Summary
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een op luciferase gebaseerde reportertest in een semi-geautomatiseerd screeningsformaat met hoge doorvoer.
Abstract
Er zijn steeds meer aanwijzingen dat een hoge autofagische flux verband houdt met tumorprogressie en resistentie tegen kankertherapie. Het testen van individuele autofagie-eiwitten is een voorwaarde voor therapeutische strategieën die zich op deze route richten. Het is aangetoond dat remming van de autofagieprotease ATG4B de algehele overleving verhoogt, wat suggereert dat ATG4B een potentieel doelwit voor kankertherapie zou kunnen zijn. Ons laboratorium heeft een selectieve test op basis van luciferase ontwikkeld voor het monitoren van ATG4B-activiteit in cellen. Voor deze test wordt het substraat van ATG4B, LC3B, aan de C-terminus gelabeld met een secretabel luciferase van het mariene roeipootkreeftje Gaussia princeps (GLUC). Deze reporter is gekoppeld aan het actine-cytoskelet, waardoor het in het cytoplasma van cellen blijft wanneer het wordt gelost. ATG4B-gemedieerde splitsing resulteert in de afgifte van GLUC door niet-conventionele secretie, die vervolgens kan worden gecontroleerd door supernatanten uit celkweek te oogsten als een correlaat van cellulaire ATG4B-activiteit. Dit artikel presenteert de aanpassing van deze op luciferase gebaseerde test aan geautomatiseerde high-throughput screening. We beschrijven de workflow en optimalisatie voor een voorbeeldige high-throughput analyse van cellulaire ATG4B-activiteit.
Introduction
Autofagie is een geconserveerd metabolisch proces dat cellen in staat stelt intracellulaire homeostase te behouden en op stress te reageren door verouderde, defecte of onnodige cellulaire inhoud af te breken via de lysosomen 1,2,3. Onder sommige pathofysiologische omstandigheden fungeert dit proces als een cruciale cellulaire reactie op nutriënten- en zuurstofgebrek, wat resulteert in gerecyclede voedingsstoffen en lipiden, waardoor de cellen zich kunnen aanpassen aan hun metabolische behoeften 2,3,4. Autofagie is ook geïdentificeerd als een cellulaire stressreactie die verband houdt met verschillende ziekten, zoals neurodegeneratieve aandoeningen, pathogene infectie en verschillende soorten kanker. De functie van autofagie bij kanker is complex en afhankelijk van het type, het stadium en de status van de tumor. Het kan tumorigenese onderdrukken door autofagische afbraak van beschadigde cellen, maar kan ook de overleving van gevorderde tumoren bevorderen door de celoverleving te verbeteren tijdens stressvolle omstandigheden, zoals hypoxie, gebrek aan voedingsstoffen en cytotoxische schade 2,4,5,6.
Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat remming van autofagie een voordeel biedt als strategie tegen kanker. De remming van kritieke stappen, zoals autofagosoomvorming of de fusie ervan met het lysosoom, zou dus een effectieve methode kunnen zijn voor kankerbestrijding 2,4,5,6. Groeiend bewijs heeft aangetoond dat ATG4B betrokken is bij bepaalde pathologische aandoeningen, en het heeft aandacht gekregen als een potentieel antikankerdoelwit 2,3,4. Er werd bijvoorbeeld waargenomen dat colorectale kankercellen en humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2)-positieve borstkankercellen significant hogere ATG4B-expressieniveaus hadden dan aangrenzende normale cellen 2,4. In prostaatkankercellen resulteerde remming van ATG4B in een cellijnspecifieke gevoeligheid voor chemotherapie en radiotherapie7. Onlangs zijn er sterke aanwijzingen naar voren gekomen dat ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) bijzonder kwetsbaar is voor ATG4B-remming. In een genetisch gemanipuleerd muismodel werd bijvoorbeeld aangetoond dat intermitterend verlies van ATG4B-functie de groei van PDAC-tumoren vermindert en de overleving verhoogt 3,4. Over het algemeen komt ATG4B sterk tot overexpressie in sommige kankertypes, is het gerelateerd aan de progressie van de tumor en is het gekoppeld aan resistentie tegen kankertherapie 2,4,8.
De ATG4-cysteïneproteasen bij zoogdieren hebben vier familieleden, ATG4A-ATG4D. Deze eiwitten vertonen enige doelselectiviteit in de richting van de LC3/GABARAP (ATG8)-familie van eiwitten 9,10,11 en kunnen aanvullende functies hebben die geen verband houden met hun protease-activiteit12,13. Bovendien functioneert ATG4 bij het reguleren van een nieuw type posttranslationele modificatie, de ATG8-ylering van eiwitten11,12. Hoewel ATG4B en zijn belangrijkste substraat LC3B het meest bestudeerd zijn, ontstaat er een beeld dat wijst op een complexe rol voor elk lid van de subfamilie in de regulatie van autofagische en niet-autofagische processen. Dit wordt verder bevestigd door een complex netwerk van posttranslationele modificaties die de ATG4B-activiteit reguleren via fosforylering, acetylering, glycosylering en nitrosylering 9,10,11,12,13.
Er zijn verschillende bekende ATG4B-remmers gepubliceerd 2,4,14,15. Hoewel deze geschikt zijn als onderzoeksinstrumenten, hebben hun farmacodynamische profiel, selectiviteit of potentie ze tot nu toe uitgesloten van ontwikkeling als preklinische kandidaten 4,16. Over het algemeen is er een dringende behoefte om krachtigere en selectievere verbindingen te identificeren. Vaak zijn de verbindingen goede biochemische remmers van de eiwitfunctie, maar hun werkzaamheid in celgebaseerde tests is slecht. Er zijn meerdere testen om de ATG4B-activiteit te monitoren, waaronder biochemische methoden en celgebaseerde testen4. We hebben eerder een eenvoudige, op luminescentie gebaseerde, high-throughput assay ontwikkeld voor het monitoren van ATG4B-activiteit in cellen 8,17. Deze test maakt gebruik van een luciferase-eiwit van Gaussia princeps (GLUC) dat stabiel en actief is in het extracellulaire milieu en induceerbaar kan worden vrijgegeven uit cellen als reactie op ATG4B proteolytische activiteit18,19.
In deze reporterconstructie is dNGLUC gekoppeld aan het actine-cytoskelet van cellen. Een protease-specifieke linker kan worden geïntroduceerd tussen het β-actine-anker en dNGLUC, waardoor de secretie afhankelijk wordt van de splitsing van de linker. We gebruikten het open leesframe van LC3B over de volledige lengte tussen β-actine en dNGLUC, om LC3B-splitsing 17,18,19 te kunnen volgen. Hoewel het secretiemechanisme van dNGLUC slecht wordt begrepen, is het specifiek voor het monitoren van ATG4B-activiteit, is het niet afhankelijk van algehele autofagie zoals het voorkomt in ATG5-knock-outcellen, en wordt het gemedieerd door niet-conventionele mechanismen die geen klassiek signaalpeptide nodig hebben 4,18,19. We hebben deze reporter met succes gebruikt om kleine moleculen en siRNA-bibliotheken te screenen en hebben nieuwe regulatoren van ATG4B-activiteit geïdentificeerd, zoals de Akt-eiwitkinasen8. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het gebruik van deze luciferase-reporter in een semi-geautomatiseerd screeningsformaat met hoge doorvoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het testproces wordt beschreven in figuur 1. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Retrovirus productie
OPMERKING: Het plasmide dat codeert voor ActinLC3dNGLUC is pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Gebruik een laag aantal cellen voor de productie van virussen met een hoge titer (idealiter minder dan P20).
- Kweek HEK293T cellen in Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S) bij 37 °C in een bevochtigde incubator, met een atmosfeer van 5% CO2 totdat ze 80%-90% confluent zijn voordat ze worden gezaaid voor transfectie.
- Zaai de cellen de dag voor de transfectie in een plaat met 6 putjes met een dichtheid van 1 × 106 cellen/putje in 2 ml/putje volledig groeimedium. Incubeer de plaat een nacht in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2.
NOTITIE: Volg de instructies van de fabrikant als u een transfectiereagens op liposomale basis gebruikt. Dit protocol beschrijft het gebruik van een niet-liposomaal reagens. Voordat u met de transfectie begint, moet u het DNA-transfectiereagens, het DNA en de media op kamertemperatuur laten komen (~15 min). - Voeg voor elke transfectie 200 μL serumvrij medium toe aan microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Voeg in elk buisje de volgende hoeveelheden plasmiden toe: 1.000 ng pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng van GagPol; 100 ng VSV-G.
OPMERKING: De hoeveelheid plasmiden en het volume van de media die hier worden vermeld, zijn voor een plaat met 12 putjes. Als u een ander plaattype gebruikt, past u het mediavolume en de plasmidehoeveelheden aan om de uiteindelijke concentratie van 5 ng/μL transferplasmide, 4,5 ng/μL pakkingplasmide en 0,5 ng/μL envelopplasmide te bereiken. Gebruik elk verpakkingsplasmide dat gag- en pol-expressiegenen bevat, en elk envelopplasmide dat het VSV-G-expressiegen bevat. - Vortex de DNA-transfectiereagensflacon gedurende 30 s. Pipetteer 4 μL van het transfectiereagens rechtstreeks in het medium dat het verdunde DNA bevat. Meng voorzichtig door de tube voorzichtig te kantelen.
NOTITIE: Raak de wanden van de plastic buizen niet aan met de uiteinden. Pipeteer niet op en neer of draai niet. - Incubeer de reactie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Terwijl u de reactie incubeert, verwijdert u het oude medium van de plaat met 6 putjes en vervangt u het door 2 ml/putje verse serumvrije media.
- Voeg elk transfectiecomplex druppelsgewijs toe aan elk putje.
- Schud of draai de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling over het hele putoppervlak te garanderen.
- Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2.
- Vervang na 24 uur het oude medium door vers compleet medium (2 ml/putje) en plaats de cellen terug in de bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 72 uur.
- Oogst het supernatans na 72 uur in een conische buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4.000 × g bij 4 °C om dode cellen en vuil te verwijderen. Gebruik voor verdere zuivering een grote spuit van 60 ml om het supernatans door een filter van 0,20 μm te leiden. Bereid onmiddellijk aliquots voor eenmalig gebruik van 300 μl en bewaar ze bij -80 °C.
NOTITIE: Vermijd een vries-dooicyclus om maximale productactiviteit te behouden.
2. Retrovirale transductie
- De dag voor het transduceren van de cellen, zaait u de doelcellen met een gemiddelde dichtheid (PANC1 bij 1 × 10 5 cellen/putje) in een plaat met 12 putjes in 1 ml/putje medium aangevuld met 10% FBS en 1% P/S. Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van5 % CO2.
OPMERKING: De beste celdichtheid moet van tevoren worden vastgesteld, aangezien verschillende celtypen verschillende hechtingsmogelijkheden hebben. Gebruik in het ideale geval een celdichtheid om 40%-50% confluentie te verkrijgen. - Haal de bevroren retrovirusaliquots uit de vriezer van -80 °C en ontdooi ze voor elk gebruik op ijs.
NOTITIE: Vries ongebruikte aliquots niet opnieuw in. - Bereid in een conische buis van 50 ml een mengsel van viraal supernatans en polybreen in een eindconcentratie van 8 μg/ml.
OPMERKING: De volgende volumes zijn van toepassing op de transductie van een plaat met 12 putjes met een eindvolume van 500 μL/putje. Het uiteindelijke virale supernatansvolume kan worden geschat door een reeks virale verdunningen te testen in aanwezigheid van polybreen. Hogere of lagere verdunningen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de gewenste expressieniveaus van het transgen en de grootte van het gebruikte vat. - Verwijder het oude medium van de plaat met 12 putjes en voeg 500 μL van het mengsel toe aan elk putje. Incubeer de cellen met het virale supernatans 's nachts bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 .
OPMERKING: Bewaar twee putjes met volledig medium (geen viraal supernatant) om te gebruiken als controle voor selectie. - Vervang het virusbevattende medium door vers compleet groeimedium (1 ml/putje). Plaats de cellen terug in de bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 48 uur.
3. Gepoolde populatieselectie en -instandhouding
- Vervang het groeimedium door selectiemedium (volledig groeimedium met een eindconcentratie van 1 μg/ml puromycine). Bewaak de groei van de cellen en verander de selectiemedia elke 2-3 dagen. Breid bij samenvloeiing uit tot een schaal met 6 putjes en vervolgens tot een weefselkweekschaal met een diameter van 10 cm.
- Bewaar de cellen in het selectiemedium gedurende ten minste zo lang als nodig is om de controlecellen (niet-getransduceerd) volledig te laten afsterven.
OPMERKING: Voor succesvolle resultaten wordt aanbevolen om optimale concentraties puromycine te bepalen voordat het experimentele project wordt gestart. Genereer hiervoor een puromycine-killcurve om de minimale concentratie te bepalen die nodig is om niet-getransduceerde cellen tussen 3 en 10 dagen te doden. - Zodra de cellen in het selectiemedium groeien, breidt u de cellen uit op volledige groeimedia en vriest u de voorraadaliquots voor het experimentele project in.
OPMERKING: Noteer het passagenummer en vermijd het werken met gepoolde populaties uit bevroren voorraad met passagenummers hoger dan vijf. Controleer regelmatig op mycoplasma-besmetting voordat de test wordt uitgevoerd. Idealiter gebruikt u voor elke test een nieuwe celbatch om het maximale signaal van luciferase te verkrijgen. - Houd de cellen in het selectiemedium en zaai voldoende cellen om de dag voor de test de gewenste dichtheid te bereiken.
4. Samengestelde toevoeging
OPMERKING: De kleine molecuulbibliotheek van Selleckchem bestaat uit ongeveer 4.000 verbindingen die in acht rijen en 10 kolommen zijn gerangschikt in vijftig platen met 96 putjes met een voorraadconcentratie van 10 mM in dimethylsulfoxide (DMSO).
- Aliquot 30 μL verbinding in het daarvoor bestemde putje van een bronplaat die compatibel is met een akoestische vloeistofdispenser op nanoschaal. Gebruik een polypropyleen plaat met 384 putjes (384PP-plaat). Bewaar deze platen verzegeld en bewaar ze bij -20 °C.
OPMERKING: Het hier beschreven screeningsprotocol is voor een totaal van 10 testplaten per dag; een vaste concentratie van 10 μM werd gebruikt als de uiteindelijke testconcentratie, samen met een incubatietijd van 24 uur. - Ontdooi de samengestelde bibliotheekplaten op kamertemperatuur.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de plaat volledig ontdooid en op kamertemperatuur is. Een temperatuurgradiënt over de plaat kan van invloed zijn op de vloeistofbehandeling. - Doseer 50 nL/putje in een assayplaat met 384 putjes met behulp van een akoestische vloeistofdispenser op nanoschaal.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de geselecteerde bron- en bestemmingsplaten in het programma overeenkomen met de platen die voor deze stap worden gebruikt. - Maak een doseerprogramma in een spreadsheet.
- Open de software.
- Open een nieuw protocol. Selecteer op het tabblad Protocol de volgende opties: Formaat monsterplaat, 384PP; Type monsterplaat, 384PP_DMSO2; en het type bestemmingsplaat, CellCarrier-384 Ultra PN (Afbeelding 2A).
- Selecteer onder Keuzelijst de importoptie (Afbeelding 2B) om de spreadsheet met het doseerprogramma te importeren (Afbeelding 2C).
- Selecteer de optie Protocol uitvoeren (Afbeelding 2D), controleer of de weergegeven informatie correct is en klik op Uitvoeren.
- Klik in het nieuwe venster met de naam Status uitvoeren (Figuur 2E) op Start en volg de stappen die worden weergegeven in de promptvensters (Figuur 2F,G).
5. Cel zaaien
- Trypsiniseer de cellen uit een celkweekkolf of celkweekpetrischaaltjes en neutraliseer de trypsine door FBS-bevattende media toe te voegen.
- Breng de celsuspensie over in een conische buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 390 × g . Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatans en suspendeer de celkorrel in 10 ml volledige groeimedia.
- Voer celtellingen uit.
- Bereid de celsuspensie voor met 4,6 × 107 cellen in 230 ml complete kweekmedia.
OPMERKING: Dit volume en de celdichtheid zijn voor 10x 384-well assay-platen plus een dood volume van twee 384-wells platen. - Doseer 50 μl celsuspensie in elk putje van een in rubriek 4 bereide assayplaat met 384 putjes.
OPMERKING: Cell seeding kan handmatig of met behulp van een bulkdispenser worden gedaan. - Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 24 uur.
6. Het oogsten van het cellulaire supernatans
OPMERKING: Het robotplatform voor vloeistofbehandeling dat hier wordt gebruikt, voert vloeistofbehandeling uit met een meerkanaalsarm voor 96 tips. Als er geen automatisering van vloeistofverwerking beschikbaar is, kan het protocol worden aangepast aan het formaat met een lage doorvoer door gebruik te maken van meerkanaalspipetten.
- Configureer het dek van het werkstation voor laboratoriumautomatisering zoals weergegeven in afbeelding 3.
- Plaats de wegwerpstapel met 96 punten op positie P1 (Figuur 3A).
NOTITIE: Elke stapel met 96 punten bestaat uit acht wegwerprekken. Bij gebruik van een meerkanaalsarm voor 96-punten is de plaat met 384 putjes verdeeld in vier kwadranten. Elke tipstapel is dus voldoende om het supernatans van twee testplaten over te brengen naar twee lege, effen zwarte platen met 384 putjes. De hele tipstapel moet na elke run van twee platen worden vervangen. - Plaats de testplaten op de posities P2 en P4 (Figuur 3A).
- Plaats de lege, effen zwarte platen met 384 putjes op de posities P3 en P5 (Figuur 3A).
OPMERKING: Dit flexibele en capabele robotplatform is aangepast voor deze test en er is een speciaal programma geschreven (Figuur 3B). - Haal de tips uit positie P1.
- Zuig 10 μL supernatans op van de plaat op positie P2 en breng over in de lege, vaste, zwarte plaat op positie P3.
NOTITIE: De uiteinden moeten op een geschikte diepte in de putjes worden geplaatst om het supernatans op te zuigen zonder de celmonolaag op de bodem van de put te verstoren. - Laat de punten in de afvalbak vallen op positie P6 (Figuur 3A).
- Herhaal stap 6.5-6.7 voor de resterende putjes van de plaat op positie P2 en herhaal vervolgens dezelfde stappen om het supernatans van positie P4 naar positie P5 over te brengen.
NOTITIE: Zorg ervoor dat u het supernatans opvangt en op de overeenkomstige putjes in de lege, vaste, zwarte plaat doseert (Figuur 3C,D). Omdat uitgescheiden dNGLUC zeer stabiel is in het celkweekmedium, kunnen de platen worden verzegeld en tot 7 dagen bij 4 °C in het donker worden bewaard.
7. Luciferase-test
OPMERKING: De dNGLUC die in de reporter wordt gebruikt, vertoont flitskinetiek met snel signaalverval. Vanwege het snelle verval van luminescentie na het toevoegen van substraat (coelenterazine), moet de plaatlezer worden ingesteld om het luminescentiesignaal in de supernatanten te meten; Injecteer het substraat in een putje en lees dat na een paar seconden goed af. Gebruik daarom een plaatlezer die in staat is om de luminescentie te bewaken en die is uitgerust met een substraatinjector om ervoor te zorgen dat de tijd tussen de injectie- en leesstappen uniform is voor alle monsters. De instellingen die op de plaatlezer worden gebruikt, zijn te vinden in afbeelding 4.
- Bereid de oorspronkelijke coelenterazine in de vorm van een 1 mg/ml stockoplossing in aangezuurde methanol (10 μl 3 M HCl op 1 ml methanol).
NOTITIE: Volg de lokale gezondheids- en veiligheidsrichtlijnen met betrekking tot de omgang met methanol in het laboratorium en vermijd contact met de huid. Bereid de verse werksubstraatoplossing voor voordat u met de test begint. - Initialiseer de injectorpomp (Figuur 5A).
- Spoel de slang af met gedeïoniseerd water (Figuur 5B-D).
- Spoel de slang af met methanol.
- Bereid tijdens het spoelen van de slang de werksubstraatoplossing voor door het substraat 1:100 te verdunnen (voeg voor één plaat met 384 putjes 220 μl uit de substraatvoorraadoplossing toe aan 21,8 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS]).
- Spoel de slang af met de substraatwerkoplossing (Figuur 5B-D).
- Plaats de plaat in de lezer en start de meting met behulp van de instellingen beschreven in afbeelding 4.
- Herhaal stap 7.6-7.7 voor alle analyseplaten.
- Als u klaar bent met alle testplaten, spoelt u de slang af met methanol.
- Spoel de slang af met gedeïoniseerd water.
OPMERKING: Aan het einde van deze stap worden ruwe luciferasewaarden verkregen die gecorreleerd zijn met de cellulaire ATG4B-activiteit. Voor normalisatie naar celnummers zijn de volgende stappen nodig door het celnummer in elk putje te tellen door middel van fluorescentiemicroscopie.
8. Celfixatie en kleuring
OPMERKING: Deze stap kan handmatig worden uitgevoerd met behulp van een meerkanaalspipet of met behulp van een bulkdispenser.
- Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde (in 1x PBS) gedurende 15 min.
NOTITIE: Volg de lokale gezondheids- en veiligheidsrichtlijnen met betrekking tot de omgang met paraformaldehyde in het laboratorium en vermijd contact met de huid. Voer deze stap indien mogelijk uit in een veiligheidskap. - Was drie keer met 1x PBS.
- Kleuring van de kernen met Hoechst 33342 verdund 1:5.000 in 1x PBS gedurende 15 min.
- Was drie keer met 1x PBS.
9. Beeldacquisitie
NOTITIE: Voer beeldacquisitie uit met behulp van een geautomatiseerde microscoop. Als alternatief voor beeldacquisitie om het aantal cellen te bepalen, kan ook de intracellulaire luciferase-activiteit worden bepaald. Er zijn voor- en nadelen met betrekking tot de vraag of men normaliseert naar celnummers of naar intracellulaire luciferase-activiteit, die hieronder wordt besproken. We vinden dat het bepalen van celaantallen minder invasief is en resulteert in een lagere variabiliteit dan het bepalen van intracellulaire luciferasewaarden.
- Start de bedieningssoftware van de microscoop (Afbeelding 6).
- Kies op het tabblad Instellingen het juiste vooraf gedefinieerde plaattype. Als het plaattype niet vooraf is ingesteld, voert u de afmetingen van de plaat handmatig in.
- Laad de plaat in de microscoop door te klikken op de optie Uitwerpen en laden .
- Kies vervolgens het 20x Air (numerieke apertuur [NA]: 0.4) objectief.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de objectiefkraag op de juiste waarde is ingesteld, zodat u goed kunt scherpstellen met verschillende plaattypes. - Kies onder Kanaalselectie de optie Hoechst 33342.
NOTITIE: De kanaalinstellingen voor tijd, vermogen en hoogte moeten worden geoptimaliseerd op basis van het gebruikte plaattype. - Selecteer bij Lay-out definiëren alle putten van de plaat en vier velden van de put.
- Selecteer in Online Jobs de bijbehorende map om de gegevens over te brengen naar de analysesoftware.
10. Beeldanalyse
OPMERKING: Elke beeldanalysesoftware kan worden gebruikt om celkernen uit de verkregen beelden te segmenteren en te tellen. Hier beschrijven we de stappen om specifieke online software te gebruiken die compatibel is met meerdere geautomatiseerde microscopenbestanden.
- Start de beeldanalysesoftware.
- Ga naar het tabblad Beeldanalyse om de beeldsegmentatie te starten (Figuur 7A).
- Klik op het tabblad Invoerafbeelding op het +- teken om een nieuwe bouwsteen toe te voegen (Figuur 7A).
- Selecteer in de lijst de optie Kernen zoeken (Afbeelding 7A) en selecteer Hoechst 33342 als kanaaloptie (Afbeelding 7B).
- Inspecteer de gesegmenteerde objecten op de afbeelding visueel en selecteer de meest nauwkeurige segmentatiemethode.
OPMERKING: Voor dit experiment hebben we methode C gebruikt (Figuur 7C). Elke methodeoptie heeft subcategorieën die kunnen worden aangepast om de best mogelijke segmentatie te verkrijgen. - Klik vervolgens op het tabblad Resultaten definiëren (Figuur 7C) en selecteer Standaarduitvoer als de optie Methode .
- Selecteer in de subcategorie Nuclei-aantal objecten en Aantal objecten (Figuur 7C).
- Sla de analysepijplijn op met de optie Analyse opslaan op schijf of Analyse opslaan in database .
- Selecteer op het tabblad Batchanalyse de gegevens die moeten worden geanalyseerd in de structuur.
- Selecteer onder Methode de analysepijplijn die is opgeslagen in stap 10.8.
OPMERKING: Het is ook mogelijk om een scriptbestand van buiten de software waarnaar wordt verwezen te uploaden of een bestaande analyse te uploaden die in de database is opgeslagen. - Klik op Analyse uitvoeren om de analyse te starten (Figuur 7D). Aan het einde van deze workflow worden twee datasets gegenereerd: ruwe luciferasewaarden van de supernatanten en het celnummer in elk putje. Gebruik beide om de luciferasewaarde per cel te normaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een eerdere publicatie8 hebben we deze test met succes gebruikt om kleine molecuul- en siRNA-bibliotheken te screenen en nieuwe regulatoren van ATG4B te identificeren. Hier beschrijven we het protocol en de representatieve resultaten van deze luciferase-reporter in een semi-geautomatiseerd screeningsformaat met hoge doorvoer. Figuur 8 toont een voorbeeld van de ruwe data-analyse voor zowel celkernen als luminescentie. Een typisch resultaat van een luminescentiemeting is weergegeven in figuur 8A. Het basale luminescentiesignaal van DMSO is te zien in kolom 1, en in aanwezigheid van 10 μM van de ATG4B-remmer FMK9A in kolom 24. Het resultaat van het aantal kernen van dezelfde plaat is te zien in figuur 8B. De ruwe waarden voor elke verbinding werden genormaliseerd naar neutrale gemiddelde controlewaarden om het percentage ATG4B-activiteit en celoverleving te verkrijgen (Figuur 9A,B). Zoals verwacht hadden de meeste verbindingen geen effect op de ATG4B-activiteit, zoals aangegeven door waarden dicht bij de basale luminescentie van de negatieve controle (DMSO - kolom 1). De Z'-factor, een kwaliteitsindex voor high-throughput screening, werd berekend met behulp van vergelijking (1):
Z' = 1 - (3 × 
) (1)
Waarbij STDpos de standaarddeviatie van de positieve controle (FMK9a) is, STDneg de standaarddeviatie van de negatieve controle (DMSO), AVGpos het gemiddelde van de positieve controle en AVGneg het gemiddelde van de negatieve controle.
Om de treffers te selecteren, hebben we de genormaliseerde waarden gebruikt om een verhouding te berekenen die moet worden gebruikt als afkapwaarde voor de identificatie van ATG4B-remmers. De verhouding werd berekend door de ATG4B-activiteit van elke verbinding te delen door de levensvatbaarheid van de cel. We waren van mening dat ratio's >1 duidden op mogelijke ATG4B-activatoren en ratio's <1 op mogelijke ATG4B-remmers (figuur 9C). We selecteerden alle verbindingen met verhoudingswaarden die vergelijkbaar waren met de positieve controle FMK9A en sloten verbindingen uit die cytotoxisch waren.
In deze screening hebben we 53 ATG4B-remmers uitgekozen om hun activiteit en toxiciteit te bevestigen en te evalueren. De verbindingen werden getest in 10 concentraties als tweevoudige verdunningen, variërend van 100 μM tot 195 nM. De cellen die op een concentratieresponsmanier werden behandeld, maakten het mogelijk de gekwantificeerde gegevens aan te passen en de EC50-waarden te berekenen. De relatieve toxiciteit van de remmers werd gekwantificeerd aan de hand van gegevens over de levensvatbaarheid van de cellen. Al met al toonden deze resultaten aan dat deze aanpak de identificatie van ATG4B-modulatoren mogelijk maakt.
Figuur 1: Analyseworkflow. Het experiment beschrijft de tijdlijn voor het genereren van stabiele cellijnen en een high-throughput testworkflow, te beginnen met het genereren van stabiele cellijnen, het screenen van verbindingen, het meten van luciferase, beeldacquisitie en gegevensanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stap-voor-stap instructies voor het instellen van de liquid handler . (A) Instellingen van het tabblad Protocol . (1) Selecteer het formaat en type van de monsterplaat. (2) Selecteer het type bestemmingsplaat. (B) Tabblad Keuzelijst . (1) Gebruik de importoptie om de spreadsheet te importeren. (C) Promptvenster Keuzelijst importeren . (1) Selecteer de parameters die u wilt importeren. (2) Klik op Importeren om te sluiten. (D) Lopend protocol. (1) Klik op het pictogram Uitvoeren . (2) Promptvenster met de uitvoeringsoptie en om de protocoluitvoering te starten. (E) Voer het tabblad Status uit . (1) Start het protocol. (F) Promptvenster voor het laden van de bronplaat. (G) Promptvenster voor het laden van de bestemmingsplaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Configuratie van de vloeistofbehandelingsrobot. (A) Configuratie van het Tecan-dek. (Blz. 1) Positie voor de 50 μL wegwerptipstapel. (P2,P4) Posities voor de analyseplaat. (Blz. 3,P5) Posities voor de lege, effen zwarte platen met 384 putjes. (Blz. 6) Positie voor het weggooien van de gebruikte tips. (B) Screenshot van het testscript. (C) Screenshot van de MAC96 aspiraat details. (1) Selecteer de aspiratievloeistofklasse. (2) Typ het volume voor aspiratie. (3) Selecteer de putposities voor aspiratie. (D) Screenshot van de details van de MAC96-afgifte. (1) Selecteer de doseervloeistofklasse. (2) Typ het volume voor de dosering. (3) Kies dezelfde putposities voor het doseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Screenshot van de instellingen van de luminescentieplaatlezer . (A) Tabblad Meetinstellingen . (1) Selecteer het diafragma. (2) Selecteer de afstand, tijd en correctiefactor. (B) Algemene instellingen van het protocol. (1) Selecteer het plaattype. (2) Selecteer de meetmodus. (3) Selecteer het aantal analyseplaten. (C) Doseer de meetinstellingen. (1) Selecteer de meting. (2) Stel de meettijd in. (3) Selecteer de pomp, de doseersnelheid en het volume. (4) Definieer de volgorde van de afgifte en de herhaling van de plaat. (D) Tabblad Bronselectie. (1) Selecteer de te meten putjes. (2) Start het meetprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Screenshot van de dispenserbediening van de luminescentieplaatlezer . (A) Tabblad Initialisatie . (1) Selecteer de pomp. (2) Start de pomp. (B) Optie spoelprotocol. (1) Selecteer de spoeloptie. (2) Klik op volgende om naar instellingen te gaan. (C) Opties voor het instellen van het spoellipje . (1) Selecteer de pomp. (2) Selecteer de tipbevestiging. (3) Klik op volgende om naar het volgende tabblad te gaan. (D) Tabblad om het spoelen te starten. (1) Klik op start om het spoelprotocol te starten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Screenshot van de geautomatiseerde microscoopbeeldvormingssoftware met hoge inhoud. Details van de instellingen die worden gebruikt voor het verwerven van afbeeldingen. (1) Tabblad Instellingen . (2) Selecteer het plaattype. (3) Selecteer Uitwerpen om de plaat in de microscoop te plaatsen. (4) Selecteer het doel. (5) Voeg het kanaal toe. (6) Selecteer de map om gegevens over te zetten naar Columbus-software. (7) Selecteer putten. (8) Velden selecteren. (9) Klik op het tabblad Experiment uitvoeren om de beeldacquisitie te starten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Beeldanalyse op online software . (A) Tabblad Beeldanalyse . (1) Klik op + om een bouwsteen toe te voegen. (2) Selecteer de optie Kernen zoeken . (B) Zoek Nuclei-instellingen . (1) Selecteer het kanaal. (2) Selecteer de segmentatiemethode. (C) Definieer het tabblad Resultaten . (1) Selecteer Standaarduitvoer. (2) Selecteer de optie die als resultaat moet worden weergegeven. (D) Beeldanalyse. (1) Tabblad Batchanalyse . (2) Selecteer de meting. (3) Selecteer de analysemethode. (4) Start de beeldanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Representatieve beelden van luciferasemetingen en het aantal kernen . (A) Luciferase relatieve intensiteitswaarden van een 384-wells assay-plaat weergegeven door nummers en kleuren. (B) Resultaten van beeldanalyse. (1) Heatmap van het aantal kernen van objecten. (2) Tabel met de resultaten voor elk putje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Representatieve resultaten na gegevensnormalisatie . (A) Representatief ATG4B-activiteitspercentage na gegevensnormalisatie naar gemiddelde ATG4B-activiteit van negatieve controleputjes (DMSO) binnen dezelfde plaat. Activatoren worden weergegeven in rood en remmers in blauw, waarbij wit aangeeft dat er geen significante verandering in activiteit is. Negatieve controle (DMSO) is te vinden in kolom 1 en positieve controle (FMK9A) is te vinden in kolom 24. (B) Representatief cellevensvatbaarheidspercentage na gegevensnormalisatie naar het gemiddelde celaantal van negatieve controleputjes (DMSO) binnen dezelfde plaat. Proliferatie wordt weergegeven in groen en toxiciteit in rood, waarbij geel aangeeft dat er geen significante verandering is in de levensvatbaarheid van de cellen. Negatieve controle (DMSO) is te vinden in kolom 1 en positieve controle (FMK9A) is te vinden in kolom 24. (C) Verdeling van de verbindingen volgens de verhoudingswaarde. Elke stip vertegenwoordigt één verbinding. De verhouding werd berekend door de ATG4B-activiteit te delen door de levensvatbaarheid van de cel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een celgebaseerde reporter-gen assay voor de identificatie van ATG4B-remmers. De identificatie van primaire treffers is gebaseerd op luciferase-activiteit bij de behandeling van cellen die het volledige open leesframe van LC3B tot expressie brengen tussen β-actine en dNGLUC. Enkele voordelen van deze test zijn dat het gevoelig, zeer kwantitatief en niet-invasief is, omdat het dNGLUC kan detecteren zonder de cellen te lyseren. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het genereren van een stabiele cellijn en een primaire screening. Er zijn een paar cruciale stappen in het protocol.
Ten eerste gebruikte het hier beschreven protocol de PANC1-cellijn, die een hoge transfectie-efficiëntie en een hoog proliferatievermogen vertoont. Deze screeningsmethode kan worden uitgevoerd met behulp van andere cellijnen, maar de transductie-efficiëntie kan van cellijn tot cellijn verschillen. Ten tweede moet men vermijden om te werken met stabiele celpopulaties uit bevroren bestanden met passagenummers hoger dan vijf, aangezien de expressieniveaus van de melder in de loop van de tijd kunnen afnemen. Ten derde is het belangrijk om voor elke test een verse celbatch te gebruiken om het maximale en consistente signaal van luciferase binnen verschillende experimenten te verkrijgen. Ten vierde, bij het zaaien van de cellen, handmatig of met behulp van een bulkdispenser, moet de celsuspensie constant worden geroerd om een homogene celdichtheid door de hele plaat te bereiken. Ten vijfde is het bij het oogsten van het supernatans uit de put belangrijk dat de uiteinden op een geschikte diepte in de put worden geplaatst om het supernatans op te zuigen zonder de celmonolaag op de bodem van de put te verstoren. Ten slotte moet de werkoplossing van het substraat op de dag van de bepaling worden bereid. Coelenterazine is zeer lichtgevoelig en onderhevig aan oxidatie, en er zijn enkele meldingen van snel substraatverval na bereiding.
Er zijn een aantal celgebaseerde testen beschikbaar om de gevolgen van ATG4B-remming of -activering te onderzoeken, maar het onderzoeken van de cellulaire activiteit van ATG4B blijft beperkt4. Deze methode is niet-invasief, zeer gevoelig, robuust en direct afhankelijk van ATG4B-activiteit, aangezien de activiteit resulteert in het vrijkomen van dNGLUC. Het beschreven protocol is eenvoudig en vereist slechts een korte tijd om 10x 384-well platen te screenen. Een ander voordeel van de methode is dat deze kan worden gebruikt voor het monitoren van ATG4B-activiteit in vivo, aangezien dNGLUC zeer stabiel is en ex vivo uit serum kan worden gemeten.
Hoewel we deze reporter met succes hebben gebruikt om kleine molecuul- en siRNA-bibliotheken te screenen en nieuwe regulatoren van ATG4B-activiteit te identificeren, zijn er een paar beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden in dit protocol. Ten eerste is de beschreven celgebaseerde test gebaseerd op een reporter-uitlezing die indirect veranderingen in ATG4B-activiteit weerspiegelt, waardoor zowel remmers als activatoren van ATG4B-activiteit kunnen worden gedetecteerd. Daarom moeten de treffers verder worden geëvalueerd, zodat hun specificiteit en activiteit worden gevalideerd. Bovendien moeten remmers verder worden geëvalueerd in hun vermogen om de ruimtelijke verdeling van LC3 in cellen of die van andere autofagie-gerelateerde eiwitten te reguleren. Ten tweede, hoewel deze test gemakkelijk kan worden aangepast aan een kleinschaligere test vanwege de eenvoudige bediening en gegevensanalyse, vereist het een zekere mate van automatisering voor substraattoevoeging en daaropvolgende luminescentiemeting. Ten derde, omdat het mechanisme van dNGLUC-afgifte op moleculair niveau slecht wordt begrepen, kunnen verbindingen die interfereren met elementen van de secretieroute de resultaten beïnvloeden. Ten slotte kan de levensvatbaarheid van de cel ook worden bepaald door de intracellulaire luciferase-activiteit. Hoewel we vinden dat het bepalen van celaantallen minder invasief is en resulteert in een lagere variabiliteit dan het bepalen van intracellulaire luciferasewaarden, beperkt het bepalen van celnummers het gebruik ervan voor kleinere onderzoekslaboratoria omdat ze problemen opleveren op het gebied van beeldvormingsapparatuur, data-analysesoftware en gegevensopslag. Over het algemeen maakt de ontwikkelde celgebaseerde reporter-gentest de identificatie van ATG4B-remmers mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de kernfinanciering van de UK Medical Research Council aan de MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (subsidiereferentie 2018RIF_15), en de UCL Therapeutic Acceleration Support-regeling, ondersteund door financiering van MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Het plasmide dat codeert voor ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) werd verkregen van Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al.
- Towers, C. G., Thorburn, A.
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A.
- Kimmelman, A. C., White, E.
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A.
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, ÁF., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
