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Biology

Enriquecimiento de la biblioteca de ARNm y bisulfito-ARNm para la secuenciación de nueva generación

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65352
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo fácil de seguir para llevar a cabo la purificación del ARN poli(A), la conversión de bisulfito y la preparación de bibliotecas utilizando equipos estandarizados para una muestra biológica de interés.

Abstract

Las modificaciones postranscripcionales del ARN en varios tipos de transcripciones de ARN se asocian con una regulación diversa del ARN en las células eucariotas. Se ha demostrado que las modificaciones aberrantes del ARN 5-metilcitosina y la expresión desregulada de las metiltransferasas de ARN están asociadas con diversas enfermedades, incluidos los cánceres. Se desarrolló la secuenciación de bisulfito en todo el transcriptoma para caracterizar las posiciones y los niveles cuantitativos de metilación de citosina en el ARN convertido en bisulfito a la resolución de pares de bases. En este documento, este protocolo presenta los procedimientos de dos rondas de purificación de ARN poli(A), tres ciclos de reacción de bisulfito y la preparación de la biblioteca en detalle para permitir el mapeo de todo el transcriptoma de los sitios de modificación del ARNm 5-metilcitosina. La evaluación de la cantidad y calidad del ARN después de la reacción principal es esencial para controlar la integridad del ARN y es un paso crítico para garantizar bibliotecas de secuenciación de alta calidad. Lo ideal es que los procedimientos se puedan completar en tres días. Con este protocolo, el uso de ARN total de alta calidad como entrada puede crear bibliotecas robustas de bisulfito-ARNm para la secuenciación de próxima generación a partir de la muestra de interés.

Introduction

Entre los más de 150 tipos de modificaciones postranscripcionales1, se ha identificado la modificación de la 5-metilcitosina (m5C) en varios tipos de ARN, incluidos el ARN ribosómico, el ARN de transferencia, el ARN mensajero, el micro ARN, el ARN largo no codificante, el ARN de bóveda, el ARN potenciador y los ARN pequeños específicos del cuerpocajal 2. El ARN m 5 C se asocia con diversos mecanismos biológicos y patológicos, como la regulación del desarrollo radicular de las plantas3, la expresión génica viral4 y la progresión del cáncer5. El objetivo de este protocolo es proporcionar canales optimizados para caracterizar el perfil de modificación de ARNm m5C de todo el transcriptoma de muestras biológicas en diferentes etapas de desarrollo o en el entorno de la enfermedad. Se desarrolló la secuenciación de bisulfito en todo el transcriptoma para caracterizar las posiciones y los niveles cuantitativos de metilación de citosina en el ARN convertido en bisulfito a una resolución de pares de bases 6,7,8,9. Esto es particularmente útil cuando se estudia la asociación de m5C con la expresión génica y el destino del ARN que está involucrado en los mecanismos de regulación biológica en las células. En la célula de mamífero, hay dos lectores de m 5 C conocidos: ALYREF puede reconocer m 5 C en el núcleo y sirve como transportador de núcleo de ARNm a citosol10, mientras que YBX1 puede reconocer m5C en elcitoplasma y aumentar la estabilización del ARNm11. Se reportaron ARNm aberrantes m5C relacionados con vías inmunes en células T CD4+ de lupus eritematoso sistémico12. Los estudios han revelado una asociación entre la modificación del ARNmm 5C y la modulación de la inmunidad contra el cáncer y la progresión del cáncer13,14. Por lo tanto, el mapeo del perfil de modificación de m5C en el ARNm puede proporcionar información crucial para dilucidar la posible maquinaria reguladora.

Para investigar las funciones funcionales de la modificación delARN m 5 C en determinadas condiciones biológicas, los enfoques basados en la conversión de bisulfito (bsRNA-seq) y basados en el enriquecimiento de la afinidad de anticuerpos, como m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq y 5-Aza-seq, pueden combinarse con la plataforma de secuenciación de alto rendimiento para proporcionar una detección eficiente de regiones y secuencias diana con las modificaciones m5C a escala de todo el transcriptoma15, 16. La ventaja de este protocolo proporciona el panorama completo de ARN m 5 C con una resolución de una sola base, ya que el enfoque basado en el enriquecimiento de afinidad de anticuerpos se basa en la disponibilidad de anticuerpos de alta calidad y podría lograr la resolución de unsolo fragmento del panorama de metilación de m5C17.

Todas las muestras de ARN se procesarán con dos rondas de enriquecimiento de ARNm utilizando perlas de oligo(dT), tres ciclos de reacción de bisulfito y la preparación de la biblioteca de secuenciación. Para controlar la calidad del ARN, cada muestra de ARN se examinará mediante electroforesis en gel capilar antes y después de los procedimientos de purificación del ARNm y reacción de bisulfito para evaluar la distribución de los fragmentos. Las bibliotecas purificadas se examinarán por sus cualidades de amplicón de PCR, fragmentos de distribución de tamaño de ADN mediante electroforesis en gel capilar y sus cantidades totales se examinarán mediante ensayos cuantitativos basados en colorantes de fluorescencia antes de la secuenciación. El sistema también se puede utilizar para analizar un amplio espectro de muestras biológicas, como productos agrícolas, viriones aislados, líneas celulares, organismos modelo y especímenes patológicos.

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Protocol

1. Purificación de ARN poli(A)

NOTA: Utilice el ARN total tratado con DNasa I y examine la calidad e integridad del ARN total mediante la evaluación de electroforesis en gel capilar o convencional antes de proceder a la purificación del ARN poli(A). Los investigadores deberían ser capaces de identificar las bandas ribosómicas de ARNr 28S y 18S en el campo de alto peso molecular y la banda de ARNr 5,8S en el campo de bajo peso molecular sin ninguna banda de frotis significativa en el electroferograma. Los pasos de purificación siguen esencialmente las instrucciones del fabricante con pequeñas modificaciones indicadas en los pasos específicos. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo.

  1. Preparación
    1. Caliente el reactivo, el tampón de lavado, las perlas de oligo(dT) y el tampón de lisis a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de realizar los siguientes procedimientos.
    2. Para el aislamiento de ARN enriquecido con poli(A), prepare 10-20 μg de una alícuota de ARN total de alta calidad como material de partida transfiriendo una cantidad adecuada de ARN a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml libre de nucleasa. Incubar en el bloque de calor a 70 °C durante 5 min, luego mantener en hielo durante 2 min.
      NOTA: Las cantidades de ARN total como material de partida deben ajustarse adecuadamente en función de la cantidad deseada de ARNm y de la naturaleza de las células utilizadas. Empíricamente, el ARN enriquecido con poli(A) puede representar una abundancia del 1-5% en el ARN total. Una alícuota de 10 μg de ARN total de alta calidad debe proporcionar ARN enriquecido con poli(A) de alta calidad en el rango de 100-500 ng para la conversión posterior de bisulfito.
    3. Mientras tanto, vuelva a suspender completamente las perlas de oligo(dT). Transfiera las cantidades requeridas de suspensión de perlas a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, luego colóquelo en el imán durante 3 minutos hasta que las perlas magnéticas formen un gránulo.
      NOTA: Utilice 50 μL de góligo (dT) para 10 μg de entrada total de ARN. El volumen de las cuentas en este paso podría optimizarse aún más dependiendo de las celdas utilizadas.
    4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas de oligo(dT) con cantidades iguales (el volumen de la suspensión de perlas utilizado en el paso 1.1.3.) de tampón de lisis y colóquelas en el imán durante 3 min antes de retirar el sobrenadante.
      NOTA: No seque demasiado las cuentas; El usuario debe proceder rápidamente al paso 1.2.1.
  2. La primera ronda de purificación
    1. Agregue tampón de lisis al tubo de muestra de ARN (relación de volumen 4:1) y mezcle bien antes de transferirlo a las perlas de oligo(dT).
      NOTA: Si el volumen de la muestra de ARN es de 20 μL, agregue 80 μL de tampón de lisis.
    2. Vuelva a suspender la mezcla de tampón de lisis de ARN y las perlas de oligo(dT) por completo pipeteando al menos 10 veces.
    3. Deje que las muestras se incuben con rotación continua durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    4. Coloque la muestra en el imán durante 5 minutos o hasta que el sobrenadante esté claro; Deseche el sobrenadante.
    5. Agregue 600 μL de tampón de lavado 1 a las perlas y mezcle con cuidado para volver a suspender las perlas.
    6. Coloque el tubo en el imán durante 5 minutos o hasta que el sobrenadante esté claro, deseche el sobrenadante y repita el paso de lavado 1.2.5 una vez.
    7. Lave las perlas añadiendo 300 μL de tampón de lavado 2 y vuelva a suspenderlas suavemente.
    8. Coloque el tubo en el imán durante 5 minutos o hasta que el sobrenadante esté claro, deseche el sobrenadante y repita el paso de lavado 1.2.7 una vez.
    9. Añadir 30 μL de Tris-HCl frío 10 mM (tampón de elución) al tubo de muestra e incubar a 70 °C durante 5 min.
    10. Transfiera rápidamente el tubo al imán y, cuando la suspensión esté limpia después de 20 s o más, transfiera el sobrenadante que contiene ARN enriquecido con poli(A) eluido al nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  3. La segunda ronda de purificación
    1. Agregue 120 μL (4 veces el volumen de la muestra eluida) de tampón de lisis a la muestra de ARN eluido y mezcle bien.
    2. Lave las perlas utilizadas en la primera ronda de purificación con una cantidad igual de tampón de lisis que en el paso 1.1.4, pipetee 10 veces para volver a suspender las perlas y luego colóquelas en el imán durante 5 minutos antes de desechar el sobrenadante.
    3. Transfiera la mezcla de tampón de ARN: lisis a las perlas lavadas y mezcle bien pipeteando al menos 10 veces.
    4. Incubar la muestra con rotación continua durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    5. Repita los pasos 1.2.4 a 1.2.8 para eliminar la sal y otros subtipos de ARN.
      NOTA: El volumen del tampón de lavado se puede reducir a 300 μL del tampón de lavado 1 y a 150 μL del tampón de lavado 2.
    6. Añadir 25 μL (volumen deseado) de 10 mM de Tris-HCl frío (tampón de elución) al tubo de muestra e incubar a 70 °C durante 5 min.
    7. Transfiera rápidamente el tubo al imán y, cuando la suspensión esté limpia después de 20 s o más, transfiera el sobrenadante que contiene ARN enriquecido con poli(A) eluido a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    8. Transfiera 2,2 μL a tubos de 8 tiras para evaluar la calidad de la cantidad y calidad del ARN mediante ensayos de alta sensibilidad de ARN.
    9. Almacenar la muestra a -20 °C durante períodos cortos y a -70 °C durante un período más largo.
      NOTA: Este puede ser un punto de pausa en el protocolo.

2. Conversión de bisulfito

NOTA: Todos los pasos de centrifugación se realizaron a temperatura ambiente. Los procedimientos se realizan esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero con un paso adicional 2.2 para añadir la(s) secuencia(s) de ARNm de control de espiga antes del paso 2.3 de la reacción del bisulfito.

  1. Transfiera 19 μL de muestra de ARN enriquecido con poli(A) purificado a un tubo de 8 tiras de 0,2 mL.
  2. Agregue 1,0 μL de control de espiga, que esté libre de cualquier modificación en la proporción de cantidad predeterminada de 1:10.000 (es decir, 0,1 ng de ARNm de luciferasa: 1 μg de ARN enriquecido con poli(A) purificado) en la muestra de ARN del paso 2.1.
    NOTA: La secuencia de control de la espiga puede ser ARN luciferasa de luciérnaga, luciferasa Renilla o secuencia de ARN transcrita in vitro sin citosinas metiladas.
  3. Agregue 130 μL de regente de conversión al tubo e invierta suavemente varias veces para una mezcla completa.
  4. Coloque el tubo en la máquina de PCR y realice tres ciclos de calentamiento a 70 °C durante 10 minutos, seguidos de la incubación a 64 °C durante 45 minutos cada uno y luego un paso final para enfriar a 4 °C.
  5. Coloque la columna en el tubo de recolección y transfiera 250 μL de tampón de unión de ARN a la columna.
  6. Transfiera la muestra del paso 2.4 a la columna del paso 2.5 y pipetee bien.
  7. Agregue 400 μL de etanol al 95-100% a la columna, cierre rápidamente la tapa e invierta varias veces.
  8. Centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C y desechar el flujo.
  9. Añadir 200 μL de tampón de lavado de ARN a la columna.
  10. Centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C y desechar el flujo.
  11. Añadir 200 μL de tampón de desulfonación e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
  12. Centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C y desechar el flujo.
  13. Añadir 400 μL de tampón de lavado de ARN y centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C y desechar el flujo. Repita este paso una vez.
  14. Centrifugar de nuevo a 10.000 × g durante 2 min a 25 °C para eliminar completamente el tampón de lavado residual.
    NOTA: El otro paso de centrifugación 2.14 durante 2 minutos antes de la elución es eliminar completamente el tampón de lavado. El paso de lavado se realiza dos veces para lavar el componente con alto contenido de sal del reactivo de bisulfito y el tampón de desulfonación en la columna.
  15. Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  16. Añadir 20-30 μL de H2O libre de nucleasa a la columna y dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 min.
  17. Centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C.
  18. Transferir 2,2 μL a tubos de 8 tiras para la evaluación de la cantidad y calidad del ARN.
  19. Almacenar la muestra de ARN tratada con bisulfito a -20 °C durante períodos cortos y a -70 °C durante un período más largo.
    NOTA: Este puede ser un punto de pausa en el protocolo.

3. Preparación de la biblioteca de ARNm tratada con bisulfito

NOTA: Siga la sección 4 del protocolo de instrucciones de preparación de la biblioteca para su uso con ARNm purificado o ARN agotado con ARNr. El primer paso de cebado debe seguir el protocolo de ARN FFPE ya que el tratamiento con bisulfito fragmenta el ARN. Realice cada paso en la campana de flujo laminar y agregue la mezcla de reacción en una rejilla de enfriamiento enfriada con hielo.

  1. Cebado del ARN de entrada
    1. Transfiera la cantidad deseada de muestra de ARNm tratada con bisulfito en un total máximo de 5 μL o agregue H2O libre de nucleasa para hacer un total de 5 μL.
      NOTA: Se recomienda un mínimo de 10 ng de ARNm tratado con bisulfito como entrada para este tipo de preparación de la biblioteca de ARN y para generar la molaridad final del producto de la biblioteca de 4 nM.
    2. Añadir 1 μL de cebador aleatorio (lila) a la muestra y mezclar mediante pipeteo.
    3. Coloque el tubo de muestra en la máquina de PCR preajustada a 65 °C y tape a 105 °C durante 5 minutos y manténgalo a 4 °C.
  2. Síntesis de ADNc de primera cadena
    1. Agregue 4 μL de tampón de reacción de síntesis (lila), 8 μL de reactivo de especificidad de hebra (marrón) y 2 μL de mezcla de enzimas de síntesis (marrón) a la muestra, lo que hace un volumen total de 20 μL. Mezcle bien pipeteando al menos 10 veces y gire rápidamente.
    2. Coloque el tubo de muestra en la máquina de PCR preajustado a 25 °C durante 10 minutos, 42 °C durante 50 minutos, 70 °C durante 15 minutos y manténgalo a 4 °C.
      NOTA: Para insertos de más de 200 bases, se sugiere un período de incubación de 50 min a 42 °C; para un tamaño de plaquita inferior a 200 bases, se sugiere un período de incubación de 15 min a 42 °C.
  3. Síntesis de ADNc de segunda cadena
    1. Agregue 8 μL de tampón de reacción de síntesis con la mezcla de dUTP (naranja), 4 μL de mezcla de enzimas de síntesis (naranja) y 48 μL de H2O sin nucleasa. Mezcle bien pipeteando al menos 10 veces y gire rápidamente.
    2. Coloque el tubo de muestra en la máquina de PCR preajustada a 16 °C durante 1 h con la tapa puesta o ≤40 °C.
  4. Purificación de ADNc bicatenario con perlas de purificación de ADN
    1. Precaliente las perlas de purificación de ADN durante 30 minutos antes de realizar la purificación y el vórtice para volver a suspender las perlas.
    2. Añadir 144 μL de perlas de purificación de ADN resuspendidas a la muestra de ADNc del paso 3.3.2 y mezclar bien pipeteando al menos 10 veces.
    3. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Coloque el tubo de muestra en una rejilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución esté clara y luego, retire el sobrenadante y guarde las perlas que contienen ADN.
    5. Añadir 200 μL de etanol al 80% recién hecho al tubo con las perlas manteniendo la muestra en la gradilla magnética e incubar a temperatura ambiente durante 30 s.
    6. Retire el sobrenadante y repita el paso 3.4.5 una vez, pero esta vez retire con cuidado todo el sobrenadante residual.
    7. Seque las perlas al aire durante 1-5 minutos mientras mantiene la muestra en el imán.
      NOTA: No seque demasiado las cuentas; El color debe ser marrón oscuro.
    8. Retire la muestra de la gradilla magnética y eluya el ADN añadiendo 53 μL de tampón 0,1x TE (10 mM de Tris-HCl y 1 mM de EDTA, pH 8,0) a las perlas. Mezclar bien pipeteando al menos 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
    9. Coloque el tubo en la rejilla magnética durante 5 minutos o hasta que la solución esté clara.
    10. Transfiera 50 μL de sobrenadante que contenga ADNc bicatenario a un nuevo tubo de 8 tiras.
      NOTA: El protocolo se puede detener en este punto y la muestra se puede almacenar a -30 °C.
  5. Preparación final de la biblioteca de ADNc
    1. Agregue 7 μL de tampón de reacción de pulido final (verde) y 3 μL de mezcla de enzimas de pulido final (verde) a la muestra de ADNc bicatenario eluido.
    2. Mezcle la mezcla pipeteando 10 veces con un ajuste de volumen de 50 μL sin crear burbujas, luego gire rápidamente la muestra.
    3. Coloque la muestra en una máquina de PCR e incube a 20 °C durante 30 min, 65 °C durante 30 min y manténgala a 4 °C.
  6. Ligadura de adaptadores
    1. Divida el adaptador (rojo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Agregue 2,5 μL del adaptador diluido, 1 μL de potenciador de ligadura (rojo) y 30 μL de Mezcla Maestra de Ligadura (rojo) a la muestra.
    3. Mezcle la mezcla pipeteando 10 veces con un ajuste de volumen de 80 μL sin crear burbujas, luego gire rápidamente la muestra.
    4. Colocar la muestra en una máquina de PCR e incubar a 20 °C durante 15 min.
    5. Añadir 3 μL de la mezcla de uracilo ADN glicosilasa y ADN glicosilasa-liasa endonucleasa VIII (azul) a la muestra y pipetear bien.
    6. Vuelva a colocar la muestra en la máquina de PCR e incube a 37 °C durante 15 min con la tapa ajustada a 75 °C.
  7. Purificación de ADNc tratados con reacción de ligadura
    NOTA: La selección de tamaño con las cuentas SPRIselect o, opcionalmente, con las cuentas AMpure XP se pueden utilizar para este propósito18.
    1. Precalienta las perlas 30 min antes de realizar la purificación y el vórtice para volver a suspenderlas.
    2. Transfiera 25 μL de perlas resuspendidas a la muestra de ADNc del paso 3.6.6 y mezcle bien pipeteando al menos 10 veces.
    3. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Coloque el tubo de muestra en una rejilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución esté clara y luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 8 tiras y deseche las perlas.
    5. Añadir 10 μL de perlas resuspendidas al sobrenadante y mezclar bien pipeteando al menos 10 veces.
    6. Coloque el tubo de muestra en una rejilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución esté clara y luego deseche el sobrenadante y no altere las perlas.
    7. Añadir 200 μL de etanol al 80% recién hecho al tubo con las perlas manteniendo la muestra en la gradilla magnética e incubar a temperatura ambiente durante 30 s.
    8. Retire el sobrenadante y repita el paso 3.7.7 una vez, pero esta vez retire con cuidado todo el sobrenadante residual.
    9. Seque las perlas al aire durante 1-5 minutos mientras mantiene la muestra en el imán.
      NOTA: No seque demasiado las cuentas; El color debe ser marrón oscuro.
    10. Retire la muestra de la gradilla magnética y eluya el ADN añadiendo 17 μL de tampón TE 0,1x a las perlas. Mezclar bien pipeteando al menos 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
    11. Coloque el tubo en la rejilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución esté clara.
    12. Transfiera 15 μL de sobrenadante, que contiene dsDNA preparado para el extremo diana, a un nuevo tubo de 8 tiras.
  8. Enriquecimiento por PCR de ADN ligado por adaptador
    1. Agregue 25 μL de mezcla maestra (azul), 5 μL de cebador adaptador 5' y 5 μL de cebador adaptador 3' a la muestra de ADN ligada al adaptador. Mezcle bien pipeteando al menos 10 veces.
    2. Coloque la muestra en la máquina de PCR y realice la amplificación por PCR siguiendo los siguientes pasos: (1) 98 °C durante 30 s, (2) 98 °C durante 10 s, (3) 65 °C durante 75 s, (4) 65 °C durante 5 min y (5) mantener a 4 °C; en el que los pasos (2) y (3) deben repetirse para un número de ciclo N + 2 donde N es igual a la cantidad de entrada de ARN en el manual de instrucciones. Esto significa que se necesitan 2 ciclos adicionales debido a la selección del tamaño de las muestras de doble cara realizada en el paso 3.7.
      NOTA: Por ejemplo, se recomendarían 8 ng de la entrada de ARNm purificado con 9-10 ciclos de PCR; pero con ADNc ligado de doble cara y tamaño seleccionado en el paso 3.7, el ciclo de PCR recomendado sería de 11-12 ciclos.
  9. Purificación de librerías amplificadas por PCR
    1. Precaliente las perlas de purificación de ADN durante 30 minutos antes de realizar la purificación y el vórtice para volver a suspender las perlas.
    2. Transfiera 45 μL (0,9x) de perlas resuspendidas al producto de PCR del paso 3.8.2 y mezcle bien pipeteando al menos 10 veces.
    3. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Coloque el tubo de muestra en una rejilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución esté clara y luego retire el sobrenadante y conserve las perlas que contienen ADN.
    5. Añadir 200 μL de etanol al 80% recién hecho al tubo con las perlas, dejar la muestra en la gradilla magnética y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 s.
    6. Retire el sobrenadante y repita el paso 3.9.5 una vez, pero esta vez retire con cuidado todo el sobrenadante residual.
    7. Seque las perlas al aire durante 1-5 minutos mientras mantiene la muestra en el imán.
      NOTA: No seque demasiado las cuentas; El color debe ser marrón oscuro.
    8. Retire la muestra de la rejilla magnética y agregue 22 μL de tampón TE 0.1x a las perlas para eluir el ADN. Mezclar bien pipeteando al menos 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
    9. Coloque el tubo en la rejilla magnética y déjelo reposar durante 5 minutos o hasta que la solución esté clara a temperatura ambiente.
    10. Transfiera 20 μL de sobrenadante a un nuevo tubo de 8 tiras.
    11. Transfiera 2,2 μL a tubos de 8 tiras para evaluar la calidad de la cantidad y calidad de la biblioteca.
      NOTA: La cantidad de la biblioteca también se puede detectar mediante qPCR (consulte la Tabla de materiales).
    12. Almacene la muestra de la biblioteca bsRNA-seq a -20 °C.

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Representative Results

Se generaron una serie de bibliotecas de bsRNA-seq a partir de las líneas celulares19 siguiendo los procedimientos de este informe (Figura 1). Después de la purificación total del ARN acompañada del tratamiento con DNasa realizado en muestras de líneas celulares y la calidad comprobada por electroforesis en gel y espectrofotometría UV-Vis (A260/A280), la muestra de ARN puede proceder al enriquecimiento de poli(A) ARN. Para determinar si la doble purificación podría eliminar la mayor parte del ARN ribosómico, se evaluó la eficiencia de purificación del ARN poli(A) mediante un ensayo de ARN total por electroforesis capilar que puede calcular automáticamente el porcentaje de contaminación del ARNr (Figura 2). A partir del patrón de pico de fragmentos de ARN y el porcentaje de contaminación por ARNr, las muestras de ARN con doble purificación mostraron una disminución de la contaminación del ARN ribosómico del 6,5% al 2,2% y del 2,6% al 1,1% en AsPC-1 y BxPC-3, respectivamente. Con las líneas celulares de cáncer de páncreas humano, dos rondas de purificación de perlas podrían alcanzar un promedio de 2,8 ± 1% de abundancia de ARN enriquecido con poli(A) a partir del total de muestras de ARN. Por lo tanto, el enriquecimiento de ARN poli(A) mediante perlas de oligo(dT) con pasos de purificación dobles minimizó el ARN ribosómico y representa un enriquecimiento factible de muestras de ARNm para los experimentos posteriores.

Los protocolos de conversión de bisulfito han sido reportados en varios estudios sobre la modificación del ARN 5-metilcitosina (Tabla 1). La reacción de bisulfito se puede realizar con una mezcla de reacción reconstituida por el usuario que consiste en un 40% de bisulfito de sodio y 600 mM de hidroquinona en la solución acuosa (pH 5,1) a 75 °C durante 4 horas10,20,21. Alternativamente, también se puede realizar un tratamiento más estricto con bisulfito de la muestra de ARN con un kit comercial; que en una serie de estudios de otros y del nuestro 6,22,23,24 extendió el tiempo de reacción del bisulfito a tres ciclos de incubación. Dado que el paso de incubación de tres ciclos convierte eficientemente la citosina no metilada en el segmento8 del ARNr de Escherichia coli 16S transcrito in vitro y estructuralmente más plegado, el paso de incubación de tres ciclos también se aplicó en este protocolo.

Con el doble de enriquecimiento de poli(A) y la conversión de bisulfito de tres ciclos, la calidad del ARN antes y después de la reacción se evaluó mediante electroforesis capilar. La distribución del tamaño del ARN después del tratamiento con bisulfito mostró un pico de ~200-500 nucleótidos debido a la fragmentación causada por la reacción del bisulfito (Figura 3). Además, el bsRNA fragmentado es ideal para la preparación de bibliotecas sin necesidad de realizar otro paso de fragmentación. Se utilizó un total de 8-10 ng de bsRNA como entrada para construir la biblioteca de acuerdo con este protocolo mediante el uso de 9 a 11 ciclos en la amplificación final por PCR del ADN ligado al adaptador. La electroforesis capilar del amplicón mostró una preparación bastante exitosa de la biblioteca, con solo una pequeña porción de cebador restante y sin pico de sobreamplificación (Figura 4). Para comprobar la eficiencia de conversión en cada biblioteca de muestras, se añadió a la muestra el ARN de luciferasa de luciferasa no metilada como secuencia de control de espiga antes de realizar el tratamiento con bisulfito. Después de que las lecturas de secuenciación se alinearon con la secuencia de referencia utilizando los kits de herramientas meRanTK25, el promedio de 2,440 (0.006%) de las lecturas totales se asignaron a la secuencia de pico, y la tasa de conversión total de C a T analizada alcanzó un promedio de 99.81%; el estado se puede ver en Integrated Genomics Viewer (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo de trabajo de la secuenciación del ARNm de bisulfito. La canalización consta de tres protocolos principales, que incluyen el enriquecimiento de ARNm, la conversión de bisulfito y la preparación de bibliotecas. Abreviatura: bsRNA = ARNm de bisulfito; QC. = Control de calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados del control de calidad de muestras de ARN enriquecidas con poli(A) con electroforesis capilar. (A) El perfil representativo de electroforesis capilar del ARN total de las células BxPC-3. (B ) Los perfiles representativos de electroforesis capilar de muestras procesadas con purificación de oligo(dT) de células AsPC-1 y BxPC-3. ARNm E1, elución de ARNm a partir de purificación única; ARNm E2, elución de ARNm a partir de purificación biplejista. Las estimaciones de contaminación por ARNr se calcularon mediante el sistema de operación de electroforesis que controla el ensayo de análisis de ARN total. (C) El perfil de electroforesis capilar de los marcadores Ladder se obtuvo en la misma corrida con muestras presentadas en el panel B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación de la calidad de las muestras de ARN mediante electroforesis capilar. Los perfiles representativos de electroforesis capilar de (A) el ARN total, (B) el ARNm enriquecido con poli(A) de dos veces la purificación y (C) el ARNm tratado con bisulfito de las células BxPC-3. Abreviaturas: B_empty = células BxPC-3 transducidas con vector vacío; B_shScr = células BxPC-3 transducidas con las secuencias de mezcla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Evaluación de la calidad de las bibliotecas bsRNA-seq. (A-C) Tres conjuntos de perfiles representativos de electroforesis capilar de bibliotecas bsRNA-seq construidas amplificadas por PCR a diferentes números de ciclo de PCR de 9 y 11 ciclos utilizando bsRNA de un conjunto de células BxPC-3. La cantidad estimada de entrada del ARN tratado con bisulfito se determinó mediante un ensayo de cuantificación de ARN de alta sensibilidad. Se utilizaron un total de 8, 8,4 y 9,6 ng de bsRNA en las muestras (A ) BxPC-3 simuladas, ( B) BxPC-3 vacías y (C) BxPC-3 shN2UN2, respectivamente. El marcador de escalera alcanza un máximo de 35 pb y los 10.380 pb representan los estándares internos del límite inferior y superior en el perfil de electroforesis de cada muestra. Un pico prominente de alrededor de 100 pb y un pico oscuro de alrededor de 127 pb, respectivamente, indican los cebadores de PCR (<100 pb) y el dímero-adaptador (~127 pb), que permanecieron en el eluido después de la limpieza de la PCR. Abreviaturas: BxPC-3 mock = células BxPC-3 no transducidas; BxPC-3 vacía = Células BxPC-3 transducidas con el control de vector vacío; BxPC-3 shN2UN2 = células BxPC-3 transducidas con las construcciones shNSUN2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Los perfiles de alineación de secuencia de cada biblioteca bsRNA-seq asignados a la secuencia de referencia de pico en control. Los perfiles representativos de alineación de las bibliotecas bsRNA-seq simuladas, vacías, codificadas y shNSUN2 de BxPC-3 con la secuencia de referencia de control de la espiga de luciferasa de luciérnaga de luciérnaga (indicada como el gen "Z"); Se mostraron 2 regiones representativas. Las barras grises indican todas las lecturas que presentan nucleótidos de consenso coincidentes en la posición de base indicada para la secuencia de referencia. Las barras rojas resaltan la identidad de timidina (T) en la posición base de las lecturas; las barras azules indican aquellas lecturas que tienen la identidad de citosina (C) en la posición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparación de los protocolos de reacción de bisulfito y la tasa de conversión. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

En este protocolo, se logró una línea detallada de enriquecimiento de poli(A), conversión de bisulfito y preparación de bibliotecas mediante la utilización de componentes estandarizados. Un análisis de secuenciación adicional proporcionó la identificación de ARNm 5-metilcitosina en muestras de interés.

El paso crítico es la calidad del material de partida (ARN total), ya que la degradación del ARN afectaría la tasa de recuperación de la purificación del ARN poli(A). La muestra debe manipularse con cuidado y evitarse la contaminación por ARNasa antes de realizar el paso de purificación del ARN poli(A). Otra parte crucial del procedimiento es el número de ciclos de PCR en la preparación de la biblioteca. La decisión del número de ciclo depende de la cantidad de ARNm tratado con bisulfito utilizada para la preparación de la biblioteca y de si se utiliza una selección de tamaño o de doble tamaño en el paso anterior a la PCR. Por lo tanto, los números de ciclo adecuados para la muestra de interés requerirían una prueba y evaluar la distribución del tamaño del producto de PCR mediante electroforesis capilar para determinar el número de ciclo óptimo para la misma línea celular o tejido.

En este protocolo, se utilizaron dos rondas de purificación de perlas de oligo(dT) para enriquecer y purificar el ARN poli(A) y eliminar la mayoría de los ARN ribosómicos y otros ARN. Existen otros métodos para eliminar el ARN ribosómico y mantener otros tipos de ARN en la muestra, como la depleción del ARNr26 basada en oligonucleótidos. Luego, la modificación de la 5-metilcitosina presente en otros tipos de ARN también se puede tener en cuenta en el análisis y ampliar la comprensión de las características de la 5-metilcitosina en el ARNm y otros ARN.

La reacción del bisulfito es conocida por no ser capaz de distinguir m 5 C de otras modificaciones, incluyendo la 5-hidroximetilcitosina(hm5C), 3-metilcitidina (m3C) y N4-metilcitidina (m4C)27. Sin embargo, el diseño experimental queincluye la eliminación o eliminación de la metiltransferasa m 5 C del ARN debería proporcionar evidencia informativa de sitios m5C regulados de alta confianza. Además, la validación mediante diferentes métodos, como el enriquecimiento basado en anticuerpos seguido de secuenciación o PCR o métodos basados en LC-MS/MS, podría autenticar esencialmente los sitios candidatos m5C16. La técnica emergente de secuenciación directa de ARN de nanoporos también proporciona una identificación potencial de la modificación del ARN a través del análisis computacional de la señal actual o las características de "error" llamadas bases28,29,30.

Un estudio reciente de Johnson et al. mostró que agregar el paso de fragmentación en muestras de ARN de mitocondrias después de tres rondas de conversión de bisulfito mostró una mayor tasa de conversión y aumentó el rendimiento del producto de la biblioteca de ADNc31. Este artículo analizó específicamente la tasa de conversión y lee la calidad asignada al genoma de las mitocondrias, no al transcriptoma de ARNm. Por lo tanto, el uso del paso de fragmentación se ha actualizado en la Tabla 1 para resaltar si los informes publicados incluían un paso de fragmentación de ARN para que los espectadores puedan replicar fácilmente el protocolo. Otro estudio realizado por Zhang et al. demostró que la utilización de una biblioteca de ARN sin modificación transcrita in vitro como control negativo es eficiente para eliminar la señal falsa positiva del tratamiento con bisulfito32. Estudios recientes han comparado diferentes protocolos utilizados para la construcción de bibliotecas33. Además, el usuario puede optar por realizar una canalización de secuenciación de bsRNA con o sin un paso de fragmentación adicional y una biblioteca de ARN transcrita in vitro sin modificaciones para personalizar el flujo de trabajo adecuado.

La identificación de m5C en todo el transcriptoma mediante diferentes principios podría fortalecer los hallazgos de los paisajes de modificación y proporcionar una mayor comprensión de los mecanismos reguladores de las modificaciones del ARN en modelos sanos o enfermos.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo contó con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System Agilent, Santa Clara, CA RNA quality detection
AMpure XP beads Beckman Coulter A63881 purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-4626 DNA quality detection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-1513 RNA quality detection
DiaMag02 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000001 assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000003 assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 61011 poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol J.T.Baker 64-17-5
EZ RNA methylation kit Zymo, Irvine, CA R5002 bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA Promega, Madison, WI, USA L4561 spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification Kits Roche, Switzerland KK4824 library quantification
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) New England Biolabs, Ipswich, MA E7335S library preparation
NEBNext Ultra Equation 1 Directional RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs, Ipswich, MA E7760S library preparation
Nuclease-free Water Thermo Fisher Scientific AM9932
P2 pipetman Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4641010
Qubit 2.0 fluorometer  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32854 DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32852 RNA quantity detection

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Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (197), e65352, doi:10.3791/65352 (2023).

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