Summary
Opretholdelse af oocytgenomintegritet er nødvendig for at sikre den genetiske troskab i det resulterende embryo. Her præsenterer vi en nøjagtig protokol til påvisning af DNA-dobbeltstrengsbrud i pattedyrs kvindelige kønsceller.
Abstract
Oocytter er blandt de største og mest langlivede celler i den kvindelige krop. De dannes i æggestokkene under embryonal udvikling og forbliver arresteret i profasen af meiose I. Den hvilende tilstand kan vare i årevis, indtil oocytterne får en stimulans til at vokse og opnå kompetence til at genoptage meiose. Denne langvarige tilstand af anholdelse gør dem yderst modtagelige for at akkumulere DNA-skadelige fornærmelser, som påvirker de kvindelige køns genetiske integritet og dermed det fremtidige embryos genetiske integritet.
Derfor er udviklingen af en nøjagtig metode til påvisning af DNA-skader, som er det første skridt i etableringen af DNA-skaderesponsmekanismer, af afgørende betydning. Dette papir beskriver en fælles protokol til at teste tilstedeværelsen og udviklingen af DNA-skader i profasearresterede oocytter i en periode på 20 timer. Specifikt dissekerer vi museæggestokke, henter cumulus-oocytkomplekserne (COC'er), fjerner cumuluscellerne fra COC'erne og dyrker oocytterne i Μ2-medium indeholdende 3-isobutyl-1-methylxanthin for at opretholde arrestationstilstanden. Derefter behandles oocytterne med det cytotoksiske, antineoplasmatiske lægemiddel, etoposid, for at skabe dobbeltstrengsbrud (DSB'er).
Ved hjælp af immunfluorescens og konfokalmikroskopi detekterer og kvantificerer vi niveauerne af kerneproteinet γH2AX, som er den fosforylerede form af histonen H2AX. H2AX bliver fosforyleret på DSB'ernes steder efter DNA-skader. Manglende evne til at genoprette DNA-integritet efter DNA-skade i oocytter kan føre til infertilitet, fødselsdefekter og øgede spontane aborter. Derfor er forståelsen af DNA-skaderesponsmekanismer og samtidig etableringen af en intakt metode til undersøgelse af disse mekanismer afgørende for reproduktivbiologisk forskning.
Introduction
Processen med meiose i pattedyrs kvindelige kønsceller initieres i æggestokkene før fødslen. Det samlede antal oocytter etableres i æggestokkene primært under embryogenese. Oocytter går ind i meiose og forbliver arresteret i profaseI 1. Efter pubertetens begyndelse og produktion og endokrin virkning af follikelstimulerende hormon (FSH) og luteiniserende hormon (LH) kan oocytter genoptage og fuldføre meiose2. Hos mennesker kan profasearrest vare i op til 50 år3. Celledelingerne efter indgangen til meiose I er asymmetriske, hvilket resulterer i produktion af en lille polær krop og en oocyt, der bevarer sin størrelse. Således opbevares de fleste cytoplasmatiske komponenter i ooplasma under tidlig embryogenese4. Derefter går oocytterne ind i meiose II uden at reformere deres kerne eller dekondensere deres kromosomer og forbliver arresteret i metafase II indtil befrugtning5.
En unik egenskab, der adskiller oocytter fra somatiske celler, er tilstanden af anholdelse i profase I, når oocyten besidder en intakt kerne (germinal vesikel [GV] arrest), kaldet GV fase6. Baseret på kromatinorganisationen klassificeres GV-trinoocytter i to kategorier: ikke-omgivet nukleolus (NSN) og omgivet nukleolus (SN)7,8. I NSN GV-trins oocytter spredes kromatinet gennem hele kerneområdet, og transkription er aktiv, mens kromatinet i SN-oocytter danner en kompakt ring, der omgiver kernen, og transkriptionen er tavs9. Begge typer GV-trins oocytter viser meiotisk kompetence; de går ind i meiose med samme hastighed, men NSN-oocytterne har lav udviklingskapacitet og kan ikke udvikle sig ud over tocellestadiet embryo10.
Den langvarige tilstand af profase I-anholdelse øger forekomsten af akkumulering af DNA-skader11. Derfor er DNA-skaderesponsmekanismer i oocytter afgørende for at muliggøre produktion af kønsceller med genetisk integritet og for at sikre, at det resulterende embryo har et fysiologisk kromosomindhold.
Et centralt aspekt af DNA-skaderesponsen er DNA-reparation. De vigtigste veje til DSB-reparation i eukaryote celler inkluderer ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ), homolog rekombination (HR) og alternativ NHEJ12,13,14,15. NHEJ er en hurtigere, men mere fejlbehæftet mekanisme, mens HR kræver mere tid at gennemføre, men har høj nøjagtighed16.
Der er ikke nok viden om de mekanismer, som oocytter bruger til reparation af DNA-skader. Undersøgelser har vist, at DNA-skader induceret i fuldvoksne pattedyroocytter ved anvendelse af genotoksiske midler, såsom etoposid, doxorubicin eller UVB eller ioniserende stråling, ikke påvirker tidspunktet og hastigheden for udgang fra profase I-anholdelse17. Oocytter kan gennemgå GV-nedbrydning (GVBD) selv i nærvær af forhøjede niveauer af skade. Denne skade kan bestemmes ved observation af γH2AX. Denne fosforylerede form af H2AX (γΗ2ΑΧ) er en DSB-markør, som er placeret på stedet for pauser og fungerer som et stillads for at hjælpe med at reparere faktorer og proteiner til at akkumulere i ødelagte ender18.
Fraværet af cellecyklusstop efter DNA-skade skyldes et utilstrækkeligt DNA-skadekontrolpunkt, der gør det muligt for oocytter med urepareret DNA at genindtaste meiose. Efter høje niveauer af DNA-skade kan et kontrolpunkt opretholde profasearrest gennem aktivering af en ATM / Chk1-afhængig vej. Den begrænsede kontrolpunktsrespons på DSB'er skyldes den begrænsede aktivering af ATM17,19. I M-fasen af meiose I har forskning vist, at DNA-skader kan aktivere et spindelsamlingskontrolpunkt (SAC) -induceret meiose I-kontrolpunkt, som forhindrer aktivering af E3 ubiquitinligaseanafasefremmende kompleks / cyklosomet (APC / C) og derfor M-faseudgang. Desuden overvinder ablationen af SAC-proteiner tilstanden af M-fasearrest, hvilket understreger SAC's betydning for etableringen af meiose I chekpoint20.
Som tidligere forskning tydeligt viser, kan DSB'er ikke inducere et robust profasekontrolpunkt i museoocytter. Hvis sådanne skader ikke repareres, kan det føre til, at embryoner bærer kromosomale abnormiteter. Derfor er det vigtigt at studere DNA-skaderesponsen på forskellige stadier af kvindelig gametogenese for bedre at forstå de unikke veje, som oocytter bruger til at klare potentielle genetiske fornærmelser.
Protocol
Alle museforsøg blev godkendt af de lokale myndigheder (regionen Ioannina, Grækenland) og udført i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers rådsdirektiver 2010/63/EU. Eksperimenter blev udført med hensyn til principperne i 3R'erne. Alle CD-1-mus, der blev brugt til forsøgene, blev opbevaret i dyrestalden ved universitetet i Ioannina, Grækenland, i et rum med kontrolleret temperatur (22 °C) og fugtighed (60%) og blev fodret ad libitum. Dyrestalden har tilladelse til at drive avlsanlæg (EL33-BIObr01), forsyning (EL33-BIOsup01) og forsøg (EL33BIO-exp01).
1. Fremstilling af reagenser
- Fortynd 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) pulver (se materialetabellen) i dimethylsulfoxid (DMSO) (se materialetabellen) til en slutkoncentration på 200 mM. Der anvendes 10 μL alikvoter, og der opbevares ved -20 °C. Brug opløsningen inden for 1 måned.
BEMÆRK: IBMX pulver opbevares ved -20 °C. - Alle immunfluorescensbufferne fremstilles og opbevares ved 4 °C.
- Der fremstilles sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) ved at fortynde én PBS-tablet (se materialetabellen) i 200 mlddH2Ο.
- Lav PHEM-buffer ved at tilsætte 80 ml ddH2 Ο, 0,59575 g HEPES, 1,81422 g PIPES, 0,38035 g GTA og 0,04066 gMgCl2(se materialetabellen), mens du omrører med en magnetisk omrører (se materialetabellen), og tilsæt samtidig NaOH (se materialetabellen), indtil pH-værdien når 6,9 (kontroller ved hjælp af en pH/ORP-måler [se materialetabellen]). Derefter tilsættes ddH2Ο til et slutvolumen på 100 ml.
- Der fremstilles paraformaldehyd-Triton-X-100 (PFA-Tx-100) buffer ved at fortynde PFA-pulver (se materialetabellen) i PHEM-buffer, mens der omrøres med en magnetisk omrører under opvarmning ved en slutkoncentration på 4% PFA. Derefter filtreres bufferen ved hjælp af en sprøjte og et 0,2 μm filter (se materialetabellen), og der tilsættes 0,5% Tx-100 (se materialetabellen). Forbered ca. 10 ml PFA-Tx-100 (0,4 g PFA, 50 μL Tx-100), hvilket er nok til et forsøg. Opbevar den ved 4 °C i højst 1 uge.
FORSIGTIG: Brug handsker til at håndtere PFA, og undgå kontakt med hud og øjne. - Forbered vaskebuffer ved at tilsætte bovin serumalbumin (slutkoncentration: 0,5% w/v BSA) (se materialetabellen) i PBS, og omryst mekanisk. Der tilsættes 10 % w/vNaN3-buffer (natriumazid) i en fortynding på 1:1.000 for at minimere risikoen for svampe- og bakteriekontaminering. Der fremstilles en 10% w/v NaN3-buffer ved tilsætning af 1 gNaN3-pulver (se materialetabellen) til 10 ml ddH2O; Opbevar NaN3-bufferen ved stuetemperatur.
- Forbered blokerende buffer ved at tilsætte BSA (slutkoncentration: 3% w/v) i PBS og omrøre mekanisk. Tilsæt 10% NaN3 buffer ved en 1:1.000 fortynding.
2. Indsamling af GV-oocytter fra dissekerede æggestokke og induktion af DSB'er
BEMÆRK: Alle værktøjer og opløsninger skal være sterile. Oocythåndtering udføres ved hjælp af en mundpipette under et stereomikroskop (se materialetabellen), og alle dråberne er dækket af mineralolie (se materialetabellen og figur 1E).
- Injicer mus intraperitonealt med 7 internationale enheder (IE) af drægtigt hoppes serumgonadotropin (PMSG) (se materialetabellen) 46-48 timer, før musene aflives ved cervikal dislokation.
BEMÆRK: Alle anvendte mus skal være 8-12 uger gamle. - Filtrer M2-dyrkningsmediet (se materialetabellen) med en sprøjte og et 0,2 μm filter, og tilsæt IBMX 200 mM til en slutkoncentration på 200 μM i et 14 ml rundbundet rør (se materialetabellen) for at holde oocytterne arresteret i profase I. Derefter tilberedes dråber M2-IBMX-medium i en plastisk vævskulturskål (se materialetabellen), og læg den på en varm blok (se materialetabellen) ved 37 °C i mindst 30 minutter før oocytisolering. Opbevar M2 ved 4 °C.
- Ofre musene ved cervikal dislokation, dissekere æggestokkene og placere dem i et 5 ml rundbundet rør (se materialetabellen) med M2-IBMX.
- Overfør æggestokkene til et plastiklåg, der indeholder 1,5 ml M2-IBMX, fjern eventuelt fedtvæv eller æggeledersegmenter i æggestokkene, og frigør p-pillerne ved mekanisk perforering af æggestokkene med en 27 G nål (se materialetabellen og figur 1A-C).
- Kolepillerne overføres til en kulturskål med dråber M2-IBMX (ca. 25-30 μL hver), og cumuluscellerne fjernes ved gentagen pipettering med en Pasteur-pipette med smalboring af glas (se materialetabellen og figur 1D).
- Der vælges SN GV-trins oocytter, og overfør dem i en dråbe (25 μL) M2-IBMX-medium på en varm blok ved 37 °C beskyttet mod lys (figur 1F).
- Se efter SN-oocytter baseret på deres større størrelse og centralt placerede kerner i modsætning til NSN-oocytter, hvor kernerne er placeret perifert21. Under alle omstændigheder skal du observere DNA-konfigurationen under et konfokalmikroskop, inden du træffer den endelige beslutning om typen af GV-oocyt (SN eller NSN).
- Inducer DSB'er ved hjælp af etoposid (se materialetabellen). GV-trinsoocytterne anbringes i dråber (25 μL hver) af det genotoksiske middel i 1 time på den varme blok ved 37 °C under mørke forhold.
BEMÆRK: Etoposid er en topoisomerase II-hæmmer, der introducerer DSB'er til DNA22. Etoposid opbevares i 10 μL alikvoter på 20 mg/ml ved stuetemperatur beskyttet mod lys. De koncentrationer, der er testet, er 5 μg/ml, 20 μg/ml og 50 μg/ml. - For at holde GV-stadiets oocytter arresteret i længere tid anbringes oocytterne i dråber M16-dyrkningsmedium (se materialetabellen) suppleret med 400 μM IBMX i en inkubator (se materialetabellen) ved 37 °C og 5% CO2. M16 opbevares ved 4 °C, filtreres mediet med en sprøjte og et 0,2 μm filter, og inkuberes i mindst 1 time før brug.
Figur 1: Oocytisoleringsproces . (A) Fjernelse af periovariefedtvæv og resterende æggeledersegmenter fra æggestokke i M2-medium med IBMX. Fotografi opnået gennem stereomikroskopets okularer. Skalastang = 1 mm. (B) Isolerede æggestokke i M2-medium med IBMX. Billede opnået gennem stereomikroskopets okularer. Skalastang = 1 mm. (C) Mekanisk perforering af æggestokke med en 27 G nål i M2-medium med IBMX. Billede opnået gennem stereomikroskopets okularer. Skalabjælke = 1 mm. (D) COC'er frigivet fra æggestokke efter perforering i M2-medium med IBMX. Billede opnået gennem stereomikroskopets okularer. Skalastang = 100 μm. (E) Oocytopsamling ved hjælp af en mundpipette. F) Denuderede oocytter efter fjernelse af de omgivende cumulusceller i M2-medium med IBMX. Billede opnået gennem stereomikroskopets okularer. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Oocytfiksering og immunofluorescens
BEMÆRK: Oocythåndtering udføres ved hjælp af en mundpipette under et stereomikroskop, og alle dråberne er dækket af mineralolie.
- De kontrol- og etoposidbehandlede GV-oocytter anbringes i forskellige plastvævskulturskåle med PFA-Tx-100-buffer i 40 minutter ved stuetemperatur.
- Vask oocytterne i tre forskellige dråber vaskebuffer (50 μL hver) ved stuetemperatur. Lad oocytterne stå i 5 minutter i hver dråbe.
- Oocytterne anbringes i dråber blokerende buffer (25 μL hver) i 1 time på en varm blok ved 37 °C.
- Forbered det primære antistof, der genkender γH2AX (kaninphospho-Η2ΑΧ) (Ser139) (se materialetabellen) (stamopløsning: 1 mg / ml). Der anvendes en 1:200 fortynding i blokerende buffer, og oocytterne anbringes i dråber primært antistof (15 μL hver) ved 4 °C natten over.
BEMÆRK: Phospho-Η2ΑΧ (γH2AX) er en almindelig markør til påvisning af DSB'er i både somatiske celler og GV-oocytter 18,23. - Den følgende dag vaskes oocytterne i tre forskellige dråber vaskebuffer (50 μL hver) ved stuetemperatur. Lad oocytterne stå i 5 minutter i hver dråbe.
- Forbered det sekundære antistof, Alexa Fluor 488-konjugeret gedeantikanin (se materialetabellen) (stamopløsning: 2 mg / ml). Der anvendes en 1:200 fortynding i blokerende buffer, og oocytterne anbringes i dråber sekundært antistof (15 μL hver) i 1 time på en varm blok ved 37 °C, der er beskyttet mod lys.
- Overfør oocytterne til dråber DRAQ7 (25 μL hver) (stamopløsning: 0,3 mM; se materialetabellen), som er et langt rødt fluorescerende DNA-farvestof, der kun pletter DNA i permeabiliserede celler. Brug en 1:250 fortynding i vaskebuffer i 10 minutter ved stuetemperatur under mørke forhold.
- Vask oocytterne i tre forskellige dråber vaskebuffer (50 μL hver) ved stuetemperatur. Lad dem stå i 5 minutter i hver dråbe, og overfør dem derefter til små dråber (ca. 5 μL hver) vaskebuffer i en 35 mm petriskål med glasbund (se materialetabellen) til konfokalmikroskopi (figur 2A).
BEMÆRK: Vask af både DNA-pletten og sekundært antistof udføres på samme tid.
4. Konfokal mikroskopi
BEMÆRK: Konfokal mikroskopi skal udføres straks for at undgå reduktion i fluorescensintensiteten efter placering af oocytterne i glasbundsskåle. Adgang til et konfokalmikroskop (se materialetabellen) med et motoriseret trin er påkrævet.
- Mikroskop opsætning
- I det konfokale system skal du tænde lasercontrolleren, laserne, mikroskopregulatoren, lamperne til det transmitterede lys og pc'en (figur 2B, D).
- Åbn den konfokale software, og vælg 40x olielinsen.
- Anbring skålen i prøveholderen, og prøv at fokusere på oocytterne ved at flytte scenen på XY- og Z-akser ved hjælp af joysticket (figur 2C).
- Scanning af oocytterne
- Indstil lasereffekten, forstærkningen og pinholestørrelsen uafhængigt for hvert eksperiment for at minimere enhver mætning.
- For hver oocyt indstilles interesseområdet, specifikt i kernen ved DNA-området. Definer grænserne for DNA-området, og juster z-trinstørrelsen til 3 μm. Start derefter scanningen.
- Gem billederne for hver celle i den valgte mappe.
- Når scanningen er afsluttet, skal du afslutte softwaren, lukke computeren og slukke for lasercontrolleren, laserne, mikroskopcontrolleren og lamperne til det transmitterede lys.
Figur 2: Konfokal mikroskopi. (A) Faste oocytter efter udførelse af immunofluorescensprotokollen og DNA-farvning, som er i separate dråber vaskebuffer, dækket med mineralolie, anbragt i en glasbundskål og forberedt til konfokal mikroskopibilleddannelse. Hver dråbe indeholder en anden eksperimentel kategori. Billede opnået gennem stereomikroskopets okularer. Skalabjælke = 1 mm/100 μm for den indzoomede del. B) Glasbundplade anbragt på det konfokale mikroskopstadium. (C) Brightfield-billede af oocytter opnået ved konfokal mikroskopi. Skalabjælke = 100 μm. (D) Det konfokale mikroskopisystem. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Billedanalyse
- Download Fiji ImageJ-win64 i browseren (https://imagej.net/software/fiji/downloads), åbn den, og importer dataene som TIFF-stakfiler.
BEMÆRK: Åbn hver oocytfil separat. - Klik på Billede | Farve | Opdel kanaler for at opdele alle kanalerne.
- Klik på LUT (Slå tabel op), og vælg de foretrukne farver for hver kanal.
- Klik på Billede | Farve | Flet kanaler for at flette kanalerne for γΗ2ΑΧ og DNA. Lad brightfield-kanalen være uflettet.
- I NSN-oocytter og i SN-oocytter med lave niveauer af DNA-skade detekteres γΗ2ΑΧ som foci i DNA-regionen. I dette tilfælde skal du klikke på " Multi-point" eller punktkommandoen og vælge hvert γΗ2ΑΧ-fokus, der falder sammen med DNA'et. Gentag dette trin for alle stakkene.
- I SN-oocytter med høje niveauer af DNA-skade fordeles γΗ2ΑΧ-signalet gennem hele DNA-regionen. I dette tilfælde skal du klikke på Billede | Stakke | Z-projekt, og med kommandoen Frihåndsvalg skal du vælge hele DNA-området.
- For at måle γΗ2ΑΧ fluorescens skal du klikke på Analyser | Mål og kopiér målingerne til en .xlsx fil. Beregn derefter den gennemsnitlige fluorescens, normaliser værdierne, og tæl antallet af foci, før du opretter grafer.
- Klik på Analysér | Indstil Skala for at indstille skalaen og derefter til Analysér | Værktøjer | Skalalinje for at føje en skalalinje til kanalerne.
Representative Results
Ved hjælp af proceduren demonstreret her blev museæggestokke dissekeret, fedtet blev fjernet, og fuldt voksne GV-fase oocytter blev opsamlet. Derefter blev cumuluscellerne fjernet ved gentagen pipettering ved hjælp af en smal pipette og anbragt i friske dråber M2-IBMX-medium og dækket med mineralolie på en varm blok (37 °C) (figur 1A-F). Tre forskellige etoposidkoncentrationer blev fremstillet (5 μg/ml, 20 μg/ml og 50 μg/ml) ved anvendelse af en stametoposidkoncentration på 20 mg/ml. GV-trins oocytterne blev anbragt i tre forskellige etoposidkoncentrationer i 1 time i dråber dækket med mineralolie og beskyttet mod lys ved 37 °C. Immunofluorescensprotokollen blev derefter fulgt, som beskrevet detaljeret i protokolafsnittet, og oocytterne blev anbragt i glasbundskåle og observeret ved konfokalmikroskopi (figur 2).
I SN GV-trins oocytter steg tilstedeværelsen af γH2AX umiddelbart efter DNA-beskadigelse ved alle etoposidkoncentrationerne (5 μg / ml, 20 μg / ml og 50 μg / ml), og γH2AX blev fordelt over hele DNA-regionen (figur 3). DSB-kvantificering og estimering blev udført ved at observere γH2AX-fluorescensintensiteten på DNA-steder. γH2AX-fluorescensen intensiveredes proportionalt med stigende etoposidkoncentrationer. Efter langvarig profaseanholdelse (20 timer efter etoposidbehandling) viste GV-trinsoocytterne desuden evnen til at reducere γH2AX-foci-antallet og intensiteten, hvilket indebærer tilstedeværelsen af aktive reparationsprocesser i GV-trinarresterede oocytter (figur 3E).
I modsætning til SN-oocytterne, hvor γH2AX-fluorescensen blev fordelt gennem DNA'et, blev γH2AX i NSN-oocytterne vist i foci umiddelbart efter behandling med etoposid ved 20 μg/ml. Vi estimerede antallet af foci, der faldt sammen med DNA-området, beregnede fluorescensen af hvert fokus og præsenterede den gennemsnitlige fluorescens af alle oocytterne. Både fluorescensen og antallet af foci viste statistisk signifikante forskelle mellem de to oocytkategorier (figur 4).
Konfokal mikroskopi giver information om antallet og intensiteten af foci i forskellige Z-stakke, hvilket hjælper med at identificere tilstedeværelsen af DNA-skader og reparationsdynamikken på forskellige tidspunkter. Galvano-scanning giver præcisionsscanning med lav baggrund og bedre analyse af scanningsbillederne.
Figur 3: Reduktion af γH2AX i SN GV-trins oocytter behandlet med tre forskellige etoposidkoncentrationer efter langvarig GV-anholdelse. (A) γH2AX-fluorescens i SN GV-trinoocytter 0 timer efter etoposidbehandling. γH2AX stiger umiddelbart efter eksponering ved alle etoposidkoncentrationerne, og stigningen er koncentrationsafhængig (grøn: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Billederne er Z-stack projektioner, og lysstyrken / kontrasten er blevet justeret for hver kanal ved hjælp af Fiji / ImageJ. Skalabjælke = 10 μm. (B) Graf af γH2AX-fluorescensen i SN GV-trinoocytter 0 timer efter behandling med forskellige etoposidkoncentrationer. Data repræsenterer gennemsnitlig ± SEM. Hver prik repræsenterer en oocyt (antallet af oocytter er vist i grafen), (ns = ikke-signifikant, ** p < 0,005, **** p < 0,0001, envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest). (C) γH2AX-fluorescens i SN GV-trinoocytter 20 timer efter etoposidbehandling. γH2AX reduceres 20 timer efter eksponering ved alle etoposidkoncentrationer (grøn: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Billederne er Z-stack-projektioner, og lysstyrken/kontrasten er blevet justeret for hver kanal ved hjælp af Fiji/ImageJ. Skalabjælke = 10 μm. (D) Graf af γH2AX-fluorescensen i SN GV-trins oocytter 20 timer efter behandling med forskellige etoposidkoncentrationer. Data repræsenterer gennemsnitlig ± SEM. Hver prik repræsenterer en oocyt (antallet af oocytter er vist i grafen), (ns = ikke-signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,005, *** p < 0,0005 , **** p < 0,0001, envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest). E) Søjlediagram over γH2AX-fluorescensreduktionen i SN GV-trinsoocytter efter profaseanholdelse i etoposidbehandlede oocytter. Tallet over hver kolonne angiver det procentvise fald i γH2AX-fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Phosphorylering af Η2ΑΧ i NSN GV-stadieoocytter efter behandling med etoposid ved 20 μg/ml. (A) Repræsentative konfokale billeder af en kontrol NSN GV-stage oocyt (grøn: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Billederne er Z-stack-projektioner, og lysstyrken/kontrasten er blevet justeret for hver kanal ved hjælp af Fiji/ImageJ. Skalabjælke = 10 μm. (B) Repræsentative konfokale billeder af en etoposidbehandlet NSN GV-trins oocyt (grøn: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Oocytterne blev fikseret 0 timer efter etoposidbehandling. Billederne er Z-stack-projektioner, og lysstyrke/kontrast er blevet justeret for hver kanal ved hjælp af Fiji/ImageJ. Skalastang = 10 μm. (C) Den normaliserede γΗ2ΑΧ-fluorescens i NSN GV-trins oocytter efter 20 μg/ml etoposidbehandling. Data repræsenterer gennemsnitlig ± SEM. Hver prik repræsenterer en oocyt (antallet af oocytter er vist i grafen), taget fra to uafhængige eksperimenter (**** p < 0,0001, uparret ikke-parametrisk t-test, Mann-Whitney U-test). D) Antal γΗ2ΑΧ-foci i NSN GV-trins oocytter efter 20 μg/ml etoposidbehandling. Data repræsenterer gennemsnitlig ± SEM. Hver prik repræsenterer en oocyt (antallet af oocytter er vist i grafen), taget fra to uafhængige eksperimenter (**** p < 0,0001, uparret ikke-parametrisk t-test, Mann-Whitney U-test). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Ved at bruge metoden beskrevet her påviste vi DSB'er i pattedyrs oocytter. Denne metode muliggør påvisning og undersøgelse af DNA-reparationsprocessen i oocytter. Den samme protokol kan også bruges til analyse af andre proteiner, der deltager i fysiologiske processer i pattedyrs oocytter. Det er vigtigt at undersøge, hvordan oocytter reagerer på potentielle DNA-skader for bedre at forstå årsagen til kvindelig subfertilitet hos mennesker.
At studere DNA-skaderesponsen i pattedyrs oocytter kan være udfordrende på grund af oocytternes følsomhed. Oocythåndtering kræver specifikke temperaturer og CO 2 og O2 koncentrationer. Samtidig skal oocytterne beskyttes mod lys. Håndtering bør ske ved hjælp af glaspipetter, der ikke er for smalle, da dette kan være skadeligt for oocytterne, men heller ikke for bredt, da dette kan forårsage fortynding af mediet og dermed påvirke fikseringsproceduren negativt. I hvert trin af fiksering anvendes flere dråber buffere for at minimere fortyndingseffekten. En alternativ måde at observere DSB'er på er Comet-assayet24. Selvom denne teknik er mere følsom, er den mere kompliceret. Samtidig er det ved hjælp af kometanalysen ikke muligt at detektere det nøjagtige DNA-område, hvor skaden opstår, og i celler med rigelige RNA-molekyler, som GV-trinoocytter25, kan baggrunden øges, hvilket fører til et falsk DNA-skadesignal26.
Ved at bruge immunfluorescensprotokollen, der er beskrevet her, kan vi detektere DSB'er med nøjagtighed og estimere reparationsforløbet i GV-trins oocytter, som angivet ved reduktionen i γH2AX-fluorescens over tid. Ikke desto mindre er en begrænsning ved denne metode, at visse antistoffer kan præsentere uspecifik fordeling gennem ooplasmaet, hvilket fører til billeder med høj baggrundsfluorescens. PFA-Tx-100-bufferen bruges i stedet for sekventiel PFA og Tx-100, da vi har observeret, at den forbedrer fikseringsprocessen ved at tillade påvisning af mindre baggrund og ikke-specifik fluorescens. En anden begrænsning ved at bruge γH2AX til DSB-detektion er, at skader ikke kan estimeres efter GVBD på grund af den spontane phosphorylering af γH2AX i meiose23.
I denne immunofluorescensprotokol forbliver oocytterne i en væskebuffer og kan ikke opbevares i dias. Denne kendsgerning gør det vanskeligt at bevare de faste celler i dage efter tilsætningen af det sekundære antistof. For at opnå billeder af god kvalitet og ikke miste signal, foretrækkes det at udføre billeddannelsen inden for få timer efter tilsætning af det sekundære antistof. Det skal også bemærkes, at scanningen af kernerne gennem Z-aksen kan få signalet til at blive svagere på grund af overeksponering. Af den grund foretrækkes det at sænke lasereffekten og øge scanningshastigheden.
Endelig er en anden begrænsning af immunofluorescensprotokollen, at den kun kan bruges til faste / ikke-levende celler. Derfor kan vi kun estimere tilstedeværelsen og fraværet af faktorer på bestemte tidspunkter uden at vide, om der er udsving i deres koncentration eller ændringer i deres adfærd gennem tiden. Dette problem kan løses ved hjælp af levende cellebilleddannelse og fluorescerende mærkede markører.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi anerkender støtte til dette arbejde fra projektet "Etablering af kapacitetsopbygningsinfrastrukturer inden for biomedicinsk forskning (BIOMED-20)" (MIS 5047236), som gennemføres under aktionen "Styrkelse af forsknings- og innovationsinfrastrukturen", finansieret af det operationelle program "Konkurrenceevne, iværksætteri og innovation" (NSRF 2014-2020) og medfinansieret af Grækenland og Den Europæiske Union (Den Europæiske Fond for Regionaludvikling).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
| 10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
| Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
| ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
| BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| BD Microlance 3 Needles 27 G - 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
| DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
| Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
| FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
| FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
| Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
| HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
| IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
| Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
| M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| NaN3 | Honeywell | 13412H | |
| NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
| Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
| Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
| pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
| QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |
References
- Wang, X., Pepling, M. E. Regulation of meiotic prophase one in mammalian oocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 667306 (2021).
- Filatov, M., Khramova, Y., Semenova, M. Molecular mechanisms of prophase I meiotic arrest maintenance and meiotic resumption in mammalian oocytes. Reproductive Sciences. 26 (11), 1519-1537 (2019).
- Adhikari, D., et al. Inhibitory phosphorylation of Cdk1 mediates prolonged prophase I arrest in female germ cells and is essential for female reproductive lifespan. Cell Research. 26 (11), 1212-1225 (2016).
- Sun, S. C., Kim, N. H. Molecular mechanisms of asymmetric division in oocytes. Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 883-897 (2013).
- Jones, K. T. Mammalian egg activation: From Ca2+ spiking to cell cycle progression. Reproduction. 130 (6), 813-823 (2005).
- Solc, P., Schultz, R. M., Motlik, J. Prophase I arrest and progression to metaphase I in mouse oocytes: comparison of resumption of meiosis and recovery from G2-arrest in somatic cells. Molecular Human Reproduction. 16 (9), 654-664 (2010).
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Research. 22 (2), 219-231 (1989).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 41 (4), 479-485 (1995).
- Sun, X., et al. Comprehensive analysis of nonsurrounded nucleolus and surrounded nucleolus oocytes on chromatin accessibility using ATAC-seq. Molecular Reproduction and Development. 90 (2), 87-97 (2023).
- Zuccotti, M., Bellone, M., Longo, F., Redi, C. A., Garagna, S. Fully-mature antral mouse oocytes are transcriptionally silent but their heterochromatin maintains a transcriptional permissive histone acetylation profile. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (12), 1193-1196 (2011).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Lieber, M. R. The mechanism of human nonhomologous DNA end joining. The Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 1-5 (2008).
- Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Shibata, A., Jeggo, P. A. Roles for the DNA-PK complex and 53BP1 in protecting ends from resection during DNA double-strand break repair. Journal of Radiation Research. 61 (5), 718-726 (2020).
- Mohiuddin, I. S., Kang, M. H. DNA-PK as an emerging therapeutic target in cancer. Frontiers in Oncology. 9, 635 (2019).
- Marangos, P., Carroll, J. Oocytes progress beyond prophase in the presence of DNA damage. Current Biology. 22 (11), 989-994 (2012).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Bakkenist, C. J., Kastan, M. B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. Nature. 421 (6922), 499-506 (2003).
- Marangos, P., et al. DNA damage-induced metaphase I arrest is mediated by the spindle assembly checkpoint and maternal age. Nature Communications. 6, 8706 (2015).
- Lavrentyeva, E. A., Shishova, K. V., Zatsepina, O. V. Differences in nuclear dynamics in mouse GV oocytes with a diverse chromatin configuration. Biology Bulletin Russian Academy of Sciences. 46, 332-341 (2019).
- Montecucco, A., Zanetta, F., Biamonti, G.
- Mayer, A., et al. DNA damage response during mouse oocyte maturation. Cell Cycle. 15 (4), 546-558 (2016).
- Olive, P., Banáth, J. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nature Protocols. 1, 23-29 (2006).
- Wu, D., Dean, J. EXOSC10 sculpts the transcriptome during the growth-to-maturation transition in mouse oocytes. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5349-5365 (2020).
- Simon, L., Emery, B., Carrell, D. DNA damage: COMET assay. Manual of Sperm Function Testing in Human Assisted Reproduction. Agarwal, A., Henkel, R., Majzoub, A. , 202-212 (2021).
