Summary
Denne artikkelen beskriver produksjonsprosessen for kimære antigenreseptor-T-celler til klinisk bruk, spesielt ved bruk av en automatisert celleprosessor som er i stand til å utføre viral transduksjon og dyrking av T-celler. Vi gir anbefalinger og beskriver fallgruver som bør vurderes under prosessutvikling og implementering av en klinisk studie i tidlig fase.
Abstract
Chimeric antigen receptor (CAR)-T-celler representerer en lovende immunterapeutisk tilnærming til behandling av ulike ondartede og ikke-ondartede sykdommer. CAR-T-celler er genetisk modifiserte T-celler som uttrykker et kimært protein som gjenkjenner og binder seg til et celleoverflatemål, noe som resulterer i drap av målcellen. Tradisjonelle CAR-T-celleproduksjonsmetoder er arbeidskrevende, dyre og kan medføre risiko for forurensning. CliniMACS Prodigy, en automatisert celleprosessor, gjør det mulig å produsere celleterapiprodukter i klinisk skala i et lukket system, noe som minimerer risikoen for kontaminering. Behandling skjer halvautomatisk under kontroll av en datamaskin og minimerer dermed menneskelig involvering i prosessen, noe som sparer tid og reduserer variasjon og feil.
Dette manuskriptet og videoen beskriver T-celletransduksjonsprosessen (TCT) for fremstilling av CAR-T-celler ved hjelp av denne prosessoren. TCT-prosessen involverer CD4 + / CD8 + T-celleanrikning, aktivering, transduksjon med en viral vektor, ekspansjon og høsting. Ved hjelp av aktivitetsmatrisen, en funksjonalitet som tillater bestilling og timing av disse trinnene, kan TCT-prosessen tilpasses omfattende. Vi gir en gjennomgang av CAR-T-celleproduksjon i samsvar med gjeldende Good Manufacturing Practice (cGMP) og diskuterer påkrevd frigjøringstesting og prekliniske eksperimenter som vil støtte en Investigational New Drug (IND) -applikasjon. Vi demonstrerer gjennomførbarheten og diskuterer fordeler og ulemper ved å bruke en halvautomatisk prosess for klinisk CAR-T-celleproduksjon. Til slutt beskriver vi en pågående utprøver-initiert klinisk studie som retter seg mot pediatriske B-celle maligniteter [NCT05480449] som et eksempel på hvordan denne produksjonsprosessen kan brukes i en klinisk setting.
Introduction
Adoptivoverføring av T-celler konstruert for å uttrykke en kimær antigenreseptor (CAR) har vist bemerkelsesverdig effekt ved behandling av pasienter med ildfaste B-cellemaligniteter 1,2,3,4,5. Imidlertid er de tradisjonelle produksjonsmetodene for CAR-T-celler arbeidskrevende, tidkrevende og krever høyt utdannede teknikere for å utføre høyt spesialiserte trinn. For eksempel involverer den tradisjonelle produksjonsprosessen av et autologt CAR-T-celleprodukt sentrifugering av tetthetsgradient, eluering eller magnetisk separasjon for å berike T-celler, aktivering og transduksjon med en viral vektor i en steril kolbe og ekspansjon i en bioreaktor før høsting og formulering. Ulike systemer har dukket opp nylig som tar sikte på å delvis automatisere denne prosessen. For eksempel er Miltenyi CliniMACS Prodigy (heretter referert til som "prosessoren") en automatisert cellebehandlingsenhet som kan utføre mange av disse trinnene på en automatisert måte 6,7,8,9. En grundig diskusjon av tradisjonelle og automatiserte CAR-T produksjonsmetoder er presentert i en fersk gjennomgangsartikkel10.
Prosessoren bygger på funksjonaliteten til CliniMACS Plus, et amerikansk Food and Drug Administration (FDA)-godkjent medisinsk utstyr for behandling av hematopoietiske stamceller. Prosessoren inkluderer en cellekultiveringsenhet som muliggjør automatisert vasking, fraksjonering og dyrking av celler (figur 1). T-celletransduksjonsprosessen (TCT) er et forhåndsinnstilt program i prosessorenheten som i stor grad replikerer manuell CAR-T-celleproduksjon. TCT gjør det mulig å tilpasse cellebehandling ved hjelp av et grafisk brukergrensesnitt ("Activity Matrix", figur 2). Fordi prosessoren automatiserer mange trinn og konsoliderer funksjonaliteten til flere enheter i én maskin, krever den mindre opplæring og spesialiserte feilsøkingsferdigheter fra teknikere. Fordi alle trinnene utføres innenfor et lukket slangesett til engangsbruk, kan prosessoren brukes i anlegg med mindre streng luftbehandlingsinfrastruktur enn det som anses som akseptabelt for en åpen produksjonsprosess. For eksempel bruker vi prosessoren i et anlegg sertifisert som ISO-klasse 8 (sammenlignbart med EU-grad C).
Figur 1: CAR-T-celleproduksjon ved bruk av T-celletransduksjonssystemet. Prosessoren med slangesettet installert vises. Slangesettet gjør det mulig å koble til andre komponenter som poser som inneholder prosesseringsbuffer, kulturmedium og lentiviral vektor via steril sveising. Når leukafereseproduktet er lagt til påføringsposen, kan det merkes med T-cellevalgsperler, føres gjennom separasjonskolonnen og deretter overføres til påføringsposen på nytt. Utvalgte celler blir deretter rettet til dyrkingsenheten til kulturinstrumentet og aktivert med aktiveringsreagenset (se materialtabell). Det endelige produktet samles i målcelleposen. Gjennom hele prosessen er det mulig å fjerne prøver for kvalitetskontroll aseptisk. Grå tall på innsiden av sirkler representerer de nummererte ventilene på prosessoren som leder væskebanen gjennom slangesettet. Gjengitt med tillatelse fra 11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Aktivitetsmatrise. Etter T-cellevalg og aktivering er resten av CAR-T-celleproduksjonsprosessen fullt tilpassbar. Aktiviteter kan legges til eller slettes og planlegges for riktig dag og klokkeslett, og kulturvolumet etter aktiviteten kan spesifiseres (volum). Transduksjonsaktiviteten ble for eksempel konfigurert til å begynne klokken 10:00 på dag 1, og kulturvolumet på slutten av aktiviteten ble satt til 100 ml. Aktivitetsmatrisen kan redigeres gjennom hele dyrkingsperioden. Statusen til prosessen kan overvåkes på den integrerte skjermen til behandlingsenheten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Målet med dette manuskriptet er å gi en detaljert gjennomgang av produksjonen av CAR-T-celler ved hjelp av prosessoren og i tillegg gi veiledning om testing i prosessen og produktutgivelsen som sannsynligvis vil bli pålagt av regulatorer for å godkjenne en undersøkelsesapplikasjon for nytt legemiddel (IND). Den presenterte protokollen holder seg nær leverandørens anbefalte tilnærming og er den underliggende protokollen for IND 28617, som for tiden evalueres i en enkeltsenter-etterforskerinitiert fase I / II klinisk studie. Denne studien tar sikte på å bestemme sikkerheten og effekten av å bruke denne prosessoren til å produsere humaniserte CD19-rettede autologe CAR-T-celler for pasienter med B-celle akutt lymfoblastisk leukemi (B-ALL) eller B-avstamning lymfoblastisk lymfom (B-Lly) [NCT05480449]. Studien startet i september 2022 og er planlagt å registrere opptil 89 pasienter i alderen 0-29 år med B-ALL eller B-Lly. Vi rapporterer noen produksjonsresultater fra forsøket i manuskriptet.
Vi vil påpeke at selv om manuskriptet presenteres som en protokoll med trinn som skal følges, bør det betraktes som et utgangspunkt for andre å begynne å optimalisere sin egen CAR-T-celleproduksjonsprosess. En ikke-omfattende liste over mulige variasjoner til den presenterte protokollen inkluderer: bruk av friske i stedet for kryopreserverte T-celler som utgangsmateriale; ved hjelp av en annen metode for T-celleberikelse eller utelatelse av den helt; bruk av forskjellige medier og cytokincocktailer som IL7 / IL15 i stedet for IL2; variere konsentrasjonen av humant AB-serum eller utelate det helt; timing av transduksjon; ved hjelp av "multi-hit" transduksjoner; varierende agitasjon, kulturvolumer og fôringsplan; bruk av forskjellige metoder for genetisk overføring, inkludert elektroporering av nukleinsyrer eller ikke-lentivirale vektorer; ved bruk av en annen endelig formuleringsbuffer og/eller kryobeskyttelsesmiddel; og infusjon av CAR-T-celler friske i stedet for kryopreserving til infusjon på et senere tidspunkt. Disse variasjonene kan ha en signifikant innvirkning på det terapeutiske produktets cellulære sammensetning og styrke.
| Overordnet prosesstrinn | Prosess dag | Tekniske detaljer | |||
| Berikelse av celler | Dag 0 | Utvalg av CD4+/CD8+ T-celler | |||
| Cell Aktivering | T-cellekultur såing og aktivering | ||||
| Cell transduksjon | Dag 1 | Lentiviviral transduksjon (100 ml dyrkningsvolum) | |||
| Celleutvidelse (etterfulgt av celleformulering) | Dag 2 | -- | |||
| Dag 3 | Kultur vask (1 syklus); Shaker aktivert; Kulturvolumet øker til 200 ml | ||||
| Dag 4 | -- | ||||
| Dag 5 | Fôr (50 ml); Kulturvolumet når endelig volum på 250 ml | ||||
| Dag 6 | Prøve i prosessen; Medieutveksling (-125 ml / +125 ml) | ||||
| Dag 7 | Medieutveksling (-150 ml / +150 ml) eller Harvest | ||||
| Dag 8 | Prøve i prosessen; Medieutveksling (-150 ml / +150 ml) eller Harvest | ||||
| Dag 9 | Medieutveksling (-180 ml / +180 ml) eller Harvest | ||||
| Dag 10 | Prøve i prosessen; Medieutveksling (-180 ml / +180 ml) eller Harvest | ||||
| Dag 11 | Medieutveksling (-180 ml / +180 ml) eller Harvest | ||||
| Dag 12 | Medieutveksling (-180 ml / +180 ml) eller Harvest | ||||
| Dag 13 | Høste | ||||
Tabell 1: Prosesstidslinje og oversikt. Denne tabellen oppsummerer TCT-prosesstrinnene som er brukt i en pågående klinisk studie [NCT05480449]. Prosessen starter med T-celleanrikning ved CD4+/CD8+-seleksjon, dyrkningssåing og aktivering på dag 0, etterfulgt av transduksjon på dag 1. Cellene hviler i 48 timer, etterfulgt av en kulturvask, en økning av kulturvolumet til 200 ml og omrøring ved hjelp av en ristemekanisme. På dag 6 tas den første prosessprøven. Cellene høstes når tilstrekkelige celler er tilgjengelige for minst tre fulle doser CAR-T-celler (5 × 10 6 CAR-T-celler/kg hvis pasienten er <50 kg, ellers 2,5 × 108 CAR-T-celler) og kvalitetskontrolltesting (~2 × 106 CAR-T-celler); eller når kulturen når totalt 4-5 x 109 celler. Forkortelser: TCT = T-celletransduksjon; CAR-T = kimære antigenreseptor T-celler; MACS = magnetisk aktivert cellesortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer med godkjenning av sykehusets Institutional Review Board (IRB), og alle forsøkspersoner har gitt informert samtykke til publisering av dataene som er samlet inn i forbindelse med studien.
MERK: Den første delen av protokollen gir en overordnet oversikt over CAR-T-produksjonsprosessen. De resterende delene inneholder trinnvise instruksjoner. Protokollen beskriver arbeidsflyten ved hjelp av TCT-programvareversjon 1.4, som er den gjeldende versjonen i skrivende stund. Brukergrensesnittet til andre versjoner av TCT-programvaren kan variere.
1. Prosesstidslinje og oversikt (tabell 1)
- Forbered prosedyren på en mandag (dag -1) med Preflight-kontroller. Kontroller at prosessoren og annet utstyr kjører som forventet, og at alle reagenser og forbruksvarer er tilgjengelige og oppdaterte for hele produksjonsløpet.
- På dag 0, installer slangesettet på maskinen. Tine tidligere kryopreserverte T-celler i et tørt bad og koble dem ved steril sveising til slangesettet som er installert på instrumentet.
MERK: Denne protokollen forutsetter at autologe T-celler ble samlet inn via aferese, kryopreservert og lagret til produksjonsstart. Selv om det er mulig å bruke nyoppsamlede T-celler, øker dette den logistiske byrden da det krever koordinering av afereseoppsamling med CAR-T-celleproduksjon. Vi anbefaler på det sterkeste å bruke en tørr-tine-prosess i stedet for et vannbad for å minimere risikoen for bakteriell forurensning. - Merk T-celler med CD4- og CD8-reagenser (se Materialfortegnelse) og anrik ved magnetisk utvalg.
MERK: Det er mulig å utelate T-celleberikelse eller utføre det før du laster celler på prosessoren. Se protokollens kapittel 5. - Etter anrikning av CD4 + / CD8 + celler, ta en prøve for en celletelling. Frø kulturen med 1-2 × 108 celler i et startvolum på 70 ml medium (se materialtabell) supplert med 5% humant AB serum og rekombinant humant IL2 (25 ng / ml).
- Legg til et hetteglass med aktiveringsreagens (en kolloidal polymer nanomatrise konjugert til anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer, se materialtabell) for å aktivere T-celler og inkubere kulturen uten omrøring i 24 timer ved 37 ºC i en 5% CO2 atmosfære. Kryokonservere eventuelle gjenværende CD4+/CD8+-celler som sikkerhetskopi, hvis ønskelig.
MERK: I tilfelle produksjonsfeil, kan gjenværende CD4 + / CD8 + valgte celler brukes som utgangsmateriale. Hvis feilen er rent teknisk, for eksempel forurensning eller operatørfeil, og tilstrekkelige celler gjenstår, kan du vurdere å bruke gjenværende celler til å utføre en ekstra produksjonskjøring. Hvis kvaliteten på utgangsmaterialet er av bekymring, kan en ny afereseprosedyre være berettiget; Dette er imidlertid til syvende og sist en klinisk beslutning. I begge tilfeller er en produksjonssvikt en betydelig hendelse som bør undersøkes, og sponsoren og muligens regulatorer bør informeres. - Etter 24 timers aktivering, transducer T-celler med lentiviral vektor ved en passende infeksjonsmultiplikasjon (MOI).
MERK: Det er viktig å bestemme lentiviral vektortiter og etablere en passende MOI før du begynner å produsere kliniske produkter. Vektortiteren skal bestemmes ved å utføre et småskala eksperiment der humane primære T-celler transduseres ved forskjellige konsentrasjoner av vektoren. Betraktninger for riktig MOI inkluderer kostnaden for vektoren, ønsket transduksjonseffektivitet og et akseptabelt vektorkopinummer. Denne protokollen bruker en MOI på 30-50% for å minimere kostnadene for vektoren og holde gjennomsnittlig vektorkopinummer under 8 kopier per transduserte celle. - På dag 3, utløs Kulturvask-aktiviteten, og start agitasjon på lavt nivå. Øk kulturvolumet til 200 ml.
- På dag 5, tilsett 50 ml medium til kulturen, og øk kulturvolumet til 250 ml.
- På dag 6 av dyrking, ta en prøve fra kulturen, og oppregn CAR-T-celler ved flowcytometri. Bruk denne målingen til å estimere hastigheten som kulturen vokser med og identifisere det optimale tidspunktet for høsting.
MERK: Hver prøvetaking i prosessen gir 3 ml for testing og fjerner 7 ml totalt dyrkningsvolum. - Fra dag 7 til 13, hvis kulturen ikke er avsluttet, ta opptil to ekstra prøver i prosessen annenhver dag, og utfør daglige medieutvekslinger for å mate den voksende kulturen. Høst produktet når det totale antallet kjerneceller (TNC) når 5 × 10,9 og/eller når tilstrekkelige celler er tilgjengelige for det nødvendige antall doser og frigjøringstesting.
- På høstdagen, ta en prosessprøve fra den aktivt voksende kulturen. Bruk denne prøven for mykoplasma, endotoksin, replikasjonskompetent lentivirus (RCL) testing, vektorkopinummer (VCN) testing, celletall, cellestørrelsesanalyse, flowcytometri og gramflekk.
- Start det endelige høstprogrammet, som utløser fjerning av kulturmediet og en cellevask med den endelige formuleringsbufferen (en steril isoton krystalloid løsning supplert med 4% humant serumalbumin, se materialfortegnelse). Etter at høstingen er fullført, vil målcelleposen inneholde 100 ml celleprodukt i den endelige formuleringsbufferen. Tilsett dimetylsulfoksid (DMSO) til en konsentrasjon på 10 % (v/v), alikot produktet i individuelle doser og kryokonservering ved hjelp av en fryser med kontrollert hastighet.
2. Dag -1: Klargjøring og forhåndskontroll
- Kontroller at CO2 -gassnivåer og trykkluft er tilstrekkelig til å produsere et innløpstrykk på minst 20 psi på hver linje.
- Slå på prosessoren og bekreft at det ikke er noen feil ved oppstart. Hvis nødvendig, still klokken til riktig tid. Slå av prosessoren.
- Forsikre deg om at celleantall, volum og total CD4+ og totalt CD8+-antall for T-cellens utgangsmateriale er kjent.
- Forsikre deg om at det er tilstrekkelige mengder av virusvektoren, reagenser og forbruksvarer for hele produksjonsløpet.
- Legg en flaske AB-serum for mennesker i kjøleskapet for å tine over natten.
3. Dag 0: Installasjon av rørsett
- Klargjør 3 l behandlingsbuffer (0,5 % (w/v) humant serumalbumin (HSA) i fosfatbufret saltvanns-/etylendiamintetraeddiksyre (PBS/EDTA) buffer).
- Tilbered 2 l dyrkningsmedium (2 l medium tilsatt 100 ml humant AB serum til en endelig konsentrasjon på 5 % og to hetteglass med rekombinant humant IL2 ved 25 μg/hetteglass; se Materialfortegnelse for mer informasjon om disse reagensene). Overfør 10 ml dyrkningsmedium til en 20 ml reagenspose og oppbevar ved 4 ºC over natten.
- Slå på instrumentet og velg T Cell Transduction Process (TCT) fra berøringsskjermgrensesnittet. Klikk Kjør for å starte TCT-prosessen; La instrumentet veilede brukeren gjennom prosedyren ved hjelp av instruksjoner og instruksjoner på skjermen.
- På skjermbildet Parameter Input skriver du inn operatørens initialer, slangesettets lot-nummer og utløpsdatoen når du blir bedt om det.
- Skjermbildet Prosessoppsett viser fire forskjellige prosesser. Velg Full prosess (1).
MERK: Andre tilgjengelige prosesser inkluderer å starte fra CD4+/CD8+ utvalgte T-celler (se avsnitt 5 nedenfor) og starte en tidligere avbrutt produksjonskjøring på nytt. - Når du blir bedt om det, velger du to hetteglass med markeringsreagens for å gjenspeile CD4+/CD8+-valgmetoden.
- Installer slangesettet i henhold til instruksjonene på skjermen. Forsikre deg om at alle Luer-tilkoblinger er tette og at det ikke er noen defekter i slangesettet.
- Følg instruksjonene på skjermen for å starte de automatiserte øvre og nedre integritetstester.
MERK: En integritetstest kan mislykkes på grunn av et defekt slangesett, et feil installert slangesett eller en feil i maskinens peristaltiske pumpe. Vi anbefaler på det sterkeste å ha minst ett ekstra slangesett tilgjengelig for produksjonskjøringer. Vi anbefaler også at en annen tekniker verifiserer riktig installasjon av slangesettet. - Følg instruksjonene på skjermen for å feste mediet og behandlingsbufferposene.
- Begynn den automatiske primingen av slangesettet.
MERK: TCT-prosessen må fortsette innen 3 timer etter grunning. Forsikre deg om at T-celle startmateriale vil være klart.
4. T-celle berikelse
- Når skjermbildet Transfer cell product (Overføringscelleprodukt ) vises, begynner du å tine det kryopreserverte T-celleproduktet.
MERK: Det akseptable volumet av T-celler som kan legges til slangesettet varierer fra 50 til 280 ml. Maksimalt antall målceller (summen av CD4+ og CD8+) er 3 × 109, og det maksimale TNC-antallet er 2 × 1010. - Overfør de tinte cellene til en 150 ml overføringspose. Sveis overføringsposen sterilt til påføringsposen på slangesettet.
- Fjern en prøve fra påføringsposen ved hjelp av QC-posen, og utfør en celletelling.
- Koble til hetteglassene med CD4- og CD8-reagenser.
- Start den merkede prosessen (T-celleberikelse).
- Etter anrikning fjerner du en prøve av de valgte cellene i CD4+/CD8+ fra QC-posen for påføringsposen på nytt for celleantall, flowcytometri og cellestørrelsesanalyse.
MERK: Celletellingsresultatet er nødvendig for å gå videre til neste trinn.
5. Alternativ: Starter med CD4 + / CD8 + valgte celler
- Klargjør mediet som beskrevet i trinn 3.2. Ingen behandlingsbuffer er nødvendig.
- Slå på prosessoren, og velg T-celledyrking med TS-installasjon (3) på skjermbildet Prosessoppsett . Følg instruksjonene og instruksjonene på skjermen.
- Følg instruksjonene på skjermen, fyll slangesettet med middels i stedet for behandlingsbuffer.
- Når skjermbildet "Forbered dyrking-Koble til celleprodukt" vises, begynner du å tine CD4+/CD8+ valgte T-celler.
MERK: Minste antall T-celler (summen av CD4+- og CD8+ T-celler) for prosessen er 1,0 × 108. - Overfør cellene til en 150 ml overføringspose og fortynn den med middels til et endelig volum på 50 ml.
- Steril sveis cellesuspensjonen til instrumentets påføringspose på nytt.
- Fjern en prøve av de merkede CD4+/CD8+-cellene fra den påføringsposens QC-pose på nytt for celleantall og analyse av cellestørrelse.
6. Kulturoppsett og programmering av aktivitetsmatrisen
- Skriv inn cellekonsentrasjonen og ønsket startnummer (1-2 × 108 T-celler).
MERK: Instrumentet vil automatisk pumpe riktig volum fra påføringsposen inn i kulturkammeret og justere det endelige volumet til 70 ml. - Fest et hetteglass med aktiveringsreagenset i henhold til instruksjonene på skjermen.
- Angi 5 % for CO2 -konsentrasjon og 39 °C for kultur kammertemperatur.
MERK: Produsenten anbefaler å angi 39 °C eller en verdi som er spesielt kalibrert for instrumentet. - Sett opp aktivitetsmatrisen. Bruk den forbedrede fôringsprotokollen som utgangspunkt, og endre de enkelte trinnene i protokollen til brukerdefinerte spesifikasjoner (figur 2).
- Sørg for at tidspunktet for transduksjonsaktivitet er 24 timer etter sådd (dag 1).
- Sørg for at tidspunktet for kulturvaskaktivitet er 48 timer etter transduksjon (dag 3).
- Still inn tiden for Activate Shaker (shaker type 2) til 30 min etter starten av kulturvasken.
- Slett alle Medium Bag Exchange og Waste Bag Exchange aktiviteter.
- Trykk på ok på skjermen for å begynne dyrkingen.
- Kryokonservere eventuelle gjenværende CD4+/CD8+ valgte celler i påføringsposen for fremtidig bruk, om nødvendig.
7. Dag 1: T-celletransduksjon
- Beregn volumet av lentiviralvektoren som skal brukes basert på ønsket MOI.
- Hent opp 20 ml reagensposen inneholdende 10 ml dyrkningsmedium som ble oppbevart ved 4 ºC over natten (trinn 3.2). Tine hetteglasset med vektoren og overfør volumet beregnet i 7,1 til 20 ml reagensposen.
MERK: Vi anbefaler å fryse eventuelle gjenværende vektorer for oppbevaring eller for forskning og utvikling. - Endre aktivitetsmatrisen for å angi tidspunktet for transduksjon til 2 minutter inn i fremtiden. Når du blir bedt om det, trykker du på ok for å starte transduksjonsaktiviteten.
- Sveis vektorposen sterilt til slangesettet i henhold til instruksjonene på skjermen.
- Endre aktivitetsmatrisen basert på den faktiske tiden transduksjonsaktiviteten ble startet.
MERK: Vi foreslår at transduksjon starter innen 20-24 timer etter sådd for å sikre at praktiske aktiviteter utføres i normal arbeidstid.- Sørg for at tidspunktet for kulturvask er 48 timer etter transduksjon (dag 3).
- Still inn tiden for Activate Shaker (shaker type 2) til 30 min etter kulturvask (dag 3).
- Sørg for at tidspunktet for medieutveksling er om ettermiddagen (kl. 13.00) på dag 6.
8. Dag 6: Første eksempel i prosessen
- Trykk på prøveknappen og følg instruksjonene på skjermen for å få en QC-prøve fra den aktive kulturen.
- Utføre celletelling, flowcytometri og cellestørrelsesanalyser. Send 1 ml av prøven for en Gram-flekk.
MERK: Celletall bør gjentas omtrent annenhver dag for å overvåke kulturvekst. - Forbered ytterligere 2 liter kulturmedium (se trinn 3.2).
- Legg til en middels posebytteaktivitet i aktivitetsmatrisen, tidsbestemt til å starte 2 minutter inn i fremtiden. Juster Media Exchange-aktiviteten slik at den starter 20 minutter frem i tid. Følg instruksjonene på skjermen.
MERK: Media Exchange er erstatning av kulturmediet i dyrkingskammeret. Medium Bag Exchange er erstatningen for kulturmedieposen som henger på instrumentet.
9. Innhøstingsdag (hvor som helst fra dag 7 til 13): Høsting og kryopreservering
- Trykk på prøveknappen og følg instruksjonene på skjermen for å få en QC-prøve fra den aktive kulturen.
- Skill QC-prøven i tre alikoter på 1 ml hver. Bruk 1 ml til flowcytometri, celletall og cellestørrelsesanalyser. Bruk 1 ml for mykoplasma, vektorkopinummer, replikasjonskompetent lentivirus og endotoksintesting. Send de siste 1 ml for Gram-flekken.
- Klargjør den endelige formuleringsbufferen (en steril isoton krystalloidoppløsning tilsatt 4 % HSA i en 2 l pose, se materialfortegnelse). Spar 100 ml av denne bufferen for å klargjøre kryobeskyttelsesmiddelløsningen på et senere trinn.
- Endre aktivitetsmatrisen for å angi tidspunktet for kulturslutt til 2 minutter inn i fremtiden, og slett alle andre gjenværende aktiviteter. Følg instruksjonene på skjermen for å feste den endelige formuleringsbufferen til slangesettet og begynne innhøstingen.
MERK: Prosessoren vil automatisk overføre cellene til målcelleposen. Volumet vil være 100 ml. - Ta en 0,5 ml prøve fra QC-posen med målcellepose og utfør en celletelling.
- Forsegle målcelleposen og fjern den fra slangesettet. Del CAR-T-produktet i passende doser og konserverer dem i en fryser med kontrollert hastighet. Oppbevar celler i dampfasen av lagringstank for flytende nitrogen ved ≤ -150 ºC.
MERK: Endelig formulering og aliquoting av doser er spesifikk for protokollen. Vi gir her et eksempel der tre like doser CAR-T-celler og QC-hetteglass kryopreserveres. Se avsnitt 10 for detaljer. - Last ned prosessdataene fra instrumentet, fjern og kast slangesettet, og utfør en avstengning.
10. Kryopreservering av CAR-T-celler
MERK: Denne protokollen forutsetter at CAR-T-celler kryopreserveres etter produksjon og lagres til pasienten er klar til infusjon. Selv om det er mulig å infisere nyproduserte CAR-T-celler, øker dette den logistiske byrden da det krever koordinering av CAR-T-celleproduksjon med CAR-T-celleinfusjon. Dette kan være problematisk ved produksjonssvikt. Spesielt hvis den kliniske protokollen krever lymfopleting kjemoterapi før CAR-T infusjon, anbefaler vi sterkt kryopreservering, fordi en produksjonssvikt kan utsette pasienten for risiko for unødvendig kjemoterapi. Tilsynsmyndigheter kan kreve at utprøvere demonstrerer at produktet består all frigivelsestesting før infusjon, noe som kan være vanskelig å oppnå uten kryopreservering.
- Fra de siste 100 ml av høstet produkt, bestem og fjern volumet som kreves for å oppfylle de ønskede CAR-T-dosene og hetteglassene med kvalitetskontroll (QC) for å utføre ytterligere frigjøringstesting (f.eks. levedyktighet), retensjon og en sterilitetsprøve.
MERK: Det er avgjørende å utvikle en fullt definert strategi for aliquoting av sluttproduktet. Vi foreslår at du produserer flere doser av produktet for å tillate reinfusjoner, gitt at tilstrekkelig materiale er tilgjengelig. Et produktvolum på 10-20 ml i en pose muliggjør rask tining og enkel infusjon ved å trykke på sprøyten. Det anbefales å fylle hvert produkt til ønsket CAR-T-celledose (f.eks. 5 × 106 CAR-T-celler per kg eller 2,5 × 108 CAR-T-celler), da dette vil unngå behovet for doseberegninger på infusjonsdagen. Det anbefales også å kryopreservere minst fire QC-hetteglass og ta høyde for muligheten for at det kan være restmateriale; Vi foreslår at du lagrer dette materialet, da det kan være nyttig for forsknings- og utviklingsformål. - Sentrifuge cellene for å redusere volumet.
- Hent opp produktet/produktene til halvparten av ønsket sluttvolum ved hjelp av den delen av den endelige formuleringsbufferen som ble lagt til side i trinn 9.3.
- Forbered 2x kryobeskyttelsesmiddel ved å lage en 20% DMSO-løsning i endelig formuleringsbuffer.
MERK: Cryoprotectant formulering og DMSO konsentrasjon kan endres. - Tilsett 2x kryobeskyttelsesmiddel til celler med samme volum for en endelig DMSO-konsentrasjon på 10%.
MERK: Produktets eksponering for kryobeskyttelsesmiddel bør minimeres. - Fyll doseposene og QC-hetteglassene. Send 1 ml for sterilitet.
MERK: Regulatorer krever vanligvis en 14-dagers sterilitetsanalyse utført på sluttproduktet. Imidlertid dukker det opp raske sterilitetsanalyser; På dette tidspunktet er den kompendiale 14-dagers metoden den vanligste. - Kryokonserveringsprodukter som bruker fryser med kontrollert hastighet.
MERK: Fryserprogrammet med kontrollert hastighet skal valideres for å produsere en kjølehastighet på ~ -1 ºC / min til ~ -45 ºC, med kompensasjon for det eutektiske punktet. - Oppbevar produktet i dampfasen til en ultralow fryser med flytende nitrogen ved ≤ -150 °C.
11. Undersøkelse av prosedyrens ytelse
MERK: Gjennom TCT-prosessen trekkes flere QC-prøver fra den aktive kulturen. Tabell 2 gir et rutenett som kan hjelpe leseren med å organisere resultatene for referanse og beregne prosedyreytelsesmålinger. Termene nedenfor som består av en bokstav og et tall (f.eks. "B4") refererer til celler i rutenettet i denne tabellen. Følgende verdier brukes i ytelsesberegningene: B3 = totale kjernefysiske celler (TNC) pre-anrikning; B4 = TNC etter berikelse; E2 = Summen av CD4+- og CD8+ T-celler i prosent av de totale cellene i det opprinnelige afereseproduktet; E4 = Summen av CD4+- og CD8+ T-cellene i prosent av de totale cellene etter anrikning; G2 = CD19+ celler som en prosentandel av de totale cellene i det opprinnelige produktet; G4 = CD19+-celler i prosent av de totale cellene etter CD4+/CD8+-anrikning; B10 = TNC av den aktive kulturen på høstdagen.
Tabell 2: Rutenett for prosedyreytelse. Vi tilbyr dette rutenettet for å organisere testsendinger i prosessen som trengs for å beregne statistikk om prosedyreytelse. Rader representerer prøver analysert på forskjellige tidspunkter under prosedyren og er merket med tallene 1-11. Rad 6-9 kan brukes til å fange opp resultater fra prøver tatt etter dag 6 av dyrkingen, men før høstdagen. Kolonner representerer målte parametere og er merket med bokstavene A-H. Felt som er skyggelagt grå, gjelder ikke. Noen tilleggsfelt gjelder kanskje ikke, avhengig av om CD4+/CD8+-anrikning utføres som en del av prosedyren og lengden på dyrkingen. Vi foreslår at du skriver "N/A" i disse feltene. Forkortelser: TNC = totalt antall kjerneceller; QC = kvalitetskontroll. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
- Beregn utvinning av CD4+/CD8+-celler etter seleksjon ved å dividere totalt antall CD4+ pluss CD8+ T-celler etter anrikning med totalt antall CD4+ pluss CD8+ T-celler før anrikning ved hjelp av ligning (1).
CD4 + / CD8 + T-celle utvinning =
(1) - Beregn uttømming av CD19+-celler etter anrikning ved å dele det totale antallet CD19+-celler etter CD4+/CD8+-anrikning med totalt antall CD19+-celler før anrikning. Siden dette tallet forventes å være svært lite, rapporterer logaritmen til denne brøken som vist i ligning (2):
Log CD19 celle uttømming = log10
(2) - Beregn den totale foldeveksten ved å dividere det totale antall celler i aktiv kultur ved høsting med antall celler sådd ved hjelp av ligning (3):
Total foldvekst =
(3) - Beregn gjennomsnittlig daglig vekst ved å ta roten av den totale foldveksten med hensyn til høstdagen ved hjelp av ligning (4):
Gjennomsnittlig daglig vekst = slaktedag √ (total foldevekst) (4)
(1)
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultater fra de tre første CAR-T-produksjonskjøringene i NCT05480449-studien er presentert nedenfor i tabell 3. Startmaterialet, vektor, dyrkningscytokiner og serumkonsentrasjoner av AB ble holdt konsistente for hver kjøring. Produktene ble høstet på dag 7 eller 8. Den gjennomsnittlige daglige celleveksten var 46% (økning i totalt celletall), noe som indikerer at TCT-prosessen var effektiv for å fremme celleutvidelse. Disse resultatene tyder på at prosessoren kan produsere konsistente og reproduserbare CAR-T-celleprodukter.
De endelige produkttestresultatene, oppsummert i tabell 4, viser at CAR-T-cellene passerte kvalitetskontrollstandarder. Cellenes levedyktighet var mellom 88 % og 94 %, og CD3 T-cellerenheten var 89-93 %. Det er viktig at endotoksin, mykoplasma, sterilitet, replikasjonskompetent lentivirus og gjenværende leukemiske celler ikke kunne påvises. Disse resultatene bekrefter at TCT-prosessen produserer CAR-T-celler av høy kvalitet som oppfyller regulatoriske standarder for klinisk bruk.
For denne prosedyren ble det utviklet tre flowcytometripaneler (figur 3). De inkluderer CD4/CD8-panelet for å teste prosentandelen av CD4+- og CD8+ T-celler før og etter anrikning, CD19 CAR-T-panelet for å teste transduksjonseffektivitet, og CD3/CD19-panelet for å bestemme levedyktigheten og innholdet av gjenværende leukemiske (CD19+) celler i sluttproduktet. Resultatene av disse panelene bekrefter vellykket produksjon av CAR-T-celler og fraværet av gjenværende leukemiske celler i sluttproduktet.
Samlet sett tyder resultatene på at TCT-prosessen kan produsere konsistente og høykvalitets CAR-T-celleprodukter egnet for klinisk bruk.
Figur 3: Flowcytometrianalyser. Gatingstrategien som brukes til flowcytometrianalyse er avbildet for hvert panel. Portene tegnes som svarte bokser eller ellipser og merkes, og blå piler angir retningen på gatingen. (A) CD4/CD8-panel. B-celler er definert som CD19+-undergruppen og T-celler som CD3+-undergruppen av lymfeporten. CD4+- og CD8+ T-celler er delmengder av T-celleporten. (B) CD19 CAR-T-panel. CAR+ T-celler er definert som CD19-CAR+-undergruppen av CD3+ T-celler. I tillegg er CD4+- og CD8+-undergrupper som er CD19 CAR+ listet opp. (C) CD3/CD19-panel. Dette panelet er identisk med CD4/CD8-panelet, bortsett fra at CD4- og CD8-markørene utelates. Forkortelser: SSC-A = side spredningsområde; lymfe = lymfocytt; CD19-CAR = CD19-spesifikk kimær antigenreseptor; 7AAD = 7-aminoactinomycin D. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løpe # | Utgangsmateriale | Vektor | Kultur cytokiner | AB serum % | Endelig TNC | Totalt høstet CAR-T-celler | Total foldvekst | Gjennomsnittlig daglig vekst | Høstdag | ||
| 1 | Pasient T-celler, aferese, Kryopreservert |
huCART19 | IL2 | 5% | 2,75 x 109 | 2,24 x 108 | 14 | 45% | 7 | ||
| 2 | Pasient T-celler, aferese, Kryopreservert |
huCART19 | IL2 | 5% | 4,15x109 | 1,14 x 108 | 21 | 46% | 8 | ||
| 3 | Pasient T-celler, aferese, Kryopreservert |
huCART19 | IL2 | 5% | 4,20 x 109 | 8,40 x 107 | 21 | 46% | 8 | ||
Tabell 3: Parametere og vekstegenskaper for tre CAR-T-produksjonsserier i klinisk skala. Detaljer om kulturforhold, vekst og høstedag for de tre første pasientproduksjonskjøringene ved hjelp av prosessoren for den NCT05480449 kliniske studien vises. huCART19, humanisert CD19-rettet CAR lentiviral vektor. Merk at transduksjonseffektivitet og levedyktighet for disse produktene er vist i tabell 4. Forkortelser: CAR-T-celler = kimære antigenreseptor T-celler; TNC = totalt kjernefysiske celler.
| Utgivelse Testing | ||||||||||
| Analyse | Levedyktighet av celler | CD3 % | Endotoksin | Myco-plasma | Transduksjon Effektivitet | Resterende leukemiske celler | Sterilitet Dag 14 | Vektor DNA-sekvens per celle | Vektor DNA-sekvens per transdusert celle | Replikasjon Kompetent Lentivirus |
| Spesifikasjon | ≥ 70% | ≥ 80% | ≤ 3.5 EU/ml |
Negativ | ≥ 2 % | < 1 % | Ingen vekst | Rapporter resultat | 0.04-8 kopier / transduced celle |
< 50 kopier/μg DNA |
| Resultater | ||||||||||
| Løp 1 | 90 | 89 | <0.4 | Negativ | 36 % | Ikke Oppdaget |
Nei Vekst |
1.04 | 2.89 | Ikke Oppdaget |
| Løp 2 | 88 | 93 | <0.4 | Negativ | 39 % | Ikke Oppdaget |
Nei Vekst |
1.16 | 2.97 | Ikke Oppdaget |
| Løp 3 | 94 | 91 | <0.4 | Negativ | 18 % | Ikke Oppdaget |
Nei Vekst |
0.43 | 2.39 | Ikke Oppdaget |
Tabell 4: Endelige produkttester og utgivelsesspesifikasjoner. Spesifikasjonene som vises i denne tabellen, gjelder for den NCT05480449 kliniske utprøvingen (IND 28617). Levedyktighet etter tining ble CD3 %, transduksjonseffektivitet og gjenværende leukemisk celleinnhold målt ved flowcytometri. Endotoksin ble målt ved hjelp av en FDA-lisensiert limulus amebocyttlysatbasert kromogen test. Sterilitetstesting ble utført ved hjelp av en USP<71> kompatibel metode. Mycoplasma, vektor DNA-sekvensnummer per celle og replikasjonskompetent lentivirus ble målt ved hjelp av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR). Vektor DNA-sekvensnummer per transdusert celle ble beregnet ved å dele vektor-DNA-sekvensnummeret med transduksjonseffektiviteten. Forkortelser: EU = endotoksin enhet; IND = undersøkende nytt stoff; FDA = Food and Drug Administration.
Tilleggsfigur S1: Preklinisk testing av CAR-T-celler fremstilt ved hjelp av TCT-prosessen. Immundefekte (NSG) mus ble injisert med pasientavledede xenograft leukemiceller på dag 0 og deretter behandlet med CD19-rettede CAR-T-celler produsert på prosessoren ("Semi-Automatic Manufacturing"), tradisjonelt produserte CD19-rettede CAR-T-celler ("Standard Manufacturing"), eller saltvann på dag 7. (A, B) Overlevelse hos mus behandlet med halvautomatisk produksjon av CAR-T-celler ved to dosenivåer (0,5 × 10, 6 eller 2 × 10,6 CAR-T-celler) sammenlignet med saltvann (p < 0,0001 for begge dosenivåer). (C) Sammenligning av halvautomatiske med standard CAR-T-celler ved et dosenivå kjent for å være ikke-kurativt for standardceller (0,5 × 106 CAR-T-celler). Overlevelsen var signifikant bedre hos mus behandlet med CAR-T-celler fra prosessor (p = 0,001). (D) Sammenligning av halvautomatiske med standard CAR-T-celler ved et dosenivå kjent for å være kurativt for standard CD19 CAR-T-celler. Overlevelsen var ikke signifikant forskjellig (p = 0,4). (E) Sammenligning av CAR-T-celler fra prosessoren ved de to dosenivåene. En signifikant doseeffekt ble observert med bedre overlevelse hos mus behandlet med 2 × 106 huCART19-celler (p = 0,007). Hver gruppe inneholdt 5 mus. Forkortelser: NSG = non-obese diabetiker severe kombinert immunsvikt gamma; TCT = T-celletransduksjon; CAR-T = kimære antigenreseptor T-celler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Sammenligning av vekst og lentiviral transduksjon av humane T-celler dyrket i medium supplert med forskjellige partier humant AB-serum. (A) Ekspansjon av humane T-celler utransdusert (UTD) eller transdusert med CD19 CAR-T lentiviral vektor (CAR19) i kulturer supplert med tre forskjellige partier humant AB-serum (7J, 22A eller 21J). Vekstratene for ett av partiene (22A) var vesentlig større enn for de to andre. (B) Gjennomsnittlig prosentandel (3 replikerer) av CAR19+-celler i CD3+- og CD3+/CD4+- eller CD3+/CD8+-subpopulasjonene av ex vivo-ekspanderte T-celler avledet fra friske donorer. Merk at forskjeller i vekstrater ikke syntes å påvirke cellens evne til å ta opp lentivirus som bestemt ved flowcytometrisk analyse av cellene fra de utvidede kulturer. Transduksjonseffektiviteten til T-celler og CD4+- og CD8+-subpopulasjoner var konsistent fra kultur til kultur. Feilfelt representerer standardavvik for 3 repetisjonskulturer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAR-T celleterapi har dukket opp som en lovende behandlingsmetode for B-celle og andre maligniteter. Imidlertid har tradisjonelle CAR-T-celleproduksjonsmetoder flere begrensninger, for eksempel høye kostnader, arbeidsintensiv produksjon og åpne trinn som øker risikoen for forurensning. Nylig har flere semi-automatiserte plattformer, inkludert Miltenyi CliniMACS Prodigy ("prosessoren"), dukket opp for å løse disse begrensningene. T-celletransduksjonsprosessen (TCT), integrert i prosessoren beskrevet i dette manuskriptet, omfatter T-celleanrikning, aktivering, viral transduksjon, kulturutvidelse og høsting i et lukket system. Konkurrerende automatiserte celleprosessorplattformer er mindre utbredt på dette tidspunktet, men kan ha bedre overvåking av kulturparametere, gunstige utstyrs- eller materialkostnader, eller et mindre fotavtrykk, noe som kan tillate bruk i et biosikkerhetsskap i stedet for et dedikert renromsrom. Det er viktig å velge en plattform som er optimalt egnet for en gitt applikasjon og miljø.
En betydelig begrensning av celle- og genterapier som CAR-T-celleterapi er de høye kostnadene for kommersielle produkter, noe som begrenser tilgangen til livreddende terapi. Dette er spesielt tilfelle i ressursfattige innstillinger og ikke-første-verden-land. Vi har funnet ut at det er mulig å produsere CAR-T-celler til en dramatisk lavere kostnad enn et sammenlignbart kommersielt produkt når vi distribuerer en halvautomatisert prosess i innstillingen til et akademisk sykehus som har eksisterende nåværende Good Manufacturing Practice (cGMP)-kompatible renromsfasiliteter i sammenheng med et stamcellelaboratorium og støtte fra et klinisk laboratorium som kan utføre noen av prosess- og frigjøringstester. Under disse omstendighetene finner vi at marginalkostnaden for å utføre en produksjonskjøring, inkludert materialer og arbeidskraft for produksjon og all prosess- og utgivelsestesting (men ikke inkludert utstyr og anlegg) er omtrent $ 30.000. Det skal bemerkes at utstyrskapitalkostnaden til prosessoren er mindre enn kostnaden for et enkelt kommersielt CAR-T-celleprodukt.
En av de potensielle bekymringene ved å bytte fra en manuell til en automatisert metode er redusert fleksibilitet. TCT-prosessen, selv om den er programmert med sterke rekkverk, kan fortsatt tilpasses i stor grad. Prosessen tilbyr flere utgangspunkter, inkludert en full prosess med T-celleanrikning, en full prosess uten anrikning (f.eks. for bruk med CD4 + / CD8 + forhåndsberikede celler, se avsnitt 5 i protokollen ovenfor), og en gjenopptakelse av en avbrutt prosess. I tillegg tillater aktivitetsmatrisefunksjonen tilpasning av hele dyrkingsprosessen. Med den økende interessen for rask CAR-T-produksjon, bør det bemerkes at det er mulig å konfigurere aktivitetsmatrisen til å begynne høsting så tidlig som noen få timer etter transduksjon, om ønskelig. Den raske prosedyren har den potensielle doble fordelen av redusert produksjonstid og et mer potent produkt ved å unngå differensiering og tap av anti-leukemisk aktivitet12. Videre har en variant av TCT blitt designet for ikke-virale vektorer ved bruk av elektroporering, noe som ytterligere øker fleksibiliteten til systemet.
Den optimale innhøstingstiden for CAR-T-celler avhenger av ulike faktorer, inkludert ønsket måldose, antall doser som kreves og den maksimale celletettheten som dyrkningsbeholderen kan støtte uten at det går ut over cellenes levedyktighet. Produsenten anbefaler ikke å overstige 5 milliarder celler i et volum på 250 ml. Bestemmelse av ønsket måldose bør baseres på prekliniske data i en dyremodell. For eksempel, i denne studien, brukte vi NOD scid gamma knockout (NSG) mus injisert med pasientavledede leukemiske xenotransplantater og behandlet med CAR-T-celler for å estimere at en effektiv dose ville være omtrent mellom 2 og 5 millioner CAR-T-celler per kilo (tilleggsfigur S1). Overvåking av cellestørrelse kan også være nyttig for å bestemme det optimale tidspunktet for høsting av CAR-T-celler. Ved å nøye vurdere disse faktorene, kan forskere optimalisere innhøstingstiden til CAR-T-celler for å sikre at sluttproduktet er av høy kvalitet og effekt.
Utvikling av en passende utgivelsestestplan er en kritisk komponent for å få godkjenning for en IND-applikasjon. Vi presenterer et sett med lanseringstester inkludert spesifikasjoner for vår IND 28617, og vi tror dette vil være et godt utgangspunkt for lignende produkter. Regulatorenes meninger er imidlertid i stadig utvikling, og variasjoner av den presenterte protokollen kan føre til at regulatorer krever forskjellige tester eller forskjellige spesifikasjonsterskler. Vi anbefaler på det sterkeste å lese gjeldende regulatoriske veiledningsdokumenter nøye, for eksempel FDAs Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)13. Et generelt prinsipp er at tester som demonstrerer sikkerheten til et produkt, evalueres strengere enn tester som viser styrke. Generelt bør tester som sterilitet, endotoksin, mykoplasma og replikasjonskompetent lentivirus valideres, og deres ytelseskriterier bør være kjent. I motsetning til dette er potenstester relativt understreket i tidligfaseforsøk og trenger kanskje ikke å bli fullstendig validert. Et nylig FDA-utkast til retningslinje sier at "transgenuttrykk alene som et mål på styrke kan være tilstrekkelig til å støtte IND-studier i tidlig fase"14. I tillegg bør tester som brukes til dosebestemmelse valideres. Dette kan være problematisk for nye CAR-mål der det kanskje ikke finnes standardiserte strømningsanalyser eller referansematerialer. For dette tilfellet foreslår FDA at "referansematerialet for en analyse kan være en godt karakterisert mye av selve genterapiproduktet." 13 For eksempel etablerte vi en positiv kontroll for CD19 CAR-strømningsanalysen ved bruk av CAR-T-celler fra tidlige tekniske kjøringer.
Utvikling og optimalisering av produksjonsprosessen for CAR-T celleterapi kan være utfordrende og tidkrevende, som vi erfarte i vårt arbeid. Vi opplevde flere tilbakeslag, inkludert problemer med bakteriell forurensning. Vi anbefaler sterkt å bruke en tørr tinemetode for tining av celler, da vannbad kan øke risikoen for forurensning. På grunn av dyrking kan selv et lite inokulum føre til ærlig forurensning, noe som resulterer i et ubrukelig produkt. I tillegg anbefaler vi å planlegge logistikk for utgivelsestesting, som kan innebære ytterligere valideringer og kontrakt med eksterne parter for å sikre rettidig og nøyaktig testing. Et annet viktig element ved utvikling av en CAR-T-produksjonsprosess er optimalisering av transduksjonseffektivitet. En IND-applikasjon bør inneholde data for å demonstrere styrken til virusvektoren. For å oppfylle dette kravet og samtidig innhente informasjon for å optimalisere MOI, anbefaler vi på det sterkeste å utføre en småskala titrering av virusvektoren av klinisk kvalitet på humane T-celler. Det er også viktig å vurdere bruken av tradisjonelt produserte CAR-T-celler som kontroll for museforsøk (som vist i tilleggsfigur S1). Innhenting av disse cellene kan være vanskelig og krever nøye planlegging. En annen faktor å vurdere er bruken av humant AB-serum, som er et dårlig definert reagens som kan ha en betydelig effekt på cellevekst og andre egenskaper ved produktet. For å løse dette foreslår vi å teste flere partier AB-serum og gjennomføre småskala eksperimenter for å vurdere partispesifikke effekter på cellevekst (tilleggsfigur S2). Når et egnet parti er identifisert, bør et tilstrekkelig stort volum kjøpes for å sikre konsistens på tvers av studiekohorten og minimere risikoen for batcheffekter i pasientutfall som skyldes endringer i serumparti.
Oppsummert tilbyr prosessoren og den medfølgende TCT-prosessen en produksjonsmetode som kan adressere flere begrensninger i gjeldende CAR-T-produksjonsprosedyrer, inkludert høye kostnader, arbeidsintensiv produksjon og åpne manipulasjonstrinn. Ved å tilby et lukket og halvautomatisk system, har denne prosessoren potensial til å forbedre tilgjengeligheten og overkommelige priser for CAR-T-celleterapi. Det kan imøtekomme rask produksjon og ikke-virale vektorer, noe som gjør det til et fleksibelt alternativ til tradisjonelle produksjonsmetoder. Ved å nøye vurdere faktorer som ønsket måldose, maksimal celletetthet og effekten av humant AB-serum på cellevekst, kan forskere optimalisere innhøstingstiden til CAR-T-celler for å sikre kvaliteten og effekten av sluttproduktet. Selv om prosessen kan være kompleks og arbeidskrevende, kan planlegging av logistikk for frigjøringstesting og eliminering av forurensningskilder bidra til å redusere risiko og sikre vellykket produksjon av CAR-T-celler. Samlet sett presenterer TCT-prosessen en lovende vei for CAR-T-celleterapi, med potensial til å overvinne nåværende begrensninger og forbedre pasientens tilgjengelighet, til slutt til fordel for pasienter med kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.K., S.G. og Y.W. har mottatt forskningsstøtte fra Miltenyi Biotec.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne bidragene fra flere personer og organisasjoner til dette arbeidet. Cell and Gene Therapy Laboratory og Penn Translational and Correlative Studies Laboratory ga verdifull hjelp med prosessutvikling og forberedelse til IND-innleveringer. Melissa Varghese og Amanda DiNofia har bidratt med prosessutvikling og forberedelse til IND-innleveringer som ligger til grunn for dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av et akselerasjonsstipend av celle- og genterapisamarbeidet ved Children's Hospital of Philadelphia. Forfatterne vil også takke Miltenyi Biotec for deres tekniske og forskningsstøtte. Figur 1 er dekket av copyright © 2023 Miltenyi Biotec B.V. &; Co. KG; Alle rettigheter forbeholdt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 borosilicate tubes | Charles River | TL1000 | |
| 20 mL Reagent Bag | Miltenyi Biotec | 170-076-631 | |
| 50 mL Conical Tube | Fisher | 05-539-10 | |
| 150 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2001 | |
| 2,000 mL Transfer Set | Fenwal | 4R2041 | |
| 7AAD | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| Alcohol Prep | Tyco/Healthcare | ||
| Bag Access | Medline | 2300E-0500 | |
| CD19 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-643 | |
| CD19 CAR Detection Reagent Biotin | Miltenyi Biotec | 130-129-550 | |
| CD19 PE | BD | 555413 | |
| CD3 APC | BD | 340440 | |
| CD4 VioBright FITC REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-229 | |
| CD45 VioBlue REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-637 | |
| CD8 APC-Vio770 REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-681 | |
| Cellometer Reference Beads 10um | Nexcelom | B10-02-020 | |
| Cellometer Reference Beads 15um | Nexcelom | B15-02-010 | |
| Cellometer Reference Beads 5um | Nexcelom | B05-02-050 | |
| Cellometer Slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| CliniMACS CD4 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 276-01 | The CD4 reagent |
| CliniMACS CD8 GMP MicroBeads | Miltenyi Biotec | 275-01 | The CD8 reagent |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec | 130-021-201 | The buffer |
| DMSO | Origen | CP-10 | |
| Freezing Bag 50 mL | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | |
| Freezing Vial, 1.8 mL | Nunc | 12565171N | |
| Freezing Vial, 4.5 mL | Nunc | 12565161N | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | Sterile filtered, heat inactivated | |
| Human Serum Albumin 25% | Grifols | 68516-5216-1 | |
| Human Serum Albumin 5% | Grifols | 68516-5214-1 | |
| MACS GMP Recombinant Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 170-076-148 | The cytokines |
| MACS GMP T Cell TransAct | Miltenyi Biotec | 200-076-202 | The activation reagent |
| MycoSeq Mycoplasma Detection Kit | Life Technologies | 4460623 | |
| Needles, Hypodermic 14G | Medline | SWD200573 | |
| Needles, SlideSafe 18G | BD | B-D305918 | |
| Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492209 | |
| Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped | Eppendorf | 022492225 | |
| Pipets 10 mL | Fisher | 13-678-27F | |
| Pipets 25 mL | Fisher | 13-675-30 | |
| Pipets 5 mL | Fisher | 13-678-27E | |
| Plasmalyte-A | Baxter | 2B2544X | The electrolyte solution |
| Prodigy TS520 Tubing Set | Miltenyi Biotec | 170-076- 600 | The tubing set |
| Sterile Field | Medline | NON21001 | |
| Streptavidin PE-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-106-793 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309628 | |
| Syringe 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe 3 mL | BD | 309657 | |
| Syringe 30 mL | BD | 302832 | |
| Syringe 50 mL | BD | 309653 | |
| TexMACS GMP Medium | Miltenyi Biotec | 170-076-306 | The medium |
| Triple Sampling Adapter | Miltenyi Biotec | 170-076-609 | |
| Viral Vector | CHOP Clinical Vector Core | huCART19 | |
| Equipment | |||
| Biological Safety Cabinet | The Baker Co | ||
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom | ||
| CliniMACS Prodigy | Miltenyi Biotec | 200-075-301 | The processor |
| Controlled Rate Freezer | Planer/Kryosave | ||
| Endosafe nexgen-PTS150K | Charles River | ||
| Mettler Balance | Mettler | ||
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| Refrigerated Centrifuge | Fisher Sci | ||
| SCD Sterile Tubing Welder | Terumo | ||
| Sebra Tube Sealer | Sebra | ||
| Varitherm | Barkey | The dry thaw device | |
| XN-330 Hematology Analyzer | Sysmex |
References
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Shah, N. N., et al. Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial. Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Maude, S. L., et al. Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia. Blood. 128 (22), 217 (2016).
- Mock, U., et al. Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy. Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).
- Fernández, L., et al. GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy. Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361 (2019).
- Zhu, F., et al. Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center. Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).
- Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system. Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Miltenyi Biotec. CliniMACS Prodigy User Manual. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).
- Ghassemi, S., et al. Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells. Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).
- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).
- U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).
