Summary
A manutenção da integridade do genoma do ovócito é necessária para garantir a fidelidade genética no embrião resultante. Aqui, apresentamos um protocolo preciso para detectar quebras de fita dupla de DNA em células germinativas femininas de mamíferos.
Abstract
Os ovócitos estão entre as maiores e mais longevas células do corpo feminino. Eles são formados nos ovários durante o desenvolvimento embrionário e permanecem presos na prófase da meiose I. O estado quiescente pode durar anos até que os ovócitos recebam um estímulo para crescer e obter a competência para retomar a meiose. Esse estado prolongado de prisão os torna extremamente suscetíveis ao acúmulo de insultos prejudiciais ao DNA, que afetam a integridade genética dos gametas femininos e, portanto, a integridade genética do futuro embrião.
Consequentemente, o desenvolvimento de um método preciso para detectar danos ao DNA, que é o primeiro passo para o estabelecimento de mecanismos de resposta a danos no DNA, é de vital importância. Este trabalho descreve um protocolo comum para testar a presença e o progresso de danos ao DNA em ovócitos presos à prófase durante um período de 20 h. Especificamente, dissecamos ovários de camundongos, recuperamos os complexos cumulus-oócitos (COCs), removemos as células cumulus dos COCs e cultivamos os ovócitos em meio Μ2 contendo 3-isobutil-1-metilxantina para manter o estado de parada. Posteriormente, os ovócitos são tratados com a droga citotóxica antineoplásmica, etoposide, para gerar quebras de dupla fita (DSBs).
Usando imunofluorescência e microscopia confocal, detectamos e quantificamos os níveis da proteína central γH2AX, que é a forma fosforilada da histona H2AX. O H2AX torna-se fosforilado nos locais dos DSBs após danos ao DNA. A incapacidade de restaurar a integridade do DNA após danos ao DNA em ovócitos pode levar à infertilidade, defeitos congênitos e aumento das taxas de abortos espontâneos. Portanto, a compreensão dos mecanismos de resposta a danos no DNA e, ao mesmo tempo, o estabelecimento de um método intacto para o estudo desses mecanismos são essenciais para a pesquisa em biologia reprodutiva.
Introduction
O processo de meiose em células germinativas femininas de mamíferos é iniciado nos ovários antes do nascimento. O número total de ovócitos é estabelecido nos ovários principalmente durante a embriogênese. Os ovócitos entram na meiose e permanecem presos na prófase I1. Após o início da puberdade e a produção e ação endócrina do hormônio folículo estimulante (FSH) e do hormônio luteinizante (LH), os ovócitos podem reiniciar e completar a meiose2. Em humanos, a prisão profásica pode durar até 50 anos3. As divisões celulares após a entrada na meiose I são assimétricas, resultando na produção de um pequeno corpo polar e um ovócito que mantém seu tamanho. Assim, a maioria dos componentes citoplasmáticos é armazenada no ooplasma durante o início da embriogênese4. Em seguida, os ovócitos entram na meiose II, sem reformar seu núcleo ou descondensar seus cromossomos, e permanecem presos na metáfase II até a fecundação5.
Uma característica única que distingue os ovócitos das células somáticas é o estado de parada na prófase I, quando o ovócito possui um núcleo intacto (parada da vesícula germinativa [VG]), referido como estágio6 do VG. Com base na organização da cromatina, os ovócitos em estádio GV são classificados em duas categorias: nucléolo não circundado (NSN) e nucléolo circundado (SN)7,8. Nos ovócitos em estágio de GNN VG, a cromatina se espalha por toda a região nuclear, e a transcrição é ativa, enquanto nos ovócitos SN a cromatina forma um anel compacto que envolve o nucléolo, e a transcrição é silenciosa9. Ambos os tipos de ovócitos em estádio GV apresentam competência meiótica; entram na meiose na mesma proporção, mas os oócitos NSN apresentam baixa capacidade de desenvolvimento e não podem se desenvolver além do embrião em estágio bicelular10.
O estado prolongado de parada da prófase I aumenta a incidência de acúmulo de danos ao DNA11. Portanto, mecanismos de resposta a danos no DNA em ovócitos são essenciais para permitir a produção de gametas com integridade genética e para garantir que o embrião resultante tenha um conteúdo cromossômico fisiológico.
Um aspecto central da resposta a danos no DNA é o reparo do DNA. As principais vias para o reparo do DSB em células eucarióticas incluem a junção final não homóloga (NHEJ), a recombinação homóloga (HR) e o NHEJ alternativo12,13,14,15. O NHEJ é um mecanismo mais rápido, porém mais propenso a erros, enquanto a FC requer mais tempo para ser completada, mas tem alta fidelidade16.
Não há conhecimento suficiente sobre os mecanismos que os ovócitos utilizam para reparar danos no DNA. Estudos têm demonstrado que o dano ao DNA induzido em ovócitos de mamíferos completamente crescidos pelo uso de agentes genotóxicos, como etoposídeo, doxorrubicina, UVB ou radiação ionizante, não afeta o tempo e as taxas de saída da parada da prófase I17. Os ovócitos podem sofrer degradação do GV (GVBD) mesmo na presença de níveis elevados de dano. Esse dano pode ser determinado pela observação do γH2AX. Essa forma fosforilada de H2AX (γΗ2ΑΧ) é um marcador DSB, que está localizado no local das quebras e funciona como um arcabouço para ajudar fatores de reparo e proteínas a se acumularem nas extremidades quebradas18.
A ausência de parada do ciclo celular após danos ao DNA é devida a um ponto de verificação de danos ao DNA insuficiente que permite que ovócitos com DNA não reparado entrem novamente na meiose. Após altos níveis de danos ao DNA, um ponto de verificação pode manter a parada de prófase através da ativação de uma via ATM / Chk1-dependente. A resposta limitada dos pontos de verificação aos DSBs deve-se à ativação limitada do ATM17,19. Na fase M da meiose I, a pesquisa mostrou que o dano ao DNA pode ativar um ponto de verificação induzido pela meiose I induzido pelo ponto de verificação da montagem do fuso (SAC), que impede a ativação do complexo/ciclossomo promotor da anáfase da ubiquitina ligase E3 (APC/C) e, portanto, a saída da fase M. Além disso, a ablação das proteínas SAC supera o estado de parada em fase M, reforçando a importância do SAC no estabelecimento do chekpoint20 da meiose I.
Como pesquisas anteriores mostram claramente, os DSBs não podem induzir um ponto de verificação profásico robusto em ovócitos de camundongos. Se esse dano não for reparado, pode levar a embriões portadores de anormalidades cromossômicas. Portanto, é importante estudar a resposta a danos no DNA em diferentes estágios da gametogênese feminina para entender melhor as vias únicas que os ovócitos usam para lidar com potenciais insultos genéticos.
Protocol
Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelas autoridades locais (Região de Ioannina, Grécia) e conduzidos de acordo com as Diretivas 2010/63/UE do Conselho das Comunidades Europeias. Experimentos foram conduzidos com respeito aos princípios dos 3Rs. Todos os camundongos CD-1 utilizados para os experimentos foram mantidos no biotério da Universidade de Ioannina, Grécia, em uma sala com temperatura (22 °C) e umidade (60%) controladas e alimentados ad libitum. O biotério tem licença para operar instalação de criação (EL33-BIObr01), fornecimento (EL33-BIOsup01) e experimentos (EL33BIO-exp01).
1. Preparação dos reagentes
- Diluir o pó de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (ver Tabela de Materiais) em dimetilsulfóxido (DMSO) (ver Tabela de Materiais) até uma concentração final de 200 mM. Alíquotas de 10 μL e conservar a -20 °C. Use a solução dentro de 1 mês.
NOTA: O pó IBMX é mantido a -20 °C. - Preparar todos os tampões de imunofluorescência e armazená-los a 4 °C.
- Preparar solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) diluindo um comprimido de PBS (ver Tabela de Materiais) em 200 mL de ddH2Ο.
- Fazer tampão PHEM adicionando 80 mL de ddH 2 Ο, 0,59575 g de HEPES, 1,81422 g de PIPES, 0,38035 g de EGTA e 0,04066 g de MgCl2(ver Tabela de Materiais) enquanto agita com um agitador magnético (veja a Tabela de Materiais) e simultaneamente adicionar NaOH (veja a Tabela de Materiais) até que o pH atinja 6,9 (verifique usando um medidor de pH/ORP [veja a Tabela de Materiais]). Em seguida, adicionar ddH2Ο a um volume final de 100 mL.
- Preparar o tampão paraformaldeído-Triton-X-100 (PFA-Tx-100) diluindo o pó de PFA (ver Tabela de Materiais) em tampão PHEM enquanto agita com um agitador magnético sob aquecimento a uma concentração final de 4% de PFA. Em seguida, filtre o tampão usando uma seringa e um filtro de 0,2 μm (consulte a Tabela de Materiais) e adicione 0,5% Tx-100 (consulte a Tabela de Materiais). Preparar aproximadamente 10 mL de PFA-Tx-100 (0,4 g de PFA, 50 μL de Tx-100), o que é suficiente para um experimento. Conservar a 4 °C durante 1 semana no máximo.
CUIDADO: Use luvas para manusear PFA e evite o contato com a pele e os olhos. - Preparar o tampão de lavagem adicionando albumina de soro bovino (concentração final: 0,5% p/v BSA) (ver Tabela de Materiais) em PBS e agitar mecanicamente. Adicionar 10% p/v tampão NaN3 (azida sódica) na diluição de 1:1.000 para minimizar o risco de contaminação fúngica e bacteriana. Fazer um tampão NaN 3 a 10% p/v adicionando 1 g de pó de NaN3 (ver Tabela de Materiais) a 10 mL de ddH2O; conservar o tampão NaN3 à temperatura ambiente.
- Preparar tampão de bloqueio adicionando BSA (concentração final: 3% p/v) em PBS e agitando mecanicamente. Adicionar tampão NaN3 a 10% na diluição de 1:1.000.
2. Coleta de oócitos GV de ovários dissecados e indução de DSBs
NOTA: Todas as ferramentas e soluções devem ser estéreis. O manuseio de ovócitos é realizado usando uma pipeta bucal sob um microscópio estéreo (veja a Tabela de Materiais), e todas as gotas são cobertas com óleo mineral (veja a Tabela de Materiais e a Figura 1E).
- Injetar camundongos intraperitonealmente com 7 unidades internacionais (UI) de gonadotrofina sérica de égua gestante (PMSG) (ver Tabela de Materiais) 46-48 h antes de abater os camundongos por deslocamento cervical.
NOTA: Todos os ratos utilizados devem ter 8-12 semanas de idade. - Filtrar o meio de cultura M2 (ver Tabela de Materiais) com uma seringa e um filtro de 0,2 μm e adicionar IBMX 200 mM a uma concentração final de 200 μM em um tubo de fundo redondo de 14 mL (consulte a Tabela de Materiais) para manter os ovócitos presos na prófase I. Em seguida, prepare gotas de meio M2-IBMX em uma placa de cultura de tecidos plásticos (consulte a Tabela de Materiais) e coloque-a em um bloco quente (consulte a Tabela de Materiais) a 37 °C por pelo menos 30 minutos antes do isolamento dos ovócitos. Conservar o M2 a 4 °C.
- Sacrificar os camundongos por deslocamento cervical, dissecar os ovários e colocá-los em um tubo de fundo redondo de 5 mL (consulte a Tabela de Materiais) com M2-IBMX.
- Transfira os ovários para uma tampa plástica contendo 1,5 mL de M2-IBMX, remova qualquer tecido adiposo periovariano ou segmentos das tubas uterinas e libere os COCs por perfuração mecânica dos ovários com uma agulha de 27 G (ver Tabela de Materiais e Figura 1A-C).
- Transferir os COCs para uma placa de cultura com gotas de M2-IBMX (aproximadamente 25-30 μL cada) e remover as células cumulus por pipetagem repetida usando uma pipeta de vidro de furo estreito de Pasteur (veja a Tabela de Materiais e a Figura 1D).
- Selecionar ovócitos SN em estágio de VG e transferi-los em uma gota (25 μL) de meio M2-IBMX em um bloco quente a 37 °C protegido da luz (Figura 1F).
- Procurar ovócitos SN com base em seu tamanho maior e núcleos posicionados centralmente em contraste com os ovócitos NSN, nos quais os núcleos são posicionados perifericamente21. Em qualquer caso, observe a configuração do DNA em um microscópio confocal antes de tomar a decisão final sobre o tipo de ovócito GV (SN ou NSN).
- Induzir DSBs usando etoposídeo (consulte a Tabela de Materiais). Colocar os ovócitos em estádio GV em gotas (25 μL cada) do agente genotóxico por 1 h no bloco quente a 37 °C em condições escuras.
NOTA: O etoposídeo é um inibidor da topoisomerase II que introduz DSBs no DNA22. Manter o etoposídeo em alíquotas de 10 μL de 20 mg/mL à temperatura ambiente protegido da luz. As concentrações testadas são 5 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL. - Para manter os ovócitos em estágio de VG presos por um período prolongado, coloque os ovócitos em gotas de meio de cultura M16 (ver Tabela de Materiais) suplementado com 400 μM IBMX em uma incubadora (veja a Tabela de Materiais) a 37 °C e 5% de CO2. Conservar o M16 a 4 °C, filtrar o meio com uma seringa e um filtro de 0,2 μm e incubá-lo durante, pelo menos, 1 h antes da utilização.
Figura 1: Processo de isolamento de ovócitos . (A) Remoção de tecido adiposo periovariano e sobras de segmentos das tubas uterinas dos ovários em meio M2 com IBMX. Fotografia obtida através das oculares do estereomicroscópio. Barra de escala = 1 mm. (B) Ovários isolados em meio M2 com IBMX. Imagem obtida através das oculares do estereomicroscópio. Barra de escala = 1 mm. (C) Perfuração mecânica dos ovários com agulha 27G em meio M2 com IBMX. Imagem obtida através das oculares do estereomicroscópio. Barra de escala = 1 mm. (D) COCs liberados dos ovários após perfuração em meio M2 com IBMX. Imagem obtida através das oculares do estereomicroscópio. Barra de escala = 100 μm. (E) Coleta de ovócitos utilizando pipeta bucal. (F) Oócitos desnudados, após a remoção das células do cumulus circunjacentes, em meio M2 com IBMX. Imagem obtida através das oculares do estereomicroscópio. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Fixação oocitária e imunofluorescência
NOTA: O manuseio de ovócitos é realizado usando uma pipeta bucal sob um microscópio estéreo, e todas as gotas são cobertas com óleo mineral.
- Colocar os ovócitos de GV controle e tratados com etoposídeo em diferentes placas de cultura de tecido plástico com tampão PFA-Tx-100 por 40 min à temperatura ambiente.
- Lavar os ovócitos em três gotas diferentes de tampão de lavagem (50 μL cada) à temperatura ambiente. Deixe os ovócitos por 5 min em cada gota.
- Colocar os ovócitos em gotas de tampão bloqueador (25 μL cada) durante 1 h num bloco quente a 37 °C.
- Preparar o anticorpo primário que reconhece γH2AX (fosfo-Η2ΑΧ de coelho) (Ser139) (ver Tabela de Materiais) (solução-mãe: 1 mg/mL). Use uma diluição de 1:200 em tampão de bloqueio e coloque os ovócitos em gotas de anticorpo primário (15 μL cada) a 4 °C durante a noite.
NOTA: O fosfo-η2ΑΧ (γH2AX) é um marcador comum para a detecção de DSBs tanto em células somáticas quanto em ovócitos de VG18,23. - No dia seguinte, lavar os ovócitos em três gotas diferentes de tampão de lavagem (50 μL cada) à temperatura ambiente. Deixe os ovócitos por 5 min em cada gota.
- Preparar o anticorpo secundário, Alexa Fluor 488-conjugado cabra anti-coelho (ver Tabela de Materiais) (solução-mãe: 2 mg/mL). Utilizar uma diluição de 1:200 em tampão de bloqueio e colocar os ovócitos em gotas de anticorpo secundário (15 μL cada) durante 1 h num bloco quente a 37 °C protegido da luz.
- Transfira os ovócitos em gotas de DRAQ7 (25 μL cada) (solução-estoque: 0,3 mM; veja a Tabela de Materiais), que é um corante de DNA fluorescente vermelho distante que só cora o DNA em células permeabilizadas. Use uma diluição de 1:250 em tampão de lavagem por 10 min à temperatura ambiente em condições escuras.
- Lavar os ovócitos em três gotas diferentes de tampão de lavagem (50 μL cada) à temperatura ambiente. Deixá-los por 5 min em cada gota e, em seguida, transferi-los para pequenas gotas (aproximadamente 5 μL cada) de tampão de lavagem em uma placa de Petri com fundo de vidro de 35 mm (ver Tabela de Materiais) para microscopia confocal (Figura 2A).
NOTA: A lavagem da coloração de DNA e do anticorpo secundário é realizada ao mesmo tempo.
4. Microscopia confocal
NOTA: A microscopia confocal deve ser realizada imediatamente para evitar a redução da intensidade da fluorescência após a colocação dos ovócitos em placas com fundo de vidro. É necessário acesso a um microscópio confocal (veja a Tabela de Materiais) com estágio motorizado.
- Configuração do microscópio
- No sistema confocal, ligue o controlador laser, os lasers, o controlador do microscópio, as lâmpadas para a luz transmitida e o PC (Figura 2B, D).
- Abra o software confocal e escolha a lente de óleo 40x.
- Coloque a placa no porta-espécimes e tente focar nos ovócitos movendo o palco nos eixos XY e Z usando o joystick (Figura 2C).
- Varredura dos ovócitos
- Defina a potência do laser, o ganho e o tamanho do orifício independentemente para cada experimento, a fim de minimizar qualquer saturação.
- Para cada ovócito, defina a área de interesse, especificamente no núcleo na área do DNA. Defina as bordas da área do DNA e ajuste o tamanho do passo z para 3 μm. Em seguida, inicie a digitalização.
- Salve as imagens para cada célula na pasta selecionada.
- Quando a digitalização estiver concluída, saia do software, desligue o computador e desligue o controlador de laser, os lasers, o controlador de microscópio e as lâmpadas da luz transmitida.
Figura 2: Microscopia confocal. (A) Oócitos fixados após a realização do protocolo de imunofluorescência e coloração de DNA, que são colocados em gotas separadas de tampão de lavagem, cobertos com óleo mineral, colocados em uma placa com fundo de vidro e preparados para imagens de microscopia confocal. Cada gota contém uma categoria experimental diferente. Imagem obtida através das oculares do estereomicroscópio. Barra de escala = 1 mm/100 μm para a porção ampliada. (B) Placa com fundo de vidro colocada no estágio do microscópio confocal. (C) Imagem de campo claro dos ovócitos obtida por microscopia confocal. Barra de escala = 100 μm. (D) O sistema de microscopia confocal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Análise por imagem
- Baixe o Fiji ImageJ-win64 no navegador (https://imagej.net/software/fiji/downloads), abra-o e importe os dados como arquivos de pilha TIFF.
Observação : abra cada arquivo de ovócito separadamente. - Clique na Imagem | Cor | Dividir canais para dividir todos os canais.
- Clique em LUT (Look up Table) e escolha as cores preferidas para cada canal.
- Clique na Imagem | Cor | Mesclar canais para fundir os canais para γΗ2ΑΧ e DNA. Deixe o canal de campo brilhante não mesclado.
- Em ovócitos NSN e em oócitos SN com baixos níveis de dano ao DNA, γΗ2ΑΧ é detectado como focos na região do DNA. Neste caso, clique no comando " Multiponto" ou ponto e selecione cada foco γΗ2ΑΧ que coincide com o DNA. Repita esta etapa para todas as pilhas.
- Em ovócitos SN com altos níveis de dano ao DNA, o sinal γΗ2ΑΧ é distribuído por toda a região do DNA. Neste caso, clique em Imagem | Pilhas | Projeto Z, e com o comando Seleções à mão livre , selecione toda a área de DNA.
- Para medir a fluorescência γΗ2ΑΧ, clique em Analisar | Meça e copie as medidas em um arquivo .xlsx. Em seguida, calcule a fluorescência média, normalize os valores e conte o número de focos antes de criar qualquer gráfico.
- Clique em Analisar | Definir Escala para definir a escala e, em seguida, em Analisar | Ferramentas | Barra de escala para adicionar uma barra de escala aos canais.
Representative Results
Usando o procedimento aqui demonstrado, ovários de camundongos foram dissecados, a gordura foi removida e ovócitos em estágio de VG totalmente crescidos foram coletados. Em seguida, as células do cumulus foram removidas por pipetagem repetitiva com pipeta estreita e colocadas em gotas frescas de meio M2-IBMX e cobertas com óleo mineral em bloco quente (37 °C) (Figura 1A-F). Três diferentes concentrações de etoposídeo foram preparadas (5 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL) usando uma concentração de etoposídeo estoque de 20 mg/mL. Os ovócitos em estádio GV foram colocados em três concentrações distintas de etoposídeo por 1 h em gotas cobertas com óleo mineral e protegidas da luz a 37 °C. O protocolo de imunofluorescência foi então seguido, conforme descrito detalhadamente na seção do protocolo, e os ovócitos foram colocados em placas com fundo de vidro e observados por microscopia confocal (Figura 2).
Nos ovócitos SN GV, imediatamente após a lesão do DNA, a presença de γH2AX aumentou em todas as concentrações de etoposídeo (5 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL), e o γH2AX distribuiu-se por toda a região do DNA (Figura 3). A quantificação e estimativa do DSB foram realizadas observando-se a intensidade de fluorescência do γH2AX nos sítios do DNA. A fluorescência γH2AX intensificou-se proporcionalmente com o aumento das concentrações de etoposídeo. Além disso, após parada prolongada da prófase (20 h após o tratamento com etoposídeo), os ovócitos em estádio GV mostraram a capacidade de reduzir o número e a intensidade dos focos γH2AX, implicando a presença de processos ativos de reparo nos ovócitos em estádio GV (Figura 3E).
Ao contrário dos ovócitos SN, em que a fluorescência γH2AX foi distribuída através do DNA, nos ovócitos NSN, γH2AX foi mostrado em focos imediatamente após o tratamento com etoposídeo a 20 μg/mL. Estimamos o número de focos que coincidiam com a área do DNA, calculamos a fluorescência de cada foco e apresentamos a fluorescência média de todos os ovócitos. Tanto a fluorescência quanto o número de focos apresentaram diferenças estatisticamente significantes entre as duas categorias de ovócitos (Figura 4).
A microscopia confocal fornece informações sobre o número e a intensidade dos focos em diferentes pilhas Z, ajudando assim a identificar a presença de danos no DNA e a dinâmica do reparo em momentos distintos. A digitalização Galvano fornece digitalização de precisão com baixo fundo e melhor análise das imagens de digitalização.
Figura 3: Redução de γH2AX em ovócitos SN estádio GV tratados com três diferentes concentrações de etoposídeo após parada prolongada de VG. (A) fluorescência γH2AX em ovócitos SN estádio GV 0 h após tratamento com etoposídeo. O γH2AX aumenta imediatamente após a exposição em todas as concentrações de etoposídeo, e o aumento é dependente da concentração (verde: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). As imagens são projeções Z-stack, e o brilho/contraste foram ajustados para cada canal usando Fiji / ImageJ. Barra de escala = 10 μm. (B) Gráfico da fluorescência γH2AX em oócitos SN estádio GV 0 h após o tratamento com concentrações distintas de etoposídeo. Os dados representam a média ± EPM. Cada ponto representa um ovócito (o número de ovócitos é mostrado no gráfico), (ns = não significativo, ** p < 0,005, **** p < 0,0001, ANOVA unidirecional com teste de comparações múltiplas de Tukey). (C) fluorescência γH2AX em ovócitos SN estádio GV 20 h após tratamento com etoposídeo. γH2AX reduz 20 h após a exposição em todas as concentrações de etoposídeo (verde: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). As imagens são projeções Z-stack, e o brilho/contraste foram ajustados para cada canal usando Fiji/ImageJ. Barra de escala = 10 μm. (D) Gráfico da fluorescência γH2AX em ovócitos SN estágio GV 20 h após o tratamento com concentrações distintas de etoposídeo. Os dados representam a média ± EPM. Cada ponto representa um ovócito (o número de ovócitos é mostrado no gráfico), (ns = não significativo, * p < 0,05, ** p < 0,005, *** p < 0,0005, **** p < 0,0001, ANOVA unidirecional com teste de comparações múltiplas de Tukey). (E) Gráfico de barras da redução da fluorescência γH2AX em ovócitos SN estádio GV após parada profásica em ovócitos tratados com etoposídeo. O número acima de cada coluna indica o declínio percentual na fluorescência γH2AX. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fosforilação de Η2ΑΧ em ovócitos estádio NSN GV após tratamento com etoposídeo a 20 μg/mL. (A) Imagens confocais representativas de um ovócito de estágio de GN controle NSN GV (verde: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). As imagens são projeções Z-stack, e o brilho/contraste foram ajustados para cada canal usando Fiji/ImageJ. Barra de escala = 10 μm. (B) Imagens confocais representativas de um ovócito em estágio de GN tratado com etoposídeo (verde: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Os ovócitos foram fixados 0 h após o tratamento com etoposídeo. As imagens são projeções Z-stack, e o brilho/contraste foi ajustado para cada canal usando Fiji/ImageJ. Barra de escala = 10 μm. (C) A fluorescência γΗ2ΑΧ normalizada em ovócitos estádio NSN GV após tratamento com 20 μg/mL de etoposídeo. Os dados representam a média ± EPM. Cada ponto representa um ovócito (o número de ovócitos é mostrado no gráfico), retirado de dois experimentos independentes (**** p < 0,0001, teste t não paramétrico não pareado, teste U de Mann-Whitney). (D) Número de focos γΗ2ΑΧ em oócitos estádio NSN GV após tratamento com 20 μg/mL de etoposídeo. Os dados representam a média ± EPM. Cada ponto representa um ovócito (o número de ovócitos é mostrado no gráfico), retirado de dois experimentos independentes (**** p < 0,0001, teste t não paramétrico não pareado, teste U de Mann-Whitney). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Usando o método aqui descrito, detectamos DSBs em ovócitos de mamíferos. Este método permite a detecção e o estudo do processo de reparo do DNA em ovócitos. O mesmo protocolo também poderia ser utilizado para analisar outras proteínas que participam de processos fisiológicos em ovócitos de mamíferos. É importante estudar como os ovócitos respondem a possíveis danos ao DNA para entender melhor a causa da subfertilidade feminina em humanos.
Estudar a resposta a danos no DNA em ovócitos de mamíferos pode ser um desafio devido à sensibilidade dos ovócitos. O manuseio de oócitos requer temperaturas específicas e concentrações de CO 2 e O2. Ao mesmo tempo, os ovócitos devem ser protegidos da luz. O manuseio deve ser feito com pipetas de vidro que não sejam estreitas, pois isso pode ser prejudicial para os ovócitos, mas também não deve ser largo, pois pode causar a diluição do meio e, assim, afetar negativamente o procedimento de fixação. Em cada etapa de fixação, várias gotas de tampões são utilizadas para minimizar o efeito de diluição. Uma maneira alternativa de observar DSBs é o ensaio do cometa24. Embora essa técnica seja mais sensível, ela é mais complicada. Ao mesmo tempo, usando o ensaio Cometa, não é possível detectar a região exata do DNA onde o dano ocorre, e em células com moléculas de RNA abundantes, como os ovócitos em estágio GV25, o fundo poderia ser aumentado, levando a um falso sinal de dano ao DNA26.
Usando o protocolo de imunofluorescência aqui descrito, podemos detectar DSBs com precisão e estimar o progresso do reparo em ovócitos em estádio de VG, como indicado pela redução da fluorescência γH2AX ao longo do tempo. No entanto, uma limitação deste método é que certos anticorpos podem apresentar distribuição inespecífica ao longo do ooplasma, levando a imagens com alta fluorescência de fundo. O tampão PFA-Tx-100 é utilizado em substituição ao PFA sequencial e Tx-100, pois observamos que melhora o processo de fixação por permitir a detecção de menor fundo e fluorescência inespecífica. Uma segunda limitação do uso de γH2AX para detecção de DSB é que o dano não pode ser estimado após a GVBD devido à fosforilação espontânea de γH2AX na meiose23.
Nesse protocolo de imunofluorescência, os ovócitos permanecem em tampão líquido e não podem ser armazenados em lâminas. Esse fato dificulta a preservação das células fixas por dias após a adição do anticorpo secundário. Para obter imagens de boa qualidade e não perder o sinal, é preferível realizar a imagem dentro de algumas horas após a adição do anticorpo secundário. Deve-se notar também que a varredura dos núcleos através do eixo Z pode fazer com que o sinal se torne mais fraco devido à superexposição. Por essa razão, é preferível diminuir a potência do laser e aumentar a velocidade da varredura.
Por fim, outra limitação do protocolo de imunofluorescência é que ele pode ser usado apenas para células fixas/não vivas. Portanto, podemos estimar apenas a presença e ausência de fatores em momentos específicos, sem saber se há flutuações em sua concentração ou mudanças em seu comportamento ao longo do tempo. Esse problema poderia ser superado com o uso de imagens de células vivas e marcadores fluorescentes.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio a este trabalho a partir do projeto "Estabelecimento de infraestruturas de 'capacitação' em Investigação Biomédica (BIOMED-20)" (MIS 5047236), que é implementado no âmbito da Ação "Reforço das Infraestruturas de Investigação e Inovação", financiado pelo Programa Operacional "Competitividade, Empreendedorismo e Inovação" (QREN 2014-2020), e cofinanciado pela Grécia e pela União Europeia (Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
| 10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
| Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
| ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
| BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| BD Microlance 3 Needles 27 G - 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
| DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
| Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
| FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
| FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
| Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
| HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
| IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
| Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
| M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| NaN3 | Honeywell | 13412H | |
| NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
| Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
| Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
| pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
| QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |
References
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