Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

طرق التثقيب الكهربائي وتأكيد التحول في Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65463
Automatic Translation
1, 1
1University of Toronto Mississauga

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولات للعمل مع Limosilactobacillus reuteri DSM20016 ، مع تفصيل النمو ، وتحويل البلازميد ، ومستعمرة PCR ، وقياس بروتين مراسل الفلورسنت ، وإعداد البلازميد المصغر المحدود ، بالإضافة إلى المشكلات الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. تسمح هذه البروتوكولات بقياس بروتينات المراسل في DSM20016 ، أو التأكيد عبر مستعمرة PCR إذا لم يكن هناك مراسل.

Abstract

كانت Lactobacillus جنسا كبيرا ومتنوعا بشكل لا يصدق من البكتيريا يضم 261 نوعا ، كان العديد منها سلالات متعايشة مع إمكانية استخدامها كهيكل للمساعي البيولوجية الاصطناعية داخل الجهاز الهضمي. أدى الاختلاف الواسع في النمط الظاهري والنمط الجيني الذي لوحظ داخل الجنس إلى إعادة تصنيف حديثة وإدخال 23 جنسا جديدا.

نظرا لاتساع نطاق الاختلافات داخل الأجناس القديمة ، قد لا تعمل البروتوكولات الموضحة في أحد الأعضاء كما هو معلن مع الأعضاء الآخرين. أدى نقص المعلومات المركزية حول كيفية التعامل بالضبط مع سلالات معينة إلى مجموعة من الأساليب المخصصة ، والتي غالبا ما يتم تكييفها من عائلات بكتيرية أخرى. هذا يمكن أن يعقد الأمور بالنسبة للباحثين الذين يبدأون في هذا المجال ، والذين قد لا يعرفون المعلومات التي تنطبق أو لا تنطبق على السلالة التي اختاروها.

في هذه الورقة ، نهدف إلى مركزية مجموعة من البروتوكولات ذات النجاح الواضح ، وتحديدا في تسمية سلالة Limosilactobacillus reuteri F275 (أرقام المجموعة الأخرى: DSM20016 ، ATCC23272 ، CIP109823) ، جنبا إلى جنب مع نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمشكلات الشائعة التي قد يواجهها المرء. يجب أن تمكن هذه البروتوكولات الباحث الذي لديه خبرة قليلة أو معدومة في العمل مع L. reuteri DSM20016 تحويل البلازميد ، وتأكيد التحول ، وقياس ردود فعل النظام في قارئ لوحة عبر بروتين مراسل.

Introduction

تم تصنيف جنس Lactobacillus تاريخيا على أنه إيجابي الجرام ، على شكل قضيب ، غير مكون للجراثيم ، إما لاهوائيات اختيارية أو محبة للميكروات تكسر السكريات لإنتاج حمض اللاكتيك1 بشكل أساسي. أدت هذه المعايير الفضفاضة إلى كون Lactobacillus ، ظاهريا ووراثيا ، جنسا متنوعا للغاية. أدى هذا التصنيف الواسع إلى إعادة تصنيف الجنس ، حيث قدم 23 جنسا جديدا في عام 20202.

شمل الجنس القديم الأوسع أنواعا رئيسية من البروبيوتيك تعتبر عموما آمنة (GRAS) للاستهلاك3. تحافظ عائلة Lactobacillaceae على تصور عام بأنها "بكتيريا جيدة" بسبب العديد من الفوائد الصحية المبلغ عنها الممنوحة من خلال استهلاك سلالات مختلفة4،5،6،7. تتحد السهولة التي يمكنهم من خلالها التنقل في الجهاز الهضمي8 وقبولهم العام لوضع سلالات Lactobacillaceae كمرشحين أقوياء مثل الكائنات الحية الشاسيه للتطبيقات الطبية أو العلاجية أو التشخيصية القابلة للابتلاع.

وقد أدت المجموعة الواسعة من الخصائص الموجودة داخل عائلة Lactobacillaceae إلى حالة لا توجد فيها سلالة فعلية من الكائنات الحية النموذجية. تميل مجموعات البحث إلى اختيار الأنواع ذات الخصائص الأكثر صلة بأهدافها الخاصة. (على سبيل المثال ، يمكن لمختبرات تخمير الألبان اختيار L. lactis ؛ قد تختار دراسات تخمير الخضروات L. plantarum ؛ قد تركز الأبحاث على البروبيوتيك على L. acidophilus ؛ وهكذا.)

وقد أدى هذا النطاق الواسع من الخصائص عبر الأنواع إلى تراكم البروتوكولات والإجراءات التي قد تعمل بشكل جيد لمجموعة فرعية واحدة من عائلة Lactobacillaceae ، ولكنها تتطلب التحسين للعمل بكفاءة (أو ربما للعمل على الإطلاق) في الآخرين9. هذه الحاجة إلى التحسين بين أفراد الأسرة وحتى داخل أفراد من نفس النوع يمكن أن تحبط جهود الباحثين غير المألوفين. يمكن أن تتضمن البروتوكولات المنشورة في أقسام الأساليب في الأوراق أيضا تعديلاتها الخاصة10 ، مما يؤدي إلى مجموعات بروتوكولات مجزأة ولامركزية.

يعتبر L. reuteri من الفقاريات على نطاق واسع ، ويوجد باستمرار في الثدييات والطيور11 والأسماك12 في الجهاز الهضمي (GI). غالبا ما تكون سلالات L. reuteri الفرعية متخصصة وراثيا ، عن طريق تكيف بروتين التصاق المخاط ، لاستعمار مضيفات محلية محددة بشكل دائم8،11،13. يمكن عزل أنواع الجهاز الهضمي Limosilactobacillus في مضيفين خارج مضيفهم الأصلي ، ولكنها تميل أكثر نحو الطبيعة العابرة8.

نظرا لتخصص المضيف البشري ، فإن L. reuteri DSM20016 يضع نفسه بشكل جيد للغاية كهيكل للتطبيقات التشخيصية أو العلاجية في أي نقطة في الجهاز الهضمي البشري ، ويمكن أن يوفر DSM20016 الإجهاد نافذة تأثير طويلة الأمد للتدخلات عند مقارنتها بالسلالات الأكثر انتقالية.

في هذه الورقة ، نحدد سلسلة من البروتوكولات ذات الفعالية المثبتة في Limosilactobacillus reuteri (تسمية السلالة: F275 ؛ أرقام المجموعة الأخرى: DSM20016 ، ATCC23272 ، CIP109823) ، جنبا إلى جنب مع معلومات مركزية عن السلالة من مصادر أخرى للمساعدة في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية والأنظمة. يجب أن تمكن الإجراءات المنصوص عليها هنا الباحث الذي ليس لديه خبرة سابقة من زراعة L. reuteri ، وإنشاء مخزون كهربي ، واختيار المستعمرات المحولة ، وتأكيد التحول عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة (PCR) ، وقياس استجابة النظام المصممة عبر بروتينات مراسل الفلورسنت.

نلاحظ أن البروتوكولات ذات الصلة قد غطت إعادة تجميع جينوم ssDNA بمساعدة CRISPR-Cas9 في L. reuteri (السلالة: ATCC-PTA-6475) 14 ، وتحرير الجينوم بمساعدة CRSIPR-Cas9 بمساعدة نيكاز في العديد من البقع غير L. reuteri ، بقع عائلة Lactobacillaceae 15,16 ؛ ومع ذلك ، فإن هذه لا تعالج سلالة L. reuteri DSM20016 التي هي محور تركيزنا هنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحضير L. reuteri DSM20016 الخلايا الكهربائية

ملاحظة: يستند هذا إلى بروتوكول أعده Berthier et al.17 ، مع سرعات الطرد المركزي التي أبلغ بها Rattanachaikunsopon et al.18.

  1. في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، قم بتلقيح L. reuteri من مخزون الجلسرين إلى 6 مل من مرق deMan Rogosa Sharpe (MRS). احتضان هوائي بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة.
  2. في صباح اليوم التالي ، قم بتلقيح 4 مل من الثقافة الليلية في 200 مل من مرق MRS (1:50 تخفيف).
  3. السماح بالنمو هوائيا في حاضنة ثابتة 37 درجة مئوية حتى تصل قيمة الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) إلى 0.5-0.85 ؛ يجب أن يستغرق هذا حوالي 2-3 ساعات.
  4. بمجرد الوصول إلى قيمة OD600 كافية ، صب الوسائط في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل وضعها على الجليد أثناء موازنة الأنابيب.
  5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 5000 × جم في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا ، 4 درجات مئوية.
  6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق كل حبيبة في 50 مل من المبرد مسبقا (0 درجة مئوية إلى 4 درجات مئوية) ddH2O ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى بنفس إعدادات الخطوة السابقة. الحفاظ على الخلايا على الجليد قدر الإمكان.
  7. كرر الخطوة 1.6.
  8. أعد تعليق كل حبيبة في 25 مل من ddH2O: 0.5 M سكروز ، 10٪ جلسرين. جهاز طرد مركزي عند 5000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد الخلايا إلى الجليد.
  9. أعد تعليق جميع الكريات في نفس 2 مل من ddH2O: 0.5 م سكروز ، 10٪ جلسرين.
  10. القسمة إلى أجزاء من 50 ميكرولتر إلى 100 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المبردة مسبقا ؛ يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية للاستخدام لاحقا.

2. التثقيب الكهربائي ل L. reuteri

ملاحظة: تجنب سحب العينات قدر الإمكان في الخطوات التالية. ينصح بإدراج التثقيب الكهربائي للتحكم ، بدون إضافة البلازميد ، لضمان أن يكون اختيار المضادات الحيوية مناسبا.

  1. خذ قسامة L. reuteri كاملة الكفاءة الكهربائية وقم بإذابة الثلج على الجليد.
  2. امزج بلطف 5 ميكرولتر إلى 10 ميكرولتر من البلازميد (تركيز البلازميد النهائي >6 نانومتر) في القسمة المذابة ، وتجنب السحب قدر الإمكان.
  3. انقله إلى كوفيت التثقيب الكهربائي المبرد بالجليد بفجوة 1 مم.
  4. إلكتروبورات عند 1.25 كيلو فولت و 400 Ω و 25 ميكروفولت.
  5. أضف 1 مل من مرق MRS بدرجة حرارة الغرفة (RT) واخلطه عن طريق قلب الكوفيت مرة أو مرتين.
  6. ضع الكوفيت في حاضنة ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5-3 ساعات للسماح بالتعافي.
  7. ضع الكمية بالكامل على ألواح أجار MRS متعددة مع الاختيار المناسب.
  8. ضع الألواح داخل حاوية محكمة الإغلاق تماما مع شمعة صغيرة مضاءة ("شمعة صغيرة") وكيس مولد للجو اللاهوائي.
  9. تنمو عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام أو حتى توجد مستعمرات مرئية.

3. قياس البروتين المراسل الفلوري المقاوم للأحماض mCherry2

  1. اختر أي مستعمرات مطلوبة للقياس وقم بالتلقيح في صفيحة تخزين دقيقة مكونة من 96 بئرا مع 1.5 مل من مرق MRS المعقم بالمرشح (غير المعقم) لكل بئر ومضاد حيوي مناسب للاختيار.
  2. احتضان هوائي لمدة 24 ساعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية دون رج.
    ملاحظة: يجب الاحتفاظ بصفيحة التخزين الدقيقة هذه للاستخدام في القسم 4 (مستعمرة PCR).
  3. سوف يترسب L. reuteri خارج وسائل الإعلام عندما يكون في المرحلة الثابتة ؛ إعادة تعليق الثقافة بين عشية وضحاها عن طريق الماصة.
  4. انقل 200 ميكرولتر إلى لوحة مسطحة وواضحة القاع وذات 96 بئرا ، وانقل اللوحة إلى قارئ الألواح ، وقم بقياس OD ومضان mCherry2 (الإثارة [Ex]: 589 نانومتر ؛ الانبعاث [Em]: 610 نانومتر) أو المراسلين الآخرين ذوي الصلة.

4. تأكيد امتصاص البلازميد عن طريق مستعمرة PCR

  1. من الصفيحة الدقيقة للتخزين المكونة من 96 بئرا من القسم 3 ، قم بنقل 5 ميكرولتر إلى أنبوب PCR.
    ملاحظة: إذا مرت >5 دقيقة ، فقد يكون من الضروري إعادة تعليق L. reuteri مرة أخرى.
  2. في جهاز طرد مركزي صغير محمول على الطاولة ، قم بتدويره لأسفل حتى يمكن رؤية الحبيبات (حوالي دقيقتين عند 2,000 × جرام) ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر من 20 مللي متر هيدروكسيد الصوديوم.
  3. تغلي على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، دوامة ، وكرر الغليان مرة ثانية.
  4. تبريد العينات على الفور ؛ حاول الاحتفاظ بالعينات على الجليد قدر الإمكان في الخطوات التالية لتقليل احتمالية تدهور القالب وتثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل.
  5. قم بالدوران في جهاز طرد مركزي صغير محمول على الطاولة عند 2000 × جم لمدة دقيقتين حتى يتم تكوير حطام الخلية ، ثم خذ 1 ميكرولتر من المادة الطافية وقم بتخفيفها إلى 99 ميكرولتر من DDH2O الخالي من DNase و RNase (تخفيف 100x).
  6. استخدم التخفيف 100x كقالب DNA في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي باستخدام البادئات الخاصة بالبلازميد. قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي مع بلازميد مشتق من E. coli mini-prep.
  7. أعد العينات على الثلج وأضف صبغة تحميل مناسبة بتركيز 1x.
  8. قم بتشغيله في جل أغاروز 1٪ في محلول TAE (حمض تريس أسيتات إيثيلين ديامينيترايتيك [EDTA]) عند 110 فولت لمدة 30 دقيقة. صورة إذا لزم الأمر.

5. بروتوكول التحضير المصغر ل L. reuteri ، متبوعا بتفاعل البوليميراز المتسلسل لتأكيد وجود البلازميد

ملاحظة: البروتوكول مخصص للاستخدام مع مجموعة أدوات التحضير المصغرة المدرجة في جدول المواد.

  1. تلقيح L. reuteri في 10 مل من مرق MRS الذي يحتوي على مضاد حيوي مناسب واحتضانه طوال الليل هوائيا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة.
  2. جهاز طرد مركزي عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا 4 درجات مئوية.
  3. اغسل الحبيبات في 2 مل من المخزن المؤقت القياسي P1 (مرفق مع المجموعة) من أجل إبطال الحموضة التي قد تتداخل مع الخطوات اللاحقة ، وأجهزة الطرد المركزي بنفس الإعداد كما هو موضح سابقا ، وتخلص من المادة الطافية.
  4. أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت P1 المعدل الذي يحتوي على 10 مجم / مل من الليزوزيم و 100 وحدة / مل من الطفرات من أجل تحلل الخلايا البكتيرية. احتضان لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  5. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت P2 ، واخلطه عن طريق التقليب أربع إلى ست مرات ، واحتضنه في RT لمدة لا تزيد عن 5 دقائق.
  6. أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت N3 (مضمن مع المجموعة) واقلب على الفور أربع إلى ست مرات برفق للخلط.
  7. جهاز طرد مركزي عند 10000 × جرام لمدة 10 دقائق.
  8. نقل أكبر قدر ممكن من المواد الطافية إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 60 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
  9. اغسل عمود الدوران ب 500 ميكرولتر من PB المخزن المؤقت (مرفق مع المجموعة) وأجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 60 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
  10. اغسل عمود الدوران ب 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت PE (مرفق مع المجموعة) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 60 ثانية. تخلص من التدفق من خلال وأجهزة الطرد المركزي لمدة 60 ثانية لإزالة أي مخزن مؤقت متبقي.
  11. ضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. ضع 20-30 ميكرولتر من ddH 2 O الخالي من DNAse و RNAse على مرشح عمود الدوران واتركه لمدة1-2دقيقة ، قبل الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 60 ثانية.
  12. قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي باستخدام البادئات الخاصة بالبلازميد (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA، pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA)، مع توفير الشطف للحمض النووي القالب. قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي مع بلازميد مشتق من E. coli mini-prep.
    ملاحظة: إعدادات تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمة في هذه الدراسة هي: 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، (98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية) 30 دورة ، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 4 درجات مئوية عقد. تعتمد المعلمات بشكل كبير على البلمرة المستخدمة وطول الشظية والبادئات الدقيقة التي يستخدمها أي شخص يستخدم هذا البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كفاءات التحول
لا يتطلب L. reuteri بلازميد dcm- / dam- غير ميثيلي ، كما لوحظ بالنسبة ل Lactobacillaceae19،20 الأخرى (انظر الشكل 1). يجب أن يعطي التثقيب الكهربائي ل L. reuteri DSM20016 مع 10 ميكرولتر من pTRKH3_mCherry2 البلازميد 8.5 كيلو بايت (أصل pAMβ1 ثيتا للتكرار) كفاءات تحويل تبلغ حوالي 80 وحدة تشكيل مستعمرة (CFU) / ميكروغرام (من خمس إلى ثماني مستعمرات لكل 200 ميكرولتر مطلي) ، بغض النظر عن حالة مثيلة البلازميد. من خلال المعالجة الانتقائية وإعادة التحويل ، من الممكن الحصول على سلالات L. reuteri متحولة بكفاءة تحويل أكبر بكثير21 ، والتي لوحظت مع pTRKH3_mCherry2 تبلغ حوالي 4 × 103 CFU / μg (200-250 مستعمرة لكل 200 ميكرولتر مطلي) ، مما يسمح بتطبيقات إنتاجية أعلى. كما لوحظت نتائج مماثلة للمراسل mTFP1. تم إجراء التحولات أيضا باستخدام pNZ123 (أصل الدائرة المتدحرجة pSH71) ، الذي لا يحمل أي بروتين مراسل مكون خارجي ، مما أدى إلى كفاءة تحويل 3 × 104 CFU / μg DNA (الشكل التكميلي 1).

Figure 1
الشكل 1: كفاءة التثقيب الكهربائي. تم الحصول على مجاميع 10 نانومتر pTRKH3_mTFP1 و 80 نانومتر pTRKH3_mCherry2 مخزون البلازميد من مصدرين: DH10β E. coli و dcm- / dam- methylase بالضربة القاضية E. coli. ثم تم كهرب L. reuteri ب 10 ميكرولتر من بلازميدات نمط المثيلة المختلفة وتم حساب المستعمرات. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ظروف نمو التحول
L. reuteri متسامح مع الهواء ويمكن زراعته في المرق وعلى أجار في الظروف الجوية العادية. ومع ذلك ، يعتمد نجاح التحول بشكل كبير على توليد بيئة نمو لاهوائية عند طلائها. ربما يكون هذا هو الشرط الأكثر أهمية لنجاح التحول. يمكن الكشف عن تسريبات O2 من خلال تضمين لوحة من L. reuteri غير المحولة. يتغير مورفولوجيا المستعمرة بشكل ملحوظ في وجود الأكسجين (انظر الشكل 2) ؛ بدلا من ذلك ، يمكن استخدام المؤشرات اللاهوائية (انظر جدول المواد).

Figure 2
الشكل 2: مورفولوجيا مستعمرة L. reuteri. تحولت المستعمرات مع البلازميد pTRKH3_mCherry2. (أ) ظروف منخفضة O2 غير صحيحة ، تظهر المستعمرات بيضاء ، معتمة ، ناعمة ، مستديرة ، محدبة ، ولامعة. (ب) في ظل ظروف O2 الجزئية أو المتسربة ، تظهر المستعمرات بيضاء ، معتمة ، غير متموجة (متموجة) ، مستديرة ، أمبونية (مستديرة / متعرجة) ، ولامعة. (C) مستعمرات L. reuteri مع عدم وجود تحول البلازميد تحت مستويات O2 في الغلاف الجوي. تظهر المستعمرات إما معتمة أو شفافة وإما مبونية أو مسطحة. تظهر دائما فصية ومستديرة وجافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

قياس بروتين المراسل
يختلف تعبير بروتين L. reuteri DSM20016 المراسل من النوع البري ونموه بين المستعمرات (انظر الشكل 3 أ) ، مما يجعل الخصومات الدقيقة على نشاط النظام صعبة. من الممكن اختيار وعلاج L . reuteri DSM20016 من النوع البري المحول بشكل صحيح ؛ قد تؤدي إعادة التحول إلى ظهور سلالات ذات طفرات تمكن من زيادة كفاءة التحول. بدت إحدى السلالات التي تم تطويرها عبر هذه الطريقة أكثر استقرارا من حيث تعبير البروتين المراسل (انظر الشكل 3 ب). من المستحسن البحث عن مثل هذه الطفرات ، عن طريق معالجة البلازميد وإعادة التحويل ، قبل القيام بالعمل الذي يتطلب تعبيرا مضبوطا للبروتين.

Figure 3
الشكل 3: النمو ، مضان المراسل ، ونتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة ل L. reuteri المتحولة. تستخدم كلتا التجربتين pTRKH3_mCherry2 البلازميد عند 80 نانومتر. (أ، ب) يشير كل عمود عبر كل من قطع الأراضي الفرعية الثلاثة إلى قيمة OD لنفس المستعمرة ، وقيمة التألق (على سبيل المثال: 589 نانومتر ؛ Em: 610 نانومتر) ، ونتيجة PCR (تشير الكتلة الصلبة إلى النطاق الصحيح الذي تمت ملاحظته). (أ) جميع المستعمرات من L. reuteri DSM20016 التحويل المختار (تحويل التحكم = مستعمرات صفرية). المستعمرات المحتضنة في مرق MRS المصفى لمدة 24 ساعة قبل القياس عند الكسب 100. (ب) تم اختيار ما مجموعه 88 مستعمرة تم اختيارها من سلالة L. reuteri DSM20016 لتحقيق كفاءات تحويل أعلى ، وإنتاج بروتين مراسل أكثر اتساقا ، وتثبيط أقل لتفاعل البوليميراز المتسلسل (تحويل التحكم = مستعمرات صفرية). المستعمرات المحتضنة في مرق MRS المصفى لمدة 24 ساعة قبل القياس عند الكسب 200. عناصر التحكم باللون الأزرق ، C = عنصر تحكم DSM20016 خلية غير محولة ، M = التحكم في الوسائط فقط في مرق MRS المصفى ، وأشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مستعمرة PCR
لا ينبغي استخدام مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل كوسيلة وحيدة لاستنتاج التحول الصحيح ، حيث يمكن أن تكون غير موثوقة حتى عندما يتم تخفيف العينات وحفظها مبردة (انظر الشكل 4). إذا كان التحكم في عدم وجود البلازميد المتضمن في التحولات يظهر مستعمرات صفرية ، فهذا يعني أن جميع المستعمرات لديها مقاومة البلازميد التي تحمل المضادات الحيوية. ومع ذلك ، إذا كانت مستعمرة PCR مطلوبة ، فإن الظروف المحسنة الموضحة هنا يمكن أن تزيد من النجاح بشكل كبير.

Figure 4
الشكل 4: مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل ل L. reuteri المتحولة. (أ) تم فحص مستعمرات L. reuteri DSM20016 بحثا عن نطاقات تفاعل البوليميراز المتسلسل الإيجابية ؛ تم الحصول على ستة وتلقيحها في مرق MRS المعقم الطازج. كانت عينات 5 ميكرولتر المأخوذة في نقاط زمنية مختلفة بعد التلقيح خاضعة لتفاعل البوليميراز المتسلسل مرة أخرى عند مستويات التخفيف المشار إليها. تشير الألوان في كل مرة / مربع تخفيف إلى نجاح استرداد PCR: أخضر = النطاق الصحيح الذي تمت ملاحظته ؛ أحمر = لم يلاحظ أي فرقة. (ب) تظهر نتائج التخفيف الثابت 100x أن تغيير درجة حرارة التحضير أدى إلى معدلات مختلفة لنجاح تفاعل البوليميراز المتسلسل: تم تحضير العينات على الثلج و PCR-ed على الفور (89.77٪) ، وأعدت في درجة حرارة الغرفة و PCR-ed على الفور (75٪) ، أو أعدت في RT ثم حضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل (27.27٪). (ج) (1) ثماني عينات تخفيف موجبة 100x (R1-8) من حالة RT. (2) بعد تركها في RT لمدة 48 ساعة ، تم فحص العينات PCR-ed مرة ثانية ، مما يدل على عدم وجود النطاقات عند ~ 1.1 كيلو بايت ؛ عناصر التحكم الإيجابية والسالبة (الممرات +/-) هي الممرات الموجودة في أقصى اليمين في C (2). كان السلم المستخدم 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي ، المدرج في جدول المواد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

L. reuteri مصغرة الإعدادية
التحضير المصغر ل L. reuteri محدود ويهدف فقط كطريقة بديلة لتأكيد تحويل البلازميد. أشار منشور سابق إلى أن بعض السلالات يتم تحليلها بشكل أكثر فعالية بواسطة mutanolysin22. تم العثور على عمل الليزوزيم الثنائي - موتانوليسين ليكون الأكثر فعالية ل L. reuteri DSM20016. يؤدي تشغيل الشطف المصغر من خلال هلام الأغاروز إلى مسحة بدلا من العصابات التي يمكن ملاحظتها. ومع ذلك ، يجب أن ينتج تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحق أحجام النطاق المتوقعة (انظر الشكل 5).

Figure 5
الشكل 5: الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ل PCR ومنتجات التحضير المصغرة. تم إعداد نفس المستعمرات الست من الشكل 4 أ باستخدام البروتوكول المنصوص عليه في هذه الورقة. (الصف السفلي) مصغرة الإعدادية eluate يظهر مسحة. (الصف العلوي) بعد إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام المحلول كقالب للحمض النووي ، لوحظت نطاقات إيجابية واضحة. كان السلم المستخدم 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي ، المدرج في جدول المواد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: كفاءات تحويل L. reuteri DSM20016 مع بلازميد pNZ123. التحولات التي أجريت مع pNZ123 (أصل الدائرة المتدحرجة pSH71) ، لا تحمل أي بروتين مراسل تأسيسي خارجي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: ملفات CAD للغرف اللاهوائية. الورقة 1: الرسم الأساسي ؛ الورقة 2: رسم طويل على الحائط ؛ الورقة 3: رسم حائط صغير ؛ الورقة 4: الرسم العلوي ؛ الورقة 5: رسم الغطاء ؛ الورقة 6: قفل رسم الشفة ؛ الورقة 7: رسم شريط المشبك ؛ ورقة 8: رسم لوحة المشبك. الورقة 9: نظرة عامة على التجميع؛ الورقة 10: نظرة عامة مع الأجزاء المرقمة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية لتحويل L. reuteri DSM20016 هي توليد ظروف النمو اللاهوائي بعد التحولات المطلية. المستعمرات المكتسبة في الظروف الهوائية هي فقط عرضية جدا وتفشل عموما في النمو عند تلقيحها في مرق MRS. يجب أيضا ممارسة طلاء حجم الاسترداد بالكامل لزيادة احتمالية نمو المستعمرة. حتى مع هاتين الخطوتين الحاسمتين ، لا تزال كفاءة التحويل تشكل قيدا على التجريب ، حيث يمكن أن يصل عدد المستعمرات المتوقعة إلى واحد أو اثنين لكل لوحة أثناء التحولات (انظر الشكل 1).

تم استخدام حاويات الطعام التجارية في البداية ووجد أنها غير كافية لاستبعاد O2 بشكل ثابت. يمكن العثور على ملفات CAD للغرف اللاهوائية التي صممها متجر الآلات بالجامعة في الملف التكميلي 1. نظرا لأن هذه الصناديق يمكن أن تسلل الهواء أحيانا من خلال فجوات صغيرة في النجارة ، ينصح بملئها بالماء (غير مغلق) للتحقق من وجود أي تسرب قبل الاستخدام الأول ؛ الشيكات اللاحقة ليست ضرورية بشكل عام. يجب أن تحتوي هذه الصناديق على أنظمة استبدال O 2 بدلا من أنظمة عزل O2 ، حيث لم يتم اختبارها للضغط.

يمكن أن تنشأ قضايا وسائل الإعلام. مرق MRS المعقم انتقائي ولكنه يمتلك خصائص فلورية ذاتية عالية ، مما يعيق قياس قراءات الفلورسنت المنخفضة. التعديل لاستخدام مرق MRS المعقم بالمرشح يخفف من هذه المشكلة ، ولكنه أقل انتقائية. يخفض L. reuteri الرقم الهيدروجيني للوسائط إلى حوالي الرقم الهيدروجيني 4 بعد 24 ساعة (انظر الشكل 6) ، لذلك تتطلب الوسائط التخزين المؤقت للكشف عن GFP23 الحساس للأحماض. قمنا بتعديل هذا البروتوكول لاستخدام mCherry2 أكثر مقاومة للأحماض بدلا من ذلك ، وتجنب هذه المشكلة.

Figure 6
الشكل 6: الرقم الهيدروجيني بمرور الوقت من L. reuteri في مرق MRS. L. reuteri DSM20016 يخفض الرقم الهيدروجيني بمرور الوقت (خط متقطع) ؛ تشير قيمة pKa إلى الرقم الهيدروجيني الذي يكون عنده مضان البروتين المراسل 50٪ من القيمة القصوى بسبب الحموضة (الخطوط الأفقية). EGFP pKa = 6 ، mTFP1 pKa = 4.3 ، mCherry2 pKa = 3.3. كل بروتين مراسل لديه فعالية مراسل تنخفض إلى 50٪ من التألق الأقصى في نقاط زمنية مختلفة بسبب حساسياتها الحمضية عند إنتاجها داخل L. reuteri (الخطوط الرأسية) الحمضية بشكل متزايد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ل. روتيري يبدو أن DSM20016 يثبط جهود تفاعل البوليميراز المتسلسل في المستعمرة ، مما يحد بشدة من فائدة هذا الإجراء. يمكن أن يؤدي أقل من 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية بعد الخطوة 4.3 إلى زيادة معدل فشل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، بينما يؤدي 48 ساعة عند RT إلى فشل PCR الكامل (انظر الشكل 4B ، C). يعد التعديل لتخفيف العينات والاحتفاظ بها على الجليد في جميع الأوقات أمرا بالغ الأهمية لزيادة نجاح تفاعل البوليميراز المتسلسل في المستعمرة.

لا يزال الكثير غير معروف عن الوظائف الداخلية ل L. reuteri DSM20016. يجب أن تعني لوحات التحكم في التحويل التي لا تحتوي على بلازميد مضاف أثناء التثقيب الكهربائي ، والتي تظهر مستعمرات صفرية ، أن أي مستعمرات موجودة في حالة البلازميد تمتلك البلازميد. ومع ذلك ، فقد ثبت أن تفاعل البوليميراز المتسلسل المستعمر اللاحق لا يؤكد بشكل موثوق امتصاص البلازميد حتى مع التعديلات. قد يكون هذا بسبب تقييد نوكلياز الداخلية التي تحلل شظايا الحمض النووي PCR. تمت مصادفة نوكلياز داخلي في أنواع Lactobacillaceae الأخرى وتم التغلب عليها عن طريق استخدام dam-/ dcm-E.coli 19،20. ل. روتيري يحتوي DSM20016 على العديد من إنزيمات تعديل التقييد المفترضة المشروحة عبر التحليل الحسابي24. يمكن زيادة كفاءة تحويل DSM20016 بشكل أكبر إذا كان من الممكن توصيف مواقع التعرف على إنزيم تعديل التقييد (RM) وتجنبها. هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق.

تقدم طريقة التثقيب الكهربائي المعدلة الموضحة في هذه الورقة بديلا أقل تعقيدا وأكثر حداثة لطريقة تم وصفها سابقا ل L. reuteri DSM20016 بواسطة Ahrne et al.25- تبحث هذه الورقة في الشروط الهامة التي قدمها Ahrne et al. فيما يتعلق بمتطلبات مثيلة السدود / dcm لامتصاص البلازميد ، والتي لم يتم تأكيدها. تؤكد طريقة التحويل الموضحة في هذه الورقة أيضا على متطلبات النمو اللاهوائي الحرجة بعد الطلاء ، والتي لم يتم نقلها صراحة بواسطة Ahrne et al.

يمكن استخدام بعض الأساليب والأساليب المنصوص عليها هنا في التطبيقات المستقبلية لمساعدة محاولات التلاعب الأخرى لعائلة Lactobacillaceae ، ولا سيما: تضمين لوحات التحكم في التحويل ، واستخدام المراسل المقاوم للأحماض mCherry2 ، ومتطلبات درجة حرارة PCR للمستعمرة ، وإدراج mutanolysin المصغر. ومع ذلك ، قد لا يزال البعض بحاجة إلى تعديلات للعمل على النحو الأمثل في سلالات أخرى.

ل. روتيري DSM20016 ذو أهمية سريرية وزراعية نظرا لموقعه ليس فقط كفقاريات عامة (مع استخدامات محتملة كمادة مضافة في علف الماشية) ، ولكن أيضا كواحد من عدد صغير جدا من سلالات عائلة Lactobacillaceae المرتبطة ارتباطا جوهريا ببيئة الأمعاء البشرية8. سيؤدي التلاعب الفعال بهذا الميكروب إلى فتحه كهيكل للتسليم المستقبلي للعلاجات الجديدة داخل الجهاز الهضمي والمراقبة غير الباضعة للحالات الالتهابية. في هذه المقالة ، تم تجميع هذه الطرق بشكل صريح وإثباتها بشكل جماعي مع تعديلات ، على وجه التحديد ، سلالة L. reuteri غير النموذجية DSM20016.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نحن نقدر تقديرا كبيرا المشورة القيمة التي قدمها البروفيسور جي بي فان بيكرين (جامعة ويسكونسن ماديسون) ، الذي قدمت توجيهاته بشأن العمل مع L. reuteri ATCC PTA 6475 أساسا للطرق الموضحة هنا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb Plus DNA Ladder NEB N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes Thomas Scientific 1145J12
Agarose  BioShop AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) Beckman Allegra  N/A No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet Thermo Scientific OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system VWR 58017-984
Centrifuge tubes (50 mL) FroggaBio TB50-500
DNA gel x6 loading dye NEB B7024S
Electroporation cuvette Fisherbrand FB101
Erythromycin Millipore Sigma E5389-5G
Gel electroporation bath/dock VWR 76314-748
Glycerol  BioShop GLY001
Limosilactobacillus reuteri Leibniz Institute DSMZ DSM20016 Strain designation F275
Lysozyme BioShop LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) FroggaBio LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen) Qiagen 27106 slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein 
MRS Broth (Dehydrated) Thermo Scientific CM0359B
Mutanolysin Millipore Sigma M9901-5KU
NaOH  Millipore Sigma 1064691000
P100 Pipette Eppendorf 3123000047
P1000 Pipette Eppendorf 3123000063
P2.5 Pipette Eppendorf 3123000012
P20 Pipette Eppendorf 3123000039
P200 Pipette Eppendorf 3123000055
PCR tubes FroggaBio STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge Genlantis E200100
Petri dishes VWR 25384-088
PTC-150 Thermal Cycler MJ Research N/A No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified) Addgene 27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer Thermo Scientific 840-281700
Storage microplate Fisher Scientific 14-222-225
Sucrose BioShop SUC507
TAE Buffer 50x Thermo Scientific B49
Vortex VWR 58816-121 No longer in production
VWR 1500E incubator VWR N/A No longer in production

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
  2. Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
  3. Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
  4. Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
  5. Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
  6. Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
  7. Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
  8. Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
  9. Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. Transformation of Lactobacillus by electroporation. Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).
  10. Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
  11. Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
  12. Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
  13. MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
  14. Oh, J. H., van Pijkeren, J. P. CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic Acids Research. 42 (17), 131 (2014).
  15. Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
  16. Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
  17. Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
  18. Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
  19. Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M. Genetic engineering of Lactobacillus diolivorans. FEMS Microbiology Letters. 344 (2), 152-158 (2013).
  20. Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
  21. Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
  22. O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
  23. Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
  24. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, Database issue D298-D299 (2015).
  25. Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 196،
طرق التثقيب الكهربائي وتأكيد التحول في <em>Limosilactobacillus reuteri</em> DSM20016
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duggan, A., McMillen, D. Methods for … More

Duggan, A., McMillen, D. Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016. J. Vis. Exp. (196), e65463, doi:10.3791/65463 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter