Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Berigelse af mRNA og bisulfit-mRNA biblioteksforberedelse til næste generations sekventering

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65352
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

Denne protokol giver en let at følge arbejdsgang til at udføre poly (A) RNA-oprensning, bisulfitkonvertering og biblioteksforberedelse ved hjælp af standardiseret udstyr til en biologisk prøve af interesse.

Abstract

RNA posttranskriptionelle modifikationer i forskellige typer RNA-transkripter er forbundet med forskellig RNA-regulering i eukaryote celler. Afvigende RNA-5-methylcytosinmodifikationer og den dysregulerede ekspression af RNA-methyltransferaser har vist sig at være forbundet med forskellige sygdomme, herunder kræftformer. Transkriptom-bred bisulfitsekventering blev udviklet til at karakterisere positionerne og de kvantitative cytosinmethyleringsniveauer i det bisulfitkonverterede RNA ved baseparopløsningen. Heri præsenterer denne protokol procedurerne for to runder af poly (A) RNA-oprensning, tre cyklusser af bisulfitreaktion og biblioteksforberedelse i detaljer for at muliggøre transkriptom-dækkende kortlægning af mRNA 5-methylcytosinmodifikationssteder. Vurderingen af RNA-mængde og kvalitet efter hovedreaktionen er afgørende for at overvåge RNA-integritet og er et kritisk skridt for at sikre sekventeringsbiblioteker af høj kvalitet. Ideelt set kan procedurerne afsluttes inden for tre dage. Med denne protokol kan brug af total RNA af høj kvalitet som input praktisk talt opbygge robuste bisulfit-mRNA-biblioteker til næste generations sekventering fra prøven af interesse.

Introduction

Blandt over 150 typer posttranskriptionelle modifikationer1 er 5-methylcytosin (m5C) modifikation blevet identificeret i forskellige typer RNA'er, herunder ribosomalt RNA, overførsels-RNA, messenger-RNA, mikro-RNA, langt ikke-kodende RNA, hvælvings-RNA, forstærker-RNA og små cajal-kropsspecifikke RNA'er2. RNA m 5 C er forbundet med forskellige biologiske og patologiske mekanismer såsom regulering af planterodsudvikling3, viral genekspression4 og kræftprogression5. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe strømlinede rørledninger til karakterisering af den transkriptom-brede mRNA m5C modifikationsprofil af biologiske prøver i forskellige udviklingsstadier eller i sygdomsindstillingen. Transkriptom-dækkende bisulfitsekventering blev udviklet til at karakterisere positionerne og de kvantitative cytosinmethyleringsniveauer i det bisulfitkonverterede RNA ved baseparopløsning 6,7,8,9. Dette er især nyttigt, når man studerer sammenhængen mellem m5C og genekspression og RNA-skæbne, der er involveret i de biologiske reguleringsmekanismer i celler. I pattedyrcellen er der to kendte m 5 C-læsere: ALYREF kan genkende m 5 C ved kernen og fungerer som en mRNA-kerne-til-cytosoltransportør10, mens YBX1 kan genkende m5C i cytoplasmaet og øge mRNA-stabilisering11. Afvigende m5C mRNA'er relateret til immunveje blev rapporteret i systemiske lupus erythematosus CD4+ T-celler12. Undersøgelser har afsløret en sammenhæng mellem mRNA m5C modifikation og modulering af kræftimmunitet og kræftprogression13,14. Derfor kan kortlægning af m5C-modifikationsprofilen på mRNA'et give afgørende information til belysning af det potentielle reguleringsmaskineri.

For at undersøge de funktionelle roller af RNA m5 C-modifikation under visse biologiske betingelser kan de bisulfitkonverteringsbaserede (bsRNA-seq) og antistofaffinitetsberigelsesbaserede tilgange såsom m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq og 5-Aza-seq kombineres med high-throughput sekventeringsplatformen for at give effektiv detektion af målrettede regioner og sekvenser med m5C-modifikationerne på entranskriptom-bred skala15, 16. Fordelen ved denne protokol giver det omfattende RNA m 5C-landskab ved en enkeltbaseopløsning, da den antistofaffinitetsberigelsesbaserede tilgang er afhængig af tilgængeligheden af antistoffer af høj kvalitet og kunne opnå enkeltfragmentopløsningen af m5C methyleringslandskab17.

Alle RNA-prøver behandles med to runder mRNA-berigelse ved hjælp af oligo (dT) perler, tre cyklusser af bisulfitreaktion og sekventeringsbibliotekets forberedelse. For at overvåge RNA-kvaliteten undersøges hver RNA-prøve ved kapillærgelelektroforese før og efter procedurerne for mRNA-oprensning og bisulfitreaktion for at vurdere fragmentfordelingen. De oprensede biblioteker vil blive undersøgt ved deres PCR-amplikonkvaliteter, DNA-størrelsesfordelingsfragmenter ved kapillærgelelektroforese og deres samlede mængder undersøgt ved fluorescensfarvestofferbaserede kvantitative assays inden sekventering. Systemet kan også bruges til at analysere et bredt spektrum af biologiske prøver såsom landbrugsprodukter, isolerede virioner, cellelinjer, modelorganismer og patologiske prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Poly (A) RNA-oprensning

BEMÆRK: Brug det samlede RNA behandlet med DNase I og undersøg den samlede RNA-kvalitet og integritet ved kapillær eller konventionel gelelektroforesevurdering, før du fortsætter til poly (A) RNA-oprensning. Investigatorer bør være i stand til at identificere 28S og 18S rRNA ribosomale bånd i feltet med høj molekylvægt og 5,8S rRNA-båndet i feltet med lav molekylvægt uden signifikante udtværingsbånd i elektroferogrammet. Rensningstrinnene følger i det væsentlige producentens anvisninger med mindre ændringer, der er angivet i de specifikke trin. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer og instrumenter, der anvendes i denne protokol.

  1. Præparation
    1. Opvarm reagenset, vaskebufferen, oligo(dT)-perlerne og lysisbufferen ved stuetemperatur i 30 minutter, før du udfører følgende procedurer.
    2. Til isolering af poly(A)-beriget RNA fremstilles 10-20 μg af en prøve total RNA af høj kvalitet som udgangsmateriale ved at overføre en passende mængde RNA til et nukleasefrit 1,5 ml mikrocentrifugeglas. Inkuber i varmeblokken ved 70 °C i 5 minutter, og hold derefter på is i 2 minutter.
      BEMÆRK: Mængderne af total RNA som udgangsmateriale bør justeres passende afhængigt af den ønskede mængde mRNA og arten af de anvendte celler. Empirisk kan det poly (A) -berigede RNA tegne sig for 1-5% overflod i det samlede RNA. En prøve på 10 μg total RNA af høj kvalitet skulle tilvejebringe poly(A)-beriget RNA af høj kvalitet i området 100-500 ng til nedstrøms bisulfitkonvertering.
    3. I mellemtiden skal du helt suspendere oligo (dT) perlerne. Overfør de nødvendige mængder perleopslæmning til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og sæt det derefter på magneten i 3 minutter, indtil magnetperlerne danner en pellet.
      BEMÆRK: Brug 50 μL oligo (dT) perler til 10 μg total RNA-input. Mængden af perler i dette trin kan optimeres yderligere afhængigt af de anvendte celler.
    4. Supernatanten fjernes, oligo(dT)-perlerne resuspenderes med lige store mængder lysisbuffer (volumen af perleopslæmningen anvendt i trin 1.1.3), og magneten anbringes i 3 minutter, før supernatanten fjernes.
      BEMÆRK: Overtør ikke perlerne; Brugeren skal hurtigt gå videre til trin 1.2.1.
  2. Den første runde af rensning
    1. Tilsæt lysisbuffer til RNA-prøverøret (volumenforhold 4: 1) og bland grundigt, før det overføres til oligo (dT) perlerne.
      BEMÆRK: Hvis RNA-prøvevolumenet er 20 μL, tilsættes 80 μL lysisbuffer.
    2. Resuspender RNA'et: lysisbufferblanding og oligo (dT) perler fuldstændigt ved pipettering af mindst 10x.
    3. Lad prøverne inkubere ved kontinuerlig rotation i 15 minutter ved stuetemperatur.
    4. Prøven anbringes på magneten i 5 min., eller indtil supernatanten er klar. Supernatanten kasseres.
    5. Tilsæt 600 μL vaskebuffer 1 til perlerne og bland forsigtigt for at ophænge perlerne igen.
    6. Anbring tuben på magneten i 5 minutter, eller indtil supernatanten er klar, kassér supernatanten, og gentag vasketrin 1.2.5 én gang.
    7. Vask perlerne ved at tilsætte 300 μL vaskebuffer 2, og ophæng forsigtigt perlerne igen.
    8. Anbring tuben på magneten i 5 minutter, eller indtil supernatanten er klar, kassér supernatanten, og vask trin 1.2.7 gentages én gang.
    9. Der tilsættes 30 μL kold 10 mM Tris-HCl (elueringsbuffer) til prøveglasset og inkuberes ved 70 °C i 5 minutter.
    10. Røret overføres hurtigt til magneten, og når suspensionen er klar efter 20 s eller mere, overføres supernatanten indeholdende elueret poly(A)-beriget RNA til det nye 1,5 ml mikrocentrifugeglas.
  3. Den anden runde af rensning
    1. Der tilsættes 120 μL (4x volumenet af elueret prøve) lysisbuffer til den eluerede RNA-prøve og blandes grundigt.
    2. De perler, der blev anvendt i den første rensningsrunde, vaskes med en tilsvarende mængde lysisbuffer som trin 1.1.4, pipet 10x for at genopslæmme perlerne, og derefter anbringes de på magneten i 5 minutter, før supernatanten kasseres.
    3. Overfør RNA: lysisbufferblandingen til de vaskede perler og bland grundigt ved pipettering mindst 10x.
    4. Prøven inkuberes med kontinuerlig rotation i 15 minutter ved stuetemperatur.
    5. Gentag trin 1.2.4 til 1.2.8 for at fjerne salt og andre RNA-undertyper.
      BEMÆRK: Mængden af vaskebuffer kan reduceres til 300 μL vaskebuffer 1 og 150 μL vaskebuffer 2.
    6. Der tilsættes 25 μL (ønsket volumen) koldt 10 mM Tris-HCl (elueringsbuffer) til prøveglasset og inkuberes ved 70 °C i 5 minutter.
    7. Røret overføres hurtigt til magneten, og når suspensionen er klar efter 20 s eller mere, overføres supernatanten indeholdende elueret poly(A)beriget RNA til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugeglas.
    8. Overfør 2,2 μL til 8-strips rør til kvalitetsvurdering af RNA-mængde og kvalitet ved hjælp af RNA-højfølsomhedsassays.
    9. Prøven opbevares ved -20 °C i korte perioder og -70 °C i længere tid.
      BEMÆRK: Dette kan være et pausepunkt i protokollen.

2. Omdannelse af bisulfit

BEMÆRK: Centrifugeringstrinnene blev alle udført ved stuetemperatur. Procedurerne udføres i det væsentlige i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger, men med et yderligere trin 2.2 til tilføjelse af spike-in kontrol mRNA-sekvens(er) før bisulfitreaktionstrin 2.3.

  1. Overfør 19 μL oprenset poly(A)-beriget RNA-prøve til et 0,2 ml 8-strips rør.
  2. Der tilsættes 1,0 μL spike-in-kontrol, som er fri for ændringer ved det forudbestemte mængdeforhold på 1:10.000 (dvs. 0,1 ng luciferase mRNA: 1 μg oprenset poly(A)beriget RNA) i RNA-prøven i trin 2.1.
    BEMÆRK: Spike-in-kontrolsekvensen kan være Firefly luciferase RNA, Renilla luciferase eller in vitro transkriberet RNA-sekvens uden methylerede cytosiner.
  3. Tilsæt 130 μL konverteringsregent til røret og vend forsigtigt flere gange for grundig blanding.
  4. Anbring røret i PCR-maskinen, og udfør tre cyklusser med opvarmning ved 70 °C i 10 minutter, efterfulgt af inkubation ved 64 °C i 45 minutter hver og derefter et sidste trin for at køle ned til 4 °C.
  5. Søjlen anbringes på opsamlingsrøret, og der overføres 250 μL RNA-bindingsbuffer til kolonnen.
  6. Overfør prøven fra trin 2.4 til kolonnen fra trin 2.5 og pipet grundigt.
  7. Tilsæt 400 μL 95-100% ethanol til søjlen, luk hurtigt hætten og inverter flere gange.
  8. Der centrifugeres ved 10.000 × g i 30 s ved 25 °C, og gennemstrømningen kasseres.
  9. Der tilsættes 200 μL RNA-vaskebuffer til søjlen.
  10. Der centrifugeres ved 10.000 × g i 30 s ved 25 °C, og gennemstrømningen kasseres.
  11. Der tilsættes 200 μL afsulfoneringsbuffer og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
  12. Der centrifugeres ved 10.000 × g i 30 s ved 25 °C, og gennemstrømningen kasseres.
  13. Der tilsættes 400 μL RNA-vaskebuffer og centrifugeres ved 10.000 × g i 30 s ved 25 °C, og gennemstrømningen kasseres. Gentag dette trin én gang.
  14. Der centrifugeres igen ved 10.000 × g i 2 minutter ved 25 °C for at fjerne restvaskebufferen helt.
    BEMÆRK: Det andet centrifugeringstrin 2.14 i 2 minutter før eluering er at fjerne vaskebufferen helt. Vasketrinnet udføres to gange for at vaske komponenten med højt saltindhold ud af bisulfitreagenset og afsulfoneringsbufferen på søjlen.
  15. Overfør søjlen til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  16. Der tilsættes 20-30 μL nukleasefri H2O til søjlen og henstår ved stuetemperatur i 1 min.
  17. Der centrifugeres ved 10.000 × g i 30 s ved 25 °C.
  18. Overfør 2,2 μL til 8-strips rør til vurdering af RNA-mængde og kvalitet.
  19. Den bisulfitbehandlede RNA-prøve opbevares ved -20 °C i korte perioder og -70 °C i længere tid.
    BEMÆRK: Dette kan være et pausepunkt i protokollen.

3. Bisulfitbehandlet mRNA-bibliotekspræparat

BEMÆRK: Følg bibliotekets forberedelsesinstruktionsprotokol afsnit 4 til brug med oprenset mRNA eller rRNA-depleteret RNA. Det første primingtrin bør følge FFPE RNA-protokollen, da bisulfitbehandlingen fragmenterer RNA'et. Udfør hvert trin i laminar flowhætten, og tilsæt reaktionsblandingen på et iskølet kølestativ.

  1. Priming af input-RNA'et
    1. Den ønskede mængde bisulfitbehandlet mRNA-prøve overføres i et samlet maksimum på 5 μL eller tilsættes nukleasefriH2O, så der i alt er 5 μL.
      BEMÆRK: Mindst 10 ng bisulfitbehandlet mRNA som input anbefales til denne type RNA-bibliotekspræparat og til generering af den endelige molaritet af 4nM-biblioteksproduktet.
    2. Der tilsættes 1 μL tilfældig primer (lilla) til prøven og blandes ved pipettering.
    3. Prøveglasset anbringes i den forudindstillede PCR-maskine ved 65 °C og låget ved 105 °C i 5 minutter, og det opbevares ved 4 °C.
  2. Første streng cDNA-syntese
    1. Der tilsættes 4 μL syntesereaktionsbuffer (lilla), 8 μL strengspecificitetsreagens (brun) og 2 μL synteseenzymblanding (brun) til prøven, hvilket giver et samlet volumen på 20 μL. Bland grundigt ved pipettering mindst 10x og drej hurtigt ned.
    2. Prøveglasset anbringes i den forudindstillede PCR-maskine ved 25 °C i 10 minutter, 42 °C i 50 minutter, 70 °C i 15 minutter, og det opbevares ved 4 °C.
      BEMÆRK: For indsatser over 200 baser foreslås en inkubationstid på 42 °C på 50 min. For skærstørrelser under 200 baser foreslås en inkubationstid på 42 °C på 15 min.
  3. Anden streng cDNA-syntese
    1. Der tilsættes 8 μL syntesereaktionsbuffer med dUTP-blanding (orange), 4 μL synteseenzymblanding (orange) og 48 μL NukleasefriH2O. Bland grundigt ved pipettering mindst 10x og drej hurtigt ned.
    2. Prøveglasset anbringes i den forudindstillede PCR-maskine ved 16 °C i 1 time med låget sat af eller ≤40 °C.
  4. Oprensning af dobbeltstrenget cDNA med DNA-oprensningsperler
    1. Forvarm DNA-oprensningsperlerne 30 minutter før rensning og hvirvel for at resuspendere perlerne.
    2. Der tilsættes 144 μL resuspenderede DNA-oprensningsperler til cDNA-prøven fra trin 3.3.2 og blandes grundigt ved pipettering af mindst 10x.
    3. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
    4. Prøveglasset anbringes på et magnetstativ i 5 minutter, indtil opløsningen er klar, hvorefter supernatanten fjernes, og perlerne, der indeholder DNA, opbevares.
    5. Tilsæt 200 μL frisklavet 80% ethanol til røret med perlerne, mens prøven opbevares på magnetstativet og inkuberes ved stuetemperatur i 30 sekunder.
    6. Supernatanten fjernes og trin 3.4.5 gentages én gang, men denne gang fjernes al den resterende supernatant forsigtigt.
    7. Lufttør perlerne i 1-5 min, mens prøven holdes på magneten.
      BEMÆRK: Overtør ikke perlerne; Farven skal være mørkebrun.
    8. Fjern prøven fra magnetstativet og eluer DNA'et ved at tilsætte 53 μL 0,1x TE (10 mM Tris-HCl og 1 mM EDTA, pH 8,0) buffer til perlerne. Bland grundigt ved pipettering mindst 10x og inkuber ved stuetemperatur i 2 min.
    9. Anbring røret på magnetstativet i 5 minutter, eller indtil opløsningen er klar.
    10. 50 μl supernatant indeholdende dobbeltstrenget cDNA overføres til et nyt 8-stripsglas.
      BEMÆRK: Protokollen kan stoppes på dette tidspunkt, og prøven kan opbevares ved -30 °C.
  5. Afslut forberedelse af cDNA-bibliotek
    1. Der tilsættes 7 μL endepoleringsreaktionsbuffer (grøn) og 3 μL endepoleringsenzymblanding (grøn) til den eluerede dobbeltstrengede cDNA-prøve.
    2. Bland blandingen ved pipettering 10x med en 50 μL volumenindstilling uden at skabe bobler, og drej derefter hurtigt prøven ned.
    3. Prøven anbringes i en PCR-maskine og inkuberes ved 20 °C i 30 minutter, 65 °C i 30 minutter, og den opbevares ved 4 °C.
  6. Adaptor ligering
    1. Fortynd adapteren (rød) i henhold til producentens anvisninger.
    2. Der tilsættes 2,5 μL af den fortyndede adapter, 1 μL ligeringsforstærker (rød) og 30 μL Ligation Master Mix (rød) til prøven.
    3. Bland blandingen ved pipettering 10x med en 80 μL volumenindstilling uden at skabe bobler, og drej derefter hurtigt prøven ned.
    4. Prøven anbringes i en PCR-maskine og inkuberes ved 20 °C i 15 minutter.
    5. Der tilsættes 3 μL af blandingen af uracil-DNA-glycosylase og DNA-glycosylase-lyaseendonuklease VIII (blå) til prøven og pipet grundigt.
    6. Prøven anbringes i PCR-maskinen og inkuberes ved 37 °C i 15 minutter med låget indstillet til 75 °C.
  7. Oprensning af ligeringsreaktionsbehandlede cDNA'er
    BEMÆRK: Størrelsesvalget med SPRIselect Beads, eller eventuelt med AMpure XP perler kan begge bruges til dette formål18.
    1. Forvarm perlerne 30 minutter før rensning og hvirvel for at resuspendere dem.
    2. Der overføres 25 μL resuspenderede perler til cDNA-prøven fra trin 3.6.6 og blandes grundigt ved pipettering af mindst 10x.
    3. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
    4. Prøveglasset anbringes på en magnetrist i 5 minutter, indtil opløsningen er klar, hvorefter supernatanten overføres til et nyt 8-stavsrør, og perlerne kasseres.
    5. Der tilsættes 10 μL opslæmmede perler til supernatanten, og der blandes grundigt med pipettering på mindst 10x.
    6. Prøveglasset anbringes på en magnetrist i 5 minutter, indtil opløsningen er klar, og supernatanten kasseres derefter, og perlerne må ikke forstyrres.
    7. Tilsæt 200 μL frisklavet 80% ethanol til røret med perlerne, mens prøven opbevares på magnetstativet og inkuberes ved stuetemperatur i 30 sekunder.
    8. Supernatanten fjernes og trin 3.7.7 gentages én gang, men denne gang fjernes al den resterende supernatant forsigtigt.
    9. Lufttør perlerne i 1-5 min, mens prøven holdes på magneten.
      BEMÆRK: Overtør ikke perlerne; Farven skal være mørkebrun.
    10. Fjern prøven fra magnetstativet og eluer DNA'et ved at tilføje 17 μL 0,1x TE-buffer til perlerne. Bland grundigt ved pipettering mindst 10x og inkuber ved stuetemperatur i 2 min.
    11. Placer røret på magnetstativet i 5 minutter, indtil opløsningen er klar.
    12. Der overføres 15 μL supernatant, som indeholder dsDNA fremstillet af målgavlen, til et nyt 8-stavsrør.
  8. PCR-berigelse af adaptor-ligeret DNA
    1. Tilsæt 25 μL mastermix (blå), 5 μL 5' adapterprimer og 5 μL af 3'-adapterprimeren til den adapterligerede DNA-prøve. Bland grundigt ved pipettering af mindst 10x.
    2. Prøven anbringes i PCR-maskinen, og PCR-forstærkningen udføres ved hjælp af følgende trin: 1) 98 °C i 30 s, 2) 98 °C i 10 s, 3) 65 °C i 75 s, 4) 65 °C i 5 minutter og 5) fastholdes ved 4 °C; hvor trin (2) og (3) gentages for et N+2-cyklusnummer, hvor N er lig med RNA-inputmængden i brugsanvisningen. Dette betyder, at der er behov for yderligere 2 cyklusser på grund af det dobbeltsidede størrelsesvalg af prøver, der udføres i trin 3.7.
      BEMÆRK: For eksempel anbefales 8 ng af det rensede mRNA-input med 9-10 cyklusser PCR; men med dobbeltsidet, størrelsesvalgt, ligeret cDNA i trin 3.7 ville den anbefalede PCR-cyklus være 11-12 cyklusser.
  9. Oprensning af PCR-forstærkede biblioteker
    1. Forvarm DNA-oprensningsperlerne i 30 minutter, før du udfører rensningen og hvirvlen for at resuspendere perlerne.
    2. Overfør 45 μL (0,9x) resuspenderede perler til PCR-produktet fra trin 3.8.2 og bland grundigt ved pipettering af mindst 10x.
    3. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
    4. Prøveglasset anbringes på et magnetstativ i 5 minutter, indtil opløsningen er klar, hvorefter supernatanten fjernes, og perlerne, der indeholder DNA, opbevares.
    5. Tilsæt 200 μL frisklavet 80% ethanol til røret med perlerne, lad prøven stå på magnetstativet og lad den stå ved stuetemperatur i 30 s.
    6. Supernatanten fjernes og trin 3.9.5 gentages én gang, men denne gang fjernes al den resterende supernatant forsigtigt.
    7. Lufttør perlerne i 1-5 min, mens prøven holdes på magneten.
      BEMÆRK: Overtør ikke perlerne; Farven skal være mørkebrun.
    8. Tag prøven ud af magnetstativet og tilsæt 22 μL 0,1x TE-buffer til perlerne for at eluere DNA'et. Bland grundigt ved pipettering mindst 10x og inkuber ved stuetemperatur i 2 min.
    9. Anbring røret på magnetstativet, og lad det stå i 5 minutter, eller indtil opløsningen er klar ved stuetemperatur.
    10. 20 μL supernatant overføres til et nyt 8-stavsglas.
    11. Overfør 2,2 μL til 8-bånds rør til kvalitetsvurdering af bibliotekets kvantitet og kvalitet.
      BEMÆRK: Bibliotekets mængde kan også detekteres ved qPCR (se materialetabellen).
    12. BsRNA-seq-biblioteksprøven opbevares ved -20 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En række bsRNA-seq-biblioteker fra cellelinjer19 blev genereret ved at følge procedurerne i denne rapport (figur 1). Efter total RNA-oprensning ledsaget af DNase-behandling udført på cellelinjeprøver og kvaliteten kontrolleret ved gelelektroforese og UV-Vis-spektrofotometri (A260/A280) kan RNA-prøven fortsætte til poly(A) RNA-berigelse. For at afgøre, om dobbeltoprensningen kunne fjerne størstedelen af ribosomalt RNA, blev oprensningseffektiviteten af poly(A)RNA vurderet ved kapillærelektroforese total RNA-analyse, der automatisk kan beregne rRNA-forureningsprocenten (figur 2). Fra RNA-fragmentets topmønster og rRNA-kontamineringsprocent viste RNA-prøver med to gange oprensning faktisk nedsat forurening af ribosomalt RNA fra 6,5% til 2,2% og 2,6% til 1,1% i henholdsvis AsPC-1 og BxPC-3. Med humane cellelinjer for kræft i bugspytkirtlen kunne to runder perlerensning nå et gennemsnit på 2,8 ± 1% poly (A) -berigede RNA-mængder fra de samlede RNA-prøver. Derfor minimerede poly (A) RNA-berigelsen med oligo (dT) perler med dobbelt oprensningstrin ribosomalt RNA og repræsenterer en mulig mRNA-prøveberigelse til nedstrømseksperimenterne.

Bisulfitkonverteringsprotokollerne var blevet rapporteret i flere undersøgelser af RNA-5-methylcytosinmodifikation (tabel 1). Bisulfitreaktionen kunne udføres med en brugerrekonstitueret reaktionsblanding bestående af 40 % natriumbisulfit og 600 mM hydroquinon i vandig opløsning (pH 5,1) ved 75 °C i 4 timer10,20,21. Alternativt kan en strengere bisulfitbehandling af RNA-prøve også udføres med et kommercielt kit; som i en række undersøgelser fra andre og vores 6,22,23,24 forlængede bisulfitreaktionstiden til tre inkubationscyklusser. Da trecyklusinkubationstrinnet effektivt konverterer umethyleret cytosin i in vitro-transkriberet og strukturelt mere foldet Escherichia coli 16S rRNA-segment8, blev trecyklusinkubationstrinnet også anvendt i denne protokol.

Med to gange poly(A)-berigelse og trecyklusbisulfitkonvertering blev RNA-kvaliteten før og efter reaktionen vurderet ved kapillærelektroforese. RNA-størrelsesfordelingen efter bisulfitbehandlingen viste et højdepunkt på ~ 200-500 nukleotider på grund af fragmentering forårsaget af bisulfitreaktionen (figur 3). Derudover er det fragmenterede bsRNA ideelt til biblioteksforberedelse uden behov for at udføre endnu et fragmenteringstrin. I alt 8-10 ng bsRNA som input blev brugt til at konstruere biblioteket i henhold til denne protokol ved at bruge 9 til 11 cyklusser i den endelige PCR-amplifikation af adapterligeret DNA. Amplikonens kapillærelektroforese viste en ganske vellykket biblioteksforberedelse, med kun en lille del af primeren tilbage og ingen top af overforstærkning (figur 4). For at kontrollere konverteringseffektiviteten i hvert prøvebibliotek blev det umethylerede firefly luciferase RNA som en spike-in kontrolsekvens tilsat til prøven, før bisulfitbehandlingen blev udført. Efter at sekventeringen var justeret til referencesekvensen ved hjælp af meRanTK-værktøjssæt25, blev gennemsnittet på 2.440 (0,006%) af de samlede læsninger kortlagt til spike-in-sekvensen, og den samlede analyserede C-til-T-konverteringsfrekvens nåede et gennemsnit på 99,81%; status kan ses i Integrated Genomics Viewer (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Workflowdiagram over bisulfit mRNA-sekventering. Rørledningen består af tre hovedprotokoller, herunder mRNA-berigelse, bisulfitkonvertering og biblioteksforberedelse. Forkortelse: bsRNA = bisulfit mRNA; QC. = kvalitetskontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kvalitetskontrolresultater af poly(A)-berigede RNA-prøver med kapillærelektroforese. (A) Den repræsentative kapillærelektroforeseprofil for det totale RNA fra BxPC-3-celler. B ) De repræsentative kapillærelektroforeseprofiler af prøver behandlet med oligo(dT)-oprensning fra AsPC-1- og BxPC-3-celler. mRNA E1, mRNA-eluering fra engangsrensning; mRNA E2, mRNA-eluering fra to-timers oprensning. RNA-forureningsestimaterne blev beregnet af elektroforeseoperationssystemet, der styrer det samlede RNA-analyseassay. (C) Stigemarkørernes kapillærelektroforeseprofil blev opnået i samme serie med prøver præsenteret i panel B. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kvalitetsvurdering af RNA-prøver ved kapillærelektroforese. De repræsentative kapillærelektroforeseprofiler af (A) det totale RNA, (B) det poly(A)-berigede mRNA fra to gange oprensning og (C) det bisulfitbehandlede mRNA fra BxPC-3-cellerne. Forkortelser: B_empty = BxPC-3-celler transduceret med tom vektor; B_shScr = BxPC-3-celler transduceret med scramble-sekvenserne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Kvalitetsvurdering af bsRNA-seq-biblioteker. (A-C) Tre sæt repræsentative kapillærelektroforeseprofiler af konstruerede bsRNA-seq-biblioteker forstærket af PCR ved forskellige PCR-cyklusnumre på 9 og 11 cyklusser ved anvendelse af bsRNA fra et sæt BxPC-3-celler. Den estimerede inputmængde af det bisulfitbehandlede RNA blev bestemt ved et højsensitivt RNA-kvantificeringsassay. I alt 8, 8,4 og 9,6 ng bsRNA blev anvendt i henholdsvis (A) BxPC-3 mock, (B) BxPC-3 tom og (C) BxPC-3 shN2UN2 prøver. Stigemarkøren topper ved 35 bp, og 10.380 bp repræsenterer de interne standarder for den nedre og øvre grænse i elektroforeseprofilen for hver prøve. En fremtrædende top på henholdsvis omkring 100 bp og en uklar top på omkring 127 bp indikerer PCR-primerne (<100 bp) og adapter-dimeren (~ 127 bp), som forblev i eluatet efter PCR-oprydning. Forkortelser: BxPC-3 mock = utransducerede BxPC-3 celler; BxPC-3 tom = BxPC-3-celler transduceret med den tomme vektorkontrol; BxPC-3 shN2UN2 = BxPC-3-celler transduceret med shNSUN2-konstruktionerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Sekvensjusteringsprofilerne for hvert bsRNA-seq-bibliotek kortlagt til spike-in-control-referencesekvensen. De repræsentative justeringsprofiler for BxPC-3 mock, empty, scramble og shNSUN2 bsRNA-seq-bibliotekerne til firefly luciferase spike-in kontrolreferencesekvensen (angivet som "Z" genet); 2 repræsentative regioner blev vist. Grå bjælker angiver alle aflæsninger, der præsenterer matchede konsensusnukleotider ved den angivne basisposition til referencesekvensen. Røde bjælker fremhæver thymidin (T) identiteten ved basispositionen af læsningerne; blå søjler angiver de aflæsninger, der har cytosin (C) identitet på positionen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Sammenligning af bisulfitreaktionsprotokoller og konverteringsfrekvensen. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol blev en detaljeret pipeline af poly (A) berigelse, bisulfitkonvertering og biblioteksforberedelse opnået ved at anvende standardiserede komponenter. Yderligere sekventeringsanalyse tilvejebragte identifikation af mRNA 5-methylcytosin i prøver af interesse.

Det kritiske trin er kvaliteten af udgangsmaterialet - total RNA - da nedbrydningen af RNA ville påvirke genvindingshastigheden for poly (A) RNA-oprensning. Prøven skal håndteres omhyggeligt, og RNase-kontaminering undgås, før poly(A)RNA-oprensningstrinnet udføres. En anden afgørende del af proceduren er antallet af PCR-cyklusser i biblioteksforberedelse. Beslutningen af cyklusnummer afhænger af mængden af bisulfitbehandlet mRNA, der anvendes til biblioteksforberedelse, og om brugen af en størrelsesudvælgelse eller dobbelt størrelsesvalg i trinnet før PCR. De passende cyklusnumre for den pågældende prøve vil således kræve en prøvekørsel og vurdere fordelingen af PCR-produktstørrelsen ved kapillærelektroforese for at bestemme det optimale cyklusnummer for den samme cellelinje eller det samme væv.

I denne protokol blev to runder af oligo (dT) perlerensning brugt til at berige og rense poly (A) RNA og eliminerede et flertal af ribosomale RNA'er og andre RNA'er. Der er andre metoder til at fjerne ribosomalt RNA og holde andre RNA-typer i prøven, såsom oligobaseret udtømning af rRNA26. Derefter kan 5-methylcytosinmodifikationen, der er til stede i andre RNA-typer, også tages i analyse og udvide forståelsen af 5-methylcytosinegenskaber i mRNA og andre RNA'er.

Bisulfitreaktion er kendt for ikke at kunne skelne m 5 Cfra andre modifikationer, herunder 5-hydroxymethylcytosin (hm5C), 3-methylcytidin (m3C) og N4-methylcytidin (m4C) 27. Det eksperimentelle design, herunder m 5 C RNA methyltransferase knockdown eller knockout bør imidlertid give informativ dokumentation for højt konfidensreguleredem5C steder. Desuden kan validering ved hjælp af forskellige metoder såsom antistofbaseret berigelse efterfulgt af sekventering eller PCR- eller LC-MS/MS-baserede metoder i det væsentlige autentificere kandidat m5C-lokaliteterne16. Den nye teknik til direkte nanopore RNA-sekventering giver også potentiel identifikation af RNA-modifikation via beregningsanalysen af det aktuelle signal eller base-kaldet 'fejl' funktioner28,29,30.

En nylig undersøgelse af Johnson et al. viste, at tilføjelse af fragmenteringstrinnet i mitokondrier RNA-prøver efter tre runder bisulfitkonvertering faktisk viste en højere konverteringshastighed og øgede udbyttet af cDNA-biblioteksprodukt31. Dette papir analyserede specifikt konverteringsfrekvensen og læser kvalitet kortlagt til mitokondriegenomet, ikke mRNA-transkriptomet. Derfor er brugen af fragmenteringstrinnet blevet opdateret i tabel 1 for at fremhæve, om de offentliggjorte rapporter indeholdt et RNA-fragmenteringstrin, så seerne let kan replikere protokollen. En anden undersøgelse af Zhang et al. viste, at anvendelse af in vitro transkriberet modifikationsfrit RNA-bibliotek som en negativ kontrol er effektiv til at eliminere det falsk-positive signal fra bisulfitbehandling32. Nylige undersøgelser har sammenlignet forskellige protokoller, der anvendes til biblioteksbyggeri33. Brugeren kan yderligere vælge at udføre bsRNA-seq-pipeline med eller uden et yderligere fragmenteringstrin og in vitro transkriberet modifikationsfrit RNA-bibliotek for at tilpasse passende arbejdsgang.

Den transkriptom-dækkende identifikation af m5C ved forskellige principper kunne styrke resultaterne af modifikationslandskaberne og give mere forståelse af reguleringsmekanismerne for RNA-modifikationer i sunde eller sygdomsmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Science and Technology Council of Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System Agilent, Santa Clara, CA RNA quality detection
AMpure XP beads Beckman Coulter A63881 purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-4626 DNA quality detection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-1513 RNA quality detection
DiaMag02 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000001 assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000003 assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 61011 poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol J.T.Baker 64-17-5
EZ RNA methylation kit Zymo, Irvine, CA R5002 bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA Promega, Madison, WI, USA L4561 spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification Kits Roche, Switzerland KK4824 library quantification
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) New England Biolabs, Ipswich, MA E7335S library preparation
NEBNext Ultra Equation 1 Directional RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs, Ipswich, MA E7760S library preparation
Nuclease-free Water Thermo Fisher Scientific AM9932
P2 pipetman Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4641010
Qubit 2.0 fluorometer  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32854 DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32852 RNA quantity detection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
  2. Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102 (2019).
  3. Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959 (2023).
  4. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  5. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
  6. Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
  7. Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
  8. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
  9. Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40 (2020).
  10. Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606 (2017).
  11. Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
  12. Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430 (2020).
  13. Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15 (2022).
  14. Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43 (2020).
  15. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
  16. Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
  17. Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231 (2020).
  18. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).
  19. Chen, S. -Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
  20. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  21. Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
  22. Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
  23. Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
  24. Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
  25. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
  26. Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281 (2019).
  27. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602 (2013).
  28. Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
  29. Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198 (2021).
  30. Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
  31. Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045 (2022).
  32. Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
  33. Chao, H. -P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).

Tags

MRNA-berigelse bisulfit-mRNA-biblioteksforberedelse næste generations sekventering RNA-posttranskriptionelle modifikationer RNA-regulering eukaryote celler RNA-5-methylcytosinmodifikationer RNA-methyltransferaser sygdomme kræft transkriptom-bred bisulfitsekventering cytosinmethyleringsniveauer poly (a) RNA-oprensning bisulfitreaktion biblioteksforberedelse MRNA 5-methylcytosinmodifikationssteder RNA-kvantitet og kvalitetsvurdering RNA-integritetsovervågning høj kvalitet Sekvensering af biblioteker
Berigelse af mRNA og bisulfit-mRNA biblioteksforberedelse til næste generations sekventering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment … More

Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (197), e65352, doi:10.3791/65352 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter