Summary
تهدف هذه المقالة إلى تقديم طريقة محسنة لتقييم تجلط الدم الوريدي في نموذج سرطان الفأر ، باستخدام مقاطع الأوعية الدموية لتحقيق الربط الوريدي. يقلل التحسين من التباين في القياسات المتعلقة بالتخثر ويعزز الصلة بالتخثر الوريدي المرتبط بسرطان الإنسان.
Abstract
تسلط ورقة المنهجية هذه الضوء على الفروق الجراحية الدقيقة لنموذج القوارض للتخثر الوريدي ، وتحديدا في سياق تجلط الدم المرتبط بالسرطان (CAT). يعد التخثر الوريدي العميق من المضاعفات الشائعة لدى الناجين من السرطان ويمكن أن يكون قاتلا. عادة ما تتضمن نماذج التخثر الوريدي الحالي للفأر انسدادا ميكانيكيا كاملا أو جزئيا للوريد الأجوف السفلي (IVC) باستخدام خياطة. يؤدي هذا الإجراء إلى ركود كلي أو جزئي للدم وتلف البطانة ، مما يؤدي إلى تكوين الخثار. النماذج الحالية لها قيود مثل التباين العالي في أوزان الجلطات ، ومعدل الوفيات الكبير ، ومنحنى التعلم المطول. يقدم هذا التقرير التحسينات الجراحية باستخدام مشابك الأوعية الدموية لمعالجة بعض هذه القيود. باستخدام نموذج فأر xenograft لسرطان القولون الجيني ، استخدمنا مقاطع الأوعية الدموية المخصصة لربط الوريد الأجوف تحت الكلوي. تسمح هذه المشابك بمساحة شفاه متبقية مماثلة لخياطة البولي بروبلين 5-0 بعد ربط IVC. الفئران مع طريقة خياطة بمثابة الضوابط. أدت طريقة مشبك الأوعية الدموية إلى انسداد وعائي جزئي ثابت قابل للتكرار وأوزان جلطة أكبر مع تباين أقل من طريقة الخياطة. كان من المتوقع زيادة أوزان الجلطات ، وكتلة الجلطة الأكبر ، والجلطة في مساحة سطح اللمعان IVC بسبب ارتفاع ضغط مقاطع الأوعية الدموية مقارنة بخياطة البولي بروبلين 6-0. تم التحقق من صحة هذا النهج عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية على نطاق رمادي ، والذي كشف عن كتلة جلطة أكبر باستمرار في الوريد الأجوف تحت الكلوي مع مقاطع الأوعية الدموية مقارنة بطريقة خياطة. تم إثبات هذه الملاحظات بشكل أكبر من خلال تلطيخ التألق المناعي. تقدم هذه الدراسة طريقة محسنة لتوليد نموذج تجلط وريدي في الفئران ، والذي يمكن استخدامه لتعميق الفهم الميكانيكي ل CAT وفي الأبحاث الانتقالية مثل اكتشاف الأدوية.
Introduction
الجلطات الدموية الوريدية المرتبطة بالسرطان (VTE)
خطر الجلطات الدموية الوريدية (VTE) أعلى من 4 إلى 7 مرات في الناجين من السرطان مقارنة بعامة السكان1،2،3. تثبت هذه الحالة أنها قاتلة في واحد من كل سبعة مرضى مصابين بالسرطان. يختلف معدل الإصابة ب VTE اعتمادا على نوع السرطان وعبء الورم ويكون أعلى بين مرضى سرطان البنكرياس والمعدة4.
الانصمام الخثاري الوريدي المرتبط بالسرطان في مرضى السرطان له أهمية تنبؤية. يرتبط بالبقاء على قيد الحياة بشكل عام غير موات في السنة الأولى بعد تشخيص السرطان ، حتى بعد ضبط العمر والعرق ومرحلة السرطان الأساسي5. تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية فحص الانصمام الخثاري الوريدي المرتبط بالسرطان والحاجة إلى التحقيق في آليته باستخدام نموذج حيواني. يتم التأكيد على الأهمية الانتقالية لهذا المجال من خلال حقيقة أن VTE في مرضى السرطان يمكن الوقاية منه وعلاجه بالوقاية من الخثار والعلاج المضاد للتخثر6.
النماذج الحيوانية للسرطان والتخثر الوريدي
تسمى نماذج السرطان تقليديا الطعوم الخارجية ، والتي تستلزم حقن الخلايا السرطانية في الفئران. يشار إلى حقن الخلايا السرطانية في موقع مثل أصلها كنموذج تقويم العظام ، بينما في موقع مختلف (المستوى تحت الجلد فوق الجناح) يعرف باسم النموذج غير المتجانس. تحدد أنواع منشأ الخلايا السرطانية كنموذج خيفي ، مثل خط خلية HT-29 (سرطان القولون البشري)7،8،9. على العكس من ذلك ، تستخدم النماذج التركيبية خطوط خلايا سرطان الفئران ، بما في ذلك خطوط خلايا RenCa و MC-38 3,10.
وصفت الأدبيات نماذج تجلط الدم الشرياني والوريدي والشعيرات الدموية في القوارض. يحدث تجلط الدم الوريدي في الوريد الأجوف السفلي (IVC) عن طريق الإصابة الميكانيكية (سلك التوجيه) أو الربط الكامل IVC أو الكيميائي (كلوريد الحديديك) أو الإصابة الإلكتروليتية. يمثل تجلط الدم الناجم عن كلوريد الحديديك أو ربط IVC نماذج انسداد كاملة. هذا الأخير يؤدي إلى ركود الدم والتسلل الالتهابي في الأوردة11،12،13. ينتج عن نموذج الربط الكامل معدل مرتفع من تكوين الجلطة في 95٪ إلى 100٪ من الفئران. قد يتضمن نموذج الربط الجزئي IVC انقطاع الفروع الحرقفية القطنية الجانبية ، ويتم إلغاء العودة الوريدية عن طريق تطبيق ربط الخيوط في نقاط الهدف البعيدة ل IVC12. في بعض الأحيان ، يتم استخدام حامل مساحة لمقاطعة العودة الوريدية جزئيا. ومع ذلك ، فإن وزن الجلطة غير متسق في نموذج الانسداد الجزئي الحالي ، مما يؤدي إلى تباين كبير في أوزان الجلطات وارتفاعاتها12,14.
كل من هذه النماذج الميكانيكية الوريدية الكبيرة (الجزئية والكاملة) لها قيود. أولا ، غالبا ما يؤدي ربط IVC (نموذج الركود) إلى انخفاض ضغط الدم. يتم تحويل الدم عبر الأوردة الفقرية. على الرغم من أنه في أيدي ذوي الخبرة ، فإن معدل الوفيات مع هذا النموذج يتراوح بين 5٪ -30٪ ، مع توقع معدل أعلى خلال منحنى التعلم. الأهم من ذلك ، أن نموذج الانسداد الكامل لا يعيد إنتاج تجلط الأوردة العميقة (DVT) في البشر ، حيث تكون الجلطة عادة غير انسدادية. من المرجح أن يؤدي الانسداد الكامل إلى تغيير العوامل الدموية والمعلمات الديناميكية الدوائية ، مما يغير التوافر البيولوجي للمركبات في الموقع المحلي. بسبب هذه القيود ، قد لا تكون نماذج الانسداد الكامل مثالية لاختبار المركبات الكيميائية الجديدة للأغراض العلاجية واكتشافات الأدوية12.
وتجدر الإشارة إلى أنه لتوفير نموذج الفئران أكثر صلة سريريا للتخثر الوريدي مع انخفاض التدفق مع تلف البطانة ، تم تقديم نموذج تجلط الدم الوريدي ، حيث يتم تشغيل DVT عن طريق تقييد تدفق الدم في حالة عدم وجود اضطراب بطاني. تم التحقق من صحة النموذج عن طريق المجهر الإلكترونيالماسح 15. نموذج تجلط الدم المفضل ذي الصلة سريريا هو نموذج به تجلط شبه كامل يتيح اكتشاف الأدوية. تكوين الجلطة في نماذج الانسداد الجزئي الحالية غير متسق ، مما يؤدي إلى تباين كبير في وزن الجلطة وارتفاعاتها12,16. علاوة على ذلك ، فإن وزن الجلطة متغير بالطرق التقليدية ، مما يتطلب المزيد من الفئران لكل دراسة12.
ركزت نماذج الجلطة السابقة المرتبطة بالسرطان على سرطان القولون والبنكرياس والرئة وكانت جميعها نماذج انسداد كاملة17،18،19. تعدل هذه المخطوطة نموذج تجلط الدم بالانسداد الجزئي لتوفير جلطات ذات تباين أقل ووفيات الفئران (الشكل 1). استخدمت الدراسات السابقة خطوط الخلايا السرطانية الخيفية على خلفية الفئران التي تعاني من نقص المناعة19،20،21. تستخدم هذه المخطوطة طعم xenograft syngene للخلايا MC-38 في الفئران C57Bl6 / J ، مما يسمح باستخدام الفئران ذات الكفاءة المناعية وفحص المكونات المناعية لتكوين التخثر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
في هذه الدراسة ، تم استخدام 16 أنثى فأر C57Bl6 / J ، من 8 إلى 12 أسبوعا في العمر ، ووزن جسم من 20 إلى 25 جم. تم إيواء الفئران في ظل ظروف قياسية وتم إطعامها بالطعام والماء الإعلاني. أجريت هذه الدراسة بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في جامعة بوسطن. تم تنفيذ الإجراءات المفتوحة الموصوفة هنا في حالة معقمة.
1. نموذج Xenograft
- زراعة الخلايا
- قبل الزرع تحت الجلد غير المتجانس ، تنمو خلايا MC-38 كطبقة أحادية إلى التقاء 80٪.
- بعد التربسين وإعادة التعليق في 10٪ من الوسائط المحتوية على FBS ، خلايا الطرد المركزي عند 277 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. ثم أعد تعليق الخلايا في وسائط خالية من المصل إلى تركيز 1 × 104 خلايا MC-38 / ميكرولتر وسائط خالية من المصل.
- بالنسبة للتربسين ، قم بزراعة خلايا MC-38 حتى تصل إلى التقاء مرغوب فيه (عادة حوالي 70٪ -80٪) ثم قم باستنشاق وسط الاستزراع من طبق بتري.
- أضف 1 مل من محلول التربسين-EDTA واحتضان الخلايا مع التربسين لمدة دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح بالانفصال. اضغط برفق أو هز طبق بتري لضمان انفصال متساو.
- أضف وسط مزرعة يحتوي على مصل أو مثبط التربسين لتحييد النشاط ومنع المزيد من تفكك الخلايا. اجمع الخلايا المنفصلة مع محلول التربسين المحايد.
- للتعليق ، بمجرد فصل الخلايا من خلال التربسين ، قم بإعدادها للزرع أو لمزيد من التجارب. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية المجمعة عند 277 × جم لحبيبات الخلايا.
- قم بإزالة المادة الطافية بعناية (السائل فوق حبيبات الخلية). أضف 9 مل من وسط الاستزراع أو المخزن المؤقت أو المحلول إلى حبيبات الخلية لتحقيق تركيز الخلية المطلوب للزرع أو التجريب.
- أعد تعليق الخلايا برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل أو باستخدام شاكر قارورة الثقافة. تجنب السحب القوي الذي قد يؤدي إلى تلف الخلايا.
ملاحظة: اعتمادا على المتغير أو خط الخلية المستخدم ، يمكن إعادة تعليق الخلايا بنسبة 1: 1 من مصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان والوسائط الخالية من المصل لإبطاء نمو خلايا الفئران شديدة العدوانية وانتشارها بعد الزرع. يجب اتخاذ جميع خطوات زراعة الخلايا في غطاء معقم كامل في مساحة مخصصة لمزرعة الخلايا على وجه التحديد وتم اختبارها للميكوبلازما بانتظام.
- عد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي وفقا للبروتوكول اليدوي المقدم.
- زرع الخلايا
- قم بتعيين ثمانية فئران بشكل عشوائي للمجموعة التجريبية ، وثمانية فئران للمجموعة الضابطة على النحو التالي. في المجموعة الضابطة ، استخدم الفئران مع MC38 xenograft وقم بإجراء ربط IVC بخياطة البولي بروبلين 5-0. في المجموعة التجريبية ، استخدم الفئران مع MC38 xenograft وقم بإجراء ربط IVC باستخدام مقطع وعائي مخصص.
- ضع الماوس في الاستلقاء الجانبي الأيسر واحلق الجانب الأيمن بين الأطراف الأمامية والخلفية. ضع الكحول واليود على طول منطقة أسفل الظهر لإعداد المنطقة المعقمة للحقن.
- حقن 2 × 106 خلايا MC-38 محضرة في 200 ميكرولتر من الوسط تحت الجلد في الجناح ، في منتصف الطريق بين الضلع البعيد للحيوان وبروز الحوض باستخدام إبرة 27G أثناء إمساك برفق في اليد غير المهيمنة.
- بعد الحقن ، افحص بعناية وأعدها إلى القفص. يجب فحص بحثا عما يلي ؛ 1. التغييرات في السلوك ومستويات النشاط والتنقل العام للفئران. أي تغييرات كبيرة يمكن أن تشير إلى عدم الراحة أو مشاكل صحية. 2. الحالة البدنية العامة للفئران ، بما في ذلك جودة الفراء ، وعادات الاستمالة ، وأي علامات واضحة للضيق أو التشوهات 3. العودة إلى استهلاك الطعام وتناول المياه 4. أي تغييرات في مستوى نشاطهم أو وضعهم أو تفاعلاتهم مع زملائهم في القفص. يمكن أن يكون الخمول أو العدوان المتزايد علامات على الضيق.
2. متابعة نمو الورم
- مراقبة على أساس كل أسبوعين لاتجاهات نمو الورم لمدة 3-4 أسابيع. قياس الأورام مع الفرجار وتسجيل أبعاد الورم.
- قم بقياس الأورام على طول أطول محور لها (L) والمحور العمودي على المحور الطويل (W). احسب حجم الورم (V) باستخدام المعادلة L x (W2) = V. إذا تجاوز حجم الورم 20 مم في كل بعد وكان لدى الورم دليل على التقرح ، فقم بالقتل الرحيم للحيوانات قبل إنهاء التجربة.
- بمجرد أن يصل حجم الورم إلى 400 مم3 ، خطط لاستخدام الفئران لربط IVC.
3. التخدير والتحضير
- تخدير الماوس في غرفة isoflurane وحقن مسكن تحت الجلد: عقد من قاعدة الذيل. الحفاظ على على السطح الظهري لليد غير المهيمنة.
- نقل إلى غرفة تحريض التخدير المستمر مليئة 3 ٪ -4 ٪ إيزوفلوران. تأكد من التخدير العام الكافي مع عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم. استخدم جرعة صيانة من 1٪ -3٪ إيزوفلوران. تطبيق مرهم الطبيب البيطري على كلتا العينين.
- الحقن تحت الجلد مع البوبرينورفين (المواد الأفيونية لتخفيف الألم): قم بإذابة مخزون البوبرينورفين بتركيز 0.3 مجم / مل في 0.9٪ كلوريد الصوديوم (NaCl) لتحقيق تركيز 0.03 مجم / مل.
- حقن جرعة 0.05-0.1 ملغ/كغ من 0.03 ملغ/مل البوبرينورفين مع 500 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪ تحت الجلد قبل الجراحة. في كمية الفئران 20 غرام من 2 ميكروغرام أو 66 ميكرولتر من 0.03 ملغ / مل البوبرينورفين مطلوب.
- تحضير الجلد: ضع الفأر المخدر بالكامل في وضع ضعيف فوق بطانية التدفئة. تطهير منطقة البطن الأمامية مع صبغة الكلورهيكسيدين 0.5 ٪ ، 2x. تحقق بشكل متكرر من درجة حرارة بطانية التدفئة أثناء الإجراء وتأكد من عدم انخفاض درجة الحرارة.
4. ربط IVC
- بضع البطن في خط الوسط
- شق جلد البطن بمقص ناعم يبدأ من بروز الخنجري إلى المثانة. قرصة الصفاق في منتصف الطريق على طول شق الجلد مع ملقط الرضحية. تأكد من وجود مساحة كافية بين الشق والأمعاء العلوية (الشكل 2 أ).
- افتح الصفاق بطريقة طولية مع خط ألبا اللاوعائي.
- إضفاء الطابع الخارجي على الأمعاء إلى الجانب الأيمن من البطن
- سحب الأمعاء مع نصائح القطن الرطب. غطي الأمعاء بشاش معقم رطب تماما. تأكد من أن الأمعاء المغطاة في اتجاه خال من الجر دون أي جر مفرط على الأوعية المساريقي.
- التعرض الكامل ل IVC والفروع ، بما في ذلك التقاء الوريد الكلوي الأيسر ب IVC (الشكل 2B).
- إسقاط 200-300 ميكرولتر من المياه المالحة العادية. استكشف مسار الحالب و IVC والشريان الأورطي والأوردة الكلوية (الشكل 2).
- المستوى اللاوعائي عند نقطة التقاء IVC تحت الكلوي والتقاء الوريد الكلوي الأيسر.
- مرر خياطة البولي بروبلين 6-0 عبر المستوى اللاوعائي برفق 2x-3x بحركات ذيلية إلى رأسية مع ملقط غير رضحي مغلق الطرف.
- تأكد من التحكم في أي حد أدنى من النز بضغط لطيف مزود بدكاك قطني. قم بتوسيع المستوى المقدم عن طريق تمرير خياطة البولي بروبلين 6-0 مع حركات ذيلية لطيفة إلى الجمجمة.
- كي فروع الغدد التناسلية والقطنية (الشكل 2 د)
- قد يكون هناك ما يصل إلى 4 فروع خلفية أو قطنية. لتجنب المضاعفات المحتملة لنقص تروية العمود الفقري والعرج ، اترك الفروع القطنية سليمة في البروتوكول الحالي.
- تأكد من وجود 2 إلى 3 فروع جانبية ، بما في ذلك الإمداد الشرياني لقرن الرحم الثنائي والأوعية تحت المعدة. ضمان التعطيل المستمر للفروع الأولى الموجودة ثنائيا. كي الفروع الثنائية البعيدة فقط عند التقاء الوريد الكلوي الأيسر و IVC (IVC تحت الكلوي). تأكد من عدم تعطل أوعية التصريف الوريدية لقرن الرحم.
ملاحظة: يتم اختيار الكي الجانبي لأن هذه الطريقة توفر سطحا أملسا وغير متقطع ، مما يقلل من أي احتمال للنزيف غير المنضبط. علاوة على ذلك ، فإن الكي أسرع وأكثر جدوى من ربط الخياطة بخيوط 10-0. لذلك ، ستتعرض لإجراء أقصر وأكثر أمانا.
- تحقق مرة أخرى من مسار الحالب والأوعية الدموية للتأكد من عدم وجود أي ناز أو كي غير مقصود (الشكل 2C).
- ربط IVC مع مقاطع الأوعية الدموية في المجموعة التجريبية
- تخصيص مقاطع الأوعية الدموية بعرض 2-0 خياطة النايلون بواسطة ملقط غير مؤلم. تطبيق مقاطع الأوعية الدموية المخصصة في المجموعة التجريبية محيطيا حول IVC تحت الكلوي.
- ضع مشابك الأوعية الدموية على الخيط. يوفر ممر الخيط الأساسي مستوى لاوعائي كافيا مع حركتين إلى ثلاث حركات ذيلية دقيقة إلى حركات الجمجمة (الشكل 2E-F).
- مزيد من تمرير مقاطع الأوعية الدموية من خلال الطائرة المعدة. قم بإعداد المستوى عند التقاء الوريد الكلوي الأيسر و IVC على نطاق واسع بما يكفي للسماح بمرور مقطع هادئ (الشكل 2E).
- ضع مشبك الأوعية الدموية المخصص أفقيا ، عموديا على دورة IVC ، من خلال المستوى المعد. ضع مشابك الأوعية الدموية فوق خياطة البولي بروبلين 5-0 لضمان المساحة المتبقية الكافية (الشكل 2 ج).
- تأكد من تنفيذ الخطوات المذكورة أعلاه برفق لمنع أي تلف في الأوعية الدموية أو نزيف في موقع مشابك الأوعية الدموية. مراقبة المجال الجراحي للناز المحتمل. ضع ضغطا لطيفا بطرف القطن على المجال الجراحي في حالة النز.
- ربط IVC مع خياطة في المجموعة الضابطة
- ربط خياطة مع خياطة 6-0 البولي بروبلين. اصنع خياطة عقدة مربعة جراحية حول IVC تحت الكلوي في المستوى المحضر فوق خياطة حريرية 5-0.
- بمجرد اكتمال الخيط ، قم بإزالة الخيط الحريري برفق لضمان مساحة كافية من البقايا.
- إجراء الحقن تحت الجلد من 200 ميكرولتر من المياه المالحة العادية.
ملاحظة: لتوفير تقنية مماثلة للانسداد الجزئي IVC مع تطبيق المشبك ، تم تخصيص مشبك الأوعية الدموية في الدراسة الحالية لتوفير مساحة بين الشفاه. ثم يتم وضع مشبك الأوعية الدموية في المستوى اللاوعائي المحضر في التقاء الوريد الكلوي الأيسر و IVC. - إغلاق بضع البطن مع الجري المستمر 4-0 خياطة vicryl.
5. المتابعة بعد جراحة المؤشر
- راقب باستمرار بعد العملية لمدة 1 ساعة أو حتى يتم استعادة التوازن والقدرة على التصحيح ، أيا كان ما يأتي أولا في قفص نظيف معزول حتى يتعافى تماما.
- مراقبة يوميا لمدة 2 أيام. إذا كان يبدو بائسا ، راقبه مرتين في اليوم لمدة 2 أيام. تطبيق التسكين والسوائل بعد العملية الجراحية حسب البروتوكول.
- قم بإذابة مخزون البوبرينورفين بتركيز 0.3 مجم / مل في كلوريد الصوديوم 0.9٪ (NaCl) لتحقيق تركيز 0.03 مجم / مل.
- حقن جرعة 0.05-0.1 ملغ/كغ من 0.03 ملغ/مل البوبرينورفين تحت الجلد مع 500 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪، كل 8-12 ساعة خلال ال 48 ساعة الأولى بعد جراحة المؤشر. في فأر 20 جم ، ستكون هناك حاجة إلى 2 ميكروغرام أو 66 ميكرولتر من 0.03 مجم / مل من البوبرينورفين.
6. القتل الرحيم وحصاد IVC الذي يحتوي على الجلطة
- تخدير الماوس في غرفة isoflurane ، وعقد من قاعدة الذيل والحفاظ على على السطح الظهري من يدك.
- نقل إلى غرفة تحريض التخدير المستمر مليئة 3 ٪ -4 ٪ إيزوفلوران. ضع في وضع ضعيف.
- قم بإجراء بضع البطن الطويل في خط الوسط بدءا من الخنجري إلى المثانة كما هو موضح.
- قم بإخراج الأمعاء إلى الجانب الأيمن من البطن واحصد IVC المثبت القاصي إلى التشعب الحرقفي إلى حد IVC تحت الكلوي (الشكل 2G).
- بعد حصاد الجلطة والورم ، القتل الرحيم للحيوان مع خلع عنق الرحم.
7. التحليل الإحصائي
- قدم التحليل الإحصائي على أنه المتوسط والوسيط والانحراف المعياري (SD) أو الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) أو النسبة المئوية 25 أو 75 أو النطاق الكامل للقيم ، بما في ذلك القيم الدنيا والقصوى ، حسب الاقتضاء. قم بإجراء اختبار t للطالب ، واختبار F حسب الاقتضاء. تقييم الدلالة الإحصائية عند مستوى p <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم حقن مجموعة من إناث الفئران C57Bl6 / J ، من عمر 8-12 أسبوعا ، بخلايا MC-38 في المرحلة اللوغاريتمية لنمو الخلايا. نمت الطعوم الخارجية بسرعة بين الأسبوعين الثالث والرابع بعد الحقن18. بمجرد أن وصلت الأورام إلى متوسط حجم 400 مم3 ، تم اختيار الفئران بشكل عشوائي إلى المجموعات الضابطة والتجريبية. خضعت المجموعة الضابطة لربط IVC بالخياطة ، بينما خضعت الفئران التجريبية لربط IVC مع تطبيق مقطع الأوعية الدموية. كانت أحجام الورم في المجموعات الضابطة والتجريبية قابلة للمقارنة دون فروق ذات دلالة إحصائية (353 ± 100 ملم 3 مقابل 367 ± 46.2 ملم3 ، ع = 0.445). تم حصاد IVCs تحت الكلوية إلى نقطة تشعب الأوردة الحرقفية التي تحتوي على الجلطة بعد 48 ساعة ، وكانت أوزان الجلطة بمثابة قراءات بيولوجية للتخثر الوريدي. كانت دورة ما بعد الجراحة في جميع في المجموعات الضابطة والتجريبية هادئة ، دون دليل على تغير لون قرن الرحم ، أو نقص التروية العضلية الهيكلية ، أو مشاكل العرج في الطرف السفلي. خلال بضع البطن الثاني ، لم يلاحظ أي إزاحة مقطع الأوعية الدموية. لم يلاحظ أي وفيات قبل انتهاء التجارب.
وزن الجلطة إلى نسبة وزن الجسم الطبيعية
نظرا لأن الفئران المصابة بالطعم الأجنبي من المحتمل أن تفقد وزن الجسم ، فقد تم تطبيع أوزان الجلطات (بالملغ) إلى إجمالي أوزان الجسم في وقت الحصاد (كلاهما بالملغ). لوحظت زيادة تقترب من 1.5 ضعف في أوزان الجلطة إلى الجسم الطبيعية في الفئران في المجموعة التجريبية (متوسط ± SEM ، 0.002580 ± 0.00098) مقارنة بالفئران الضابطة (0.001453 ± 0.002666 ، قيمة P: 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0.0019 ؛ 0 الشكل 3).
مقايسة التألق المناعي
تم استخدام التقييم النسيجي المرضي لفحص IVC والجلطات. تم تلطيخ الأجزاء المضمنة بالبارافين من الوريد الأجوف تحت الكلوي بمضاد CD31 (علامة على الخلايا البطانية)20 ومضاد الفيبرين ، و DAPI (الشكل 4 أ).
أظهر الوريد الأجوف تحت الكلوي من الفئران الضابطة تلطيخا سليما ل CD31 ويحتل الفيبرين جزئيا تجويف الوعاء. في المجموعة التجريبية ، لم يكن تعبير CD31 سليما ، مما يشير إلى تلف الخلايا البطانية وجلطة كبيرة مع تعبير بارز عن الفيبرين. كما عبر جدار الوعاء عن تلطيخ الفيبرين (الشكل 4 أ).
بالنسبة للتألق المناعي ، تم استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة لفأر الفيبرين عند تخفيف 1: 1000 وتم تحضينه طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بالنسبة ل CD31 ، تم استخدام جسم مضاد متعدد النسيلة للأرانب مضاد ل CD31 تم التحقق من صحته للبقع المناعية و IF (1: 1000 و 1: 100 بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية). من المعروف أن هذا الجسم المضاد يتفاعل ضد الفأر والإنسان والخنزير CD31. بالنسبة ل IF ، تتكون الأجسام المضادة الثانوية من Alex Fluor 488 و 594 و 647 عند تخفيف 1: 250 لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
لتحديد كمية الصورة ، تم مسح الشريحة بأكملها بواسطة نظام مرحلة آلي. تمت معالجة الصور في ImageJ ، حيث تم تحويل الإشارة إلى تدرج الرمادي ، وتم تحليل عدد وكثافة وحدات البكسل ككثافة متكاملة. تم وضع علامة على منطقة الوريد كمنطقة الاهتمام. تم تطبيع الكثافة المتكاملة لجميع الصور إلى منطقتها18.
يظهر أن هذه يتم تنظيمها في نماذج تجلط الأوردة العميقة المرتبط بالسرطان. تم إجراء القياس الكمي للعديد من الصور باستخدام تحليل الكثافة المتكامل ، كما تم سابقا باستخدام الصورة J18. كان لدى المجموعة الضابطة تعبير فيبرين أقل بكثير مقارنة بالمجموعة التجريبية (p:0.0080; الشكل 4 ب ؛ 174 ± 104 مقابل 503.5 ± 182.4 متوسط ± SD). والجدير بالذكر أن الفروق في تعبيرات الفيبرين كانت أقل في التجربة مقارنة بالمجموعة الضابطة (إحصائيات F ، DFn ، Dfd: 3.074 ، 4 ، 4).
التصوير بالموجات فوق الصوتية بتدرج الرمادي
بعد 2 أيام من الجراحة وقبل حصاد الجلطة مباشرة ، خضعت الفئران للتصوير بالموجات فوق الصوتية الرمادية. أظهرت الفئران في كلا المجموعتين جلطات في الوريد الأجوف تحت الكلوي. ومع ذلك ، كانت الجلطات أكبر في الفئران مع مقطع الأوعية الدموية. تظهر صور التصوير بالموجات فوق الصوتية التمثيلية في الشكل 5. تشير المنطقة عديمة الصدى في الوعاء إلى أن التجويف السالكين والكثافة المفرطة الصدى في الوعاء يدل على وجود جلطة منظمة. يظهر الوريد الأجوف تحت الكلوي المربوط لفأر من المجموعة الضابطة جلطة جزئية محددة برأسي سهم أصفر في الشكل 5 أ. في المقابل ، يظهر الشكل 5B جلطة كبيرة تكاد تسد الوريد الأجوف تحت الكلوي الناتج عن نموذج مشبك الأوعية الدموية (يصوره رأسان سهمان أصفران ومميزان بعلامات نجمية بيضاء). وتجدر الإشارة إلى أن الوريد الأجوف تحت الكلوي انهار في المجموعة الضابطة بينما تم توسيعه في المجموعة التجريبية ، بما يتفق مع عبء الجلطة الأكبر في المجموعة الأخيرة.
تشير كل من المقايسات (التصوير بالموجات فوق الصوتية و IF) إلى أن المجموعة التجريبية لديها جلطات أكبر باستمرار من المجموعة الضابطة.
الشكل 1: رسم تخطيطي يصور IVC-Aorta وتطبيق المقطع على التقاء الوريد الكلوي الأيسر (LRV) -IVC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: نموذج تجلط IVC أثناء العملية مع تطبيق المشابك. أ: فتح البطن في خط الوسط. (ب) التعرض الكامل للحقن الوريدي الوريدي، بما في ذلك التقاء الوريد الكلوي الأيسر بالوريد الوريدي. (ج) إظهار مسار الحالب وتجنب أي صدمة علاجية المنشأ للحالب الأيسر. د: كي فروع المناسل. ه: تشريح IVC إلى نقطة التقاء الوريد الكلوي الأيسر. (F) تمرير درز البولي بروبلين 5-0 عبر المستوى التشريحي لتوسيع المستوى لتمرير الدرزة. ز: تمرير مشبك وعائي عبر المستوى المحضر. (H) تكوين الجلطة بعد 48 ساعة من لقط IVC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مجموعة الفئران ذات المشابك الوعائية IVC ، لديها نسبة وزن جلطة إلى جسم طبيعية أعلى. متوسط نسبة وزن الجلطة إلى الجسم الطبيعية. وحدة كل من القيم المعبر عنها بالملليغرام. أشرطة الخطأ = SD. تم تطبيق اختبار t للطالب. P <0.0001 الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: زيادة تعبير الفيبرين و CD 31 في مجموعة من الفئران مع ربط IVC بمقاطع وعائية. تم الحصول على صور التألق المناعي التمثيلي عند تكبير 100x من المجموعة الضابطة مع ربط IVC مع خياطة ومن المجموعة التجريبية مع ربط IVC مع مقاطع الأوعية الدموية. تظهر الصور المختارة عشوائيا لكل ماوس (N = 4 ماوس / مجموعة). أ: تعبير الفيبرين وCD31 في المجموعتين الضابطة والتجريبية. يصور رأسا سهم أصفر مميزان بعلامات نجمية بيضاء الجلطة الكبيرة التي تسد IVC تقريبا ، مما يعني أن IVC محجوب جزئيا. (ب) الكثافة المتكاملة للفيبرين: يمثل الخط القيمة المتوسطة. تم إجراء اختبار T للطالب. قيمة p = 0.0080. IF تلطيخ صور الوريد الأجوف تحت الكلوي التمثيلي ، بما في ذلك الجلطات في المجموعات الضابطة والتجريبية وملطخة بمضادات CD31 ، والأجسام المضادة الثانوية Alexa Fluro. يتم عرض تكبير 400x. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: زيادة مساحة سطح الجلطة داخل IVC المثبت جزئيا في مجموعة من الفئران ذات المشابك الوعائية IVC الربط. صور التصوير بالموجات فوق الصوتية ذات التدرج الرمادي التمثيلي للمجموعة الضابطة والتجريبية. (أ) صورة دوبلر ذات تدرج رمادي تمثيلي للمجموعة الضابطة: تظهر منطقة IVC منطقة عديمة الصدى توحي بتجويف براءة الاختراع ، ويظهر الجزء الآخر منطقة مفرطة الصدى تدل على الجلطة. (ب) صورة دوبلر ذات تدرج رمادي تمثيلي للمجموعة التجريبية: كانت الجلطة المنظمة (العلامة النجمية البيضاء) داخل IVC ، كما هو موضح برؤوس الأسهم الصفراء ، أكثر بروزا في المجموعة التجريبية. علاوة على ذلك ، ظهرت الجلطة بطريقتين متميزتين في القسم السهمي. كما تم تحديد جلطة تسد المقطع العرضي الكبير للتجويف على الجانب الآخر من IVC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في نموذج سرطان القولون xenograft syngenetic ، نلاحظ ارتفاع تجلط الدم وتعبيرات علامات التخثر في المجموعة التجريبية مقارنة بالمجموعة الضابطة. الأهم من ذلك ، كان التباين في جميع هذه المعلمات أقل في المجموعة التجريبية مقارنة بالمجموعة الضابطة. تضمن التعديل إدخال مشبك وعائي مع ملف ضغط محدد عند نقطة التقاء IVC والوريد الكلوي الأيسر. تم وضع المشبك فوق فاصل ، وهو عبارة عن خياطة من مادة البولي بروبيلين 5-0. يقلل هذا التعديل من التباين في حجم الجلطة وعلامات تجلط الدم. شهدت جميع الفئران البقاء على قيد الحياة بنسبة 100 ٪.
الفروق الفنية الدقيقة
تضمن الإجراء اهتماما خاصا لعدة خطوات. بعد فتح البطن ، تم فحص الحالبين بدقة لمنع أي إصابة عرضية. لتحقيق التعرض الأمثل ، تم تغطية الأمعاء بشاش رطب والاحتفاظ بها في الربع العلوي الأيمن دون جر مفرط. بعد ذلك ، تم كي الفروع الجانبية IVC على بعد 2 إلى 3 مم من الحالب و IVC والشريان الأورطي لمنع تلف الأوردة. بعد التأكد من الإرقاء الكامل ، تم إعداد الطائرة لربط IVC. من المهم أن نلاحظ أن الشريان الأورطي و IVC في الفئران يرتبطان ارتباطا وثيقا على طول مسارهما ، ومحاولة تشريحهما يمكن أن تؤدي إلى نزيف وفقدان. الاستثناء الوحيد هو الوريد الكلوي الأيسر ونقطة التقاء الشريان الأورطي21. ثم تم إعداد ممر خياطة باستخدام ما لا يزيد عن ثلاث حركات متباينة دقيقة وحادة بالملقط.
تم الإبلاغ عن قطر IVC للفأر البالغ من العمر 8 إلى 12 أسبوعا في حدود 0.3 إلى 0.5 مم تقريبا. يجب أن يؤمن إجراء الربط الجزئي IVC مساحة للتمييز عن الربط الكامل. في الدراسة الحالية ، نظرنا في عيار خياطة 5-0 ، يتوافق مع 0.10 إلى 0.15 ملم للفاصل. لذلك ، تم تعديل مساحة شفة مقاطع الأوعية الدموية لخياطة 2-0 لتوفير مساحة كافية ل IVC 0.3 مم ومساحة 0.1 مم.
قدم خيط البولي بروبلين دليلا غير دموي ، مما يسمح بتوسيع المستوى بذيلية متكررة لحركة الجمجمة لمدة 1 إلى 2 مم إضافية لاستيعاب تطبيق مقاطع الأوعية الدموية. أخيرا ، تم وضع مشابك الأوعية الدموية المخصصة مع مساحة متبقية للشفة متوافقة مع خياطة البولي بروبلين 5-0.
إن اختيار المشابك المعدنية النبيلة ، مثل البلاتين ، لإغلاق الأوعية الدموية ، مدفوع بحقيقة أن هذه المواد خاملة نسبيا وتقلل من الالتهاب الناجم عن المواد مقارنة بالغرز المحددة القابلة للامتصاص والمتأخرة22،23،24. هذه المشابك المعدنية مقاومة للتفاعلات الكيميائية ، مما يجعلها مستقرة. هذا يؤدي إلى بديل أكثر أمانا وفعالية مع انخفاض خطر الالتهاب مقارنة باستخدام مواد خياطة.
الصلة الانتقالية للنموذج
تختلف نماذج تجلط الدم الوريدي في الفئران اختلافا جوهريا عن تجلط الأوردة العميقة في البشر. أولا ، في نماذج القوارض ، لوحظ تكوين الجلطة في اتجاه المنبع. ومع ذلك ، يتم تشكيل VTs السريرية في اتجاه مجرى النهر من nidus25,26. ثانيا ، تختلف علاقات السبب والنتيجة بين البشر ونماذج الفئران. في البشر ، تكوين الجلطة هو حدث المؤشر الذي يتبعه انسداد تدفق الدم. استثناء واحد هو متلازمة ماي ثورنر. تشير متلازمة ماي ثورنر إلى حالة طبية يزيد فيها الضغط الخارجي المتزايد على الوريد الحرقفي الأيسر، الواقع بين العمود الفقري والشريان الحرقفي الأيمن، من خطر الإصابة بتجلط الوريد الحرقفي الأيسر، أو جلطة دموية في الوريد الحرقفي الأيسر. في نماذج الفئران ، يكون انسداد التدفق الوريدي هو الحدث الأساسي ، مما يؤدي إلى بطء تدفق الدم وتكوين الجلطة25.
بالمقارنة مع النماذج الأخرى ، مثل نموذج إصابة الوريد الفخذيكهربائيا 12 ، يوفر ركود IVC ميزة واضحة. يسمح بفحص التدابير العلاجية المحلية ، مثل مرشحات IVC ، وانحلال الخثرة الموجه بالقسطرة وإعادة الاستقناء داخل اللمعة مع توفير بيئة لتشكيل الجلطة في وجود تدفق الدم. وبالتالي ، يتم فحص ذراعين من إصابة البطانة والركود في هذا النموذج. ترتبط الجلطات في IVC أيضا بحدوث مضاعفات أعلى ، مثل الصمات الرئوية. أحد القيود هو أن IVC هو موقع أقل شيوعا لجلطات الأوردة العميقة في البشر.
إطار عمل التخفيض والصقل والاستبدال (3R)
من المهم دمج إطار 3Rs في النماذج الحيوانية. يحد تكامل إطار 3R من معاناة ويعزز ممارسات البحوث الحيوانية الأخلاقية والمسؤولة. ينطبق 3Rs على اكتشافنا الحالي لأننا لم نلاحظ أي وفيات في الفئران. أيضا ، من الممكن استخدام عدد أقل من في الدراسات. وبالتالي ، يمكن تقليل عدد الفئران والتكلفة.
قيود الدراسة
يتضمن أحد القيود المحتملة لطريقة المشبك نطاقا ضيقا نسبيا من ملفات تعريف الضغط لمقاطع الأوعية الدموية التي تم اختبارها. وبناء على ذلك ، يمكن تصميم المزيد من الدراسات مع مجموعة واسعة من ملامح الضغط. أظهرت الدراسات السابقة أن الفئران التي تعاني من نقص المناعة أكثر عرضة لتشكيل الجلطة ، وقد تختلف أوزان الجلطات في الفئران ذات الكفاءة المناعية12. يتم تشجيع الدراسات المستقبلية على فحص مدى اتساق أوزان الجلطات في خلفيات سلالة الفئران المختلفة.
استنتاج
توفر الطريقة الحالية مقياسا أكثر اتساقا لدراسة الجلطة الوريدية عبر نموذج ربط IVC الجزئي. نأمل أن يسمح هذا التعديل بتوليد نماذج فأرة قوية وموثوقة للتحقيق في عواقب تجلط الدم المرتبط بالسرطان باستخدام نماذج سرطانية مختلفة ذات صلة بالأمراض البشرية.
بينما يركز العمل الحالي بشكل خاص على تجلط الدم المرتبط بالسرطان ، فإن العمل المستقبلي سيستلزم إجراء تحليل شامل لنماذج الفئران من الأمراض المصاحبة المختلفة (مثل السمنة والفشل الكلوي المزمن) والفئران العادية التي تزيد من خطر تجلط الدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل AHA Cardio-Oncology SFRN CAT-HD CENTER منحة 857078 (KR و VCC و XY و SL) و R01HL166608 (KR و VCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
References
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
- Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
- Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
- Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
- Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
- Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
- Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Cancer Research. 62 (13), 3711-3715 (2002).
- Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Research. 46 (7), 3358-3363 (1986).
- Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
- Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
- Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
- von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
- Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
- Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
- Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
- Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
- Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
- Poyyamoli, S., et al.
- Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).
