Summary
Aqui, apresentamos protocolos para trabalhar com Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detalhando crescimento, transformação plasmidial, PCR de colônias, medição de proteína repórter fluorescente e mini-preparação limitada de plasmídeos, bem como problemas comuns e solução de problemas. Esses protocolos permitem a medição de proteínas repórteres em DSM20016, ou a confirmação via PCR de colônia se nenhum repórter estiver envolvido.
Abstract
Lactobacillus eram um gênero incrivelmente grande e diversificado de bactérias compreendendo 261 espécies, várias das quais eram cepas comensais com potencial para uso como chassi para empreendimentos biológicos sintéticos dentro do trato gastrointestinal. A ampla variação fenotípica e genotípica observada dentro do gênero levou a uma recente reclassificação e à introdução de 23 novos gêneros.
Devido à amplitude das variações dentro dos gêneros antigos, os protocolos demonstrados em um membro podem não funcionar como anunciado com outros membros. A falta de informações centralizadas sobre como manipular exatamente cepas específicas levou a uma série de abordagens ad hoc , muitas vezes adaptadas de outras famílias bacterianas. Isso pode complicar as coisas para os pesquisadores que estão começando na área, que podem não saber quais informações se aplicam ou não à cepa escolhida.
Neste artigo, pretendemos centralizar um conjunto de protocolos com sucesso demonstrado, especificamente na designação F275 da cepa de Limosilactobacillus reuteri (outros números de coleta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), juntamente com conselhos de solução de problemas e problemas comuns que se podem encontrar. Esses protocolos devem permitir que um pesquisador com pouca ou nenhuma experiência trabalhando com DSM20016 de L. reuteri transforme um plasmídeo, confirme a transformação e meça o feedback do sistema em um leitor de placas por meio de uma proteína repórter.
Introduction
O gênero Lactobacillus foi historicamente classificado como gram-positivo, em forma de bastonete, não formador de esporos, anaeróbios facultativos ou microaerófilos que quebram açúcares para produzir principalmente ácido lático1. Esses critérios frouxos levaram a que Lactobacillus fosse, fenotípica e genotipicamente, um gênero extremamente diverso. Essa ampla categorização resultou na reclassificação do gênero, introduzindo 23 novos gêneros em 20202.
O gênero antigo e mais amplo incluía as principais espécies comensais e probióticas geralmente consideradas seguras (GRAS) para consumo3. A família Lactobacillaceae mantém uma percepção pública de serem "bactérias boas" devido aos muitos benefícios relatados à saúde conferidos pelo consumo de várias cepas 4,5,6,7. A facilidade com que eles podem navegar no trato gastrointestinal8 e sua aceitação pública combinam-se para posicionar cepas de Lactobacillaceae como fortes candidatas como organismos de chassi para aplicações medicinais, terapêuticas ou diagnósticas ingeríveis.
A ampla gama de características presentes na família Lactobacillaceae levou a uma situação em que não há de fato uma cepa de organismo-modelo; Os grupos de pesquisa tendem a selecionar espécies com as propriedades mais relevantes para seus objetivos particulares. (Por exemplo, laboratórios de fermentação láctea poderiam escolher L. lactis; estudos de fermentação vegetal poderiam selecionar L. plantarum; pesquisas sobre probióticos poderiam se concentrar em L. acidophilus; e assim por diante.)
Essa mesma ampla gama de características entre as espécies levou a um acúmulo de protocolos e procedimentos que podem funcionar bem para um subconjunto da família Lactobacillaceae , mas requerem otimização para funcionar eficientemente (ou talvez para funcionar) em outros9. Essa necessidade de otimização entre membros da família e mesmo dentro de membros da mesma espécie pode frustrar os esforços de pesquisadores desconhecidos. Os protocolos publicados nas seções de métodos dos artigos também podem incluir suas própriasmodificações10, levando a coleções de protocolos fragmentadas e descentralizadas.
L. reuteri é considerado um comensal amplamente vertebrado, encontrado consistentemente nos tratos gastrointestinal (GI) de mamíferos, aves11 e peixes12. As subcepas de L. reuteri são frequentemente geneticamente especializadas, via adaptação de proteínas de adesão do muco, para colonizar mais permanentemente hospedeiros nativos específicos 8,11,13. As espécies de Limosilactobacillus do trato gastrointestinal podem ser isoladas em hospedeiros fora de seu hospedeiro nativo, mas tendem mais para uma natureza transitória8.
Devido à especialização humano-hospedeiro, o L. reuteri DSM20016 posiciona-se muito bem como um chassi para aplicações diagnósticas ou terapêuticas em qualquer ponto do trato gastrointestinal humano, e a tensão DSM20016 poderia fornecer uma janela de efeito mais duradoura para intervenções quando comparada a cepas mais transitórias.
Neste artigo, descrevemos uma série de protocolos com eficácia demonstrada em Limosilactobacillus reuteri (designação da cepa: F275; outros números de coleta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), juntamente com informações centralizadas sobre a cepa de outras fontes para auxiliar em aplicações de biologia molecular e de sistemas. Os procedimentos aqui descritos devem permitir que um pesquisador sem experiência prévia em cultura de L. reuteri, crie estoques eletrocompetentes, selecione colônias transformadas, confirme a transformação via reação em cadeia da polimerase (PCR) de colônias e meça a resposta do sistema projetado via proteínas fluorescentes repórteres.
Observamos que protocolos relacionados cobriram a recombinação do genoma assistida por CRISPR-Cas9 em L. reuteri (cepa: ATCC-PTA-6475)14 e a edição do genoma assistida por nickase CRSIPR-Cas9 em múltiplas colorações não-L. reuteri, da família Lactobacillaceae 15,16; estes, no entanto, não abordam a cepa L. reuteri DSM20016 que é nosso foco aqui.
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Protocol
1. Preparação de células eletrocompetentes DSM20016 L. reuteri
NOTA: Baseia-se em um protocolo de Berthier et al.17, com velocidades de centrifugação informadas por Rattanachaikunsopon et al.18º.
- Em um tubo de centrífuga de 50 mL, inocular L. reuteri do estoque de glicerol em 6 mL de caldo deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubar aeróbia durante a noite a 37 °C numa incubadora estática.
- Na manhã seguinte, inocular 4 mL da cultura noturna em 200 mL de caldo MRS (diluição 1:50).
- Deixar crescer aerobicamente numa incubadora estática a 37 °C até que o valor de densidade óptica de 600 nm (OD600) atinja 0,5-0,85; Isso deve levar aproximadamente 2-3 h.
- Assim que um valor OD600 adequado for atingido, decantar o meio em tubos de centrífuga de 50 mL e colocar no gelo enquanto equilibra os tubos.
- Centrifugar por 5 min a 5.000 x g em uma centrífuga pré-resfriada a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante, ressuspenda cada pastilha em 50 mL de ddH2O pré-resfriado (0 °C a 4 °C) e centrifugue novamente com as mesmas configurações da etapa anterior. Mantenha as células no gelo tanto quanto possível.
- Repita a etapa 1.6.
- Ressuspender cada pellet em 25 mL de ddH2O: sacarose 0,5 M, glicerol a 10%. Centrifugar a 5.000 x g a 4 °C por 10 min. Descarte o sobrenadante e coloque as células novamente no gelo.
- Ressuspender todos os pellets nos mesmos 2 mL de ddH2O: sacarose 0,5 M, glicerol a 10%.
- Alíquota em porções de 50 μL a 100 μL em tubos de microcentrífuga pré-resfriados; conservar a -80 °C para utilização posterior.
2. Eletroporação de L. reuteri
NOTA: Evite pipetar tanto quanto possível nas etapas a seguir. A inclusão de uma eletroporação controle, sem adição de plasmídeo, é aconselhada para garantir que a seleção de antibióticos seja adequada.
- Pegue uma alíquota de L. reuteri eletrocompetente inteira e descongele-a no gelo.
- Misturar suavemente 5 μL a 10 μL de plasmídeo (concentração final de plasmídio >6 nM) na alíquota descongelada, evitando ao máximo a pipetagem.
- Transfira para uma cubeta de eletroporação gelada de 1 mm de folga.
- Eletroporato a 1,25 kV, 400 Ω e 25 μF.
- Adicione 1 mL de caldo MRS à temperatura ambiente (TR) e misture invertendo a cubeta uma ou duas vezes.
- Coloque as cubetas em uma incubadora estática a 37 °C por 2,5-3 h para permitir a recuperação.
- Plaquear toda a quantidade em várias placas de ágar MRS com seleção apropriada.
- Coloque os pratos dentro de um recipiente completamente hermético com uma pequena vela acesa ("tealight") e um sachê gerador de atmosfera anaeróbica.
- Crescer a 37 °C por 2-3 dias ou até que colônias visíveis estejam presentes.
3. Medição da proteína repórter fluorescente resistente a ácidos mCherry2
- Escolha as colônias necessárias para a medição e inocular em uma microplaca de armazenamento de 96 poços com 1,5 mL de caldo MRS esterilizado por filtro (não autoclavado) por poço e um antibiótico de seleção apropriado.
- Incubar aeróbia durante 24 h durante a noite a 37 °C sem agitar.
NOTA: Esta microplaca de armazenamento deve ser mantida para utilização na secção 4 (PCR de colónias). - L. reuteri precipitar-se-á para fora da mídia quando na fase estacionária; ressuspender a cultura durante a noite por meio de pipetagem.
- Transfira 200 μL para uma placa plana, de fundo claro, de 96 poços, transfira a placa para um leitor de placas e meça o DO e a fluorescência de mCherry2 (excitação [Ex]: 589 nm; emissão [Em]: 610 nm) ou outros repórteres relevantes.
4. Confirmação da captação de plasmídeos via PCR de colônias
- A partir da microplaca de armazenamento de 96 poços da seção 3, transferir 5 μL para um tubo de PCR.
NOTA: Se >5 min tiverem passado, pode ser necessário ressuspender o L. reuteri uma segunda vez. - Em uma microcentrífuga portátil de bancada, gire para baixo até que o pellet possa ser visto (aproximadamente 2 min a 2.000 x g), descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 20 μL de NaOH 20 mM.
- Ferva a 95 °C por 5 min, vórtice, e repita a fervura uma segunda vez.
- Resfriar imediatamente as amostras; tente manter as amostras no gelo tanto quanto possível nas etapas a seguir para diminuir a probabilidade de degradação do molde e inibição da PCR.
- Gire para baixo em uma microcentrífuga portátil de bancada a 2.000 x g por 2 min até que os restos celulares sejam peletizados, em seguida, pegue 1 μL do sobrenadante e dilua em 99 μL de ddH2O sem DNase e RNase gelada (diluição de 100x).
- Use a diluição de 100x como o DNA molde em uma reação de PCR padrão usando primers plasmidiais específicos. Incluir um controle positivo com um plasmídeo derivado da mini-preparação de E. coli.
- Devolver as amostras no gelo e adicionar um corante de carga adequado a uma concentração de 1x.
- Executar em gel de agarose a 1% em tampão TAE (ácido tris-acetato-etilenodiaminotetracético [EDTA]) a 110 V durante 30 minutos. Imagem se necessário.
5. Mini-prep para L. reuteri , seguido de PCR para confirmar a presença plasmidial
NOTA: Protocolo destinado ao uso com o kit mini-prep listado na Tabela de Materiais.
- Inocular L. reuteri em 10 mL de caldo MRS contendo um antibiótico apropriado e incubar durante a noite aeróbia a 37 °C em uma incubadora estática.
- Centrifugar a 5.000 x g por 10 min em centrífuga pré-resfriada a 4 °C.
- Lavar o pellet em 2 mL de tampão P1 padrão (incluído no kit) para anular a acidez que possa interferir nas etapas posteriores, centrifugar com a mesma configuração descrita anteriormente e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet em 250 μL de tampão P1 modificado contendo 10 mg/mL de lisozima e 100 U/mL de mutanolisina para lisar as células bacterianas. Incubar durante 1-2 h a 37 °C.
- Adicionar 250 μL de tampão P2, misturar invertendo quatro a seis vezes e incubar em TR por um período não superior a 5 min.
- Adicione 350 μL de tampão N3 (incluído com o kit) e inverta imediatamente quatro a seis vezes suavemente para misturar.
- Centrifugar a 10.000 x g por 10 min.
- Transfira o máximo de sobrenadante possível para uma coluna de spin e centrífuga a 10.000 x g por 60 s. Descarte o fluxo.
- Lavar a coluna de spin com 500 μL de tampão PB (incluído no kit) e centrifugar a 10.000 x g por 60 s. Descarte o fluxo.
- Lave a coluna de spin com 750 μL de PE tampão (incluído no kit) e centrifuja a 10.000 x g por 60 s. Descarte o fluxo e centrifugue por 60 s para remover qualquer buffer residual.
- Coloque a coluna de spin num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Aplicar 20-30 μL de ddH2O livre de DNAse e RNAse no filtro da coluna de spin e deixar por 1-2 min, antes de centrifugar a 10.000 x g por 60 s.
- Realizar uma reação de PCR padrão usando primers plasmidiais específicos (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), com eluato fornecendo o DNA molde. Incluir um controle positivo com um plasmídeo derivado da mini-preparação de E. coli.
NOTA: As configurações de PCR usadas neste estudo são: 98 °C por 5 min, (98 °C por 30 s, 55 °C por 30 s, 72 °C por 45 s) 30 ciclos, 72 °C por 2 min, 4 °C segurar. Os parâmetros são altamente dependentes da polimerase utilizada, do comprimento do fragmento e dos primers exatos utilizados por qualquer pessoa que utilize este protocolo.
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Representative Results
Eficiências de transformação
L. reuteri não necessita de plasmídeo dcm-/dam- não metilado, como observado para outras Lactobacillaceae19,20 (ver Figura 1). A eletroporação de DSM20016 de L. reuteri com 10 μL do pTRKH3_mCherry2 plasmidial de 8,5 kb (pAMβ1 origem da replicação) deve proporcionar eficiências de transformação de aproximadamente 80 unidades formadoras de colônias (UFC)/μg (cinco a oito colônias por 200 μL plaqueadas), independentemente da condição de metilação do plasmídeo. Com cura seletiva e retransformação, é possível obter linhagens mutadas de L. reuteri com eficiências de transformação muito maiores21, observadas com pTRKH3_mCherry2 de aproximadamente 4 x 103 UFC/μg (200-250 colônias por 200 μL plaqueadas), permitindo aplicações de maior rendimento. Resultados semelhantes também foram observados para o repórter mTFP1. As transformações também foram realizadas com pNZ123 (origem do círculo rolante pSH71), sem proteína repórter constitutiva exógena, resultando em eficiências de transformação de 3 x 104 UFC/μg de DNA (Figura 1 Suplementar).
Figura 1: Eficiências de eletroporação. Totais de 10 nM pTRKH3_mTFP1 e 80 nM pTRKH3_mCherry2 estoques de plasmídios foram obtidos de duas fontes: DH10β E. coli e dcm-/dam-methylase knockout E. coli. L. reuteri foi então eletroporada com 10 μL dos dois diferentes plasmídeos do padrão de metilação e as colônias contadas. As barras de erro indicam desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Condições de crescimento da transformação
L. reuteri é aerotolerante e pode ser cultivada em caldo e em ágar em condições atmosféricas normais. No entanto, o sucesso da transformação depende fortemente da geração de um ambiente de crescimento anaeróbio quando plaqueado; é talvez a condição mais importante para o sucesso da transformação. O2 vazamentos podem ser detectados pela inclusão de uma placa de L. reuteri não transformada. A morfologia da colônia muda visivelmente na presença de oxigênio (ver Figura 2); alternativamente, podem ser utilizados indicadores anaeróbios (ver Tabela de Materiais).
Figura 2: Morfologia da colônia de L. reuteri. Colônias transformadas com o plasmídeo pTRKH3_mCherry2. (A) Abaixo das condições de baixo O2 , as colônias aparecem brancas, opacas, lisas, redondas, convexas e brilhantes. (B) Sob condições parciais ou vazadas O2 , as colônias aparecem brancas, opacas, onduladas (onduladas), redondas, umbonadas (arredondadas/puxadas) e brilhantes. (C) Colônias de L. reuteri sem transformação plasmidial sob níveis de O2 atmosférico. As colônias aparecem opacas ou translúcidas e umbonadas ou planas; eles sempre aparecem lobate, redondos e secos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Medição de proteína do repórter
A expressão e o crescimento da proteína selvagem L. reuteri DSM20016 do tipo selvagem variam entre as colônias (ver Figura 3A), dificultando deduções precisas sobre a atividade do sistema. É possível selecionar e curar corretamente transformados de L. reuteri DSM20016; A retransformação pode dar origem a cepas com mutações que permitem maior eficiência de transformação. Uma estirpe desenvolvida através deste método pareceu muito mais estável em termos de expressão da proteína repórter (ver Figura 3B). É aconselhável que tais mutações sejam pesquisadas, via cura e retransformação plasmidial, antes da realização de trabalhos que exijam expressão proteica sintonizada.
Figura 3: Resultados de crescimento, fluorescência do repórter e PCR de colônia para L. reuteri transformada. Ambos os experimentos utilizam pTRKH3_mCherry2 plasmídeo a 80 nM. (A,B) Cada coluna em cada uma das três subparcelas refere-se ao valor OD da mesma colônia, valor de fluorescência (Ex: 589 nm; Em: 610 nm) e resultado da PCR (bloco sólido indica banda correta observada). (A) Todas as colônias de L. reuteri DSM20016 transformação colhida (transformação controle = zero colônias). Colônias incubadas em caldo MRS filtrado por 24 h antes da mensuração com ganho de 100. (B) Um total de 88 colônias colhidas da linhagem DSM20016 de L. reuteri selecionadas para maior eficiência de transformação, produção de proteína reporter mais consistente e menor inibição da PCR (transformação controle = zero colônias). Colônias incubadas em caldo MRS filtrado por 24 h antes da mensuração no ganho de 200. Os controles estão em azul, C = controle de célula DSM20016 não transformada, M = controle de mídia somente caldo MRS filtrado e barras de erro indicam desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
PCR Colônia
A PCR de colônia não deve ser usada como único meio de deduzir a transformação correta, pois eles podem não ser confiáveis mesmo quando as amostras são diluídas e mantidas refrigeradas (ver Figura 4). Se o controle sem plasmídio incluído com transformações exibe zero colônias, isso implica que todas as colônias têm o plasmídeo carregando resistência a antibióticos. No entanto, se a PCR da colônia for necessária, as condições otimizadas estabelecidas aqui podem aumentar muito o sucesso.
Figura 4: PCR de colônia de L. reuteri transformada. (A) colônias de DSM20016 de L. reuteri foram testadas para bandas positivas de PCR; seis foram obtidas e inoculadas em caldo fresco autoclavado de MRS. Amostras de 5 μL colhidas em vários momentos após a inoculação foram novamente submetidas à PCR nos níveis de diluição indicados. As cores em cada caixa de tempo/diluição indicam o sucesso da recuperação da PCR: verde = faixa correta observada; vermelho = nenhuma faixa observada. (B) Os resultados para uma diluição fixa de 100x mostram que a variação da temperatura de preparação resultou em diferentes taxas de sucesso da PCR: as amostras foram preparadas em gelo e PCR-ed imediatamente (89,77%), preparadas à temperatura ambiente e PCR-ed imediatamente (75%), ou preparadas em RT então incubadas a 37 °C por 30 min antes da PCR (27,27%). (C) (1) Oito amostras positivas de diluição de 100x (R1-8) da condição RT. (2) Após 48 h de permanência no TR, as amostras foram submetidas à PCR uma segunda vez, mostrando ausência das bandas em ~1,1 kb; os controles positivo e negativo (faixas +/-) são as faixas mais à direita em C (2). A escada utilizada foi de 1 kb mais a escada de DNA, listada na Tabela de Materiais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
L. reuteri mini-preparação
A mini-preparação para L. reuteri é limitada e pretende apenas ser um método alternativo de confirmação da transformação plasmidial. Uma publicação anterior observou que algumas cepas são lisadas mais efetivamente pela mutanolisina22; a ação dupla lisozima-mutanolisina foi a mais eficaz para L. reuteri DSM20016. Executar o eluato de mini-preparação através de um gel de agarose resulta em uma mancha em vez de bandas observáveis. A PCR subsequente deve, no entanto, produzir tamanhos de banda esperados (ver Figura 5).
Figura 5: Eletroforese em gel de agarose de produtos de PCR e mini-prep. As mesmas seis colônias da Figura 4A foram minipreparadas usando o protocolo estabelecido neste trabalho. (Linha inferior) O eluato de mini-preparação mostra uma mancha. (Linha superior) Após a PCR ter sido realizada usando o eluente como molde de DNA, bandas positivas claras são observadas. A escada utilizada foi de 1 kb mais a escada de DNA, listada na Tabela de Materiais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Eficiências de transformação do DSM20016 de L. reuteri com o plasmídeo pNZ123. Transformações realizadas com pNZ123 (origem do círculo rolante pSH71), não carregando proteína repórter constitutiva exógena. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 1: Arquivos CAD para câmaras anaeróbias. Folha 1: Desenho de base; Folha 2: Desenho de parede longa; Folha 3: Desenho de parede pequena; Folha 4: Desenho superior; Folha 5: Desenho da tampa; Folha 6: Desenho do lábio de bloqueio; Folha 7: Desenho da barra de grampo; Folha 8: Desenho da placa de braçadeira; Folha 9: Visão geral da montagem; Folha 10: Visão geral com partes numeradas. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A etapa mais crítica para a transformação da DSM20016 de L. reuteri é a geração de condições de crescimento anaeróbio após as transformações serem plaqueadas; colônias adquiridas em condições aeróbicas são muito ocasionais e geralmente não crescem quando inoculadas em caldo MRS. O chapeamento de todo o volume de recuperação também deve ser praticado para maximizar a probabilidade de crescimento da colônia. Mesmo com essas duas etapas críticas, a eficiência da transformação ainda é uma limitação na experimentação, pois as colônias esperadas podem chegar a um ou dois por placa durante as transformações (ver Figura 1).
Inicialmente foram utilizadas embalagens comerciais para alimentos, que se mostraram insuficientes para a exclusão consistente de O2. Arquivos CAD para câmaras anaeróbias projetadas pela oficina mecânica da universidade podem ser encontrados no Arquivo Suplementar 1. Uma vez que estas caixas podem ocasionalmente ter infiltração de ar através de pequenas lacunas na marcenaria, aconselha-se enchê-las com água (sem selo) para verificar se há vazamentos antes do primeiro uso; em geral, não são necessários controlos posteriores. Essas caixas devem ter sistemas de substituição de O 2 em vez de sistemas de sequestro de O2, pois não foram testadas para pressurização.
Podem surgir problemas de mídia; o caldo MRS autoclavado é seletivo, mas possui propriedades altamente autofluorescentes, dificultando a medição de baixas leituras fluorescentes. A modificação no uso do caldo MRS esterilizado por filtro ameniza essa questão, mas é menos seletiva. L. reuteri reduz o pH do meio para cerca de pH 4 após 24 h (ver Figura 6), de modo que o meio requer tamponamento para detectar GFP23 sensível ao ácido. Modificamos esse protocolo para usar mCherry2 mais resistente a ácidos, evitando esse problema.
Figura 6: pH ao longo do tempo de L. reuteri em caldo MRS. L. reuteri DSM20016 reduz o pH ao longo do tempo (linha tracejada); o valor de pKa indica o pH no qual a fluorescência da proteína repórter seria de 50% do valor máximo devido à acidez (linhas horizontais). EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4,3, mCherry2 pKa = 3,3. Cada proteína repórter tem eficácia reduzida a 50% da fluorescência máxima em diferentes pontos de tempo devido às suas sensibilidades ácidas quando produzidas dentro de L. reuteri (linhas verticais) cada vez mais ácidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
L. reuteri DSM20016 parece inibir os esforços de PCR das colônias, limitando severamente a utilidade desse procedimento. Apenas 30 minutos a 37 °C após o passo 4.3 podem aumentar a taxa de falha da PCR, enquanto 48 h na RT resultam em falha completa da PCR (ver Figura 4B,C). A modificação para diluir as amostras e mantê-las sempre no gelo é fundamental para aumentar o sucesso da PCR da colônia.
Muito permanece desconhecido sobre as funções internas de L. reuteri DSM20016. Placas de controle de transformação sem adição de plasmídio durante a eletroporação, mostrando zero colônias, devem implicar que quaisquer colônias presentes na condição plasmidial possuam o plasmídeo. No entanto, a PCR de colônia subsequente demonstrou não confirmar de forma confiável a captação de plasmídeos, mesmo com modificações. Isso pode ser devido às endonucleases de restrição que degradam fragmentos de DNA da PCR. Endonucleases têm sido encontradas em outras espécies de Lactobacillaceae e superadas através do uso de dam-/dcm-E.coli 19,20. L. reuteri DSM20016 possui várias enzimas putativas de modificação de restrição anotadas via análise computacional24. As eficiências de transformação de DSM20016 poderiam ser potencialmente aumentadas se seus sítios de reconhecimento enzimático de modificação de restrição (RM) pudessem ser caracterizados e evitados. Mais investigações são necessárias.
O método de eletroporação modificado apresentado neste trabalho oferece uma alternativa menos complexa e mais moderna a um método descrito anteriormente para L. reuteri DSM20016 por Ahrne et al.25. Este trabalho investiga estipulações significativas feitas por Ahrne e col. sobre os requisitos de metilação de barragens/dcm para a captação de plasmídeos, que não foram corroboradas. O método de transformação apresentado neste trabalho também enfatiza a exigência crítica de crescimento anaeróbio após o plaqueamento, não transmitida explicitamente por Ahrne et al.
Alguns métodos e abordagens aqui descritos podem ser usados em aplicações futuras para auxiliar outras tentativas de manipulação da família Lactobacillaceae , notadamente: a inclusão de placas de controle de transformação, o uso do repórter resistente a ácido mCherry2, requisitos de temperatura de PCR de colônia e inclusão de mutanolisina mini-prep. No entanto, alguns ainda podem precisar de modificações para funcionar de forma ideal em outras cepas.
L. reuteri DSM20016 é de importância clínica e agrícola devido à sua posição não apenas como um comensal genérico de vertebrados (com usos potenciais como aditivo na alimentação animal), mas também como um de um número muito pequeno de cepas da família Lactobacillaceae intrinsecamente associadas ao ambiente intestinal humano8. A manipulação eficiente deste micróbio irá abri-lo como um chassi para a entrega futura de novas terapias dentro do trato gastrointestinal e monitoramento não invasivo de condições inflamatórias. Neste artigo, esses métodos foram explicitamente agrupados e demonstrados coletivamente com modificações para, especificamente, a cepa não-modelo de L. reuteri DSM20016.
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Disclosures
Não existem conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos imensamente os valiosos conselhos fornecidos pelo Prof. J.P. van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), cuja orientação sobre o trabalho com L. reuteri ATCC PTA 6475 forneceu uma base para os métodos descritos aqui.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
References
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