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Biology

次世代シーケンシングのためのmRNAおよび亜硫酸水素-mRNAライブラリー調製の濃縮

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/65352
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

Summary

このプロトコルは、目的の生物学的サンプルに対して標準化された装置を使用して、ポリ(A)RNA精製、重亜硫酸塩変換、およびライブラリ調製を行うためのわかりやすいワークフローを提供します。

Abstract

様々なタイプのRNA転写物におけるRNA転写後修飾は、真核細胞における多様なRNA制御と関連している。RNAの5-メチルシトシン修飾の異常とRNAメチルトランスフェラーゼの発現異常は、がんを含むさまざまな疾患と関連していることが示されています。トランスクリプトームワイドの亜硫酸水素塩基配列決定は、塩基対の分解能で亜硫酸水素バイサルファイト変換RNAの位置と定量的シトシンメチル化レベルを特徴付けるために開発されました。本明細書では、このプロトコルは多(A) RNAの浄化の2つの円形、重亜硫酸塩の反作用の3周期、およびmRNA 5-methylcytosineの修正の場所のトランスクリプトーム広い地図を描くことを可能にするために図書館の準備のプロシージャを詳しく示す。主反応後のRNAの量と質の評価は、RNAの完全性をモニターするために不可欠であり、高品質のシーケンシングライブラリを確保するための重要なステップです。理想的には、手続きは3日以内に完了することができます。このプロトコルでは、高品質のトータルRNAをインプットとして使用することで、目的のサンプルから次世代シーケンシング用の堅牢な亜硫酸水素-mRNAライブラリを実際に構築できます。

Introduction

150種類以上の転写後修飾1のうち、5-メチルシトシン(m5C)修飾は、リボソームRNA、トランスファーRNA、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、長鎖ノンコーディングRNA、ボールトRNA、エンハンサーRNA、低分子カハール体特異的RNAなど、さまざまな種類のRNAで同定されています2。RNAm5Cは、植物の根の発生3、ウイルスの遺伝子発現4、癌の進行5の調節など、多様な生物学的および病理学的メカニズムと関連している。このプロトコルの目的は、異なる発生段階または疾患設定における生物学的サンプルのトランスクリプトームワイドmRNA m5C修飾プロファイルを特徴付けるための合理化されたパイプラインを提供することです。トランスクリプトームワイドの亜硫酸バイサルファイトシーケンシングは、塩基対の分解能6、7、8、9で亜硫酸水素バイサルファイト変換RNAの位置と定量的シトシンメチル化レベルを特徴付けるために開発されました。これは、細胞内の生物学的調節機構に関与する遺伝子発現およびRNA運命とのm5Cの会合を研究する場合に特に有用である。哺乳類細胞において、2つの既知のm5Cリーダーがある:ALYREFは核でm5Cを認識することができ、mRNA核から細胞質へのトランスポーター10として機能し、一方YBX1は細胞質中のm5Cを認識し、mRNA安定化を増大させることができる11。免疫経路に関連する異常なm5C mRNAは、全身性エリテマトーデスCD4 + T細胞で報告されました12。研究により、mRNA m5C修飾とがん免疫の調節とがんの進行との関連が明らかになりました13,14。したがって、mRNA上のm5C修飾プロファイルをマッピングすることは、潜在的な調節機構を解明するための重要な情報を提供することができます。

特定の生物学的条件下でのRNA m5C修飾の機能的役割を調査するために、m5C-RIP-seq、miCLIP-seq、および5-Aza-seqなどの亜硫酸バイサルファイト変換ベース(bsRNA−seq)および抗体アフィニティーエンリッチメントベースのアプローチをハイスループットシーケンシングプラットフォームと組み合わせて、トランスクリプトームワイドスケールでm5C修飾による標的領域および配列の効率的な検出を提供することができる15、16。このプロトコルの利点は、抗体親和性濃縮ベースのアプローチが高品質の抗体の入手可能性に依存し、m5Cメチル化ランドスケープの単一フラグメント分解能を達成できるため、包括的なRNAm5Cランドスケープを単一塩基分解能で提供する17。

すべての RNA サンプルは、オリゴ (dT) ビーズを使用した 2 回の mRNA 濃縮、3 サイクルの重亜硫酸反応、およびシーケンシング ライブラリの調製で処理されます。RNAの品質を監視するために、各RNAサンプルは、mRNA精製および亜硫酸水素反応の手順の前後にキャピラリーゲル電気泳動によって検査され、フラグメント分布を評価します。精製されたライブラリは、PCRアンプリコンの品質、キャピラリーゲル電気泳動によるDNAサイズ分布フラグメント、およびシーケンシング前の蛍光色素ベースの定量アッセイによって検査されたそれらの全体的な量によって検査されます。また、農産物、単離されたビリオン、細胞株、モデル生物、病理標本など、幅広い生体試料の解析にも使用できます。

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Protocol

1. ポリ(A)RNA精製

注:ポリ(A)RNA精製に進む前に、DNase Iで処理したトータルRNAを使用し、キャピラリーまたは従来のゲル電気泳動評価によってトータルRNAの品質と完全性を調べます。研究者は、高分子量フィールドの 28S および 18S rRNA リボソーム バンドと、低分子量フィールドの 5.8S rRNA バンドを、エレクトロフェログラムに有意な塗抹標本バンドなしで識別できる必要があります。精製ステップは、基本的にメーカーの指示に従い、特定のステップで示されている軽微な変更が加えられています。このプロトコルで使用されるすべての材料と機器に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。

  1. 準備
    1. 試薬、洗浄バッファー、オリゴ(dT)ビーズ、溶解バッファーを室温で30分間温めてから、以下の手順を行ってください。
    2. ポリ(A)濃縮RNAを単離するには、ヌクレアーゼフリーの1.5 mL微量遠心チューブに十分な量のRNAを移し、出発物質として10〜20 μgの高品質トータルRNAアリコートを調製します。ヒートブロック内で 70°C で5分間インキュベートし、その後氷上で2 分間保持します。
      注:出発物質となるトータルRNAの量は、mRNAの所望量および使用する細胞の性質に応じて適切に調整する必要があります。経験的には、ポリ(A)濃縮RNAは、全RNAの1〜5%の存在量を占める可能性があります。10 μgの高品質トータルRNAのアリコートは、下流の亜硫酸水素変換のために100〜500 ngの範囲で高品質のポリ(A)濃縮RNAを提供するはずです。
    3. その間、オリゴ(dT)ビーズを完全に再懸濁します。必要量のビーズ懸濁液を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移し、磁気ビーズがペレットを形成するまで磁石の上に3分間置きます。
      注:50 μL のオリゴ(dT)ビーズを使用して、10 μg のトータル RNA インプットを行います。このステップのビーズの容量は、使用する細胞に応じてさらに最適化できます。
    4. 上清を除去し、オリゴ(dT)ビーズを等量(ステップ1.1.3で使用したビーズ懸濁液の量)の溶解緩衝液で再懸濁し、磁石上に3分間置いてから上清を除去します。
      注意: ビーズを過度に乾燥させないでください。ユーザーはすぐに手順 1.2.1 に進む必要があります。
  2. 1回目の浄化
    1. 溶解バッファーを RNA サンプルチューブ(体積比 4:1)に添加し、十分に混合してからオリゴ(dT)ビーズに移します。
      注:RNA サンプル量が 20 μL の場合は、80 μL の溶解バッファーを添加します。
    2. RNA:溶解バッファーミックスとオリゴ(dT)ビーズを少なくとも10回ピペッティングして完全に再懸濁します。
    3. サンプルを室温で15分間連続的に回転させてインキュベートします。
    4. サンプルを磁石の上に5分間、または上清が透明になるまで置きます。上澄みを捨てます。
    5. 600 μL の Wash Buffer 1 をビーズに加え、慎重に混合してビーズを再懸濁します。
    6. チューブを磁石の上に5分間、または上澄みが透明になるまで置き、上澄みを捨てて、洗浄手順1.2.5を1回繰り返します。
    7. 300 μL の Wash Buffer 2 を添加してビーズを洗浄し、ビーズを静かに再懸濁します。
    8. チューブを磁石の上に5分間、または上澄みが透明になるまで置き、上澄みを捨てて、洗浄手順1.2.7を1回繰り返します。
    9. 30 μLの冷たい10 mM Tris-HCl(溶出バッファー)をサンプルチューブに加え、 70°C で 5分間インキュベートします。
    10. チューブをマグネット上に素早く移し、20秒以上経過して懸濁液が透明になったら、溶出したポリ(A)濃縮RNAを含む上清を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。
  3. 2回目の浄化
    1. 溶出したRNAサンプルに120 μL(溶出サンプルの4倍)の溶解バッファーを加え、完全に混合します。
    2. 最初の精製で使用したビーズをステップ1.1.4と同量の溶解バッファーで洗浄し、10回ピペットでビーズを再懸濁し、磁石上に5分間置いてから上清を廃棄します。
    3. RNA:溶解バッファーミックスを洗浄したビーズに移し、少なくとも10回ピペッティングして完全に混合します。
    4. サンプルを室温で15分間連続的に回転させてインキュベートします。
    5. 手順 1.2.4 から 1.2.8 を繰り返して、塩分と他の RNA サブタイプを除去します。
      注:洗浄バッファーの容量は、洗浄バッファー1で300 μL、洗浄バッファー2で150 μLに減らすことができます。
    6. 25 μL(所望の容量)の冷たい10 mM Tris-HCl(溶出バッファー)をサンプルチューブに加え、 70°C で 5分間インキュベートします。
    7. チューブをマグネット上に素早く移し、20秒以上経過して懸濁液が透明になったら、溶出したポリ(A)濃縮RNAを含む上清を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。
    8. 2.2 μL を 8 ストリップチューブに移し、RNA 高感度アッセイを使用して RNA の量と質の品質を評価します。
    9. サンプルは、短期間は-20°C、長期間は-70°Cで保管してください。
      メモ: これは、プロトコルの一時停止ポイントである可能性があります。

2.亜硫酸水素塩変換

注:遠心分離のステップはすべて室温で行いました。手順は基本的にメーカーの指示に従って実行されますが、亜硫酸水素反応のステップ2.3の前にスパイクインコントロールmRNA配列を追加するためのステップ2.2が追加されています。

  1. 精製したポリ(A)濃縮 RNA サンプル 19 μL を 0.2 mL の 8 ストリップチューブに移します。
  2. 所定の量比 1:10,000 で修飾のないスパイクインコントロール 1.0 μL (つまり、0.1 ng のルシフェラーゼ mRNA:精製ポリ(A) 濃縮 RNA 1 μg) をステップ 2.1 の RNA サンプルに添加します。
    注:スパイクインコントロール配列は、ホタルルシフェラーゼRNA、レニラルシフェラーゼ、またはメチル化シトシンを含まない in vitro 転写RNA配列です。
  3. 130 μL のコンバージョンリージェントをチューブに加え、数回静かに反転させて完全に混合します。
  4. チューブをPCRマシンに入れ、70°Cで10分間加熱した後、64°Cでそれぞれ45分間インキュベートし、最後に4°Cまで冷却します。
  5. カラムをコレクションチューブにセットし、250 μL の RNA 結合バッファーをカラムに移します。
  6. ステップ 2.4 のサンプルをステップ 2.5 のカラムに移し、完全にピペッティングします。
  7. 400 μLの95〜100%のエタノールをカラムに加え、キャップをすばやく閉じて、数回反転させます。
  8. 10,000 × g で 25 °C で 30 秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
  9. 200 μL の RNA 洗浄バッファーをカラムに加えます。
  10. 10,000 × g で 25 °C で 30 秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
  11. 200 μLの脱硫緩衝液を加え、室温で30分間インキュベートします。
  12. 10,000 × g で 25 °C で 30 秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
  13. 400 μL の RNA 洗浄バッファーを添加し、10,000 × g で 25 °C で 30 秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。この手順を 1 回繰り返します。
  14. 10,000 × g 、25°Cで2分間遠心分離し、残留洗浄バッファーを完全に除去します。
    注:溶出前の2分間のもう1つの遠心分離ステップ2.14は、洗浄バッファーを完全に除去することです。洗浄工程を2回行い、カラム上の亜硫酸水素試薬および脱スルホン化緩衝液から高塩分成分を洗い流します。
  15. カラムを新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。
  16. 20〜30μLのヌクレアーゼフリーH2Oをカラムに加え、室温で1分間静置します。
  17. 10,000 × g 、25°Cで30秒間遠心分離します。
  18. 2.2 μL を 8 ストリップチューブに移し、RNA の量と質を評価します。
  19. 重亜硫酸塩処理したRNAサンプルは、短期間は-20°C、長期間は-70°Cで保存してください。
    メモ: これは、プロトコルの一時停止ポイントである可能性があります。

3. 亜硫酸水素塩処理mRNAライブラリーの調製

注:精製 mRNA または rRNA 枯渇 RNA で使用する場合は、ライブラリ調製手順プロトコルのセクション 4 に従ってください。バイサルファイト処理はRNAを断片化するため、最初のプライミングステップはFFPE RNAプロトコルに従う必要があります。層流フードですべてのステップを実行し、反応混合物を氷冷冷却ラックに加えます。

  1. インプットRNAのプライミング
    1. 所望の量の重亜硫酸塩処理mRNAサンプルを合計最大5μLで移すか、ヌクレアーゼフリーH2Oを添加して合計5μLにする。
      注:このタイプの RNA ライブラリー調製および4 nM ライブラリ産物の最終モル濃度を生成するには、インプットとして最低 10 ng の重亜硫酸塩処理 mRNA が推奨されます。
    2. 1 μLのランダムプライマー(ライラック)をサンプルに加え、ピペッティングで混合します。
    3. サンプルチューブを65°CにプリセットしたPCRマシンに入れ、蓋を105°Cで5分間置き、4°Cで保持します。
  2. 第一鎖cDNA合成
    1. 合成反応バッファー(ライラック)4 μL、鎖特異性試薬(茶色)8 μL、合成酵素ミックス(茶色)2 μLをサンプルに加え、総容量を20 μLにします。 少なくとも10回ピペッティングして完全に混合し、すばやくスピンダウンします。
    2. 25°Cで10分間、42°Cで50分間、70°Cで15分間プリセットされたPCRマシンにサンプルチューブを入れ、4°Cで保持します。
      注:200 塩基を超えるインサートの場合、42 °C で 50 分間のインキュベーション期間を推奨します。インサートサイズが200塩基未満の場合は、42°Cで15分間のインキュベーション期間を推奨します。
  3. 二本鎖cDNA合成
    1. 8 μLの合成反応バッファーとdUTPミックス(オレンジ)、4 μLの合成酵素ミックス(オレンジ)、48 μLのヌクレアーゼフリーH2Oを加え、少なくとも10回ピペッティングして完全に混合し、すぐにスピンダウンします。
    2. サンプルチューブを16°CにプリセットされたPCRマシンに、蓋を外した状態で1時間、または≤40°Cに入れます。
  4. DNA精製ビーズによる二本鎖cDNAの精製
    1. 精製を行う前にDNA精製ビーズを30分間予熱し、ボルテックスしてビーズを再懸濁します。
    2. ステップ 3.3.2 で再懸濁した DNA 精製ビーズ 144 μL を cDNA サンプルに加え、ピペッティングで 10 回以上混合します。
    3. 室温で5分間インキュベートします。
    4. 溶液が透明になるまでサンプルチューブを磁気ラックに5分間置き、その後、上清を取り除き、DNAを含むビーズを保管します。
    5. 作りたての80%エタノール200μLをビーズと一緒にチューブに加え、サンプルを磁気ラックに保持し、室温で30秒間インキュベートします。
    6. 上澄み液を取り出し、手順3.4.5を1回繰り返しますが、今回は残った上澄み液を慎重にすべて取り除きます。
    7. サンプルを磁石に保持しながら、ビーズを1〜5分間風乾します。
      注意: ビーズを過度に乾燥させないでください。色はダークブラウンでなければなりません。
    8. 磁気ラックからサンプルを取り出し、53 μLの0.1x TE(10 mM Tris-HClおよび1 mM EDTA、pH 8.0)バッファーをビーズに添加してDNAを溶出します。ピペッティングで10回以上混合し、室温で2分間インキュベートします。
    9. チューブを磁気ラックに5分間、または溶液が透明になるまで置きます。
    10. 二本鎖cDNAを含む上清50 μLを新しい8ストリップチューブに移します。
      注:この時点でプロトコルを停止し、サンプルを-30°Cで保存できます。
  5. cDNAライブラリーの調製終了
    1. 溶出した二本鎖cDNAサンプルに、末端研磨反応バッファー(緑色)7 μLと末端研磨酵素ミックス(緑色)3 μLを加えます。
    2. 気泡を発生させずに、50 μLの容量設定で10回ピペッティングして混合物を混合し、サンプルをすばやくスピンダウンします。
    3. サンプルをPCR装置に入れ、20°Cで30分間、65°Cで30分間インキュベートし、4°Cで保持します。
  6. アダプターライゲーション
    1. アダプター(赤)をメーカーの指示に従って希釈します。
    2. 希釈したアダプター 2.5 μL、ライゲーションエンハンサー 1 μL(赤)、ライゲーションマスターミックス(赤)30 μLをサンプルに加えます。
    3. 気泡を発生させずに、80 μLの容量設定で10回ピペッティングして混合物を混合し、サンプルをすばやくスピンダウンします。
    4. サンプルをPCR装置に入れ、20°Cで15分間インキュベートします。
    5. ウラシルDNAグリコシラーゼとDNAグリコシラーゼ-リアーゼエンドヌクレアーゼVIII(青)の混合物3 μLをサンプルに加え、ピペットで完全に移します。
    6. サンプルをPCR装置に戻し、蓋を75°Cに設定して37°Cで15分間インキュベートします。
  7. ライゲーション反応処理されたcDNAの精製
    注:SPRIselectビーズによるサイズ選択、またはオプションでAMpure XPビーズによるサイズ選択は、どちらもこの目的に使用できます18。
    1. ビーズを30分間予熱してから精製を行い、ボルテックスして再懸濁します。
    2. ステップ3.6.6で再懸濁したビーズ25 μLをcDNAサンプルに移し、少なくとも10回ピペッティングして完全に混合します。
    3. 室温で5分間インキュベートします。
    4. 溶液が透明になるまでサンプルチューブを磁気ラックに5分間置き、上清を新しい8ストリップチューブに移し、ビーズを廃棄します。
    5. 再懸濁したビーズ10 μLを上清に加え、少なくとも10回ピペッティングして完全に混合します。
    6. 溶液が透明になるまでサンプルチューブを磁気ラックに5分間置き、上清を廃棄し、ビーズを乱さないようにします。
    7. 作りたての80%エタノール200μLをビーズと一緒にチューブに加え、サンプルを磁気ラックに保持し、室温で30秒間インキュベートします。
    8. 上澄みを取り除き、手順3.7.7を一度繰り返しますが、今回は残った上澄みを慎重にすべて取り除きます。
    9. サンプルを磁石の上に置いたまま、ビーズを1〜5分間風乾します。
      注意: ビーズを過度に乾燥させないでください。色はダークブラウンでなければなりません。
    10. 磁気ラックからサンプルを取り出し、ビーズに 17 μL の 0.1x TE バッファーを添加して DNA を溶出します。ピペッティングで10回以上混合し、室温で2分間インキュベートします。
    11. 溶液が透明になるまで、チューブを磁気ラックに5分間置きます。
    12. ターゲット末端調製dsDNAを含む上清15 μLを新しい8ストリップチューブに移します。
  8. アダプターライゲーション済みDNAのPCR濃縮
    1. 25 μLのマスターミックス(青)、5 μLの5'アダプタープライマー、および5 μLの3'アダプタープライマーをアダプターライゲーション済みDNAサンプルに加えます。少なくとも10回ピペッティングして完全に混合します。
    2. サンプルをPCRマシンに入れ、(1)98°Cで30秒、(2)98°Cで10秒、(3)65°Cで75秒、(4)65°Cで5分間、(5)4°Cで保持する。ここで、手順(2)と(3)をN+2サイクル番号(Nは取扱説明書のRNAインプット量に等しい)に対して繰り返す必要があります。これは、ステップ3.7で実行したサンプルの両面サイズ選択のために、さらに2サイクルが必要であることを意味します。
      注:例えば、精製されたmRNAインプットのうち8 ngは、9〜10サイクルのPCRで推奨されます。しかしステップ3.7の両面、サイズ選択された、連結されたcDNAによって、推薦されたPCR周期は11-12周期である。
  9. PCR増幅ライブラリの精製
    1. DNA精製ビーズを30分間予熱してから、精製とボルテックスを行い、ビーズを再懸濁します。
    2. ステップ 3.8.2 で再懸濁したビーズ 45 μL(0.9 倍)を PCR 産物に移し、少なくとも 10 回ピペッティングして完全に混合します。
    3. 室温で5分間インキュベートします。
    4. 溶液が透明になるまでサンプルチューブを磁気ラックに5分間置き、上清を取り除き、DNAを含むビーズを保管します。
    5. 作りたての80%エタノール200μLをビーズのあるチューブに加え、サンプルを磁気ラックに置いて、室温で30秒間放置します。
    6. 上澄み液を取り出し、手順3.9.5を1回繰り返しますが、今回は残った上澄み液を慎重に取り除きます。
    7. サンプルを磁石の上に置いたまま、ビーズを1〜5分間風乾します。
      注意: ビーズを過度に乾燥させないでください。色はダークブラウンでなければなりません。
    8. サンプルを磁気ラックから取り出し、22 μL の 0.1x TE バッファーをビーズに添加して DNA を溶出します。ピペッティングで10回以上混合し、室温で2分間インキュベートします。
    9. チューブを磁気ラックに置き、5分間、または室温で溶液が透明になるまで放置します。
    10. 上清 20 μL を新しい 8 ストリップチューブに移します。
    11. 2.2 μL を 8 ストリップチューブに移し、ライブラリの量と質の品質を評価します。
      注:ライブラリの量はqPCRでも検出できます( 材料表を参照)。
    12. bsRNA-seqライブラリサンプルは-20°Cで保存してください。

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Representative Results

細胞株19 から得られた一連のbsRNA-seqライブラリーは、本レポート (図1)の手順に従って作製しました。細胞株サンプルに対してDNase処理を伴ったトータルRNA精製を行い、ゲル電気泳動およびUV-Vis分光光度法(A260/A280)で品質を確認した後、RNAサンプルはポリ(A)RNA濃縮に進むことができます。二重精製でリボソームRNAの大部分を除去できるかどうかを調べるために、rRNAコンタミネーション率を自動計算できるキャピラリー電気泳動トータルRNAアッセイにより、ポリ(A)RNAの精製効率を評価しました (図2)。RNAフラグメントのピークパターンとrRNAコンタミネーション率から、2回精製したRNAサンプルは、AsPC-1とBxPC-3でそれぞれ6.5%から2.2%、2.6%から1.1%にリボソームRNAのコンタミネーションが減少することを示しました。ヒト膵臓がん細胞株では、2回のビーズ精製で、全RNAサンプルから平均2.8±1%のポリ(A)濃縮RNAの存在量に達する可能性があります。したがって、オリゴ(dT)ビーズによるポリ(A)RNA濃縮と二重精製ステップは、リボソームRNAを最小限に抑え、下流の実験で実現可能なmRNAサンプル濃縮を表しています。

重亜硫酸塩の転換プロトコルはRNAの5methylcytosineの修正(表1)の複数の調査で報告されていた。亜硫酸水素反応は、40%亜硫酸水素ナトリウムと600mMハイドロキノンからなるユーザー再構成反応混合物を水溶液(pH 5.1)中に75°Cで4時間10,20,21時間行うことができた。あるいは、RNAサンプルのより厳格な亜硫酸水素塩処理も市販のキットで実施できます。これは、他の人や私たちの6,22,23,24からの多くの研究で、亜硫酸水素塩の反応時間を3回のインキュベーションサイクルに延長しました。3サイクルのインキュベーションステップは、in vitroで転写され、構造的に折りたたまれた大腸菌16S rRNAセグメント8の非メチル化シトシンを効率的に変換するため、3サイクルのインキュベーションステップもこのプロトコルに適用されました。

ポリ(A)を2回濃縮し、3サイクルの亜硫酸水素塩変換を行い、反応前後のRNA品質をキャピラリー電気泳動で評価しました。亜硫酸水素塩処理後のRNAサイズ分布は、亜硫酸水素反応によるフラグメンテーションにより、200~500ヌクレオチドのピークを示しました (図3)。さらに、断片化されたbsRNAは、別の断片化ステップを行うことなく、ライブラリ調製に理想的です。入力としてbsRNAの合計8-10 ngがアダプター連結されたDNAの最終的なPCRの拡大の9から11の周期の使用によってこのプロトコルに従って図書館を組み立てるのに使用された。アンプリコンのキャピラリー電気泳動では、プライマーのごく一部しか残っておらず、過剰増幅のピークも見られず、ライブラリ調製が非常に成功しました (図4)。各サンプルライブラリの変換効率を確認するために、スパイクインコントロール配列として非メチル化ホタルルシフェラーゼRNAをサンプルに添加してから、バイサルファイト処理を行いました。meRanTKツールキット25を用いてシーケンシングリードをリファレンス配列にアライメントした後、全リードの平均2,440(0.006%)がスパイクイン配列にマッピングされ、分析されたC-T変換率の合計は平均99.81%に達しました。ステータスは、Integrated Genomics Viewer (図5)で確認できます。

Figure 1
図1:亜硫酸水素塩基配列決定のワークフロー図。このパイプラインは、mRNA濃縮、重亜硫酸塩変換、ライブラリ調製を含む3つの主要なプロトコルで構成されています。略語:bsRNA =亜硫酸水素塩mRNA;品質管理。=品質管理。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:キャピラリー電気泳動によるポリ(A)濃縮RNAサンプルの品質管理結果。(A) BxPC-3細胞由来の全RNAの代表的なキャピラリー電気泳動プロファイル。(B)AsPC-1およびBxPC-3細胞由来のオリゴ(dT ) 精製で処理したサンプルの代表的なキャピラリー電気泳動プロファイル。mRNA E1、1回限りの精製からのmRNA溶出。mRNA E2、2回精製によるmRNA溶出。rRNAコンタミネーションの推定値は、トータルRNA分析アッセイを制御する電気泳動操作システムによって計算されました。 (C) ラダーマーカーのキャピラリー電気泳動プロファイルは、パネル Bに示したサンプルと同じ分析で取得しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:キャピラリー電気泳動によるRNAサンプルの品質評価。(A)トータル RNA、(B)2 回精製によるポリ(A)濃縮 mRNA、(C)BxPC-3 細胞からの亜硫酸水素処理 mRNA の代表的なキャピラリー電気泳動プロファイル。 略語: B_empty = 空のベクターで形質導入されたBxPC-3細胞。B_shScr = スクランブル配列で形質導入したBxPC-3細胞。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:bsRNA-seqライブラリの品質評価。(A-C) BxPC-3細胞のbsRNAを用いて、9サイクルと11サイクルの異なるPCRサイクル番号でPCRで増幅したbsRNA-seqライブラリの代表的なキャピラリー電気泳動プロファイルを3セット掲載しています。亜硫酸水素塩処理RNAの推定インプット量は、高感度RNA定量アッセイによって決定された。 (A )BxPC-3 モック、( B) BxPC-3 空、 (C) BxPC-3 shN2UN2 サンプルでは、それぞれ合計 8、8.4、9.6 ng の bsRNA を使用しました。ラダーマーカーのピークは 35 bp で、10,380 bp は、各サンプルの電気泳動プロファイルの下限と上限の内部標準を表します。約 100 bp の顕著なピークと約 127 bp の曖昧なピークは、PCR クリーンアップ後に溶出液に残った PCR プライマー(<100 bp)およびアダプターダイマー(~127 bp)を示しています。略語: BxPC-3 mock = 形質導入されていない BxPC-3 細胞;BxPC-3 empty = 空のベクターコントロールで形質導入したBxPC-3細胞。BxPC-3 shN2UN2 = shNSUN2コンストラクトで形質導入されたBxPC-3細胞。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:各bsRNA-seqライブラリの配列アライメントプロファイルは、spike-in-controlリファレンス配列にマッピングされています。 BxPC-3モック、エンプティ、スクランブル、shNSUN2 bsRNA-seqライブラリのホタルルシフェラーゼスパイクインコントロールリファレンス配列(「Z」遺伝子として表示)に対する代表的なアライメントプロファイル。代表的な2つの地域が示された。灰色のバーは、参照配列に示された塩基位置に一致したコンセンサスヌクレオチドを示すすべてのリードを示します。赤いバーは、リードの基部位置にあるチミジン(T)の同一性を強調しています。青色のバーは、その位置にシトシン(C)の同一性を有するリードを示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表1:重亜硫酸反応プロトコルと変換率の比較。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルでは、標準化されたコンポーネントを利用することで、ポリ(A)濃縮、重亜硫酸塩変換、およびライブラリ調製の詳細なパイプラインが達成されました。さらなるシーケンシング解析により、目的のサンプル中のmRNA 5-メチルシトシンが同定されました。

RNAの分解はポリ(A)RNA精製の回収率に影響を与えるため、重要なステップは出発物質であるトータルRNAの品質です。ポリ(A)RNA精製ステップを実施する前に、サンプルを慎重に取り扱い、RNaseの汚染を避ける必要があります。手順のもう一つの重要な部分は、ライブラリ調製におけるPCRサイクルの数です。サイクル数の決定は、ライブラリ調製に使用される重亜硫酸塩処理mRNAの量と、PCR前のステップで1つのサイズ選択または2倍のサイズ選択を使用するかどうかによって異なります。したがって、目的のサンプルに適したサイクル番号は、試運転が必要であり、キャピラリー電気泳動によってPCR産物のサイズ分布を評価して、同じ細胞株または組織に最適なサイクル番号を決定します。

このプロトコルでは、オリゴ(dT)ビーズ精製を2回行ってポリ(A)RNAを濃縮および精製し、リボソームRNAと他のRNAの大部分を排除しました。リボソームRNAを除去し、他の種類のRNAをサンプルに保持する方法は他にもあり、例えば、オリゴベースのrRNAの枯渇などがある26。次に、他のRNAタイプに存在する5-メチルシトシン修飾も分析に取り入れることができ、mRNAや他のRNAにおける5-メチルシトシンの特徴の理解を深めることができます。

亜硫酸水素反応は、m5Cを、5-ヒドロキシメチルシトシン(hm5C)、3-メチルシチジン(m3C)、およびN4-メチルシチジン(m4C)などの他の修飾と区別できないことで知られている27。しかしながら、m5CRNAメチルトランスフェラーゼのノックダウンまたはノックアウトを含む実験デザインは、信頼性の高い調節されたm5C部位の有益な証拠を提供するはずである。さらに、抗体ベースの濃縮とそれに続くシーケンシングまたはPCRまたはLC-MS/MSベースの方法などの異なる方法を用いたバリデーションは、本質的に候補m5C部位を認証することができる16。また、ナノポアRNAの直接シーケンシングという新しい技術により、現在のシグナルや塩基と呼ばれる「エラー」特徴の計算解析により、RNA修飾を同定できる可能性があります28,29,30。

Johnsonらによる最近の研究では、3回の重亜硫酸塩変換後にミトコンドリアRNAサンプルにフラグメンテーションステップを追加すると、実際により高い変換率が示され、cDNAライブラリ製品31の収量が増加したことが示されました。この論文では、変換率を具体的に分析し、mRNAトランスクリプトームではなく、ミトコンドリアゲノムにマッピングされた品質を読み取っています。したがって、 表 1 ではフラグメンテーションステップの使用が更新され、公開されたレポートに RNA フラグメンテーションステップが含まれているかどうかが強調され、閲覧者がプロトコルを簡単に再現できるようになりました。Zhangらによる別の研究では、 in vitro で転写された修飾のないRNAライブラリーをネガティブコントロールとして利用することが、重亜硫酸塩処理からの偽陽性シグナルを排除するのに効率的であることが実証された32。最近の研究では、図書館の建設に用いられるさまざまなプロトコルが比較されている33。ユーザーはさらに、bsRNA-seqパイプラインを、追加のフラグメンテーションステップの有無にかかわらず、適切なワークフローをカスタマイズするためにin vitro 転写された修飾のないRNAライブラリーを実施することを選択できます。

異なる原理によるm5Cのトランスクリプトーム全体の同定は、修飾ランドスケープの知見を強化し、健常モデルまたは疾患モデルにおけるRNA修飾の調節メカニズムのさらなる理解を提供する可能性がある。

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Disclosures

著者には開示すべき利益相反はありません。

Acknowledgments

この研究は、台湾国家科学技術評議会の支援を受けました。[NSTC 111-2314-B-006-003]

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System Agilent, Santa Clara, CA RNA quality detection
AMpure XP beads Beckman Coulter A63881 purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-4626 DNA quality detection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit Agilent, Santa Clara, CA 5067-1513 RNA quality detection
DiaMag02 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000001 assist library preparation
DiaMag1.5 - magnetic rack Diagenode, Denville, NJ B04000003 assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 61011 poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol J.T.Baker 64-17-5
EZ RNA methylation kit Zymo, Irvine, CA R5002 bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA Promega, Madison, WI, USA L4561 spike in control seqeunce 
KAPA Library Quantification Kits Roche, Switzerland KK4824 library quantification
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) New England Biolabs, Ipswich, MA E7335S library preparation
NEBNext Ultra Equation 1 Directional RNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs, Ipswich, MA E7760S library preparation
Nuclease-free Water Thermo Fisher Scientific AM9932
P2 pipetman Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4641010
Qubit 2.0 fluorometer  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32854 DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Q32852 RNA quantity detection

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Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment … More

Chen, S. Y., Huang, P. H. Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (197), e65352, doi:10.3791/65352 (2023).

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