Summary
Ici, nous présentons des protocoles pour travailler avec Limosilactobacillus reuteri DSM20016, détaillant la croissance, la transformation plasmidique, la PCR de colonie, la mesure de protéines rapporteures fluorescentes et la mini-préparation plasmidique limitée, ainsi que les problèmes courants et le dépannage. Ces protocoles permettent la mesure des protéines rapporteures dans DSM20016, ou la confirmation par PCR de colonie si aucun rapporteur n’est impliqué.
Abstract
Lactobacillus était un genre incroyablement grand et diversifié de bactéries comprenant 261 espèces, dont plusieurs étaient des souches commensales avec le potentiel d’être utilisé comme châssis pour des activités biologiques synthétiques dans le tractus gastro-intestinal. La grande variation phénotypique et génotypique observée au sein du genre a conduit à une reclassification récente et à l’introduction de 23 nouveaux genres.
En raison de l’ampleur des variations au sein des anciens genres, les protocoles démontrés chez un membre peuvent ne pas fonctionner comme annoncé avec d’autres membres. Un manque d’informations centralisées sur la façon exacte de manipuler des souches spécifiques a conduit à une gamme d’approches ad hoc , souvent adaptées à partir d’autres familles bactériennes. Cela peut compliquer les choses pour les chercheurs qui débutent dans le domaine, qui peuvent ne pas savoir quelle information s’applique ou non à la souche choisie.
Dans cet article, nous visons à centraliser un ensemble de protocoles dont le succès a été démontré, en particulier dans la désignation de la souche Limosilactobacillus reuteri F275 (autres numéros de collection: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), ainsi que des conseils de dépannage et des problèmes courants que l’on peut rencontrer. Ces protocoles devraient permettre à un chercheur ayant peu ou pas d’expérience de travail avec L. reuteri DSM20016 de transformer un plasmide, de confirmer la transformation et de mesurer la rétroaction du système dans un lecteur de plaques via une protéine rapporteur.
Introduction
Le genre Lactobacillus a été historiquement classé comme gram-positif, en forme de bâtonnet, non sporulé, anaérobie facultatif ou microaérophiles qui décomposent les sucres pour produire principalement de l’acide lactique1. Ces critères vagues ont conduit à Lactobacillus étant, phénotypiquement et génotypiquement, un genre extrêmement diversifié. Cette vaste catégorisation a entraîné la reclassification du genre, introduisant 23 nouveaux genres en 20202.
L’ancien genre, plus large, comprenait les principales espèces commensales et probiotiques généralement considérées comme sûres (GRAS) pour la consommation3. La famille des lactobacillacées maintient une perception publique d’être de « bonnes bactéries » en raison de nombreux avantages pour la santé rapportés conférés par la consommation de diverses souches 4,5,6,7. La facilité avec laquelle ils peuvent naviguer dans le tractus gastro-intestinal8 et leur acceptation par le public se combinent pour positionner les souches de Lactobacillaceae comme des candidats solides en tant qu’organismes de châssis pour des applications médicinales, thérapeutiques ou diagnostiques ingérables.
Le large éventail de caractéristiques présentes dans la famille des Lactobacillaceae a conduit à une situation dans laquelle il n’y a pas de souche d’organisme modèle de facto ; Les groupes de recherche ont eu tendance à sélectionner les espèces dont les propriétés correspondent le mieux à leurs objectifs particuliers. (Par exemple, les laboratoires de fermentation laitière pourraient choisir L. lactis; les études sur la fermentation végétale pourraient sélectionner L. plantarum; la recherche sur les probiotiques pourrait se concentrer sur L. acidophilus; et ainsi de suite.)
Ce même large éventail de caractéristiques à travers les espèces a conduit à une accumulation de protocoles et de procédures qui peuvent bien fonctionner pour un sous-ensemble de la famille des Lactobacillaceae , mais nécessitent une optimisation pour fonctionner efficacement (ou peut-être pour fonctionner du tout) dans d’autres9. Ce besoin d’optimisation entre les membres de la famille et même au sein des membres d’une même espèce peut contrecarrer les efforts de chercheurs inconnus. Les protocoles publiés dans les sections méthodes des articles peuvent également inclure leurs propres modifications10, ce qui conduit à des collections de protocoles fragmentées et décentralisées.
L. reuteri est considéré comme un commensal largement vertébré, présent de manière constante dans les voies gastro-intestinales (GI) des mammifères, des oiseaux11 et des poissons12. Les sous-souches de L. reuteri sont souvent génétiquement spécialisées, par adaptation de la protéine d’adhésion du mucus, pour coloniser de façon plus permanente des hôtes indigènes spécifiques 8,11,13. Les espèces de Limosilactobacillus peuvent être isolées chez des hôtes en dehors de leur hôte indigène, mais tendent davantage vers une nature transitoire8.
En raison de la spécialisation homme-hôte, L. reuteri se positionne DSM20016 très bien comme un châssis pour des applications diagnostiques ou thérapeutiques à n’importe quel point du tractus gastro-intestinal humain, et la souche DSM20016 pourrait fournir une fenêtre d’effet plus durable pour les interventions par rapport aux souches plus transitoires.
Dans cet article, nous décrivons une série de protocoles dont l’efficacité a été démontrée chez Limosilactobacillus reuteri (désignation de la souche : F275 ; autres numéros de collection : DSM20016, ATCC23272 CIP109823), ainsi que des informations centralisées sur la souche provenant d’autres sources pour faciliter les applications de biologie moléculaire et systémique. Les procédures décrites dans le présent document devraient permettre à un chercheur sans expérience préalable de cultiver L. reuteri des stocks électrocompétents, de sélectionner des colonies transformées, de confirmer la transformation par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) et de mesurer la réponse du système conçu au moyen de protéines rapporteures fluorescentes.
Nous notons que des protocoles connexes ont couvert la recombinaison du génome de l’ADNss assistée par CRISPR-Cas9 chez L. reuteri (souche : ATCC-PTA-6475)14, et l’édition du génome assistée par la nickase CRSIPR-Cas9 dans plusieurs colorations de la famille des Lactobacillaceae non L. reuteri 15,16 ; ceux-ci ne traitent toutefois pas de la souche DSM20016 L. reuteri sur laquelle nous nous concentrons ici.
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Protocol
1. Préparation de cellules électrocompétentes DSM20016 L. reuteri
NOTE: Ceci est basé sur un protocole de Berthier et al.17, avec des vitesses de centrifugation informées par Rattanachaikunsopon et al.18.
- Dans un tube à centrifuger de 50 mL, inoculer L. reuteri à partir d’un stock de glycérol dans 6 mL de bouillon deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incuber en aérobiose pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur statique.
- Le lendemain matin, inoculer 4 mL de la culture de nuit dans 200 mL de bouillon MRS (dilution de 1:50).
- Laisser croître en aérobie dans un incubateur statique à 37 °C jusqu’à ce que la valeur de densité optique de 600 nm (OD600) atteigne 0,5-0,85; Cela devrait prendre environ 2-3 h.
- Dès qu’une valeur adéquate de OD600 est atteinte, décanter le média dans des tubes à centrifuger de 50 ml et placer sur de la glace tout en équilibrant les tubes.
- Centrifuger pendant 5 min à 5 000 x g dans une centrifugeuse préréfrigérée à 4 °C.
- Jeter le surnageant, remettre chaque pastille en suspension dans 50 mL deddH2Oprérefroidi (0 °C à 4 °C) et centrifuger à nouveau avec les mêmes réglages que l’étape précédente. Gardez les cellules sur la glace autant que possible.
- Répétez l’étape 1.6.
- Remettez chaque pastille en suspension dans 25 mL deddH2O: 0,5 M de saccharose, 10 % de glycérol. Centrifuger à 5 000 x g à 4 °C pendant 10 min. Jetez le surnageant et remettez les cellules sur la glace.
- Remettez toutes les pastilles en suspension dans les mêmes 2 mL deddH2O: 0,5 M de saccharose, 10 % de glycérol.
- Aliquote en portions de 50 μL à 100 μL dans des tubes microcentrifugés prérefroidis; Conserver à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
2. Électroporation de L. reuteri
REMARQUE: Évitez de pipeter autant que possible dans les étapes suivantes. L’inclusion d’une électroporation témoin, sans plasmide ajouté, est conseillée pour s’assurer que la sélection des antibiotiques est adéquate.
- Prenez une aliquote de L. reuteri électrocompétente entière et décongelez-la sur de la glace.
- Mélanger délicatement 5 μL à 10 μL de plasmide (concentration plasmidique finale >6 nM) dans l’aliquote décongelée, en évitant autant que possible de pipeter.
- Transférer dans une cuvette d’électroporation glacée de 1 mm.
- Électroporate à 1,25 kV, 400 Ω et 25 μF.
- Ajouter 1 mL de bouillon MRS à température ambiante (RT) et mélanger en retournant la cuvette une ou deux fois.
- Placer les cuvettes dans un incubateur statique à 37 °C pendant 2,5 à 3 h pour permettre la récupération.
- Plaquer la quantité entière sur plusieurs plaques de gélose MRS avec la sélection appropriée.
- Placez les assiettes dans un récipient complètement hermétique avec une petite bougie allumée (« tealight ») et un sachet générateur d’atmosphère anaérobie.
- Cultiver à 37 °C pendant 2-3 jours ou jusqu’à ce que des colonies visibles soient présentes.
3. Mesure de la protéine rapporteur fluorescente résistante aux acides mCherry2
- Prélever toutes les colonies nécessaires à la mesure et inoculer dans une microplaque de stockage de 96 puits avec 1,5 mL de bouillon MRS stérilisé par filtre (non autoclavé) par puits et un antibiotique de sélection approprié.
- Incuber en aérobiose pendant 24 h pendant la nuit à 37 °C sans agiter.
NOTE: Cette microplaque de stockage doit être conservée pour être utilisée dans la section 4 (PCR de colonie). - L. reuteri précipite hors du milieu lorsqu’il est en phase stationnaire; Resuspendre la culture de nuit par pipetage.
- Transférer 200 μL dans une plaque plane à fond clair de 96 puits, transférer la plaque dans un lecteur de plaque et mesurer la DO et la fluorescence de mCherry2 (excitation [Ex] : 589 nm; émission [Em] : 610 nm) ou d’autres déclarants pertinents.
4. Confirmation de l’absorption plasmidique par PCR des colonies
- À partir de la microplaque de stockage de 96 puits de la section 3, transférer 5 μL dans un tube PCR.
NOTE: Si >5 minutes se sont écoulées, il peut être nécessaire de remettre en suspension le L. reuteri une deuxième fois. - Dans une microcentrifugeuse portative de paillasse, faire tourner vers le bas jusqu’à ce que la pastille soit visible (environ 2 min à 2 000 x g), jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 20 μL de NaOH 20 mM.
- Faire bouillir à 95 °C pendant 5 min, vortex, et répéter l’ébullition une deuxième fois.
- Refroidir immédiatement les échantillons; essayez de garder les échantillons sur la glace autant que possible dans les étapes suivantes pour réduire la probabilité de dégradation du gabarit et d’inhibition de la PCR.
- Faites tourner dans une microcentrifugeuse portative de paillasse à 2 000 x g pendant 2 minutes jusqu’à ce que les débris cellulaires soient enrobés, puis prenez 1 μL du surnageant et diluez dans 99 μL de DNase et de RNase glacés ddH2O (dilution 100x).
- Utilisez la dilution 100x comme ADN modèle dans une réaction PCR standard à l’aide d’amorces spécifiques au plasmide. Inclure un témoin positif avec un plasmide dérivé de la mini-préparation E. coli.
- Remettre les échantillons sur de la glace et ajouter un colorant de chargement approprié à une concentration de 1x.
- Introduire dans du gel d’agarose à 1 % dans un tampon TAE (acide tris-acétate-éthylènediaminetétraacétique [EDTA]) à 110 V pendant 30 min. Image si nécessaire.
5. Protocole de mini-préparation pour L. reuteri , suivi d’une PCR pour confirmer la présence de plasmides
REMARQUE : Protocole destiné à être utilisé avec la trousse de mini-préparation indiquée dans le tableau des matières.
- Inoculer L. reuteri dans 10 mL de bouillon MRS contenant un antibiotique approprié et incuber pendant une nuit en aérobie à 37 °C dans un incubateur statique.
- Centrifuger à 5 000 x g pendant 10 min dans une centrifugeuse pré-réfrigérée à 4 °C.
- Laver la pastille dans 2 mL de tampon P1 standard (inclus avec la trousse) afin d’éliminer l’acidité qui peut interférer avec les étapes ultérieures, centrifuger avec le même réglage que décrit précédemment et jeter le surnageant.
- Resuspendre la pastille dans 250 μL de tampon P1 modifié contenant 10 mg/mL de lysozyme et 100 U/mL de mutanolysine afin de lyser les cellules bactériennes. Incuber pendant 1-2 h à 37 °C.
- Ajouter 250 μL de tampon P2, mélanger en retournant quatre à six fois et incuber à TA pendant 5 minutes au maximum.
- Ajouter 350 μL de tampon N3 (inclus avec le kit) et retourner immédiatement quatre à six fois doucement pour mélanger.
- Centrifuger à 10 000 x g pendant 10 min.
- Transférer autant de surnageant que possible dans une colonne de rotation et centrifuger à 10 000 x g pendant 60 s. Ignorez le flux.
- Lavez la colonne d’essorage avec 500 μL de tampon PB (inclus avec le kit) et centrifugez à 10 000 x g pendant 60 s. Ignorez le flux.
- Lavez la colonne d’essorage avec 750 μL de tampon PE (inclus avec le kit) et centrifugez à 10 000 x g pendant 60 s. Éliminer l’écoulement continu et centrifuger pendant 60 s pour éliminer tout tampon résiduel.
- Placer la colonne d’essorage dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Appliquer 20 à 30 μL de ddH2O sans ADN et ARNase sur le filtrede la colonne de spin et laisser reposer 1 à 2 min, avant de centrifuger à 10 000 x g pendant 60 s.
- Effectuer une réaction PCR standard à l’aide d’amorces spécifiques au plasmide (pTRKH3_pTUSeq_F : CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R : CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), l’éluat fournissant l’ADN modèle. Inclure un témoin positif avec un plasmide dérivé de la mini-préparation E. coli.
NOTE: Les paramètres de PCR utilisés dans cette étude sont les suivants: 98 °C pendant 5 min, (98 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 45 s) 30 cycles, 72 °C pendant 2 min, 4 °C maintien. Les paramètres dépendent fortement de la polymérase utilisée, de la longueur du fragment et des amorces exactes utilisées par toute personne utilisant ce protocole.
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Representative Results
Efficacité de la transformation
L. reuteri ne nécessite pas de plasmide non méthylé dcm-/dam-, comme observé pour d’autres Lactobacillaceae19,20 (voir Figure 1). L’électroporation de L. reuteri DSM20016 avec 10 μL du plasmide de 8,5 kb pTRKH3_mCherry2 (pAMβ1 origine thêta de la réplication) devrait donner des efficacités de transformation d’environ 80 unités formant colonies (UFC)/μg (cinq à huit colonies par 200 μL plaqués), quelle que soit la condition de méthylation plasmidique. Avec le durcissement sélectif et la retransformation, il est possible d’obtenir des souches mutées de L. reuteri avec des efficacités de transformation beaucoupplus grandes 21, observées avec des pTRKH3_mCherry2 d’environ 4 x 103 UFC / μg (200-250 colonies par 200 μL plaqués), permettant des applications à débit plus élevé. Des résultats similaires ont également été observés pour le rapporteur mTFP1. Des transformations ont également été réalisées avec pNZ123 (pSH71 rolling circle origin), ne portant aucune protéine rapporteure constitutive exogène, ce qui a entraîné des efficacités de transformation de 3 x 104 UFC / μg d’ADN (Figure supplémentaire 1).
Figure 1 : Efficacité de l’électroporation. Des stocks totaux de 10 nM pTRKH3_mTFP1 et 80 nM pTRKH3_mCherry2 stocks plasmidiques ont été obtenus à partir de deux sources : DH10β E. coli et E. coli knockout dcm-/dam-methylase. L. reuteri a ensuite été électropoté avec 10 μL des deux plasmides de méthylation différents et les colonies ont été comptées. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Conditions de croissance de la transformation
L. reuteri est aérotolérant et peut être cultivé en bouillon et en gélose dans des conditions atmosphériques normales. Cependant, le succès de la transformation repose fortement sur la génération d’un environnement de croissance anaérobie lorsqu’il est plaqué; C’est peut-être la condition la plus importante pour le succès de la transformation. Les fuites O2 peuvent être détectées en incluant une plaque de L. reuteri non transformée. La morphologie des colonies change sensiblement en présence d’oxygène (voir la figure 2); des indicateurs anaérobies peuvent également être utilisés (voir le tableau des matériaux).
Figure 2 : Morphologie de la colonie de L. reuteri. Colonies transformées avec le plasmide pTRKH3_mCherry2. (A) Sous-corriger les conditions de faible teneur enO2, les colonies apparaissent blanches, opaques, lisses, rondes, convexes et brillantes. (B) Dans des conditions partielles ou perméables d’O2, les colonies apparaissent blanches, opaques, ondulées (ondulées), rondes, ombonées (arrondies/noueuses) et brillantes. (C) Colonies de L. reuteri sans transformation plasmidique sous les niveaux atmosphériques d’O2. Les colonies apparaissent opaques ou translucides et soit ombonées, soit plates; Ils apparaissent toujours lobés, ronds et secs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Mesure de la protéine rapporteur
L’expression et la croissance de la protéine rapporteure L. reuter DSM20016 i de type sauvage varient d’une colonie à l’autre (voir la figure 3A), ce qui rend difficiles les déductions précises sur l’activité du système. Il est possible de sélectionner et de guérir correctement les DSM20016 de L . reuteri de type sauvage correctement transformés; La retransformation peut donner lieu à des souches avec des mutations permettant une plus grande efficacité de transformation. Une souche développée par cette méthode semblait beaucoup plus stable en termes d’expression de la protéine rapporteur (voir Figure 3B). Il est conseillé de rechercher de telles mutations, par durcissement plasmidique et retransformation, avant d’effectuer des travaux nécessitant une expression protéique ajustée.
Figure 3 : Résultats de la croissance, de la fluorescence du rapporteur et de la PCR des colonies pour L. reuteri transformé. Les deux expériences utilisent pTRKH3_mCherry2 plasmide à 80 nM. (A,B) Chaque colonne de chacune des trois sous-parcelles fait référence à la valeur OD de la même colonie, valeur de fluorescence (Ex: 589 nm; Em: 610 nm) et résultat de la PCR (le bloc solide indique la bande correcte observée). (A) Toutes les colonies de L. reuteri DSM20016 transformation prélevées (transformation de contrôle = zéro colonies). Colonies incubées dans un bouillon MRS filtré pendant 24 h avant mesure au gain 100. (B) Un total de 88 colonies choisies dans la souche de L. reuteri DSM20016 sélectionnée pour une efficacité de transformation plus élevée, une production plus constante de protéines rapporteures et une inhibition plus faible de la PCR (transformation de contrôle = zéro colonie). Colonies incubées dans un bouillon MRS filtré pendant 24 h avant mesure au gain 200. Les contrôles sont en bleu, C = contrôle de cellule DSM20016 non transformé, M = contrôle de média de bouillon MRS filtré uniquement et les barres d’erreur indiquent l’écart type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
PCR colonie
La PCR des colonies ne doit pas être utilisée comme seul moyen de déduire une transformation correcte, car elle peut être peu fiable même lorsque les échantillons sont dilués et conservés au frais (voir Figure 4). Si le contrôle sans plasmide inclus avec les transformations ne présente aucune colonie, cela implique que toutes les colonies ont le plasmide porteur de résistance aux antibiotiques. Cependant, si la PCR de colonie est nécessaire, les conditions optimisées décrites ici peuvent considérablement augmenter le succès.
Figure 4 : PCR de colonies de L. reuteri transformés. (A) L. reuteri DSM20016 colonies ont été dépistés pour les bandes PCR positives; six ont été obtenus et inoculés dans du bouillon MRS autoclavé frais. Des échantillons de 5 μL prélevés à divers moments après l’inoculation ont été soumis à nouveau à la PCR aux niveaux de dilution indiqués. Les couleurs dans chaque case temps/dilution indiquent le succès de la récupération PCR : vert = bande correcte observée; rouge = aucune bande observée. (B) Les résultats d’une dilution fixe de 100x montrent que la variation de la température de préparation a entraîné des taux différents de réussite de la PCR : les échantillons ont été préparés sur glace et PCR-ed immédiatement (89,77 %), préparés à température ambiante et PCR-ed immédiatement (75 %), ou préparés à TA puis incubés à 37 °C pendant 30 minutes avant la PCR (27,27 %). (C) (1) Huit échantillons positifs de dilution 100x (R1-8) provenant de l’état RT. (2) Après avoir été laissés à RT pendant 48 h, les échantillons ont été PCR-ed une deuxième fois, montrant une absence des bandes à ~1,1 kb; les témoins positifs et négatifs (voies +/-) sont les voies les plus à droite en C (2). L’échelle utilisée était de 1 kb plus l’échelle d’ADN, répertoriée dans le tableau des matériaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
L. reuteri mini-préparation
La mini-préparation pour L. reuteri est limitée et conçue uniquement comme une méthode alternative de confirmation de transformation plasmidique. Une publication antérieure notait que certaines souches sont plus efficacement lysées par la mutanolysine22; L’action double lysozyme-mutanolysine s’est avérée la plus efficace pour L. reuteri DSM20016. L’exécution de la mini-préparation élua à travers un gel d’agarose entraîne un frottis plutôt que des bandes observables. La PCR ultérieure devrait toutefois produire les tailles de bande attendues (voir la figure 5).
Figure 5 : Électrophorèse sur gel d’agarose des produits PCR et mini-prep. Les six mêmes colonies de la figure 4A ont été mini-préparées à l’aide du protocole décrit dans le présent document. (Rangée du bas) Mini-prépa éluat montre un frottis. (Rangée du haut) Après que la PCR a été réalisée en utilisant l’éluant comme modèle d’ADN, des bandes positives claires sont observées. L’échelle utilisée était de 1 kb plus l’échelle d’ADN, répertoriée dans le tableau des matériaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Efficacité de transformation de L. reuteri DSM20016 avec le plasmide pNZ123. Transformations réalisées avec pNZ123 (origine cercle roulant pSH71), ne portant aucune protéine rapporteure constitutive exogène. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 1 : Fichiers CAO pour chambres anaérobies. Feuille 1: Dessin de base; Feuille 2: Dessin mural long; Feuille 3: Petit dessin mural; Feuille 4: Dessin du haut; Feuille 5: Dessin du couvercle; Feuille 6: Dessin des lèvres verrouillées; Feuille 7: Dessin de la barre de serrage; Feuille 8: Dessin de la plaque de serrage; Fiche 9: Vue d’ensemble de l’assemblage; Fiche 10 : Vue d’ensemble avec parties numérotées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’étape la plus critique pour la transformation de L. reuteri DSM20016 est la génération de conditions de croissance anaérobie après que les transformations ont été plaquées; Les colonies acquises dans des conditions aérobies ne sont que très occasionnelles et ne se développent généralement pas lorsqu’elles sont inoculées dans du bouillon MRS. Le placage de l’ensemble du volume de récupération doit également être pratiqué pour maximiser la probabilité de croissance de la colonie. Même avec ces deux étapes critiques, l’efficacité de la transformation est toujours une limite à l’expérimentation, car les colonies attendues peuvent être aussi faibles qu’une ou deux par plaque pendant les transformations (voir Figure 1).
Des contenants alimentaires commerciaux ont d’abord été utilisés et jugés insuffisants pour assurer l’exclusion cohérente de l’O2. Les fichiers CAO pour les chambres anaérobies conçues par l’atelier d’usinage de l’université se trouvent dans le dossier supplémentaire 1. Étant donné que ces boîtes peuvent parfois avoir des infiltrations d’air par de petits espaces dans la menuiserie, il est conseillé de les remplir d’eau (non scellée) pour vérifier les fuites avant la première utilisation; Des contrôles ultérieurs ne sont généralement pas nécessaires. Ces boîtes devraient être équipées de systèmes de remplacement O 2 plutôt que de systèmes de séquestration O2, car elles n’ont pas été testées pour la pressurisation.
Des problèmes liés aux médias peuvent survenir; Le bouillon MRS autoclavé est sélectif mais possède des propriétés hautement auto-fluorescentes, ce qui entrave la mesure des lectures fluorescentes faibles. La modification visant à utiliser un bouillon de SRM stérilisé par filtre améliore ce problème, mais est moins sélective. L. reuteri abaisse le pH du milieu à environ pH 4 après 24 h (voir Figure 6), de sorte que le milieu nécessite une mise en mémoire tampon pour détecter la GFP23 sensible à l’acide. Nous avons modifié ce protocole pour utiliser mCherry2 plus résistant aux acides, évitant ainsi ce problème.
Figure 6 : pH au fil du temps de L. reuteri dans le bouillon MRS. L. reuteri DSM20016 abaisse le pH au fil du temps (ligne pointillée); la valeur du pKa indique le pH auquel la fluorescence de la protéine rapporteur serait de 50 % de la valeur maximale en raison de l’acidité (lignes horizontales). EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4,3, mCherry2 pKa = 3,3. Chaque protéine rapporteur a une efficacité de rapporteur réduite à 50% de la fluorescence maximale à différents moments en raison de leur sensibilité acide lorsqu’elles sont produites dans des L. reuteri (lignes verticales) de plus en plus acides. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
L. reuteri DSM20016 semble inhiber les efforts de PCR des colonies, limitant considérablement l’utilité de cette procédure. Aussi peu que 30 minutes à 37 °C après l’étape 4.3 peuvent augmenter le taux d’échec de la PCR, tandis que 48 h à RT entraînent une défaillance complète de la PCR (voir Figure 4B,C). La modification visant à diluer les échantillons et à les garder sur la glace en tout temps est essentielle pour augmenter le succès de la PCR des colonies.
Beaucoup reste inconnu sur les fonctions internes de L. reuteri DSM20016. Les plaques de contrôle de transformation sans plasmide ajouté pendant l’électroporation, montrant zéro colonie, devraient impliquer que toutes les colonies présentes dans l’état plasmidique possèdent le plasmide. Cependant, il a été démontré que la PCR ultérieure des colonies ne confirmait pas de manière fiable l’absorption plasmidique, même avec des modifications. Cela pourrait être dû à des endonucléases de restriction dégradant les fragments d’ADN PCR. Des endonucléases ont été rencontrées chez d’autres espèces de Lactobacillaceae et surmontées par l’utilisation de dam-/dcm-E.coli 19,20. L. reuteri DSM20016 a plusieurs enzymes putatives de restriction-modification annotées par analyse informatique24. L’efficacité de transformation de DSM20016 pourrait être encore améliorée si ses sites de reconnaissance enzymatique de modification de restriction (RM) pouvaient être caractérisés et évités. Une enquête plus approfondie est nécessaire.
La méthode d’électroporation modifiée décrite dans cet article offre une alternative moins complexe et plus moderne à une méthode précédemment décrite pour L. reuteri DSM20016 par Ahrne et al.25. Le présent document examine les principales dispositions prises par Ahrne et coll. concernant les exigences en matière de méthylation par les mères/dcm- pour l’absorption des plasmides, qui n’ont pas été corroborées. La méthode de transformation décrite dans le présent document met également l’accent sur l’exigence critique de croissance anaérobie après le placage, qui n’a pas été explicitement exprimée par Ahrne et al.
Certaines méthodes et approches décrites ici peuvent être utilisées dans des applications futures pour aider d’autres tentatives de manipulation de la famille des Lactobacillaceae , notamment: l’inclusion de plaques de contrôle de transformation, l’utilisation du rapporteur résistant aux acides mCherry2, les exigences de température PCR des colonies et l’inclusion de mutanolysine mini-préparation. Cependant, certaines peuvent encore avoir besoin de modifications pour fonctionner de manière optimale dans d’autres souches.
L. reuteri DSM20016 est d’une importance clinique et agricole en raison de sa position non seulement en tant que commensal générique de vertébrés (avec des utilisations potentielles comme additif dans l’alimentation du bétail), mais aussi en tant que l’une des très rares souches de la famille des lactobacillaceae intrinsèquement associées à l’environnement intestinal humain8. Une manipulation efficace de ce microbe l’ouvrira en tant que châssis pour la livraison future de nouvelles thérapies dans le tractus gastro-intestinal et la surveillance non invasive des conditions inflammatoires. Dans cet article, ces méthodes ont été explicitement rassemblées et démontrées collectivement avec des modifications pour, en particulier, la souche non modèle de L. reuteri DSM20016.
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Disclosures
Il n’existe aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous apprécions grandement les précieux conseils fournis par le professeur J.P. van Pijkeren (Université du Wisconsin-Madison), dont les conseils sur le travail avec L. reuteri ATCC PTA 6475 ont fourni une base pour les méthodes décrites ici.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
References
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