Summary
מאמר זה נועד להציג שיטה אופטימלית להערכת פקקת ורידים במודל סרטן עכברים, באמצעות קליפסים וסקולריים להשגת קשירה ורידית. אופטימיזציה ממזערת את השונות במדידות הקשורות לפקקת ומשפרת את הרלוונטיות לפקקת ורידים הקשורה לסרטן אנושי.
Abstract
מאמר מתודולוגי זה מדגיש את הניואנסים הכירורגיים של מודל מכרסם של פקקת ורידי, במיוחד בהקשר של פקקת הקשורה לסרטן (CAT). פקקת ורידים עמוקים היא סיבוך שכיח בקרב מחלימים מסרטן ועלולה להיות קטלנית. המודלים הנוכחיים של פקקת ורידים מורין כוללים בדרך כלל חסימה מכנית מלאה או חלקית של הווריד הנבוב התחתון (IVC) באמצעות תפר. הליך זה גורם לקיפאון מלא או חלקי של נזק לדם ולאנדותל, ומפעיל טרומבוגנזה. למודלים הנוכחיים מגבלות כגון שונות גבוהה יותר במשקלי קרישי דם, שיעור תמותה משמעותי ועקומת למידה ממושכת. דו"ח זה מציג חידודים כירורגיים באמצעות קליפסים וסקולריים כדי להתמודד עם חלק ממגבלות אלה. באמצעות מודל עכבר סינגני של סרטן המעי הגס, השתמשנו בקליפסים מותאמים אישית של כלי דם כדי לקשור את הווריד האינפרא כלייתי קאווה. קליפסים אלה מאפשרים מרווח שפתיים שיורי בדומה לתפר פוליפרופילן 5-0 לאחר קשירת IVC. עכברים בשיטת התפרים שימשו כבקרות. שיטת קליפס כלי הדם הביאה לחסימה חלקית עקבית של כלי הדם ולמשקלי קריש גדולים יותר עם פחות שונות מאשר שיטת התפרים. משקלי הקריש הגדולים יותר, מסת הקריש הגדולה יותר והקריש לשטח הפנים הלומינלי IVC היו צפויים בשל פרופיל הלחץ הגבוה יותר של אטבי כלי הדם בהשוואה לתפר פוליפרופילן 6-0. הגישה אומתה על ידי אולטרה-סאונד בקנה מידה אפור, אשר חשף מסת קריש גדולה יותר באופן עקבי בווריד הווריד האינפרא כלייתי עם קליפסים וסקולריים בהשוואה לשיטת התפרים. תצפיות אלה אוששו עוד יותר עם צביעת האימונופלואורסצנטיות. מחקר זה מציע שיטה משופרת ליצירת מודל פקקת ורידים בעכברים, אשר ניתן להשתמש בו כדי להעמיק את ההבנה המכניסטית של CAT ובמחקר תרגומי כגון גילוי תרופות.
Introduction
טרומבואמבוליזם ורידי הקשור לסרטן (VTE)
הסיכון לטרומבואמבוליזם ורידי (VTE) גבוה פי 4 עד 7 במחלימים מסרטן בהשוואה לאוכלוסייה הכללית 1,2,3. מצב זה מתגלה כקטלני באחד מכל שבעה חולי סרטן. שכיחות VTE משתנה בהתאם לסוג הסרטן ולנטל הגידול והיא הגבוהה ביותר בקרב חולים עם סרטן הלבלב והקיבה4.
VTE הקשור לסרטן בחולי סרטן יש משמעות פרוגנוסטית. היא קשורה להישרדות כללית שלילית בשנה הראשונה לאחר אבחון סרטן, גם לאחר התאמה לגיל, גזע ושלב של סרטן בסיסי5. ממצאים אלה מדגישים את החשיבות של בחינת VTE הקשור לסרטן ואת הצורך לחקור את המנגנון שלו באמצעות מודל של בעלי חיים. הרלוונטיות התרגומית של תחום זה מודגשת עוד יותר על ידי העובדה כי VTE בחולי סרטן ניתן למניעה וניתן לטיפול עם טרומבופרופילקסיס וטיפול אנטיטרומבוטי6.
מודלים בעלי חיים של סרטן פקקת ורידים
מודלים של סרטן מכונים בדרך כלל xenografts, אשר כרוך הזרקה של תאים סרטניים בעכברים. הזרקת תאים סרטניים באתר כמו מוצאו מכונה מודל אורתוטופי, ואילו באתר אחר (מישור תת עורי מעל האגף) מכונה מודל הטרוטופי. מין המקור של תאי סרטן קובע אותם כמודל אלוגני, כגון קו התאים HT-29 (סרטן המעי הגס האנושי)7,8,9. להיפך, מודלים סינגניים משתמשים בקווי תאי סרטן מורין, כולל RenCa ו- MC-38 קווי תאים 3,10.
הספרות תיארה מודלים של פקקת עורקים, ורידים ונימים במכרסמים. פקקת ורידים נגרמת בווריד הנבוב התחתון (IVC) על ידי פגיעה מכנית (חוט מנחה) או קשירת IVC מלאה, כימית (ברזל כלורי), או פגיעה אלקטרוליטית. פקקת ברזל הנגרמת על ידי כלוריד או קשירת IVC מייצגת מודלים של חסימה מלאה. האחרון גורם לקיפאון של דם וחדירות דלקתיות בוורידים11,12,13. מודל הקשירה המלא מביא לשיעור גבוה של היווצרות פקקת ב-95% עד 100% מהעכברים. מודל קשירת IVC חלקית עשוי לכלול הפרעה של ענפים איליומותניים לטרליים, והחזרה הוורידית מתבטלת על ידי החלת קשירת תפרים בנקודות המטרה הדיסטליות של IVC12. לעיתים, נעשה שימוש במחזיק חלל כדי לקטוע את החזרה הוורידית באופן חלקי. עם זאת, משקל הפקקת אינו עקבי במודל החסימה החלקי הנוכחי, וכתוצאה מכך שונות גבוהה במשקלי קריש ובגבהים12,14.
לשני המודלים המכניים הגדולים הללו (חלקיים ומלאים) יש מגבלות. ראשית, קשירת IVC (מודל קיפאון) גורמת לעיתים קרובות ללחץ דם נמוך. הדם מוזרם דרך ורידי החוליות. אמנם בידיים מנוסות, התמותה במודל זה נעה בין 5%-30%, כאשר השיעור הגבוה יותר צפוי במהלך עקומת הלמידה. חשוב לציין, מודל החסימה המלאה אינו משחזר פקקת ורידים עמוקים (DVT) בבני אדם, שם פקקת בדרך כלל אינה חסימתית. חסימה מלאה עשויה לשנות גורמים דימולוגיים ופרמטרים פרמקודינמיים, ולשנות את הזמינות הביולוגית של תרכובות באתר המקומי. בשל מגבלות אלה, מודלים מלאים של חסימה עשויים שלא להיות אופטימליים לבדיקת תרכובות כימיות חדשות למטרות טיפוליות ותגליות תרופות12.
יש לציין כי כדי לספק מודל מוריני רלוונטי יותר מבחינה קלינית של פקקת ורידים עם ירידה בזרימה עם נזק לאנדותל, הוצג מודל פקקת ורידי, שבו DVT מופעל על ידי הגבלת זרימת הדם בהיעדר הפרעה אנדותל. המודל אומת על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק15. מודל פקקת רלוונטי קלינית מועדף הוא מודל עם פקקת כמעט מלאה המאפשרת גילוי תרופות. היווצרות הקריש במודלים הנוכחיים של חסימה חלקית אינה עקבית, וכתוצאה מכך שונות גבוהה במשקל הקריש ובגבהים12,16. יתר על כן, משקל הקריש משתנה בשיטות הקונבנציונליות, ודורש יותר עכברים לכל מחקר12.
מודלים קודמים של פקקת הקשורה לסרטן התמקדו בסרטן המעי הגס, הלבלב והריאות וכולם היו מודלים של חסימה מלאה17,18,19. כתב היד הזה משנה את מודל פקקת החסימה החלקית כדי לספק לקרישי דם שונות נמוכה יותר ותמותת עכברים (איור 1). מחקרים קודמים השתמשו בשורות תאים אלוגניים של סרטן על עכברים אתימיים מדוכאי חיסוןרקע 19,20,21. כתב יד זה משתמש בקסנוגרפט סינגני של תאי MC-38 בעכברי C57Bl6/J, המאפשר שימוש בעכברים בעלי יכולת חיסונית ובדיקת רכיבים חיסוניים לטרומבוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
במחקר זה נעשה שימוש ב-16 נקבות עכברי C57Bl6/J, בגילאי 8-12 שבועות ובמשקל גוף של 20 עד 25 גרם. העכברים שוכנו בתנאים סטנדרטיים והוזנו בצ'או ובמים אד ליביטום. מחקר זה בוצע באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת בוסטון. ההליכים הפתוחים המתוארים כאן נעשו במצב סטרילי.
1. מודל Xenograft
- תרבית תאים
- לפני ההשתלה ההטרוטופית התת עורית, יש לגדל תאי MC-38 כחד-שכבה למפגש של 80%.
- לאחר טריפסיניזציה והשעיה במדיה 10% המכילה FBS, תאי צנטריפוגות ב 277 x גרם, 4 ° C למשך 5 דקות. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים במדיה נטולת סרום לריכוז של 1 x 104 תאי MC-38 / מדיה נטולת μL בסרום.
- עבור טריפסיניזציה, תרבית את תאי MC-38 עד שהם מגיעים למפגש הרצוי (בדרך כלל סביב 70%-80%) ולאחר מכן שאפו את מדיום התרבית מצלחת הפטרי.
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA ודגר על התאים עם טריפסין במשך דקה אחת ב 37 ° C כדי לאפשר ניתוק. טפחו בעדינות או נערו את צלחת הפטרי כדי להבטיח ניתוק אחיד.
- הוסף מדיום תרבית המכיל סרום או מעכב טריפסין כדי לנטרל את הפעילות ולמנוע דיסוציאציה נוספת של התא. אספו את התאים המנותקים יחד עם תמיסת הטריפסין המנוטרלת.
- להשעיה, ברגע שהתאים מנותקים באמצעות טריפסיניזציה, הכינו אותם להשתלה או לניסויים נוספים. צנטריפוגה את תרחיף התא שנאסף ב 277 x גרם כדי pellet את התאים.
- בזהירות להסיר את supernatant (נוזל מעל גלולת התא). הוסף 9 מ"ל של מדיום תרבית, חיץ או תמיסה לגלולת התא כדי להשיג את ריכוז התא הרצוי להשתלה או לניסוי.
- השהה מחדש בעדינות את התאים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה או באמצעות שייקר בקבוקים לתרבית. הימנע pipetting נמרץ שעלול להזיק לתאים.
הערה: בהתאם לגרסה או לקו התאים שבהם נעשה שימוש, ניתן להשעות מחדש תאים ביחס של 1:1 של מטריצת קרום מרתף מסיסה ומדיה נטולת סרום כדי להאט את הצמיחה וההפצה של תאי עכבר אגרסיביים במיוחד לאחר ההשתלה. כל שלבי תרביות התאים צריכים להתבצע במכסה מנוע אספטי שלם בתרבית תאים שהוקצה במיוחד לשטח ונבדקו למיקופלסמה באופן קבוע.
- ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי בהתאם לפרוטוקול הידני שסופק.
- השתלת תאים
- הקצו באופן אקראי שמונה עכברים לקבוצת הניסוי, ושמונה עכברים לקבוצת הביקורת באופן הבא. בקבוצת הביקורת, יש להשתמש בעכברים עם קסנוגרפט MC38 ולבצע קשירת IVC בתפר פוליפרופילן 5-0. בקבוצת הניסוי, השתמשו בעכברים עם קסנוגרפט MC38 ובצעו קשירת IVC עם קליפס כלי דם מותאם אישית.
- מניחים את העכבר בשכיבה צידית שמאלית ומגלחים את צד ימין בין הגפיים הקדמיות והאחוריות. יש למרוח אלכוהול ויוד לאורך האזור המותני הגבי כדי להכין את האזור להזרקה.
- הזריקו 2 x 106 תאי MC-38 שהוכנו ב 200 μL של מדיום תת עורי באגף, באמצע הדרך בין הצלע הדיסטלית ביותר של החיה לבין בולטות האגן באמצעות מחט 27G תוך החזקת החיה בעדינות ביד הלא דומיננטית.
- לאחר ההזרקה, בדקו היטב את בעלי החיים והחזירו אותם לכלוב. בעלי החיים צריכים להיבדק עבור הדברים הבאים; 1. שינויים בהתנהגות, ברמות הפעילות ובניידות הכללית של העכברים. כל שינוי משמעותי עלול להצביע על אי נוחות או בעיות בריאותיות. 2. מצבם הגופני הכללי של העכברים, כולל איכות הפרווה, הרגלי טיפוח וכל סימן נראה לעין של מצוקה או חריגות 3. חזרה לצריכת מזון וצריכת מים 4. כל שינוי ברמת הפעילות, ביציבה או באינטראקציות שלהם עם חברים לכלוב. עייפות או תוקפנות מוגברת יכולים להיות סימנים למצוקה.
2. מעקב אחר צמיחת הגידול
- עקוב אחר בעלי החיים על בסיס דו-שבועי עבור מגמות צמיחת הגידול במשך 3-4 שבועות. למדוד את הגידולים עם קליפר ולרשום את ממדי הגידול.
- מדדו את הגידולים לאורך הציר הארוך ביותר שלהם (L) ואת הציר המאונך לציר הארוך (W). חשב את נפח הגידול (V) באמצעות המשוואה L x (W2) = V. אם גודל הגידול עולה על 20 מ"מ בכל ממד או שיש עדות לכיב, יש להרדים את בעלי החיים לפני סיום הניסוי.
- לאחר שנפח הגידול מגיע ל-400 מ"מ3, תכננו להשתמש בעכברים לקשירת IVC.
3. הרדמה והכנה
- מרדימים את העכבר בתא איזופלורן ומזריקים את משכך הכאבים תת עורית: מחזיקים את בעל החיים מבסיס הזנב. שמור את החיה על פני השטח הגבי של היד הלא דומיננטית.
- מעבירים את בעל החיים לתא השראת הרדמה רציפה מלא באיזופלורן 3%-4%. ודא הרדמה כללית נאותה עם היעדר רפלקס צביטת בוהן. יש להשתמש במינון תחזוקה של 1%-3% איזופלורן. יש למרוח משחה וטרינרית על שתי העיניים.
- הזרקה תת עורית עם buprenorphine (אופיואיד להקלה על כאב): להמיס את מלאי buprenorphine בריכוז של 0.3 מ"ג / מ"ל ב 0.9% נתרן כלורי (NaCl) כדי להשיג ריכוז של 0.03 מ"ג / מ"ל.
- יש להזריק מינון של 0.05-0.1 מ"ג/ק"ג של 0.03 מ"ג/מ"ל בופרנורפין יחד עם 500 מיקרוליטר של 0.9% NaCl סטרילי תת עורית לפני ניתוח. בכמות עכבר של 20 גרם של 2 מיקרוגרם או 66 מיקרוליטר של 0.03 מ"ג/מ"ל נדרש בופרנורפין.
- הכנת העור: הניחו את העכבר מורדם לחלוטין במצב שכיבה מעל שמיכת החימום. יש לחטא את אזור הבטן הקדמי בתמיסת כלורהקסידין 0.5%, 2x. לעתים קרובות לבדוק את הטמפרטורה של שמיכת חימום במהלך ההליך ולוודא כי הטמפרטורה לא נופל.
4. קשירת IVC
- לפרוטומיה בקו האמצע
- חתכו את עור הבטן עם מספריים עדינים החל מהבולטות הקסיפואידית ועד לשלפוחית השתן. צובטים את הצפק באמצע הדרך לאורך חתך העור עם מלקחיים א-טראומטיים. ודאו רווח הולם בין החתך למעי שמעליו (איור 2A).
- פתח את הצפק באופן אורכי יחד עם linea alba avascular.
- יציאה חיצונית של המעיים לצד ימין של הבטן
- משוך את המעיים עם קצות כותנה רטובים. מכסים את המעיים בגזה סטרילית לחה לחלוטין. ודא כי המעיים המכוסים נמצאים בכיוון ללא מתיחה ללא כל מתיחה מוגזמת על כלי הדם mesenteric.
- חשיפה מלאה של IVC וענפים, כולל מפגש של וריד הכליה השמאלי עם IVC (איור 2B).
- טיפה 200-300 μL של מלוחים רגילים. חקרו את מסלול השופכנים, IVC, אבי העורקים וורידי הכליה (איור 2).
- מישור כלי הדם בנקודת המפגש של IVC אינפרא כלייתי ומפגש ורידי הכליה השמאלי.
- מעבירים את תפר הפוליפרופילן 6-0 דרך מישור האווסקולרי בעדינות 2x-3x עם תנועות קאודליות לצפלדות עם המלקחיים הא-טראומטיים בקצה הסגור.
- יש לוודא שכל נוזל מינימלי נשלט בלחץ עדין המסופק עם טמפונדה עם קצה כותנה. הרחב את המישור שסופק על ידי העברת תפר פוליפרופילן 6-0 עם תנועות קאודליות עדינות לגולגולת.
- צריבת ענפי הגונדל והמותני (איור 2D)
- עד 4 ענפים אחוריים או מותניים עשויים להיות נוכחים. כדי למנוע סיבוכים פוטנציאליים של איסכמיה בעמוד השדרה וצליעה, השאר את ענפי המותניים שלמים בפרוטוקול הנוכחי.
- בדוק כי 2 עד 3 ענפים צדדיים, כולל אספקת עורקי קרן הרחם דו צדדית וכלי דם hypogastric נמצאים. להבטיח הפרעה עקבית של הסניפים הראשונים הנוכחיים באופן דו-צדדי. לצרוב את הענפים הדו-צדדיים רק דיסטליים למפגש של וריד הכליה השמאלי ו- IVC (IVC אינפרא כלייתי ). ודא כי כלי ניקוז ורידי של קרן הרחם אינם משובשים.
הערה: צריבה צדדית נבחרת מכיוון ששיטה זו מספקת משטח חלק וללא הפרעה, ומפחיתה כל פוטנציאל לדימום בלתי מבוקר. יתר על כן, צריבה מהירה ואפשרית יותר מקשירת תפרים עם 10-0 תפרים. לכן, בעלי החיים ייחשפו להליך קצר ובטוח יותר.
- בדקו שוב את מהלך השופכן ואת כלי הדם כדי לוודא שאין צריבה נוטפת או לא מכוונת (איור 2C).
- קשירת IVC עם קליפסים וסקולריים בקבוצת הניסוי
- התאם אישית את אטבי כלי הדם ברוחב של תפר ניילון 2-0 על ידי מלקחיים א-טראומטיים. החל את קליפסי כלי הדם המותאמים אישית בקבוצת הניסוי סביב IVC אינפרא כלייתי.
- יש למרוח את תפסי כלי הדם על התפר. מעבר התפר הראשי מספק מישור אווסקולרי מספיק עם שתיים עד שלוש תנועות קאודליות לגולגולת קפדניות (איור 2E-F).
- עוד להעביר את קליפים כלי הדם דרך המטוס מוכן. הכינו את המישור במפגש של וריד הכליה השמאלי וה-IVC רחב מספיק כדי לאפשר מעבר קליפס ללא אירועים (איור 2E).
- מניחים את תפס כלי הדם המותאם אישית בצורה אופקית, בניצב למסלול IVC, דרך המישור המוכן. הניחו את אטבי כלי הדם מעל תפר פוליפרופילן 5-0 כדי להבטיח מספיק מקום שנותר (איור 2G).
- ודא כי השלבים לעיל מבוצעים בעדינות כדי למנוע כל נזק כלי דם או דימום באתר של קליפים כלי הדם. שימו לב לשדה הניתוחי לנטיפת פוטנציאל. יש להפעיל לחץ עדין עם קצה הכותנה על שדה הניתוח במקרה של נטיפה.
- קשירת IVC עם תפר בקבוצת הביקורת
- קשירת תפרים עם תפר פוליפרופילן 6-0. בצע תפר קשר מרובע כירורגי סביב IVC אינפרא כליות במישור מוכן מעל תפר משי 5-0.
- לאחר השלמת התפר, הסר בעדינות את תפר המשי כדי להבטיח מקום מספיק בשאריות.
- לבצע הזרקה תת עורית של 200 μL של מלוחים רגילים.
הערה: כדי לספק טכניקה דומה לחסימה חלקית של IVC עם מריחת מהדק, תפס כלי הדם מותאם אישית במחקר הנוכחי כדי לספק רווח בין השפתיים. לאחר מכן ממוקם קליפ כלי הדם במישור האווסקולרי המוכן במפגש של וריד הכליה השמאלי וה- IVC. - סגור את laparotomy עם ריצה רציפה 4-0 תפר vicryl.
5. מעקב לאחר ניתוח האינדקס
- יש להשגיח על בעל החיים ברציפות לאחר הניתוח במשך שעה אחת או עד להחזרת שיווי המשקל ויכולת התיקון, מה שמגיע ראשון בכלוב נקי ומבודד עד להחלמה מלאה.
- לפקח על החיה מדי יום במשך 2 ימים. אם בעל החיים נראה במצוקה, לפקח עליו פעמיים ביום במשך יומיים. ניהול שיכוך כאבים לאחר הניתוח ונוזלים לפי פרוטוקול.
- להמיס את מלאי buprenorphine עם ריכוז של 0.3 מ"ג / מ"ל ב 0.9% נתרן כלורי (NaCl) כדי להשיג את הריכוז של 0.03 מ"ג / מ"ל.
- יש להזריק מינון של 0.05-0.1 מ"ג/ק"ג של 0.03 מ"ג/מ"ל בופרנורפין תת עורית יחד עם 500 מיקרוליטר של 0.9% NaCl סטרילי, כל 8 עד 12 שעות במהלך 48 השעות הראשונות לאחר ניתוח המדד. בעכבר של 20 גרם, יהיה צורך ב-2 מיקרוגרם או 66 מיקרוליטר של 0.03 מ"ג/מ"ל בופרנורפין.
6. המתת חסד וקצירת IVC המכיל את הקריש
- מרדימים את העכבר בתא איזופלורן, מחזיקים את בעל החיים מבסיס הזנב ושומרים אותו על משטח הגב של היד.
- מעבירים את בעל החיים לתא השראת הרדמה רציפה מלא באיזופלורן 3%-4%. הניחו את בעל החיים במצב שכיבה.
- בצע לפרוטומיה ארוכה בקו האמצע החל מהקסיפואיד ועד לשלפוחית השתן כמתואר.
- הגדירו את המעי לצד ימין של הבטן וקצרו את ה-IVC הדיסטלי המהודק לביפורקציה האיליאק עד לרמה של IVC אינפרא-כלייתי (איור 2G).
- לאחר קצירת הקריש והגידול, יש להרדים את בעל החיים עם נקע צוואר הרחם.
7. ניתוח סטטיסטי
- הצג ניתוח סטטיסטי כממוצע, חציון וסטיית תקן (SD) או שגיאת תקן של הממוצע (SEM), אחוזון 25 או 75, או את כל טווח הערכים, כולל ערכי מינימום ומקסימום, לפי הצורך. בצע מבחן t לתלמיד, ואת מבחן F לפי הצורך. להעריך מובהקות סטטיסטית ברמת p <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לקבוצה של נקבות עכברי C57Bl6/J, בנות 8-12 שבועות, הוזרקו תאי MC-38 בשלב הלוגריתמי של גדילת התא. הקסנוגרפטים גדלו במהירות בין השבוע השלישי לרביעי לאחר ההזרקה18. ברגע שהגידולים הגיעו לנפח ממוצע של 400 מ"מ3, עכברים חולקו באופן אקראי לקבוצות הביקורת והניסוי. קבוצת הביקורת עברה קשירת IVC עם תפר, ואילו עכברי הניסוי עברו קשירת IVC עם יישום קליפס כלי דם. נפחי הגידול בקבוצת הביקורת ובקבוצות הניסוי היו דומים ללא הבדלים משמעותיים (353 ± 100 מ"מ 3 לעומת 367 ± 46.2 מ"מ3, p = 0.445). IVCs אינפרא כלייתי לנקודת הביפורקציה של הוורידים האיליאק המכילים את הקריש נקצרו לאחר 48 שעות, ומשקולות הקריש שימשו כקריאה ביולוגית של טרומבוגניות ורידית. הקורס שלאחר הניתוח בכל בעלי החיים בקבוצת הביקורת ובקבוצות הניסוי היה ללא אירועים, ללא עדות לשינוי צבע קרן הרחם, איסכמיה של שרירים ושלד או בעיות צליעה בגפה התחתונה. במהלך הלפרוטומיה השנייה, לא נצפתה תזוזה של קליפ כלי דם. לא נצפתה תמותה לפני סיום הניסויים.
משקל קריש ליחס משקל גוף מנורמל
מכיוון שעכברים עם xenograft צפויים לרדת במשקל הגוף, משקלי קרישי דם (במ"ג) נורמלו למשקל הגוף הכולל בזמן הקציר (שניהם במ"ג). עלייה של קרוב לפי 1.5 במשקלי הקריש לגוף המנורמלים נצפתה בעכברים בקבוצת הניסוי (ממוצע ± SEM, 0.002580 ± 0.00098) בהשוואה לעכברי ביקורת (0.001453 ± 0.002666, ערך P: 0.0019; איור 3).
בדיקת Immunofluorescence
ההערכה ההיסטופתולוגית שימשה לבדיקת IVC וקרישי דם. החלקים המשובצים בפרפין מהווריד האינפרא-כלייתי קאווה הוכתמו באנטי-CD31 (סמן של תאי אנדותל)20 ובאנטי-פיברין, וב-DAPI (איור 4A).
הווריד האינפרא-כלייתי קאווה מעכברי ביקורת הראה צביעת CD31 שלמה ופיברין שתופס חלקית את לומן הכלי. בקבוצת הניסוי, ביטוי CD31 לא היה שלם, מה שמרמז על נזק לתאי אנדותל וקריש גדול עם ביטוי פיברין בולט. דופן הכלי ביטאה גם צביעת פיברין (איור 4A).
עבור Immunofluorescence, נוגדן חד שבטי עכבר פיברין שימש בדילול 1:1000 והודגר בן לילה ב 4 ° C. עבור CD31, נוגדן רב-שבטי נגד CD31 ארנב מאומת עבור immunoblots ו IF (1:1000 ו 1:100 לילה ב 4 ° C) שימש. נוגדן זה ידוע כמגיב נגד עכבר, אדם וחזיר CD31. עבור IF, הנוגדנים המשניים כללו את Alex Fluor 488, 594 ו- 647 בדילול 1:250 למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
לצורך כימות תמונה, השקופית כולה נסרק על ידי מערכת במה ממונעת. התמונות עובדו ב-ImageJ, שם האות הומר לגווני אפור, והמספר והעוצמה של הפיקסלים נותחו כצפיפות משולבת. אזור הווריד סומן כאזור העניין. הצפיפות המשולבת של כל התמונות נורמלה לשטחה18.
אלה מוצגים להיות upregulated במודלים של פקקת ורידים עמוקים הקשורים לסרטן. הכימות של מספר תמונות בוצע באמצעות ניתוח צפיפות משולב, כפי שנעשה בעבר באמצעות תמונה J18. לקבוצת הביקורת היה ביטוי פיברין נמוך משמעותית בהשוואה לקבוצת הניסוי (p:0.0080; איור 4B; 174 ± 104 לעומת 503.5 ± 182.4 פירושו ± SD). יש לציין כי השונות בביטויי הפיברין הייתה נמוכה יותר בניסוי בהשוואה לקבוצת הביקורת (F statistics, DFn, Dfd: 3.074, 4, 4).
אולטרה-סאונד בגווני אפור
לאחר יומיים של ניתוח וממש לפני קציר הקריש, עכברים עברו אולטרה-סאונד בגווני אפור. עכברים בשתי הקבוצות הראו קרישי דם בווריד האינפרא-כלייתי קאווה. עם זאת, קרישי הדם היו גדולים יותר בעכברים עם אטב כלי דם. תמונות אולטרה-סאונד מייצגות מוצגות באיור 5. אזור אנכואי של כלי השיט מצביע על לומן פטנט וצפיפות היפראקואית בכלי מעידה על קריש מאורגן. הווריד האינפרא-כלייתי קאווה של עכבר מקבוצת הביקורת מראה קריש חלקי התחום על-ידי שני ראשי חץ צהובים באיור 5A. לעומת זאת, איור 5B מראה קריש דם גדול שכמעט מסתיר את הווריד האינפרא-כלייתי קאווה שנוצר באמצעות מודל קליפס כלי דם (מתואר על-ידי שני ראשי חץ צהובים ומסומן בכוכביות לבנות). יש לציין כי הווריד האינפרא-כלייתי קאווה קרס בקבוצת הביקורת בזמן שהוא הוגדל בקבוצת הניסוי, בהתאם לעומס הקריש הגדול יותר בקבוצה השנייה.
שתי הבדיקות (אולטרה-סאונד ו-IF) מצביעות על כך שלקבוצת הניסוי היו קרישי דם גדולים יותר באופן עקבי מאשר לקבוצת הביקורת.
איור 1: סכמטי המתאר את IVC-אבי העורקים ואת יישום הקליפ על מפגש וריד הכליה השמאלי (LRV)-IVC. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מודל פקקת IVC תוך ניתוחית עם יישום קליפים . (A) לפרוטומיה בקו האמצע. (B) חשיפה מלאה של IVC, כולל מפגש של וריד הכליה השמאלי עם IVC. (C) הדגמת מהלך השופכן והימנעות מכל טראומה יאטרוגנית לשופכן השמאלי. (D) צריבת ענפי הגונדל. (E) דיסקציה של IVC לנקודת מפגש הוורידים השמאלית של הכליה. (F) העברת תפר הפוליפרופילן 5-0 דרך המישור המנותח כדי להרחיב את המישור להעברת התפר. (G) העברת מהדק כלי דם דרך המישור המוכן. (H) היווצרות קריש 48 שעות לאחר הידוק IVC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: לקבוצת עכברים עם קליפסים וסקולריים לקשירת IVC, היה יחס מנורמל גבוה יותר בין משקל קריש לגוף. ממוצע יחס מנורמל בין משקל קריש לגוף. היחידה של שני הערכים המבוטאים במיליגרם. קווי שגיאה = SD. הוחל מבחן t של התלמיד. P <0.0001 לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ביטוי מוגבר של פיברין ו-CD 31 בקבוצת עכברים עם קליפסים וסקולריים לקשירת IVC. תמונות האימונופלואורסנציה המייצגות התקבלו בהגדלה של פי 100 מקבוצת הביקורת עם קשירת IVC עם תפר ומקבוצת הניסוי עם קשירת IVC עם קליפסים וסקולריים. מוצגות תמונות שנבחרו באופן אקראי לכל עכבר (N = 4 עכברים לקבוצה). (A) ביטוי פיברין ו-CD31 בקבוצות הבקרה והניסוי. שני ראשי חץ צהובים המסומנים בכוכביות לבנות מתארים את הקריש הגדול המסתיר כמעט את IVC, מה שמרמז על IVC מוסתר חלקית. (B) הצפיפות המשולבת של פיברין: הקו מייצג את הערך החציוני. בוצע מבחן T של התלמיד. p-value = 0.0080. צביעת IF של תמונות מייצגות של ורידי קאווה אינפרא-כלייניים, כולל קרישי דם בקבוצות הביקורת והניסוי ומוכתמת בנוגדנים משניים נגד CD31, ונוגדנים משניים של Alexa Fluro. מוצגת הגדלה של פי 400. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קווי שגיאה מתייחסים ל- SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שטח פנים מוגבר של קריש דם בתוך IVC מהודק חלקית בקבוצת עכברים עם קליפסים וסקולריים IVC קשירה. תמונות הסונוגרפיה בגווני אפור של קבוצת הביקורת והניסוי. (A) תמונת דופלר מייצגת בגווני אפור של קבוצת הביקורת: אזור של IVC מראה אזור אנאקואי המרמז על לומן פטנט, והחלק השני מראה אזור היפראקואי המעיד על הקריש. (B) תמונת דופלר מייצגת בגווני אפור של קבוצת הניסוי: הקריש המאורגן (כוכבית לבנה) בתוך IVC, כפי שהוא מתואר עם ראשי חץ צהובים, היה בולט יותר בקבוצת הניסוי. יתר על כן, הקריש הופיע בשני אופנים שונים בקטע הסגיטלי. קריש דם שהסתיר את חתך הרוחב המשמעותי של הלומן סומן גם בצד השני של IVC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במודל סינגני של סרטן המעי הגס, אנו רואים טרומבוגניות גבוהה יותר וביטויים גבוהים יותר של סמני קרישה בקבוצת הניסוי בהשוואה לקבוצת הביקורת. חשוב לציין כי השונות בכל הפרמטרים הללו הייתה נמוכה יותר בקבוצת הניסוי בהשוואה לקבוצת הביקורת. השינוי כלל החדרת קליפ כלי דם עם פרופיל לחץ ספציפי בנקודת המפגש של IVC ווריד הכליה השמאלי. הקליפ הונח מעל ספייסר, שהיה תפר פוליפרופילן 5-0. שינוי זה מפחית את השונות בגודל הקריש ובסמני פקקת. כל העכברים חוו 100% הישרדות.
ניואנסים טכניים
ההליך כלל תשומת לב ספציפית למספר שלבים. לאחר הלפרטומיה, שני השופכנים נבדקו ביסודיות כדי למנוע פגיעה בשוגג. כדי להשיג חשיפה אופטימלית, המעיים כוסו בגזה לחה ונשמרו ברביע העליון הימני ללא מתיחה מוגזמת. לאחר מכן, צרוב את ענפי הצד IVC במרחק של 2 עד 3 מ"מ מהשופכנים, IVC ואבי העורקים כדי למנוע נזק לורידים. לאחר הבטחת המוסטאזיס מלא, הוכן המטוס לקשירת IVC. חשוב לציין כי אבי העורקים וה- IVC בעכברים קשורים קשר הדוק לאורך מסלולם, וניסיון לנתח אותם עלול להוביל לדימום ולאובדן החיה. היוצא מן הכלל היחיד הוא וריד הכליה השמאלי ונקודת מפגש אבי העורקים21. לאחר מכן הוכן מעבר תפר באמצעות לא יותר משלוש תנועות חדות וחדות עם מלקחיים.
קוטר IVC של עכבר בן 8 עד 12 שבועות מדווח להיות בטווח של כ 0.3 עד 0.5 מ"מ. הליך קשירת IVC חלקי צריך להבטיח מקום להבדיל מקשירה מלאה. במחקר הנוכחי, שקלנו קליבר תפר 5-0, המתאים 0.10 עד 0.15 מ"מ עבור הספייסר. לכן, חלל השפה של קליפסי כלי הדם הותאם לתפר 2-0 כדי לספק מקום מתאים ל- IVC של 0.3 מ"מ וחלל של 0.1 מ"מ.
תפר הפוליפרופילן סיפק מדריך ללא דם, המאפשר להרחיב את המטוס עם קאודלית חוזרת ונשנית לתנועת הגולגולת למשך 1 עד 2 מ"מ נוספים כדי להתאים ליישום קליפסי כלי הדם. לבסוף, הונחו קליפסים וסקולריים מותאמים אישית עם חלל שנותר בשפה התואם לתפר פוליפרופילן 5-0.
הבחירה באטבי מתכת אצילים, כגון פלטינה, לסגירת כלי דם, מונעת על ידי העובדה שחומר זה אינרטי יחסית ומפחית דלקת הנגרמת על ידי חומר בהשוואה לתפרים ספציפיים נספגים ובעלי ספיגה מאוחרת22,23,24. אטבי מתכת אלה עמידים בפני תגובות כימיות, מה שהופך אותם ליציבים. זה מוביל לחלופה בטוחה ויעילה יותר עם סיכון נמוך יותר לדלקת בהשוואה לשימוש בחומרי תפרים.
רלוונטיות תרגומית של המודל
המודלים של פקקת ורידים מורין שונים במהותם מפקקת ורידים עמוקים בבני אדם. ראשית, במודלים של מכרסמים, היווצרות הקריש נצפתה בכיוון מעלה. עם זאת, VTs קליניים נוצרים במורד הזרם מ nidus25,26. שנית, יחסי סיבה ותוצאה שונים בין בני אדם למודלים של עכברים. בבני אדם, היווצרות קריש דם היא אירוע אינדקס ואחריו חסימת זרימת הדם. יוצאת דופן אחת היא תסמונת מאי-טרנר. תסמונת מאי-טרנר מתייחסת למצב רפואי שבו לחץ חיצוני מוגבר על וריד האיליאק השמאלי, הממוקם בין עמוד השדרה לעורק האיליאק הימני, מעלה את הסיכון לפקקת ורידים איליאקית שמאלית, או לקריש דם בווריד האיליאק השמאלי. במודלים של עכברים, החסימה לזרימה הוורידית היא האירוע העיקרי, הגורם לזרימת דם איטית ולהיווצרות פקקת25.
בהשוואה למודלים אחרים, כגון מודל12 לפגיעה אלקטרוליטית בווריד הירך, קיפאון IVC מציע יתרון ברור. הוא מאפשר בחינה של אמצעים טיפוליים מקומיים, כגון מסנני IVC, פקקת מכוונת קטטר והתחדשות אנדולומינלית עם מתן סביבה להיווצרות קריש דם בנוכחות זרימת הדם. בכך, נבדקות שתי זרועות של פגיעה באנדותל וקיפאון במודל זה. קרישי דם ב- IVC קשורים גם להתרחשות גבוהה יותר של סיבוכים, כגון אמבולי ריאתי. מגבלה אחת היא כי IVC הוא אתר פחות נפוץ עבור DVT בבני אדם.
מסגרת הפחתה-עידון-החלפה (3R)
חשוב לשלב את מסגרת 3Rs במודלים של בעלי חיים. השילוב של מסגרת 3R מגביל את סבלם של בעלי חיים ומקדם פרקטיקות אתיות ואחראיות של מחקר בבעלי חיים. ה-3Rs חל על הממצא הנוכחי שלנו, מאחר שלא ראינו תמותה בעכברים. כמו כן, ניתן להשתמש בפחות בעלי חיים במחקרים. לפיכך, מספר העכברים ואת העלות ניתן להפחית.
מגבלות המחקר
מגבלה אפשרית של שיטת הקליפ כוללת טווח פרופיל לחץ צר יחסית של קליפסי כלי הדם שנבדקו. בהתאם לכך, מחקרים נוספים עם מגוון רחב של פרופילי לחץ עשויים להיות מתוכננים. מחקרים קודמים הראו כי עכברים מזן מדוכא חיסון רגישים יותר להיווצרות קרישי דם, ומשקלי הקריש עשויים להיות שונים בעכברים מדוכאי חיסון12. מחקרים עתידיים מוזמנים לבחון את מידת העקביות של משקלי קריש ברקעים שונים של זני עכברים.
מסקנה
השיטה הנוכחית מספקת מדד עקבי יותר לחקר פקקת ורידים באמצעות מודל קשירת IVC חלקי. אנו מקווים כי שינוי זה יאפשר לדור של מודלים מורינים חזקים ואמינים לחקור את ההשלכות של פקקת הקשורה לסרטן באמצעות מודלים שונים של סרטן עם רלוונטיות למחלות אנושיות.
בעוד שהעבודה הנוכחית התמקדה באופן ספציפי בפקקת הקשורה לסרטן, העבודה העתידית תכלול ביצוע ניתוח מקיף של מודלים עכבריים של תחלואה נלווית שונה (כגון השמנת יתר, אי ספיקת כליות כרונית) ועכברים רגילים המגבירים את הסיכון לפקקת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי AHA קרדיו-אונקולוגיה SFRN CAT-HD CENTER GRANT 857078 (KR, VCC, XY ו- SL) ו- R01HL166608 (KR ו- VCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
References
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
- Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
- Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
- Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
- Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
- Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
- Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Cancer Research. 62 (13), 3711-3715 (2002).
- Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Research. 46 (7), 3358-3363 (1986).
- Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
- Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
- Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
- von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
- Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
- Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
- Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
- Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
- Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
- Poyyamoli, S., et al.
- Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).
