Summary
Her beskriver vi en detaljert protokoll for bruk av en luciferase-basert reporteranalyse i et halvautomatisert screeningformat med høy gjennomstrømning.
Abstract
Økende bevis har vist at høy autofagisk fluks er relatert til tumorprogresjon og kreftbehandlingsresistens. Å analysere individuelle autofagiproteiner er en forutsetning for terapeutiske strategier rettet mot denne veien. Hemming av autofagiproteasen ATG4B har vist seg å øke totaloverlevelsen, noe som tyder på at ATG4B kan være et potensielt legemiddelmål for kreftbehandling. Vårt laboratorium har utviklet en selektiv luciferasebasert analyse for overvåking av ATG4B-aktivitet i celler. For denne analysen er substratet til ATG4B, LC3B, merket ved C-terminalen med en utskillelig luciferase fra den marine hoppekrepsen Gaussia princeps (GLUC). Denne reporteren er knyttet til aktincytoskjelettet, og holder det dermed i cytoplasma av celler når det ikke kløyes. ATG4B-mediert spaltning resulterer i frigjøring av GLUC ved ikke-konvensjonell sekresjon, som deretter kan overvåkes ved å høste supernatanter fra cellekultur som et korrelat av cellulær ATG4B-aktivitet. Denne artikkelen presenterer tilpasningen av denne luciferase-baserte analysen til automatisert screening med høy gjennomstrømning. Vi beskriver arbeidsflyt og optimalisering for eksemplarisk høy gjennomstrømningsanalyse av cellulær ATG4B-aktivitet.
Introduction
Autofagi er en konservert metabolsk prosess som gjør det mulig for celler å holde intracellulær homeostase og reagere på stress ved å nedbryte gammelt, defekt eller unødvendig celleinnhold via lysosomene 1,2,3. Under noen patofysiologiske forhold fungerer denne prosessen som en avgjørende cellulær respons på nærings- og oksygenmangel, noe som resulterer i resirkulerte næringsstoffer og lipider, slik at cellene kan tilpasse seg deres metabolske behov 2,3,4. Autofagi har også blitt identifisert som en cellulær stressrespons relatert til flere sykdommer, som nevrodegenerative lidelser, patogeninfeksjon og ulike typer kreft. Autofagiens funksjon ved kreft er kompleks og avhengig av svulstens type, stadium og status. Det kan undertrykke tumorigenese gjennom autofagisk nedbrytning av skadede celler, men kan også fremme overlevelsen av avanserte svulster ved å forbedre celleoverlevelse under stressende forhold, som hypoksi, næringsmangel og cytotoksisk skade 2,4,5,6.
Flere studier har vist at autofagihemming gir en fordel som kreftstrategi. Dermed kan inhiberingen av kritiske trinn, som autofagosomdannelse eller fusjon med lysosomet, være en effektiv metode for kreftkontroll 2,4,5,6. Økende bevis har vist at ATG4B er involvert i visse patologiske forhold, og det har fått oppmerksomhet som et potensielt anticancermål 2,3,4. For eksempel ble det observert at kolorektal kreftceller og human epidermal vekstfaktorreseptor 2 (HER2)-positive brystkreftceller hadde signifikant høyere ATG4B-ekspresjonsnivåer enn tilstøtende normale celler 2,4. I prostatakreftceller resulterte hemming av ATG4B i en cellelinjespesifikk følsomhet for kjemoterapi og strålebehandling7. Nylig har det kommet sterke bevis på at bukspyttkjertelduktalt adenokarsinom (PDAC) er spesielt utsatt for ATG4B-hemming. For eksempel, i en genetisk konstruert musemodell, ble det vist at intermitterende tap av ATG4B-funksjon reduserer PDAC-tumorvekst og øker overlevelsen 3,4. Samlet sett er ATG4B sterkt overuttrykt i noen krefttyper, er relatert til utviklingen av svulst, og er knyttet til kreftbehandlingsresistens 2,4,8.
ATG4-cysteinproteasene hos pattedyr har fire familiemedlemmer, ATG4A-ATG4D. Disse proteinene utviser en viss målselektivitet mot LC3 / GABARAP (ATG8) -familien av proteiner 9,10,11 og kan ha tilleggsfunksjoner som ikke er knyttet til deres proteaseaktivitet12,13. Videre fungerer ATG4 i regulering av en ny type posttranslasjonell modifikasjon, ATG8-yleringen av proteiner11,12. Mens ATG4B og dets hovedsubstrat LC3B er de mest studerte, dukker det opp et bilde som antyder en kompleks rolle for hvert underfamiliemedlem i reguleringen av autofagiske og ikke-autofagiske prosesser. Dette bekreftes ytterligere av et komplekst nettverk av posttranslasjonelle modifikasjoner som regulerer ATG4B-aktivitet via fosforylering, acetylering, glykosylering og nitrosylering 9,10,11,12,13.
Flere kjente ATG4B-hemmere har blitt publisert 2,4,14,15. Selv om disse er egnet som forskningsverktøy, har deres farmakodynamiske profil, selektivitet eller styrke ennå utelukket dem fra utvikling som prekliniske kandidater 4,16. Samlet sett er det et presserende behov for å identifisere mer potente og selektive forbindelser. Ofte er forbindelsene gode biokjemiske hemmere av proteinfunksjon, men deres effekt i cellebaserte analyser er dårlig. Det er flere analyser for å overvåke ATG4B-aktivitet, inkludert biokjemiske metoder og cellebaserte analyser4. Vi har tidligere utviklet en enkel, luminescensbasert høykapasitetsanalyse for overvåking av ATG4B-aktivitet i celle 8,17. Denne analysen benytter et luciferaseprotein fra Gaussia princeps (GLUC) som er stabilt og aktivt i det ekstracellulære miljøet og kan induseres frigjøres fra celler som respons på ATG4B proteolytisk aktivitet18,19.
I denne reporterkonstruksjonen er dNGLUC knyttet til aktincytoskjelettet til celler. En protease-spesifikk linker kan innføres mellom β-aktinankeret og dNGLUC, noe som gjør sekresjonen avhengig av spaltning av linkeren. Vi brukte den åpne leserammen i full lengde av LC3B mellom β-aktin og dNGLUC, for å kunne overvåke LC3B-spaltning17,18,19. Selv om sekresjonsmekanismen til dNGLUC er dårlig forstått, er den spesifikk for overvåking av ATG4B-aktivitet, er ikke avhengig av generell autofagi slik den forekommer i ATG5 knockoutceller, og er mediert av ikke-konvensjonelle mekanismer som ikke krever et klassisk signalpeptid 4,18,19. Vi har med hell brukt denne reporteren til å skjerme små molekyler og siRNA-biblioteker, og har identifisert nye regulatorer av ATG4B-aktivitet, som Akt-proteinkinasene8. Dette papiret beskriver en detaljert protokoll for bruk av denne luciferase-reporteren i et halvautomatisert, høyt gjennomstrømningsscreeningsformat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Analyseprosessen er skissert i figur 1. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Retrovirus produksjon
MERK: Plasmidet som koder for ActinLC3dNGLUC er pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Bruk et lavt antall celler for virusproduksjon med høy titer (ideelt mindre enn P20).
- Dyrkning HEK293T celler i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) supplert med 10 % føtal bovint serum (FBS) og 1 % penicillin/streptomycin (P/S) ved 37 °C i en fuktet inkubator, med en atmosfære på 5 % CO2 til de er 80 % -90 % konfluente før såing for transfeksjon.
- Dagen før transfeksjon, frø cellene til en 6-brønnsplate med en tetthet på 1 × 106 celler / brønn i 2 ml / brønn av komplett vekstmedium. Inkuber platen over natten i en fuktet inkubator med en atmosfære på 5% CO2.
MERK: Følg produsentens instruksjoner hvis du bruker et liposomalt basert transfeksjonsreagens. Denne protokollen beskriver bruken av et ikke-liposomalt basert reagens. Før du starter transfeksjonen, la DNA-transfeksjonsreagenset, DNA og media balanseres til romtemperatur (~ 15 min). - For hver transfeksjon, tilsett 200 μL serumfritt medium til 1,5 ml mikrosentrifugerør. I hvert rør, tilsett følgende mengder plasmider: 1000 ng pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng av GagPol; 100 ng VSV-G.
MERK: Mengden plasmider og volum av media som er oppført her, er for en 12-brønnsplate. Hvis du bruker en annen platetype, juster medievolumet og plasmidmengdene for å nå den endelige konsentrasjonen på 5 ng/μL overføringsplasmid, 4,5 ng/μL pakkeplasmid og 0,5 ng/μL konvoluttplasmid. Bruk et pakkeplasmid som inneholder gag- og pol-uttrykkende gener, og ethvert konvoluttplasmid som inneholder VSV-G-uttrykkende gen. - Vortex DNA-transfeksjonsreagenshetteglasset i 30 s. Pipette 4 μL av transfeksjonsreagenset direkte inn i mediet som inneholder det fortynnede DNA. Bland forsiktig ved å tippe tuben forsiktig.
NOTAT: Ikke berør veggene i plastrørene med spissene. Ikke pipetter opp og ned eller virvel. - Inkuber reaksjonen i 15 minutter ved romtemperatur.
- Mens du inkuberer reaksjonen, fjern det gamle mediet fra 6-brønnsplaten og erstatt det med 2 ml / brønn av ferske serumfrie medier.
- Legg hvert transfeksjonskompleks til hver brønn på en dråpevis måte.
- Rist eller virvle platen forsiktig for å sikre jevn fordeling over hele brønnoverflaten.
- Inkuber platen over natten ved 37 °C i en fuktet inkubator med en atmosfære på 5% CO2.
- Etter 24 timer, erstatt det gamle mediet med friskt komplett medium (2 ml / brønn) og returner cellene tilbake til den fuktede inkubatoren med en atmosfære på 5% CO2 i 72 timer.
- Etter 72 timer høstes supernatanten i et 50 ml konisk rør og sentrifugerer i 10 minutter ved 4000 × g ved 4 °C for å fjerne døde celler og rusk. For ytterligere rensing, bruk en stor 60 ml sprøyte for å passere supernatanten gjennom et 0,20 mikrom filter. Forbered umiddelbart engangsalikoter på 300 μL og oppbevar ved -80 °C.
MERK: Unngå en fryse-tine-syklus for å opprettholde maksimal produktaktivitet.
2. Retroviral transduksjon
- Dagen før transdusering av cellene, frø målcellene ved en middels tetthet (PANC1 ved 1 × 10 5 celler / brønn) i en 12-brønns plate i 1 ml / brønn av medium supplert med 10% FBS og 1% P / S. Inkuber platen over natten ved 37 ° C i en fuktet inkubator med en atmosfære på5 % CO2.
MERK: Den beste celletettheten må etableres på forhånd, da forskjellige celletyper har forskjellige tilknytningsevner. Ideelt sett bør du bruke en celletetthet for å oppnå 40% -50% sammenløp. - Fjern de frosne retrovirusalikotene fra fryseren på -80 °C og tine på is før hver bruk.
MERK: Ikke frys ubrukte alikoter på nytt. - I et 50 ml konisk rør fremstilles en blanding av viral supernatant og polybren ved en endelig konsentrasjon på 8 μg / ml.
MERK: De påfølgende volumene gjelder transduksjon av en 12-brønns plate som inneholder et endelig volum på 500 μL / brønn. Det endelige virale supernatantvolumet kan estimeres ved å teste en rekke virale fortynninger i nærvær av polybren. Høyere eller lavere fortynninger kan brukes avhengig av de ønskede ekspresjonsnivåene av transgenet og størrelsen på karet som brukes. - Fjern det gamle mediet fra 12-brønnplaten og tilsett 500 μL av blandingen til hver brønn. Inkuber cellene med viral supernatant over natten ved 37 ° C i en fuktet inkubator med en atmosfære på 5% CO2.
MERK: Hold to brønner med komplett medium (ingen viral supernatant) som skal brukes som kontroll for valg. - Erstatt det virusholdige mediet med friskt, komplett vekstmedium (1 ml/brønn). Plasser cellene tilbake i den fuktede inkubatoren med en atmosfære på 5% CO2 i 48 timer.
3. Samlet befolkningsutvalg og vedlikehold
- Erstatt vekstmediet med seleksjonsmedium (komplett vekstmedium med en endelig konsentrasjon på 1 μg/ml puromycin). Overvåk veksten av cellene og endre utvalgsmediet hver 2-3 dag. Ved samløp, utvid til en 6-brønns tallerken, og deretter til en 10 cm diameter vevskulturskål.
- Hold cellene i utvalgsmedium i minst så lang tid som det tar for kontrollcellene (utransducerte) å dø helt.
MERK: For vellykkede resultater anbefales det at optimale konsentrasjoner av puromycin bestemmes før oppstart av eksperimentelt prosjekt. For dette, generer en puromycin drepekurve for å bestemme minimumskonsentrasjonen som kreves for å drepe utransducerte celler mellom 3 og 10 dager. - Når cellene vokser i utvalgsmediet, utvider du cellene på komplette vekstmedier og fryser stamalikoter for eksperimentprosjektet.
MERK: Registrer passeringsnummeret og unngå å arbeide med samlede populasjoner fra frosne populasjoner med passasjenummer høyere enn fem. Kontroller regelmessig for mykoplasmaforurensning før analysen utføres. Ideelt sett bruk en fersk cellebatch før hver analyse for å oppnå maksimalt signal om luciferase. - Oppretthold cellene i utvalgsmedium og frø nok celler til å nå ønsket tetthet dagen før analysen.
4. Sammensatt tillegg
MERK: Selleckchem småmolekylbibliotek består av ca. 4000 forbindelser arrangert i åtte rader og 10 kolonner i femti 96-brønnsplater ved en lagerkonsentrasjon på 10 mM i dimetylsulfoksid (DMSO).
- Aliquot 30 μL av forbindelsen i riktig brønn av en kildeplate som er kompatibel med en nanoskala akustisk væskedispenser. Bruk en 384-brønns polypropylenplate (384PP-plate). Oppbevar disse platene forseglet og oppbevares ved -20 °C.
MERK: Screeningprotokollen beskrevet her er for totalt 10 analyseplater per dag; en fast konsentrasjon på 10 μM ble brukt som den endelige analysekonsentrasjonen sammen med en 24 timers inkubasjonsperiode. - Tine de sammensatte bibliotekplatene ved romtemperatur.
MERK: Forsikre deg om at platen er helt tint og likevektet til romtemperatur. En temperaturgradient over platen kan påvirke væskehåndteringen. - Dispenser 50 nL / brønn i en 384-brønns analyseplate ved hjelp av en nanoskala akustisk væskedispenser.
MERK: Forsikre deg om at de valgte kilde- og destinasjonsplatene i programmet samsvarer med de som brukes i dette trinnet. - Opprett et dispenseringsprogram på et regneark.
- Åpne programvaren.
- Åpne en ny protokoll. Fra kategorien Protokoll velger du følgende alternativer: Prøveplateformat, 384PP; Prøveplatetype, 384PP_DMSO2; og destinasjonsplatetype, CellCarrier-384 Ultra PN (figur 2A).
- Under Velg liste velger du importalternativet (figur 2B) for å importere regnearket som inneholder dispenseringsprogrammet (figur 2C).
- Velg alternativet Kjør protokoll (figur 2D), kontroller om informasjonen som vises, er riktig, og klikk på Kjør.
- I det nye vinduet kalt Run status (figur 2E), klikk på Start og følg trinnene som vises i ledetekstvinduene (figur 2F,G).
5. Cellesåing
- Trypsiniser cellene fra en cellekulturkolbe eller cellekultur Petri-retter og nøytraliser trypsinet ved å legge til FBS-holdige medier.
- Overfør cellesuspensjonen til et 50 ml konisk rør og sentrifuge ved 390 × g i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern deretter supernatanten forsiktig og resuspender cellepelleten i 10 ml fullstendig vekstmedium.
- Utfør celletelling.
- Klargjør cellesuspensjonen med 4,6 × 107 celler i 230 ml komplette kulturmedier.
MERK: Dette volumet og celletettheten er for 10x 384-brønns analyseplater pluss et dødvolum på to 384-brønnplater. - Dispenser 50 mikrol cellesuspensjon i hver brønn på en 384-brønns analyseplate, tilberedt i avsnitt 4.
MERK: Cellesåing kan gjøres enten manuelt eller ved å bruke en bulkdispenser. - Inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator med en atmosfære på 5% CO2 i 24 timer.
6. Høsting av den cellulære supernatanten
MERK: Væskehåndteringsrobotplattformen som brukes her, utfører væskehåndtering med en flerkanalsarm for 96-tips. Hvis ingen væskehåndteringsautomatisering er tilgjengelig, kan protokollen tilpasses til lavt gjennomstrømmingsformat ved å bruke flerkanalspipetter.
- Konfigurer dekket på arbeidsstasjonen for laboratorieautomatisering som vist i figur 3.
- Plasser engangsstabelen med 96 spisser i posisjon P1 (figur 3A).
MERK: Hver stakk med 96 tips er dannet av åtte engangsstativer. Når du bruker en flerkanalsarm for 96-tips, er 384-brønnplaten delt i fire kvadranter. Dermed er hver spissstabel nok til å overføre supernatanten fra to analyseplater til to tomme, helsvarte, 384-brønnsplater. Hele spissstakken må byttes ut etter hvert løp med to plater. - Plasser analyseplatene på posisjon P2 og P4 (figur 3A).
- Plasser de tomme, helsvarte, 384-brønnplatene på posisjon P3 og P5 (figur 3A).
MERK: Denne fleksible og kapable robotplattformen er tilpasset denne analysen, og et spesielt program ble skrevet (figur 3B). - Få tipsene fra posisjon P1.
- Aspirer 10 μL supernatant fra platen på posisjon P2 og overfør til den tomme, ensfargede svarte platen på posisjon P3.
MERK: Spissene skal plasseres på en passende dybde inne i brønnene for å aspirere supernatanten uten å forstyrre cellemonolaget i bunnen av brønnen. - Slipp spissene i avfall på posisjon P6 (figur 3A).
- Gjenta trinn 6,5-6,7 for de gjenværende brønnene på platen i posisjon P2, og gjenta deretter de samme trinnene for å overføre supernatanten fra posisjon P4 til posisjon P5.
MERK: Sørg for å samle supernatanten og dispensere på de tilsvarende brønnene i den tomme, helsvarte platen (figur 3C,D). Siden utskilt dNGLUC er svært stabil i cellekulturmedium, kan platene forsegles og oppbevares i opptil 7 dager ved 4 °C i mørket.
7. Luciferase-analyse
MERK: dNGLUC som brukes i reporteren viser flashkinetikk med raskt signalhenfall. På grunn av det raske forfallet av luminescens etter tilsetning av substrat (coelenterazin), bør plateleseren settes til å måle luminescenssignalet i supernatantene; Injiser underlaget i en brønn og les det godt etter noen sekunder. Av denne grunn, bruk en plateleser som er i stand til å overvåke luminescens og utstyrt med en substratinjektor for å sikre at tiden mellom injeksjons- og lesetrinnene vil være jevn for alle prøver. Innstillingene som brukes på plateleseren, finner du i figur 4.
- Tilbered naturlig coelenterazin som en 1 mg/ml stamløsning i forsuret metanol (10 μL av 3 M HCl til 1 ml metanol).
MERK: Følg lokale helse- og sikkerhetsretningslinjer for håndtering av metanol i laboratoriet og unngå hudkontakt. Forbered den ferske arbeidssubstratløsningen før du starter analysen. - Initialiser injektorpumpen (figur 5A).
- Skyll slangen med avionisert vann (figur 5B-D).
- Skyll slangen med metanol.
- Mens du skyller slangen, klargjør den fungerende substratløsningen ved å fortynne substratet 1:100 (for en 384-brønnplate, tilsett 220 μL fra substratstamløsningen til 21,8 ml 1x fosfatbufret saltvann [PBS]).
- Skyll slangen med substratets arbeidsløsning (figur 5B-D).
- Legg platen inn i leseren og start målingen ved hjelp av innstillingene beskrevet i figur 4.
- Gjenta trinn 7.6-7.7 for alle analyseplater.
- Når du er ferdig med alle analyseplatene, skyll slangen med metanol.
- Skyll slangen med avionisert vann.
MERK: På slutten av dette trinnet oppnås rå luciferaseverdier som er korrelative til den cellulære ATG4B-aktiviteten. For normalisering til celletall er de neste trinnene nødvendige ved å telle cellenummeret i hver brønn ved fluorescensmikroskopi.
8. Cellefiksering og farging
MERK: Dette trinnet kan utføres manuelt ved hjelp av en flerkanals pipette eller ved hjelp av en bulkdispenser.
- Fest cellene med 4% paraformaldehyd (i 1x PBS) i 15 minutter.
MERK: Følg lokale helse- og sikkerhetsråd angående håndtering av paraformaldehyd i laboratoriet og unngå hudkontakt. Utfør dette trinnet i en sikkerhetshette hvis mulig. - Vask tre ganger med 1x PBS.
- Beis kjernene med Hoechst 33342 fortynnet 1:5 000 i 1x PBS i 15 minutter.
- Vask tre ganger med 1x PBS.
9. Oppkjøp av bilder
MERK: Utfør bildeopptak ved hjelp av et automatisert mikroskop. Som et alternativ til bildeopptak for å bestemme antall celler, kan den intracellulære luciferaseaktiviteten også bestemmes. Det er fordeler og ulemper med hensyn til om man normaliserer til celletall eller til intracellulær luciferaseaktivitet, som er omtalt nedenfor. Vi finner at bestemmelse av celletall er mindre invasiv og resulterer i lavere variabilitet enn å bestemme intracellulære luciferaseverdier.
- Start programvaren for mikroskopets operativsystem (figur 6).
- I kategorien Oppsett velger du riktig forhåndsdefinert platetype. Hvis platetypen ikke er forhåndsinnstilt, angir du platedimensjonene manuelt.
- Legg platen inn i mikroskopet ved å klikke på alternativet Eject and Load .
- Deretter velger du målet 20x luft (numerisk blenderåpning [NA]: 0,4 ).
MERK: Forsikre deg om at målkragen er satt til riktig verdi, slik at riktig fokus med forskjellige platetyper. - Under Kanalvalg velger du Hoechst 33342.
MERK: Kanalinnstillingene for tid, kraft og høyde må optimaliseres i henhold til platetypen som brukes. - På Definer layout velger du alle brønnene fra platen og fire felt fra brønnen.
- På Online Jobs velger du den tilsvarende mappen for å overføre dataene til analyseprogramvaren.
10. Bildeanalyse
MERK: Enhver bildeanalyseprogramvare kan brukes til å segmentere og telle cellekjerner fra de oppkjøpte bildene. Her beskriver vi trinnene for å bruke en bestemt online programvare som er kompatibel med flere automatiserte mikroskopfiler.
- Start bildeanalyseprogramvaren.
- Gå til kategorien Bildeanalyse for å starte bildesegmenteringen (figur 7A).
- I kategorien Input Image klikker du på + -tegnet for å legge til en ny byggeblokk (figur 7A).
- Velg alternativet Finn kjerner fra listen (figur 7A) og velg Hoechst 33342 som kanalalternativ (figur 7B).
- Inspiser visuelt de segmenterte objektene på bildet og velg den mest nøyaktige segmenteringsmetoden.
MERK: For dette eksperimentet brukte vi metode C (figur 7C). Hvert metodealternativ har underkategorier som kan justeres for å oppnå best mulig segmentering. - Klikk deretter på kategorien Definer resultater (figur 7C) og velg Standard utgang som metodealternativ .
- Fra underkategorien velger du Kjerneantall objekter og Objektantall (figur 7C).
- Lagre analysepipelinen ved hjelp av alternativet Lagre analyse på disk eller Lagre analyse i database .
- Under kategorien Gruppeanalyse velger du dataene som skal analyseres fra treet.
- Under Metode velger du analysepipelinen som ble lagret i trinn 10.8.
MERK: Det er også mulig å laste opp en skriptfil fra utenfor den refererte programvaren eller laste opp en eksisterende analyse som er lagret i databasen. - Klikk på Kjør analyse for å starte analysen (figur 7D). På slutten av denne arbeidsflyten genereres to datasett: rå luciferase-verdier fra supernatantene og cellenummeret i hver brønn. Bruk begge til å normalisere luciferase-verdien per celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en tidligere publikasjon8 brukte vi vellykket denne analysen til å skjerme små molekyler og siRNA-biblioteker og identifiserte nye regulatorer av ATG4B. Her beskriver vi protokollen og representative resultater av denne luciferase-reporteren i et halvautomatisert, høyt gjennomstrømningsscreeningsformat. Figur 8 viser et eksempel på rådataanalyse for både cellekjerner og luminescens. Et typisk resultat av en luminescensmåling er vist i figur 8A. Det basale luminescenssignalet fra DMSO kan ses i kolonne 1, og i nærvær av 10 μM av ATG4B-hemmeren FMK9A i kolonne 24. Kjerneantallet fra samme plate kan sees i figur 8B. Råverdier for hver forbindelse ble normalisert til nøytrale kontrollmiddelverdier for å oppnå prosentandelen av ATG4B-aktivitet og celleoverlevelse (figur 9A,B). Som forventet hadde de fleste forbindelsene ingen effekt på ATG4B-aktivitet, indikert ved verdier nær basal luminescens fra den negative kontrollen (DMSO - kolonne 1). Z-faktoren, som er en kvalitetsindeks for high throughput screening, ble beregnet ved hjelp av ligning (1):
Z' = 1 - (3 × 
) (1)
Der STDpos er standardavviket til den positive kontrollen (FMK9a), er STDneg standardavviket til den negative kontrollen (DMSO), AVGpos er gjennomsnittet av den positive kontrollen, og AVGneg er gjennomsnittet av den negative kontrollen.
For å velge treffene brukte vi de normaliserte verdiene til å beregne et forholdstall som skal brukes som grenseverdi for identifisering av ATG4B-hemmere. Forholdet ble beregnet ved å dele ATG4B-aktiviteten til hver forbindelse med dens cellelevedyktighet. Vi vurderte at ratio >1 indikerte mulige ATG4B-aktivatorer og ratio <1 indikerte mulige ATG4B-hemmere (figur 9C). Vi valgte alle forbindelser med forholdsverdier tilsvarende den positive kontrollen FMK9A og ekskluderte forbindelser som var cytotoksiske.
I denne skjermen plukket vi kirsebærplukket 53 ATG4B-hemmere for å bekrefte og evaluere deres aktivitet og toksisitet. Forbindelsene ble testet i 10 konsentrasjoner som todelte fortynninger fra 100 μM til 195 nM. Cellene behandlet på en konsentrasjonsresponsmåte gjorde det mulig å tilpasse de kvantifiserte dataene og beregne EC50-verdiene . Inhibitorenes relative toksisitet ble kvantifisert av cellelevedyktighetsdata. Samlet viste disse resultatene at denne tilnærmingen muliggjør identifisering av ATG4B-modulatorer.
Figur 1: Arbeidsflyt for analyse. Eksperimentet beskriver tidslinjen for stabil cellelinjegenerering og en arbeidsflyt med høy gjennomstrømningsanalyse, som starter med stabil cellelinjegenerering, sammensatt screening, måling av luciferase, bildeoppkjøp og dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinnvise instruksjoner for oppsettet av væskebehandler . (A) Innstillinger for kategorien Protokoll . (1) Velg prøveplateformat og type. (2) Velg destinasjonsplatetype. (B) Velg liste-fanen . (1) Bruk importalternativet for å importere regnearket. (C) Importer ledetekstvindu for plukkliste . (1) Velg parametrene du vil importere. (2) Klikk på Importer å konkludere. (D) Løpende protokoll. (1) Klikk på Kjør-ikonet . (2) Hurtigvindu som viser kjørealternativet og for å starte protokollkjøringen. (E) Kjør status-fanen . (1) Start protokollen. (F) Hurtigvindu for å legge kildeplaten. (G) Hurtigvindu for å legge inn destinasjonsplaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Konfigurasjon av væskehåndteringsrobot. (A) Konfigurasjon av Tecan-dekket. (P1) Plasser for 50 μL engangsspissstabel. (P2, P4) Posisjoner for analyseplaten. (P3, P5) Posisjoner for de tomme, helsvarte, 384-brønnplatene. (P6) Posisjon for avhending av brukte tips. (B) Skjermbilde av analyseskriptet. (C) Skjermbilde av MAC96-aspiratdetaljene. (1) Velg aspirasjonsvæskeklassen. (2) Skriv inn volumet for aspirasjon. (3) Velg brønnposisjoner for aspirasjon. (D) Skjermbilde av MAC96-dispenserdetaljene. (1) Velg væskeklasse. (2) Skriv inn volumet for dispensering. (3) Velg de samme brønnposisjonene for dispensering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Skjermbilde av innstillingene for luminescensplateleseren . (A) Kategorien Måleinnstillinger . (1) Velg blenderåpning. (2) Velg avstand, tid og korreksjonsfaktor. (B) Protokoll generelle innstillinger. (1) Velg platetype. (2) Velg målemodus. (3) Velg antall analyseplater. (C) Innstillinger for utleveringsmåling. (1) Velg måling. (2) Still inn måletiden. (3) Velg pumpe, dispenseringshastighet og volum. (4) Definer dispenseringsrekkefølgen og platerepetisjonen. (D) Brønnvalg-fanen. (1) Velg brønnene for måling. (2) Start måleprotokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Skjermbilde av dispenserkontrollen til luminescensplateleseren . (a) Kategorien Initialisering . (1) Velg pumpen. (2) Start pumpen. (B) Skyll protokollalternativet. (1) Velg skyllealternativet. (2) Klikk neste for å flytte til innstillinger. (C) Alternativer for innstillinger for skyllefanen. (1) Velg pumpen. (2) Velg spissfestet. (3) Klikk neste for å flytte til neste fane. (D) Tab for å starte skyllingen. (1) Klikk på start for å starte skylleprotokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Skjermbilde av den automatiserte programvaren for mikroskopavbildning med høyt innhold. Detaljer om innstillingene som brukes til bildeopptak. (1) Kategorien Oppsett . (2) Velg platetype. (3) Velg Løs ut for å legge platen inn i mikroskopet. (4) Velg målet. (5) Legg til kanalen. (6) Velg mappen for å overføre data til Columbus-programvaren. (7) Velg brønner. (8) Velg felt. (9) Klikk på kategorien Kjør eksperiment for å starte bildeoppkjøpet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Bildeanalyse på nettbasert programvare. (A) Kategorien Bildeanalyse. (1) Klikk på + for å legge til en byggekloss. (2) Velg Finn kjerner alternativ. (B) Finn kjerneinnstillinger. (1) Velg kanalen. (2) Velg segmenteringsmetode. (C) Definer resultater-fanen. (1) Velg Standard utgang. (2) Velg alternativet som skal vises som resultat. (D) Bildeanalyse. (1) Batchanalyse-fanen. (2) Velg måling. (3) Velg analysemetode. (4) Start bildeanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Representative bilder fra luciferasemålinger og kjernetelling . (A) Luciferase relative intensitetsverdier fra en 384-brønns analyseplate representert ved tall og farger. (B) Resultater av bildeanalyse. (1) Varmekart over kjernens antall objekter. (2) Tabell som viser resultatene for hver brønn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Representative resultater etter datanormalisering . (A) Representativ ATG4B aktivitetsprosent etter datanormalisering til gjennomsnittlig ATG4B-aktivitet fra negative kontrollbrønner (DMSO) innenfor samme plate. Aktivatorer er vist i rødt og hemmere i blått, med hvitt som indikerer ingen signifikant endring i aktivitet. Negativ kontroll (DMSO) finnes i kolonne 1 og positiv kontroll (FMK9A) finnes i kolonne 24. (B) Representativ celle levedyktighetsprosent etter datanormalisering til å bety cellenummer fra negativ kontroll (DMSO) brønner innenfor samme plate. Spredning er vist i grønt og toksisitet i rødt, med gult som indikerer ingen signifikant endring i cellenes levedyktighet. Negativ kontroll (DMSO) finnes i kolonne 1 og positiv kontroll (FMK9A) finnes i kolonne 24. (C) Fordeling av forbindelser i henhold til forholdsverdien. Hver prikk representerer en forbindelse. Forholdet ble beregnet ved å dele ATG4B-aktiviteten med cellelevedyktighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en cellebasert reporter-genanalyse for identifisering av ATG4B-hemmere. Identifiseringen av primære treff er basert på luciferaseaktivitet ved behandling av celler som uttrykker den åpne leserammen for LC3B i full lengde mellom β-aktin og dNGLUC. Noen fordeler med denne analysen er at den er sensitiv, svært kvantitativ og ikke-invasiv, da den kan oppdage dNGLUC uten å lysere cellene. Dette papiret presenterer en detaljert protokoll for å generere en stabil cellelinje og en primær screening. Det er noen kritiske trinn i protokollen.
For det første brukte protokollen beskrevet her PANC1-cellelinjen, som presenterer en høy transfeksjonseffekt og høy spredningsevne. Denne screeningmetoden kan utføres ved hjelp av andre cellelinjer, men transduksjonseffekten kan variere fra en cellelinje til en annen. For det andre bør man unngå å arbeide med stabile cellepopulasjoner fra frosne bestander med passasjetall høyere enn fem, da ekspresjonsnivåene til reporteren kan reduseres over tid. For det tredje er det viktig å bruke en fersk cellebatch før hver analyse for å oppnå maksimalt og et konsistent signal om luciferase innen forskjellige eksperimenter. For det fjerde, når du sår cellene, enten manuelt eller ved hjelp av en bulkdispenser, må cellesuspensjonen omrøres kontinuerlig for å oppnå en homogen celletetthet gjennom platen. For det femte, når supernatanten høstes fra brønnen, er det viktig at spissene plasseres på en passende dybde inne i brønnene for å aspirere supernatanten uten å forstyrre cellemonolaget i bunnen av brønnen. Til slutt bør substratarbeidsløsningen utarbeides på analysedagen. Coelenterazin er svært lysfølsomt og utsatt for oksidasjon, og det er noen rapporter om raskt substratforfall etter tilberedning.
En rekke cellebaserte analyser er tilgjengelige for å undersøke konsekvensen av ATG4B-hemming eller aktivering, men undersøkelse av den cellulære aktiviteten til ATG4B er fortsatt begrenset4. Denne metoden er ikke-invasiv, svært følsom, robust og direkte avhengig av ATG4B-aktivitet, da aktiviteten resulterer i frigjøring av dNGLUC. Den beskrevne protokollen er enkel og krever bare kort tid å skjerme 10x 384-brønnplater. En annen fordel med metoden er at den kan brukes til overvåking av ATG4B-aktivitet in vivo, siden dNGLUC er svært stabil og kan måles ex vivo fra serum.
Selv om vi med hell har brukt denne reporteren til å skjerme små molekyler og siRNA-biblioteker og identifisert nye regulatorer av ATG4B-aktivitet, er det noen begrensninger som skal vurderes i denne protokollen. For det første er den beskrevne cellebaserte analysen avhengig av en reporteravlesning som indirekte reflekterer endringer i ATG4B-aktivitet, noe som muliggjør påvisning av både hemmere og aktivatorer av ATG4B-aktivitet. Derfor bør treffene gjennomgå ytterligere evaluering slik at deres spesifisitet og aktivitet blir validert. Videre bør inhibitorer evalueres videre i deres evne til å regulere den romlige fordelingen av LC3 i celler eller andre autofagirelaterte proteiner. For det andre, selv om denne analysen enkelt kan modifiseres til en analyse i mindre skala på grunn av den enkle håndteringen og dataanalysen, krever den en grad av automatisering for substrattillegg og påfølgende luminescensmåling. For det tredje, fordi mekanismen for dNGLUC-frigjøring er dårlig forstått på molekylært nivå, kan forbindelser som forstyrrer elementer i sekresjonsveien påvirke resultatene. Endelig kan cellens levedyktighet også bestemmes av den intracellulære luciferaseaktiviteten. Selv om vi finner at bestemmelse av celletall er mindre invasiv og resulterer i lavere variabilitet enn å bestemme intracellulære luciferaseverdier, begrenser bestemmelse av cellenumre deres bruk for mindre forskningslaboratorier, da de gir vanskeligheter når det gjelder bildeutstyr, dataanalyseprogramvare og datalagring. Samlet sett muliggjør den utviklede cellebaserte reporter-genanalysen identifisering av ATG4B-hemmere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av UK Medical Research Council kjernefinansiering til MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR / M02492X / 1, Pancreatic Cancer UK (tilskuddsreferanse 2018RIF_15), og UCL Therapeutic Acceleration Support-ordningen, støttet av finansiering fra MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC / PC / 19054. Plasmidet som koder for ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) ble hentet fra Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al.
- Towers, C. G., Thorburn, A.
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A.
- Kimmelman, A. C., White, E.
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A.
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, ÁF., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
