flerdagers konkurranse forbi den første, fyll en kolbe med 9,9 ml DM25 per konkurransereplikat og fyll en kolbe til med 9,9 ml DM25 for et tomt.
    6. For den siste dagen av konkurransen (f.eks . dag 1 eller dag 3), fyll to reagensrør med 9,9 ml 0,85% (w / v) sterilt saltvann og klargjør en TA-plate per konkurransereplika.
  2. Dag −2: Gjenopplive konkurrentene separat i DM1000 eller LB
    1. For hver av konkurrentene, merk en kolbe fylt med 9,9 ml av enten DM1000 eller LB. Merk en ekstra kolbe fylt med 9,9 ml fra samme batch av medium for å tjene som et ikke-inokulert emne for å teste for forurensning.
      MERK: Frosne lagre gjenopplives i LB eller DM1000 for mer jevn og forutsigbar gjenoppretting av kryopreserverte celler. Glyserol som brukes som kryobeskyttelsesmiddel kan metaboliseres av E. coli, noe som vil føre til høyere celletetthet enn forventet hvis prøvene gjenopplives i DM25. LB og DM1000 støtter vekst til så høye celletettheter at denne komplikasjonen blir ubetydelig.
    2. Ta kryovialene som inneholder de frosne lagrene til konkurrentstammene ut av fryseren på -80 °C. Hold hetteglassene avkjølt i en isbøtte mens du bruker dem.
    3. Etter at hver frossen bestand har tint, virvle den grundig for å resuspendere E. coli-cellene. Hvis du gjenoppliver en klone, inokuler kolben som inneholder ferskt medium med 12 μL av den frosne bestanden. Hvis du gjenoppliver en populasjon, inokuler kolben med 120 μL av den frosne bestanden.
      MERK: 120 μL-volumet av den frosne stammen brukes til populasjoner, slik at antall celler som gjenopplives er omtrent det samme som den daglige flaskehalsen når 1% av LTEE-populasjonen overføres til en ny kolbe. Tining og virveling av frosne lagre flere ganger kan stresse celler og redusere levedyktigheten til bestandene over tid. Hvis en gitt LTEE-populasjon eller klon skal brukes i konkurranser flere ganger, er det god praksis å vokse og fryse flere kopier av bestanden slik at ingen enkelt tines og fryses på nytt mange ganger.
    4. Inkuber vekkelseskolbene og emnet ved 37 ° C over natten (16-24 timer) med 120 o / min orbital risting over en 1-tommers diameter.
  3. Dag −1: Forutsetning konkurrenter separat i DM25
    1. For hver konkurrent, merk et reagensrør fylt med 9,9 ml saltvann. For hver replikasjonskonkurranseanalyse mellom et par konkurrenter, merk to 50 ml kolber fylt med 9,9 ml DM25, hver med replikatnummeret og navnet på en av konkurrentene. Merk en ekstra kolbe fylt med 9,9 ml DM25 for å tjene som et tomt.
    2. Ta kolbene som inneholder kulturer av gjenopplivede konkurrenter ut av inkubatoren. Undersøk deres turbiditet ved øye for å bekrefte at de vokste og at det ikke er noen åpenbar forurensning.
    3. Pipett 100 μL fra hver kolbe inn i reagensrøret med saltvann for den konkurrenten.
      MERK: Dette trinnet fortynner kulturen 100 ganger, noe som er nødvendig fordi tettheten av celler er mye høyere i LB og DM1000 enn det er i DM25-miljøet som brukes i LTEE (se representative resultater).
    4. Vortex hvert fortynningsrør grundig rett før pipettering 100 μL fra den fortynnede kulturen til en kolbe med fersk DM25. Inokuler to av disse forkondisjoneringskolbene for hver replikasjonsanalyse, en for hver av konkurrentene.
    5. Inkuber forkondisjoneringskolbene og emnet ved 37 ° C i 24 ± 1 time med 120 o / min orbital risting over en 1-tommers diameter.
  4. Dag 0: Start konkurransen ved å blande konkurrenter og tallerken for innledende tellinger
    1. For hver konkurranseanalyse replikerer, merk en kolbe fylt med 9,9 ml DM25 og ett reagensrør fylt med 9,9 ml saltvann. Merk kolbene og rørene på en måte som unikt identifiserer hvert par konkurrenter og replikatnummeret til konkurranseanalysen. Merk en ekstra kolbe fylt med 9,9 ml DM25 for å tjene som et tomt.
    2. Ta forkondisjoneringskolbene ut av inkubatoren. Undersøk deres turbiditet ved øye for å bekrefte at de vokste og at det ikke er noen åpenbar forurensning.
    3. Overfør 50 μL av Ara− -konkurrenten til den første replikerte konkurransekolben fylt med fersk DM25. Overfør umiddelbart 50 μL av Ara+ -konkurrenten til samme konkurransekolbe og bland den ved å virvle forsiktig.
    4. Gjenta trinn 3.4.3 for alle replikater av alle konkurrentpar.
      MERK: Konkurransekolbene har nå en samlet 100 ganger fortynning av E. coli-kulturer dyrket i DM25, samme tilstandsceller i LTEE-opplevelsen etter hver daglig overføring. Rekkefølgen for å utføre overføringer og blanding er viktig. Legg begge konkurrentene til hver kolbe umiddelbart etter hverandre, slik at ingen av dem får et forsprang på å vokse i det friske mediet. For eksempel, ikke legg til Ara− -kulturene i alle konkurranseflasker og gå deretter tilbake og legg til alle Ara+ -stammene.
    5. Pipette 100 μL fra hver nylig inokulerte konkurransekolbe inn i reagensrøret av saltvann merket for den konkurranseanalysen replikerer slik at hvert av disse rørene inneholder en samlet 10.000 ganger fortynning av de forhåndskondisjonerte DM25-kulturene som ble kombinert.
    6. Plasser konkurransekolbene og blank inn i risteinkubatoren. Inkuber konkurransekolbene ved 37 ° C i 24 ± 1 time med 120 o / min orbital risting over en 1-tommers diameter.
    7. Samme dag, umiddelbart etter at konkurransekolbene er plassert i inkubatoren, virvler du hvert reagensrør fra trinn 3.4.5 grundig og sprer 80 μL av disse 10 000 ganger fortynningene på TA-plater som beskrevet i trinn 2.10. Merk siden av bunnen av hver plate med paret av stammer som ble blandet, replikatnummeret og "Dag 0" for å indikere at det vil bli brukt til å bestemme den første representasjonen av hver konkurrent.
    8. Inkuber TA-platene opp ned i en gravitasjonskonveksjonsinkubator ved 37 °C til kolonier av både Ara− og Ara+-konkurrentene er synlige og gjenkjennelige. Vanligvis skjer dette innen 16-24 timer, men det kan ta lengre tid for noen utviklede stammer. Tell antall Ara− (rød) og Ara+ (hvite) kolonier på hver plate ogregistrer resultatene.
      MERK: Forskjellene mellom fargene på Ara- og Ara+ koloniene på TA-platene blir mindre tydelige over tid, selv når platene lagres ved 4 °C, så de må telles så raskt som mulig når de er fjernet fra inkubatoren. Bilder av TA-plater som viser det typiske utseendet til kolonier dannet av Ara− og Ara + celler er inkludert i de representative resultatene. Denne delen har også bilder av vanlige "edge case" -kolonier (f.eks. overlapping eller utvekst av forskjellige kolonityper), og forklarer hvordan du teller dem. Hvis vekstratene og morfologiene til kolonier dannet på TA-plater av noen av konkurrentene ikke tidligere er karakterisert, spred 80 μL av en 10.000 ganger fortynning i saltvann fra prekondisjoneringskolbene på dag 0, når konkurrentene fortsatt er skilt fra hverandre. Undersøk deretter kolonier på disse kontrollplatene etter inkubering ved 37 ° C i 16-24 timer eller lenger.
  5. ALTERNATIV: Dag 1 og 2: Fortsett tredagers konkurranse
    1. For hver konkurranseanalyse replikerer, merk en kolbe fylt med 9,9 ml DM25. Merk kolbene på en måte som unikt identifiserer hvert konkurrentpar, replikasjonsnummeret og dagen for konkurranseanalysen. Merk en ekstra kolbe fylt med 9,9 ml DM25 for å tjene som et tomt.
    2. Ta konkurransekolbene fra dagen før ut av inkubatoren. Undersøk turbiditeten for øye for å verifisere forventet vekst og oppdage forurensning.
    3. Overfør 100 μL fra hver konkurransekolbe til den tilsvarende kolben med ferskt medium til neste konkurransedag.
    4. Plasser de nye konkurransekolbene og blank inn i risteinkubatoren. Inkuber dem ved 37 ° C i 24 ± 1 time med 120 o / min orbital risting over en 1-tommers diameter.
    5. Gjenta trinn 3.5.1-3.5.4 på dag 2 av konkurransen før du fortsetter.
  6. Dag 1 eller 3: Avslutt konkurranse og tallerken for endelig telling
    1. For hver konkurransekolbe, klargjør to reagensrør fylt med 9,9 ml saltvann. Merk dem på en måte som unikt identifiserer hvert konkurrentpar, replikatnummeret og om de er for første eller andre fortynning.
    2. Ta konkurransekolbene ut av inkubatoren. Undersøk deres turbiditet ved øye for å oppdage at de vokste og det var ingen åpenbar forurensning.
    3. Pipette 100 μL fra hver konkurransekolbe inn i det første saltvannsrøret for den replikasjonen. De resulterende rørene inneholder 100 ganger fortynninger av DM25-kulturer.
    4. Vortex hvert 100 ganger fortynningsrør for å blande det grundig og pipette 100 μL til det andre saltvannsrøret for det replikere. De resulterende rørene inneholder 10.000 ganger fortynninger av DM25-kulturer.
    5. Vortex hvert reagensrør som inneholder en 10 000 ganger fortynning grundig og spre 80 μL av det på en TA-plate som beskrevet i trinn 2.10. Merk siden av bunnen av hver plate med paret av stammer som ble blandet, replikasjonsnummeret og "Dag 1" for en en-dags konkurranse eller "Dag 3" for en tre-dagers konkurranse for å indikere at den vil bli brukt til å bestemme den endelige representasjonen av hver konkurrent.
    6. Inkuber TA-platene ved 37 °C og tell Ara−- og Ara+ -koloniene etter vekst som beskrevet i trinn 3.4.8.
      MERK: Hold oversikt over replikasjonsnummeret til hver konkurranseanalyse gjennom alle overføringer og platingtrinn. Forvirrende hvilke endelige og innledende tellinger som samsvarer mellom forskjellige replikatanalyser - selv når de samme to konkurrentene ble blandet i hver enkelt - vil resultere i feil kondisjonsestimater.
  7. Beregning og plott fitness
    1. Hvis du bruker Excel til å beregne og tegne inn relativ kondisjon, laster du ned XLS-regnearket (tilleggsfil 1). Hvis du bruker R, installerer du fitnessR-pakke31 og laster ned CSV-malen (kommadelte verdier) (tilleggsfil 2) eller genererer en ny kopi av denne filen ved å følge instruksjonene i vignetten.
    2. Skriv inn en "overføringsfortynning" på 100 for konkurranseanalysene som utføres i den angitte cellen eller kolonnen i den nedlastede filen. Angi det totale antallet daglige vekstsykluser der konkurrentene ble co-kultivert som "antall overføringer" (f.eks. 3 for en tre-dagers konkurranse).
    3. Skriv inn navnene på hvert konkurrentpar i de angitte cellene eller kolonnene med referansestammen som "konkurrent1" og teststammen eller populasjonen som "konkurrent2".
    4. For hver replikering av konkurranseanalysen, skriv inn de respektive innledende og endelige kolonitellingene i de angitte kolonnene i den nedlastede filen.
    5. Hvis du bruker Excel-regnearket, vil det nå vise gjennomsnittlig relativ kondisjonsverdi og 95 % konfidensgrenser på dette estimatet. Kopier resultatene for ulike kombinasjoner av konkurrenter til et annet ark, og opprett et diagram som oppsummerer resultatene. Hvis du bruker R til å analysere dataene, følger du instruksjonene i vignetten for fitnessR-pakken for å utføre disse beregningene, sender ut en CSV-fil med de beregnede verdiene og plotter resultatene.

Representative Results

Utseende og turbiditet av LTEE-kulturer
På grunn av den lave glukosekonsentrasjonen i DM25 er turbiditeten til fullvoksne LTEE-populasjoner bare knapt synlig i elleve av de tolv kolbene. Ved undersøkelse av LTEE-kulturer ved øye for normal vekst og tegn på forurensning (trinn 1.6), bør hver kolbe som inneholder en LTEE-populasjon sammenlignes side om side med den tomme (figur 3A). Unntaket er populasjon A-3, som utviklet seg til å bruke citrat som en ekstra karbon- og energikilde og derfor når en høyere celletetthet32. Turbiditeten til DM25-kulturer av REL606- og REL607-forfedrestammene ligner på en typisk utviklet populasjon (figur 3B). LTEE-stammer og populasjoner vokser til en høyere tetthet i DM1000 på grunn av den høyere konsentrasjonen av glukose og en mye høyere tetthet i LB (figur 3B). Tettheten av DM25-kulturer av A-3 LTEE-populasjonen er mellomliggende mellom tetthetene av kulturer av REL606 i DM25 og DM1000 (figur 3C).

Figure 3
Figur 3: Utseende av LTEE-kulturer. (A) Flasker som inneholder de tolv LTEE-populasjonene etter 24 timers vekst i DM25 på dagen da eksperimentet nådde 76 253 1/3 generasjoner, er avbildet ved siden av det tomme. (B) Flasker som inneholder kulturer av REL606 og REL607 forfedre dyrket i 24 timer i DM25, DM1000 og LB er avbildet sammen med medieemner. (C) Zoomet inn bilder av de samme kolbene side om side som viser hvordan turbiditeten til A-3-populasjonskolben i DM25 sammenligner med REL606-stamfaren i DM25 og DM1000. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Spektrofotometeravlesninger av de optiske tetthetene ved 600 nm (OD600) av kulturer dyrket i DM25 (trinn 1.7) samsvarer med disse visuelle observasjonene for både LTEE-populasjonene (figur 4A) og deres forfedre (figur 4B). Disse avlesningene kan brukes til å kvantitativt sammenligne og dokumentere vekst når det er mistanke om forurensning eller feil. For målinger av LTEE-populasjonene mellom 76 000 og 76 500 generasjoner fant vi at OD600 av A-3, populasjonen som utviklet seg til å vokse på citrat, var 0,223 i gjennomsnitt (0,218-0,227, 95% konfidensintervall). OD600 i de andre elleve populasjonene var gjennomsnittlig 0,0252 (0,0239-0,0265, 95 % konfidensintervall). Det var liten, men signifikant variasjon i OD600-målinger blant de elleve normalpopulasjonene (F 10,88 = 5,1035, p = 7,5×10−6). LTEE-populasjonene når stasjonær fase etter omtrent 5-6 timers inkubasjon. Hvis de overføres om morgenen, vil veksten være synlig i midten til sen ettermiddag samme dag. Mange arter av mikrober er i stand til å vokse aerobt på citrat. Derfor er økt turbiditet i andre populasjoner enn A-3 sannsynligvis et tegn på forurensning utenfra.

Figure 4
Figur 4: Turbiditet i LTEE-kulturer . (A) Optisk tetthet ved 600 nm (OD600) av de tolv LTEE-populasjonene etter 24-timers vekstsyklus på tre forskjellige dager mellom 76 000 og 76 500 generasjoner av eksperimentet. OD600-verdiene for tre 1 ml alikoter på hver av de tre forskjellige dagene er plottet som punkter. Den gjennomsnittlige OD600-verdien for tre forskjellige alikoter av emnet fra samme dag ble trukket fra disse verdiene. Fylte stolper viser gjennomsnitt. Feilfelt er 95 % konfidensgrenser. (B) OD600 av kulturer av REL606 og REL607 forfedre i DM25, DM1000 og LB. OD600-verdiene til tre 1 ml alikoter på hver av tre forskjellige dager i to separate kulturer for hver tilstand og stamme er plottet som punkter. Den gjennomsnittlige OD600-verdien for tre forskjellige alikoter av emnet fra samme dag ble trukket fra disse verdiene. Fylte stolper viser gjennomsnitt og feilfelt er 95 % konfidensgrenser. Grå skyggelagte områder mellom panelene viser hvordan OD600-aksen skaleres mellom DM25-panelet og DM1000- og LB-panelene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vekst og morfologi av LTEE-kolonier
Når man kontrollerer populasjonene for forurensning ved å legge dem på forskjellige medier (trinn 2.15), danner REL606- og REL607-forfedrene og alle utviklede populasjoner hvite kolonier med gjennomsiktige og noe uregelmessige kanter på agarplater med minimal glukose (MG) (figur 5A). Sammensetningen av MG-agar er den samme som for DM25 som brukes i de daglige LTEE-overføringene, bortsett fra med en høyere konsentrasjon av glukose, slik at de utviklede LTEE-populasjonene ofte danner større kolonier på MG enn forfedrene. På grunn av sin høyere celletetthet i DM25, vil A-3-populasjonen ha flere ganger flere kolonier hvis det samme volumet er belagt for det som for de andre populasjonene, og dette kan begrense størrelsen på koloniene. De vanligste typene forurensende mikrober danner sterke hvite, ugjennomsiktige og perfekt sirkulære kolonier på MG.

På minimal arabinose (MA) agar danner REL607-stamfaren og Ara+ -populasjonene vanligvis alle litt gjennomsiktige hvite kolonier. Dette typiske vekstmønsteret har vedvart for Ara + -populasjonene gjennom 76 000 generasjoner, bortsett fra A + 6, som har utviklet en defekt i vekst på arabinose og ikke lenger danner kolonier på MA (figur 5B). Det er ingen seleksjon for å opprettholde veksten på arabinose under LTEE-overføringene i DM25, så andre Ara + -populasjoner kan også til slutt slutte å danne kolonier på MA-agarplater etter hvert som eksperimentet fortsetter. Med unntak av A-3 danner ikke Ara-populasjonene kolonier på MA-agar , selv om nøye undersøkelser kan avsløre mikrokolonier på grunn av sporstoffer i agar. A-3-populasjonen danner mange små kolonier på MA, da disse cellene kan vokse på citratet som også er tilstede i dette mediet. Forurensningskolonier på MA er sjeldne.

Figure 5
Figur 5: Plating av LTEE-populasjoner for å oppdage forurensning. Fortynninger av REL606- og REL607-forfedrene og de tolv LTEE-populasjonene den dagen eksperimentet nådde 76 026 2/3 generasjoner ble belagt på (A) MG, (B) MA, og (C) TA agarplater og fotografert etter 24 timer og 48 timer. De samme fortynningene ble gjort for alle kulturer, men halvparten så mye volum ble belagt for forfedrene som er beskrevet i protokollen for LTEE-populasjonene, for å redegjøre noe for deres høyere celletettheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

På tetrazolium arabinose (TA) agar forventes REL606-forfederen og alle Ara−-populasjoner å danne røde kolonier, mens REL607-forfederen og alle Ara+-populasjoner generelt skal danne kolonier som er hvite (som kan inkludere lys rosa eller fersken nyanser) (figur 5C). LTEE-forfedrene danner robuste kolonier, som lett kan identifiseres som Ara− og Ara+ på TA-agar innen 16-24 timer. Opprinnelig kunne denne forskjellen brukes til å oppdage krysskontaminering mellom Ara- og Ara+-populasjoner. TA-agar har imidlertid en mer kompleks næringssammensetning enn det kjemisk definerte DM25-mediet som brukes i de daglige overføringene, og det har ikke vært et evolusjonært press for E. coli i LTEE for å opprettholde en evne til å vokse robust under disse forholdene. Følgelig viser noen utviklede LTEE-populasjoner nå dårlig vekst på TA-plater, tar 48 timer å danne kolonier eller ikke pålitelig vokser i det hele tatt. Fargene og morfologiene til kolonier dannet på TA av de utviklede LTEE-populasjonene har også endret seg i forhold til forfedrene og divergert fra hverandre. Tilstedeværelsen av noen få avvikende kolonier er ikke alltid en indikasjon på forurensning. Spontane mutasjoner kan oppstå som bytter Ara-markørtilstanden til LTEE-stammer, spesielt fra Ara + til Ara− på grunn av den høyere sannsynligheten for tap av funksjonsmutasjoner som påvirker arabinoseutnyttelse versus tilbakevendende mutasjoner som gjenoppretter araA-aktivitet. Mutasjoner som bytter Ara-markørtilstander er vanligere i populasjoner som har utviklet hypermutasjon (A-1, A-2, A-3, A-4, A + 3 og A + 6) 13. På TA-agar danner forurensende mikrober av andre arter ofte (men ikke alltid) små, perfekt sirkulære kolonier med røde sentre omgitt av forskjellige hvite grenser som er ulikt de som dannes av noen LTEE-stammer eller populasjoner.

Resultater fra samkulturkonkurransen
Konkurranser mellom alle Ara−- og Ara+-parene til de to LTEE-forfedrene (henholdsvis REL606 og REL607) og A−5- og A+5-populasjonsprøvene arkivert ved 20 000 generasjoner (henholdsvis REL8597 og REL8604) viser hvordan kolonier med forskjellige Ara-markørtilstander kan differensieres og telles på TA-agar (trinn 3.4.8 og 3.6.6) (figur 6). Kolonier ble talt for seks replikatflasker for hvert konkurrentpar før og etter en-dags og tre-dagers analyser som begynte med gjenoppliving i DM1000 (tabell 1). Det totale antallet kolonier observert for samme fortynning og volumbelagt varierer med hvilke konkurrenter som ble blandet fordi kulturer av utviklede LTEE-populasjoner når lavere celletettheter enn kulturer av forfedrestammene i DM25. Denne forskjellen er en konsekvens av utviklingen av økt cellestørrelse, som skjedde i alle LTEE-populasjoner i løpet av de første tusen generasjonene av eksperimentet 8,33.

Figure 6
Figur 6: Konkurranseanalyser belagt på TA-agarplater. Eksempler på TA-agarplater fra konkurranseanalyser. REL606 og REL607 er henholdsvis Ara− og Ara+ forfedrene til LTEE. REL8597 og REL8604 er henholdsvis 20 000 generasjon A-5 og A + 5 populasjoner fra den frosne "fossile posten" av LTEE. TA-plater som tilsvarer en replikatanalyse mellom hvert par stammer vises for dag 0, dag 1 og dag 3 av konkurransen. Platene ble fotografert etter 24 timers vekst ved 37 °C. Cellene til konkurrentene REL606 og REL8597 er Ara− og danner røde kolonier. Cellene til REL607- og REL8604-konkurrentene er Ara + og danner hvite kolonier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

De fleste kolonier på en typisk konkurranseplate vil være godt separert eller overlappe hverandre på måter som det er lett å telle hvor mange i utgangspunktet sirkulære kolonier av forskjellige typer som vokste sammen (figur 7A). Noen situasjoner kan imidlertid oppstå der det ikke er åpenbart hvordan man teller en atypisk koloni eller vekst som er en blanding av de to fargene. For det første, når en hvit Ara+-koloni og en rød Ara−-koloni overlapper hverandre, har Ara+-kolonien en tendens til å gro igjen og omslutte Ara−-kolonien. I denne situasjonen bør man telle en liten rød flekk eller gjennomsiktig "gap" i den større Ara+-kolonien som en Ara−-koloni (figur 7B). For det andre vil spontane Ara+ mutanter av og til oppstå i ara− kolonier. Disse mutantene opptrer vanligvis som hvite sektorer (papiller) som sprer seg raskere ut av det indre av en rød koloni fordi de vokser raskere når de får tilgang til arabinose som et ekstra næringsstoff (figur 7C). Disse koloniene med hvit sektor regnes som én Ara−-koloni og ingen Ara+-kolonier. Denne situasjonen blir mer vanlig hvis platene inkuberes i 48 timer eller lenger. For det tredje observeres noen ganger gjennomsiktige rosa kolonier (figur 7D). Disse dannes av Ara-konkurrenten. Til slutt vokser et lite antall sirkulære kolonier med interiører som er en litt annen nyanse av rødt noen ganger på TA-plater når de er forurenset av noen få utvendige mikrobielle celler under forberedelse av agar eller når de sprer kulturfortynninger på overflatene (figur 7E). Disse forurensningskoloniene skal ikke telles. Hvis det er mistanke om forurensning av en konkurransekultur fordi det er mange atypiske kolonier på noen av TA-platene, bør replikatet utelukkes.

Figure 7
Figur 7: Kanttilfeller påtruffet ved telling av Ara− og Ara+ kolonier på TA-agar. I hvert panel er noen Ara−- og Ara+-kolonier som skal telles, markert med henholdsvis heltrukne røde og svarte piler. Kolonier som ikke skal telles, er angitt med stiplede piler som tilsvarer typen de ser ut til å være. Alle bildene ble tatt etter 24 timers inkubasjon, unntatt i panel C. (A) Eksempler på normale Ara−- og Ara+-kolonier. (B) Eksempler på Ara+-kolonier som vokser over nærliggende Ara−-kolonier, inkludert en som bare så vidt er synlig som et gjennomsiktig gap på utsiden av den hvite kolonien. Tell hvert av disse tilfellene som to kolonier, en av hver type. (C) Eksempler på Ara−-kolonier som gir opphav til Ara+ mutantsektorer. Tell hvert tilfelle som bare en enkelt Ara-koloni. Den hvite sektoren (papilla) som oppstår skyldes en Ara+ mutant som oppstår i kolonien. Det samme feltet av kolonier er vist etter 24 timer, 48 timer og 72 timer vekst. (D) Eksempel på en gjennomsiktig rosa koloni. Regn det som Ara−. (E) Eksempler på kolonier dannet av ekstern forurensning av en mikrobe som ikke er E. coli. Disse er røde, men mindre og perfekt sirkulære med en tydelig hvit grense. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Analyse av kolonitellingene fra disse konkurransene ved hjelp av Excel-regnearket (tilleggsfil 1) eller ved å kjøre fitnessR-pakkefunksjonene i R på kolonitellinger som er lagt inn i CSV-malen (tilleggsfil 2), viser at de to forfedrene ikke kan skilles fra hverandre når det gjelder deres egnethet innenfor analysens presisjon, at både 20 000-generasjons A-5- og A+5-populasjonene er betydelig bedre egnet enn forfedrene, og at ingen av de utviklede populasjonene er signifikant bedre egnet enn den andre (Welchs t-tester, p > 0,05) (figur 8). Presisjonen til det relative kondisjonsestimatet forbedres i tredagerskonkurransene kontra endagskonkurransene for et av de tett matchede parene (REL606 vs. REL607). Presisjonen av disse målingene kan økes ytterligere ved å gjennomføre lengre konkurranser med flere vekstsykluser, hvis ønskelig. Resultatene fra flerdagskonkurranser er imidlertid ikke informative når en konkurrent blir så rikelig i forhold til den andre etter de ekstra konkurransedagene at forholdet mellom de to stammene ikke kan bestemmes nøyaktig fordi det er svært få eller ingen kolonier av den mindre egnede typen å telle. Dette er tilfellet for forfedrenes tredagers konkurranser mot de utviklede 20 000 generasjonspopulasjonene (REL606 vs. REL8604 og REL607 vs. REL8597) (figur 6 og tabell 1).

Tabell 1: Kolonitellinger fra konkurrerende kondisjonsanalyser. Endags- og tredagers konkurranseanalyser med seks replikater ble utført for alle parvise kombinasjoner av to Ara− og de to Ara+ -konkurrentene. REL606 og REL607 er henholdsvis Ara− og Ara+ forfedrene til LTEE. REL8597 og REL8604 er henholdsvis 20.000-generasjons A-5 og A + 5 populasjoner fra den frosne "fossile posten" av LTEE. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 8
Figur 8: Relativ kondisjon målt med konkurranseanalyser. Resultater av en- og tre-dagers konkurranseanalyser mellom LTEE-forfedre og 20 000 generasjon A-5 og A + 5 LTEE-populasjoner. Diagrammet til venstre viser de fire parvise konkurransene som fargekodede dobbelthodede piler. Hver kombinasjon av de to Ara− (røde etikettene) og de to Ara+ (svarte etikettene) konkurrentene ble testet med seks ganger replikasjon. Kolonitellinger fra tabell 1 ble analysert i R ved hjelp av fitnessR-pakken31, og resultatene ble plottet ved hjelp av ggplot2-pakken (versjon 3.4.0)34. Kondisjon vises som konkurrenten pilen i etiketten går mot i forhold til konkurrenten pilen kommer fra (f.eks. REL8604 i forhold til REL606). Relative kondisjonsverdier beregnet fra koloniantallet for hver konkurranseanalyse replikerer (poeng), gjennomsnittlige relative kondisjonsverdier for konkurrentparet (stolper fylt med samme fargekoding som diagrammet) og 95 % konfidensintervaller (feilfelt) vises. Relative kondisjonsverdier kunne ikke bestemmes (N.D.) for de tredagers konkurransene mellom forfedrene og de utviklede populasjonene fordi det var null eller svært få kolonier av forfedrene på dag 3-platene (se tabell 1). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1. Excel-regnearkfil for beregning av relativ kondisjon. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2. Inndatafilmal for kommadelte verdier for beregning av relativ kondisjon i R ved hjelp av fitnessR-pakken. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Langsiktig motstandskraft av LTEE og dens metoder
E. coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) er nå inne i sitt fjerde tiår. For et mikrobielt evolusjonseksperiment av hvilken som helst varighet er det avgjørende å opprettholde et reproduserbart miljø, unngå forurensning, arkivere prøver og måle kondisjon nøyaktig. LTEE demonstrerer flere tidstestede strategier for å oppnå disse målene, inkludert bruk av godt ristede kolber som skaper et homogent miljø og et kjemisk definert vekstmedium som støtter en lav celletetthet. Videre bruker LTEE forfedrestammer som er forskjellige i en genetisk markør som gir en fenotype (kolonifarge) som både er lett screenet og selektivt nøytral i evolusjonsmiljøet. Denne eksperimentelle designfunksjonen gjør det mulig å identifisere intern og ekstern kontaminering og forenkler måling av kondisjon. Imidlertid har ikke alle prosedyrene og sikkerhetstiltakene som har blitt brukt av LTEE siden 1988 vist seg å være like robuste. Noen metoder som var pålitelige da LTEE begynte, har blitt mindre effektive etter hvert som E. coli-populasjonene har utviklet seg. Heldigvis kan disse problematiske metodene nå utvides eller erstattes ved hjelp av teknologier utviklet siden eksperimentets begynnelse.

Oppdage forurensning
Påvisning av forurensning er kritisk for LTEE. Forurensning kan være av to typer: mellom LTEE-populasjoner (krysskontaminering) og med mikrober fra miljøet (ekstern forurensning). For det meste forhindrer forsiktig bruk av aseptiske teknikker og nøye oppmerksomhet under medieforberedelse og de daglige overføringene begge typer forurensning, men de skjer. Tidlig i forsøket kunne plating på TA-agar brukes til å oppdage tilfeller av krysskontaminering fordi overføringer alltid har vekslet mellom Ara− og Ara + populasjoner. Fingeravtrykket av følsomhet og motstand av disse E. coli til visse bakteriofager var også ment å være en designfunksjon som kunne skille LTEE-populasjonene fra vanlige E. coli-laboratoriestammer som kan forurense dem4. Imidlertid har disse genetiske markørene blitt upålitelige etter hvert som eksperimentet har utviklet seg (f.eks. Noen populasjoner danner ikke lenger kolonier på TA-agar)10,35. Heldigvis har populasjonene genetisk divergert da de har opplevd separate evolusjonære historier under forsøket, noe som har skapt nye genetiske markører som nå kan brukes til å oppdage krysskontaminering. For eksempel har hver populasjon utviklet en unik kombinasjon av mutasjoner i pykF- og nadR-genene 14,36,37. Noen ganger forsterker PCR og Sanger-sekvenserer disse to genene for å teste om kolonier med uvanlige morfologier eller farger skyldes krysskontaminering. Etter hvert som kostnadene ved helgenom- og helpopulasjonssekvensering fortsetter å falle, kan rutinemessig sekvensering av LTEE-populasjonene snart være mulig, og dermed presentere nye muligheter til å overvåke dem for tegn på forurensning.

Måling av konkurransedyktig kondisjon
Et annet tilfelle der LTEE har vokst ut av sine opprinnelige metoder, er at kondisjonen til den utviklede E. coli har økt i det eksperimentelle miljøet i en slik grad at man ikke lenger direkte kan måle kondisjonen til dagens populasjoner i forhold til deres forfedre ved hjelp av protokollen beskrevet her. De utviklede populasjonene utkonkurrerer forfedrene i en slik grad at få eller ingen forfedrekolonier gjenstår å telle etter en en-dags konkurranse. En tilnærming for å håndtere denne store kondisjonsforskjellen er å bruke ulike startforhold mellom stammene, og vekte de innledende volumene som blandes mot den mindre spreke konkurrenten (f.eks. 90 μL forfedre og 10 μL utviklet konkurrent). En annen tilnærming er å identifisere en utviklet Ara−-klon som har høyere kondisjon enn LTEE-forfedre, isolere en spontan Ara+ revertant mutant av den ved å velge på MA-agar, og deretter verifisere at revertantstammen har samme kondisjon som foreldrene ved å bruke en konkurranseanalyse 6,38. Dette nye Ara−/Ara+-paret kan deretter brukes som et sett med vanlige konkurrerende stammer i stedet for REL606/REL607. Ideelt sett vil den utviklede Ara−-klonen valgt som en felles konkurrent (og dens Ara+ revertant) ha middels kondisjon i forhold til alle stammer av interesse i et eksperiment. I løpet av de første 50 000 generasjonene av LTEE produserte ikke disse to tilnærmingene (ved bruk av ulike startforhold eller en felles konkurrent) meningsfullt forskjellige kondisjonsmålinger i forhold til den typiske tilnærmingen39.

Disse endringene i konkurranseprotokollen gjør visse forenklende forutsetninger som kanskje ikke alltid er sanne. Det ene er at kondisjonsmålinger er transitive. Det vil si at hvis vi konkurrerer to populasjoner hver mot en felles konkurrentstamme separat, kan vi utlede den relative kondisjonen til de to populasjonene til hverandre. Dette forholdet har vist seg å være sant for LTEE40, for det meste, men det er ikke for andre eksperimenter41. En årsak til dette avviket kan være utviklingen av negative frekvensavhengige kondisjonseffekter. Denne situasjonen oppstår når stammer isolert fra to forskjellige divergerte linjer fra populasjon A-2 av LTEE konkurreres mot hverandre19,42. Hver har en fordel når det er sjeldent, på grunn av kryssfôring, noe som stabiliserer deres sameksistens. Sekvenseringsdata som viser langsiktig sameksistens av linjer med forskjellige sett med mutasjoner antyder at lignende interaksjoner også kan ha oppstått i andre LTEE-populasjoner14,43, selv om det ikke er klart om de er sterke nok til å merkbart endre kondisjonsestimater. Endelig betyr utviklingen av aerob vekst på citrat i populasjon A-3 av LTEE32 at kondisjonen til disse cellene nå inkorporerer bruken av en "privat" ressurs når de konkurreres mot celler som ikke kan bruke citrat, noe som kompliserer tolkningen av disse resultatene. Til tross for disse unntakene har bruken av lav glukosekonsentrasjon og godt rystet miljø utvilsomt forenklet kondisjonssammenligninger mellom LTEE-stammer og populasjoner.

Ved senere generasjoner danner noen av LTEE-populasjonene ikke lenger kolonier på TA-agar, noe som gjør det vanskelig eller umulig å utføre konkurranseeksperimenter ved hjelp av selv modifiserte protokoller10. Alternative metoder som ikke krever kolonivekst kan potensielt brukes til å bestemme den relative representasjonen av to konkurrenter, for eksempel FREQ-seq som bruker neste generasjons sekvensering for å telle andelen avlesninger som inneholder to alternative alleler i en amplikon44. Denne metoden eller en lignende kan potensielt brukes med Ara-allelene eller med nyutviklede mutasjoner, som de i pykF og nadR, versus forfedresekvensen. Å utføre genetiske modifikasjoner som introduserer andre typer nøytrale markører, kan også brukes til å måle relativ kondisjon. For eksempel har fluorescerende proteingener blitt satt inn i kromosomene til celler i LTEE-avleggereksperimenter, slik at konkurrenter kan telles ved hjelp av flowcytometri45. En annen tilnærming, som åpner muligheten for å blande sammen mer enn to stammer i samme konkurransekolbe, er å sette inn strekkoder som kan PCR-forsterkes og sekvenseres i genomene til forskjellige konkurrenter. Denne tilnærmingen har blitt brukt til avstamningssporing i evolusjonseksperimenter46. Både flowcytometri og strekkodesekvensering kan nøyaktig måle mye mer ekstreme forhold mellom to stammer versus kolonitelling (fordi de kan spørre > 10.000 celler / genomer mot < 500 som kan telles på en agarplate), så bruk av disse metodene lover også å øke det dynamiske området når det gjelder kondisjonsforskjeller som kan måles i forhold til en vanlig konkurrent.

Alternative design for langsiktige mikrobielle evolusjonseksperimenter
For alle sine dyder er LTEE ikke perfekt. Visse aspekter av designen gjør den arbeidsintensiv og utsatt for menneskelige feil. For eksempel må en forsker hver dag komme inn i laboratoriet og pipette mellom Erlenmeyer-kolber for å fortsette eksperimentet. Konkurranseeksperimenter kan også utgjøre skremmende logistiske hindringer, gitt at krav til sterilt glass, media, inkubatorplass og kolonitelling raskt eskalerer når selv et lite antall konkurrenter blir testet med beskjeden replikering. Vi blir ofte spurt om hvorfor vi ikke utnytter laboratorieautomatiseringssystemer, for eksempel pipetteringsroboter som opererer på mikroplater med 96 brønner, eller kontinuerlige kultursystemer, som kjemostater eller turbidomstater. Svaret er enkelt: LTEE er på en måte en fange av sin egen lange historie. Vi tør ikke avvike fra 10 ml kulturer som rister med en bestemt hastighet i 50 ml Erlenmeyer-kolber fordi dette ville risikere å endre eksperimentet fundamentalt. Subtile aspekter av miljøet som disse populasjonene har tilpasset seg i flere tiår (f.eks. mengden lufting), vil bli endret i mikroplater eller kontinuerlige kultursystemer. Populasjonens flaskehals ved hver overføring kan også være forskjellig (mindre i mikroplater, for eksempel), noe som endrer evolusjonsdynamikken. Kort sagt, avvik fra metodene beskrevet her ville gjøre LTEE til et annet eksperiment, eller i det minste risikere å introdusere en diskontinuitet som ville forstyrre evolusjonære baner.

Forskere som designer nye evolusjonseksperimenter, bør vurdere disse andre måtene å forplante mikrobielle populasjoner på, samtidig som de er klar over deres potensielle fordeler og ulemper. Bruk av pipetteringsroboter for å overføre populasjoner i mikrobrønnplater er logistisk enklere på noen måter og kan vise seg å være ganske kraftig på grunn av det høye antallet replikerende populasjoner som kan forplantes på denne måten47,48,49. Automatiserte overføringer i de fleste nåværende oppsett skjer imidlertid ikke under helt sterile forhold, noe som øker sannsynligheten for ekstern forurensning. For å forhindre forurensning blir vekstmediet ofte supplert med antibiotika, som blir et trekk ved miljøet som påvirker evolusjonen. Overføringer i mikrobrønnplater er også mer utsatt for krysskontamineringshendelser. Til slutt har miljøet til mikrobrønnplater - spesielt hvis de ikke ristes - en tendens til å velge for veggvekst, aggregering og andre fenomener som kan komplisere utviklingen ved å skape flere nisjer i en brønn. Bruk av rike medier eller høye konsentrasjoner av næringsstoffer for å holde populasjonsstørrelsene store i små brønner vil sannsynligvis forverre disse kompleksitetene. Hvis slike interaksjoner oppstår, kan de gjøre måling og tolking av kondisjon mye vanskeligere.

Kontinuerlige kultursystemer for mikrobiell evolusjon inkluderer kjemostater, hvor friskt medium pumpes kontinuerlig inn og kultur pumpes ut, og turbidostater, hvor kulturer periodisk fortynnes gjennom automatisert sensing og pumping for å opprettholde celler i en tilstand av konstant vekst. Disse systemene er svært nyttige når man ønsker å modellere mikrobiell fysiologi og evolusjon fordi de unngår at mikrober overgår mellom vekst og sult ved å holde dem i et miljø som alltid har næringsstoffer50. Man kan til og med legge til sensorer som gjør sanntidsmålinger av optisk tetthet, O2-forbruk, pH og andre aspekter av en kulturs miljø og vekst. Imidlertid krever nåværende kontinuerlige kultursystemer enten dyre utstyrskjøp eller spesialisert ekspertise for å bygge tilpassede oppsett51,52,53,54. Også veggvekst, der celler unnslipper fortynning ved å feste seg til kulturkammeret, bedevils evolusjonær dynamikk i kontinuerlige kultursystemer med mindre de periodisk steriliseres. På grunn av disse begrensningene har de fleste chemostat- og turbidostat-evolusjonseksperimenter hittil vært av begrenset varighet og/eller involvert relativt få populasjoner under utvikling uavhengig sammenlignet med serieoverføringsevolusjonseksperimenter.

Konklusjon
Metodene vi demonstrerer her for LTEE er avgjørende for å studere sin unike historiske rekord og fortsette den åpne utviklingen av disse E. coli-populasjonene. De gir også et utgangspunkt for andre som vurderer nye evolusjonseksperimenter som kan dra nytte av laboratorieautomatisering eller legge tilbake ulike elementer av kompleksiteten som finnes i naturlige miljøer som bevisst ble utelatt fra LTEE. Siden 1988 har eksperimentell evolusjon blomstret som et felt. I løpet av denne tiden har forskere i laboratorier over hele verden demonstrert den enorme fleksibiliteten i denne tilnærmingen for å studere evolusjon, innovere ved å introdusere kreative eksperimentelle design og overvåke resultatene ved hjelp av ny teknologi. Metodene til LTEE representerer ikke et endepunkt, men vi håper de vil fortsette å inspirere og gi grunnlag for feltet langt inn i fremtiden.

Disclosures

Ingen interessekonflikter oppgitt.

Acknowledgments

Vi takker Richard Lenski og de mange forskerne som har studert og bidratt til å opprettholde Long-Term Evolution Experiment med E. coli, inkludert spesielt Neerja Hajela. LTEE støttes for tiden av National Science Foundation (DEB-1951307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma-Aldrich T8877
20 mL Glass Beaker Sigma-Aldrich CLS100020
50 mL Erlenmeyer Flasks Sigma-Aldrich CLS498050
Agar Sigma-Aldrich A1296
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich AX1385
Antifoam Sigma-Aldrich A5757
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
Freezer Box (2") VWR 82007-142
Freezer Box (3") VWR 82007-144
Freezer Box Cell Divider (49-place) VWR 82007-150
Freezer Box Cell Divider (81-place) VWR 82007-154
Freezer Vials (1/2-Dram) VWR  66009-816 
Freezer Vials (2-Dram) VWR  66010-560 
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glycerol Fisher Scientific G33
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Metal Tray Winco SPJP-202
Petri Dish Fisher Scientific FB0875712
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P5379
Sodium Chloride Sigma-Aldrich M7506
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate Sigma-Aldrich C7254
Test Tube Cap (18mm) VWR 10200-142
Test Tube Rack (18mm, steel) Adamas-Beta N/A Test Tube Racks Stainless Steel Grid Arrangement 72 Holes (17-19 mm)
Test Tubes (18 x 150 mm) VWR 47729-583
Thiamine, Hydrochloride Millipore 5871
Tryptone Gibco 211705
Yeast Extract Gibco 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  2. Fox, J. W., Lenski, R. E. From here to eternity-the theory and practice of a really long experiment. PLoS Biology. 13 (6), e1002185 (2015).
  3. Daegelen, P., Studier, F. W., Lenski, R. E., Cure, S., Kim, J. F. Tracing ancestors and relatives of Escherichia coli B, and the derivation of B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 634-643 (2009).
  4. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12 genomes. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 653-680 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Lenski, R. E. Experimental studies of pleiotropy and epistasis in Escherichia coli. II. Compensation for maladaptive pleiotropic effects associated with resistance to virus T4. Evolution. 42 (3), 425-432 (1988).
  7. Calcott, P. H., Gargett, A. M. Mutagenicity of freezing and thawing. FEMS Microbiology Letters. 10 (2), 151-155 (1981).
  8. Lenski, R. E., Travisano, M. Dynamics of adaptation and diversification: a 10,000-generation experiment with bacterial populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (15), 6808-6814 (1994).
  9. Wiser, M. J., Ribeck, N., Lenski, R. E. Long-term dynamics of adaptation in asexual populations. Science. 342 (6164), New York, N.Y. 1364-1367 (2013).
  10. Lenski, R. E., et al. Sustained fitness gains and variability in fitness trajectories in the long-term evolution experiment with Escherichia coli. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1821), 20152292 (2015).
  11. Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  12. Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
  13. Tenaillon, O., et al. Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment. Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).
  14. Good, B. H., McDonald, M. J., Barrick, J. E., Lenski, R. E., Desai, M. M. The dynamics of molecular evolution over 60,000 generations. Nature. 551 (7678), 45-50 (2017).
  15. Consuegra, J., et al. Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria. Nature Communications. 12 (1), 980-980 (2021).
  16. Cooper, T. F., Rozen, D. E., Lenski, R. E. Parallel changes in gene expression after 20,000 generations of evolution in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (3), 1072-1077 (2003).
  17. Favate, J. S., Liang, S., Cope, A. L., Yadavalli, S. S., Shah, P. The landscape of transcriptional and translational changes over 22 years of bacterial adaptation. eLife. 11, e81979 (2022).
  18. Khan, A. I., Dinh, D. M., Schneider, D., Lenski, R. E., Cooper, T. F. Negative epistasis between beneficial mutations in an evolving bacterial population. Science. 332 (6034), 1193-1196 (2011).
  19. Plucain, J., et al. Epistasis and allele specificity in the emergence of a stable polymorphism in Escherichia coli. Science. 343 (6177), 1366-1369 (2014).
  20. Quandt, E. M., Deatherage, D. E., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Recursive genomewide recombination and sequencing reveals a key refinement step in the evolution of a metabolic innovation in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2217-2222 (2014).
  21. Leon, D., D'Alton, S., Quandt, E. M., Barrick, J. E. Innovation in an E. coli evolution experiment is contingent on maintaining adaptive potential until competition subsides. PLoS Genetics. 14 (4), e1007348 (2018).
  22. Bennett, A. F., Lenski, R. E., Mittler, J. E. Evolutionary adaptation to temperature. I. Fitness responses of Escherichia coli to changes in its thermal environment. Evolution. 46 (1), 16-30 (1992).
  23. Kibota, T. T., Lynch, M. Estimate of the genomic mutation rate deleterious to overall fitness in E. coli. Nature. 381 (6584), 694-696 (1996).
  24. Friesen, M. L., Saxer, G., Travisano, M., Doebeli, M. Experimental evidence for sympatric ecological diversification due to frequency-dependent competition in Escherichia coli. Evolution. 58 (2), 245-260 (2004).
  25. Cooper, T. F. Recombination speeds adaptation by reducing competition between beneficial mutations in populations of Escherichia coli. PLoS Biology. 5 (9), e225 (2007).
  26. Cooper, T. F., Lenski, R. E. Experimental evolution with E. coli in diverse resource environments. I. Fluctuating environments promote divergence of replicate populations. BMC Evolutionary Biology. 10, 11 (2010).
  27. Quan, S., et al. Adaptive evolution of the lactose utilization network in experimentally evolved populations of Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), e1002444 (2012).
  28. Deatherage, D. E., Kepner, J. L., Bennett, A. F., Lenski, R. E., Barrick, J. E. Specificity of genome evolution in experimental populations of Escherichia coli evolved at different temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1904-E1912 (2017).
  29. Izutsu, M., Lake, D. M., Matson, Z. W. D., Dodson, J. P., Lenski, R. E. Effects of periodic bottlenecks on the dynamics of adaptive evolution in microbial populations. BioRixv. , 4457 (2021).
  30. Chavarria-Palma, J. E., Blount, Z. D., Barrick, J. E. LTEE Media Recipes. , (2022).
  31. Barrick, J. E., Lake, D. M. fitnessR: fitnessR-v1.0.0. barricklab. , (2023).
  32. Blount, Z. D., Borland, C. Z., Lenski, R. E. Historical contingency and the evolution of a key innovation in an experimental population of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (23), 7899-7906 (2008).
  33. Grant, N. A., Magid, A. A., Franklin, J., Dufour, Y., Lenski, R. E. Changes in cell size and shape during 50,000 generations of experimental evolution with Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 203 (10), 22 (2021).
  34. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
  35. Meyer, J. R., et al. Parallel changes in host resistance to viral infection during 45,000 generations of relaxed selection. Evolution. 64 (10), 3024-3034 (2010).
  36. Woods, R., Schneider, D., Winkworth, C. L., Riley, M. A., Lenski, R. E. Tests of parallel molecular evolution in a long-term experiment with Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (24), 9107-9712 (2006).
  37. Barrick, J. E., Deatherage, D. E., D'Alton, S. LTEE-Ecoli: genomics resources for the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. , Available from: https://github.com/barricklab/LTEE-Ecoli (2022).
  38. Izutsu, M., Lenski, R. E. Experimental test of the contributions of initial variation and new mutations to adaptive evolution in a novel environment. Frontiers in Ecology and Evolution. 10, 958406 (2022).
  39. Wiser, M. J., Lenski, R. E. A comparison of methods to measure fitness in Escherichia coli. PLoS One. 10 (5), 0126210 (2015).
  40. de Visser, J. A. G. M., Lenski, R. E. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. XI. Rejection of non-transitive interactions as cause of declining rate of adaptation. BMC Evolutionary Biology. 2 (1), 19 (2002).
  41. Paquin, C. E., Adams, J. Relative fitness can decrease in evolving asexual populations of S. cerevisiae. Nature. 306 (5941), 368-371 (1983).
  42. Rozen, D. E., Lenski, R. E. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. VIII. Dynamics of a balanced polymorphism. The American Naturalist. 155 (1), 24-35 (2000).
  43. Quandt, E. M., Gollihar, J., Blount, Z. D., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Fine-tuning citrate synthase flux potentiates and refines metabolic innovation in the Lenski evolution experiment. eLife. 4, e09696 (2015).
  44. Chubiz, L. M., Lee, M. -C., Delaney, N. F., Marx, C. J. FREQ-Seq: a rapid, cost-effective, sequencing-based method to determine allele frequencies directly from mixed populations. PLoS One. 7 (10), e47959 (2012).
  45. Gallet, R., Cooper, T. F., Elena, S. F., Lenormand, T. Measuring selection coefficients below 10-3: method, questions, and prospects. Genetics. 190 (1), 175-186 (2012).
  46. Levy, S. F., et al. Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking. Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).
  47. Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
  48. Frenkel, E. M., et al. Crowded growth leads to the spontaneous evolution of semistable coexistence in laboratory yeast populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (36), 11306-11311 (2015).
  49. Jordt, H., et al. Coevolution of host-plasmid pairs facilitates the emergence of novel multidrug resistance. Nature Ecology and Evolution. 4 (6), 863-869 (2020).
  50. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  51. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and use of multiplexed chemostat arrays). Journal of Visualized Experiments. (72), e50262 (2013).
  52. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  53. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  54. Ekkers, D. M., Branco Dos Santos, F., Mallon, C. A., Bruggeman, F., Van Doorn, G. S. The omnistat: A flexible continuous-culture system for prolonged experimental evolution. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 932-942 (2020).

Tags

Genetikk utgave 198
Daglige overføringer, arkivering av populasjoner og måling av kondisjon i det langsiktige evolusjonseksperimentet med <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrick, J. E., Blount, Z. D., Lake, … More

Barrick, J. E., Blount, Z. D., Lake, D. M., Dwenger, J. H., Chavarria-Palma, J. E., Izutsu, M., Wiser, M. J. Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. J. Vis. Exp. (198), e65342, doi:10.3791/65342 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter