Summary
Dit artikel heeft tot doel een geoptimaliseerde methode te presenteren voor het beoordelen van veneuze trombose in een muiskankermodel, met behulp van vasculaire clips om veneuze ligatie te bereiken. Optimalisatie minimaliseert de variabiliteit in trombosegerelateerde metingen en verbetert de relevantie voor bij de mens kankergerelateerde veneuze trombose.
Abstract
Dit methodologiedocument belicht de chirurgische nuances van een knaagdiermodel van veneuze trombose, specifiek in de context van kanker-geassocieerde trombose (CAT). Diepe veneuze trombose is een veel voorkomende complicatie bij overlevenden van kanker en kan mogelijk fataal zijn. De huidige modellen voor veneuze trombose bij muizen omvatten meestal een volledige of gedeeltelijke mechanische occlusie van de inferieure vena cava (IVC) met behulp van een hechtdraad. Deze procedure induceert een volledige of gedeeltelijke stasis van bloed en endotheelschade, waardoor trombogenese ontstaat. De huidige modellen hebben beperkingen, zoals een hogere variabiliteit in stolselgewichten, een aanzienlijk sterftecijfer en een langere leercurve. Dit rapport introduceert chirurgische verfijningen met behulp van vasculaire clips om enkele van deze beperkingen aan te pakken. Met behulp van een syngeen xenotransplantaatmuismodel voor darmkanker gebruikten we op maat gemaakte vasculaire clips om de infrarenale vena cava te ligateren. Deze clips zorgen voor resterende lipruimte, vergelijkbaar met een 5-0 polypropyleen hechtdraad na IVC-ligaties. Muizen met de hechtmethode dienden als controles. De vasculaire clipmethode resulteerde in een consistente reproduceerbare partiële vasculaire occlusie en grotere stolselgewichten met minder variabiliteit dan de hechtmethode. De grotere stolselgewichten, de grotere stolselmassa en het stolsel van het IVC-luminale oppervlak werden verwacht vanwege het hogere drukprofiel van de vasculaire clips in vergelijking met een 6-0 polypropyleen hechtdraad. De aanpak werd gevalideerd door echografie met grijze schaal, die een consistent grotere stolselmassa in de infrarenale vena cava met vasculaire clips onthulde in vergelijking met de hechtmethode. Deze waarnemingen werden verder onderbouwd met de immunofluorescentiekleuring. Deze studie biedt een verbeterde methode om een veneus trombosemodel bij muizen te genereren, dat kan worden gebruikt om het mechanistische begrip van CAT te verdiepen en in translationeel onderzoek zoals het ontdekken van geneesmiddelen.
Introduction
Kanker-geassocieerde veneuze trombo-embolie (VTE)
Het risico op veneuze trombo-embolie (VTE) is 4 tot 7 keer hoger bij overlevenden van kanker in vergelijking met de algemene bevolking 1,2,3. Deze aandoening blijkt fataal bij één op de zeven patiënten met kanker. De incidentie van VTE varieert afhankelijk van het type kanker en de tumorlast en is het hoogst bij patiënten met pancreas- enmaagkanker4.
Kanker-geassocieerde VTE bij kankerpatiënten heeft een prognostische betekenis. Het wordt geassocieerd met een ongunstige algehele overleving in het eerste jaar na een diagnose van kanker, zelfs na correctie voor leeftijd, ras en stadium van onderliggende kanker5. Deze bevindingen benadrukken het belang van het onderzoeken van kankergerelateerde VTE en de noodzaak om het mechanisme ervan te onderzoeken met behulp van een diermodel. De translationele relevantie van dit gebied wordt verder benadrukt door het feit dat VTE bij kankerpatiënten te voorkomen en te behandelen is met tromboprofylaxe en antitrombotische therapie6.
Diermodellen van kanker en veneuze trombose
Kankermodellen worden conventioneel xenotransplantaten genoemd, waarbij kankercellen bij muizen worden geïnjecteerd. De injectie van kankercellen op een plaats zoals de oorsprong wordt een orthotopisch model genoemd, terwijl op een andere plaats (onderhuids vlak over de flank) bekend staat als een heterotopisch model. De soort van herkomst van kankercellen bepaalt ze als een allogeen model, zoals de HT-29-cellijn (menselijke darmkanker)7,8,9. Integendeel, syngene modellen gebruiken de muizenkankercellijnen, waaronder RenCa- en MC-38-cellijnen 3,10.
De literatuur heeft arteriële, veneuze en capillaire trombosemodellen bij knaagdieren beschreven. Veneuze trombose wordt geïnduceerd in de inferieure vena cava (IVC) door mechanisch letsel (voerdraad) of volledige IVC-ligatie, chemisch (ijzerchloride) of elektrolytisch letsel. IJzerchloride-geïnduceerde trombose of IVC-ligatie vertegenwoordigt complete occlusiemodellen. Dit laatste resulteert in de stagnatie van bloed en inflammatoire infiltraten in aderen11,12,13. Het volledige ligatiemodel resulteert in een hoge mate van trombosevorming bij 95% tot 100% van de muizen. Het partiële IVC-ligatiemodel kan onderbreking van laterale iliolumbale takken omvatten, en de veneuze terugkeer wordt opgeheven door hechtdraadligaties toe te passen in de distale doelpunten van IVC12. Soms wordt een spatiehouder gebruikt om de veneuze terugkeer gedeeltelijk te onderbreken. Het trombusgewicht is echter inconsistent in het huidige partiële occlusiemodel, wat resulteert in een hoge variabiliteit in stolselgewichten en -lengtes12,14.
Beide grote mechanische adermodellen (gedeeltelijk en volledig) hebben beperkingen. Ten eerste resulteert IVC-ligatie (stasismodel) vaak in hypotensie. Het bloed wordt door werveladers geleid. Hoewel in ervaren handen, varieert de mortaliteit met dit model van 5%-30%, waarbij het hogere percentage wordt verwacht tijdens de leercurve. Belangrijk is dat het volledige occlusiemodel geen diepe veneuze trombose (DVT) reproduceert bij mensen, waar een trombus doorgaans niet-occlusief is. Volledige occlusie zal waarschijnlijk hemorheologische factoren en farmacodynamische parameters veranderen, waardoor de biologische beschikbaarheid van verbindingen op de lokale locatie verandert. Vanwege deze beperkingen zijn volledige occlusiemodellen mogelijk niet optimaal voor het testen van nieuwe chemische verbindingen voor therapeutische doeleinden en ontdekkingen van geneesmiddelen12.
Opgemerkt moet worden dat om een meer klinisch relevant muizenmodel van veneuze trombose met verminderde stroom met endotheelschade te bieden, een veneus trombosemodel is geïntroduceerd, waarbij DVT wordt veroorzaakt door de beperking van de bloedstroom in afwezigheid van endotheelverstoring. Het model werd gevalideerd door middel van scanning-elektronenmicroscopie15. Een klinisch relevant trombosemodel dat de voorkeur geniet, is een model met bijna volledige trombose dat het mogelijk maakt geneesmiddelen te ontdekken. De stolselvorming in de huidige partiële occlusiemodellen is inconsistent, wat resulteert in een hoge variabiliteit in het gewicht en de hoogte van het stolsel12,16. Bovendien is het gewicht van het stolsel variabel bij de conventionele methoden, waardoor er meer muizen per onderzoek nodig zijn12.
Eerdere kanker-geassocieerde trombosemodellen waren gericht op darm-, pancreas- en longkanker en waren allemaal complete occlusiemodellen17,18,19. Dit manuscript wijzigt het partiële occlusietrombosemodel om stolsels te voorzien van een lagere variabiliteit en muizensterfte (Figuur 1). Eerdere studies gebruikten allogene kankercellijnen op immuungecompromitteerde athymische muizen op de achtergrond 19,20,21. Dit manuscript maakt gebruik van een MC-38 cel syngeen xenotransplantaat in C57Bl6/J muizen, wat het gebruik van immunocompetente muizen en onderzoek van immuuncomponenten voor trombogenese mogelijk maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor dit onderzoek werden 16 vrouwelijke C57Bl6/J-muizen gebruikt, 8-12 weken oud en een lichaamsgewicht van 20 tot 25 g. De muizen werden onder standaardomstandigheden gehuisvest en werden ad libitum gevoed met voer en water. Deze studie werd uitgevoerd met goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Boston. De hier beschreven open procedures werden uitgevoerd in een steriele toestand.
1. Het model van Xenograft
- Celkweek
- Voorafgaand aan heterotope subcutane implantatie, kweek MC-38-cellen als een monolaag tot 80% confluentie.
- Na trypsinisatie en resuspensie in 10% FBS-bevattende media, centrifugeer de cellen bij 277 x g, 4 °C gedurende 5 min. Resuspendeer vervolgens de cellen in serumvrije media tot een concentratie van 1 x 104 MC-38 cellen/μL serumvrije media.
- Voor trypsinisatie kweekt u de MC-38-cellen totdat ze een gewenste samenvloeiing bereiken (meestal ongeveer 70%-80%) en zuigt u vervolgens het kweekmedium uit de petrischaal.
- Voeg 1 ml trypsine-EDTA-oplossing toe en incubeer de cellen met trypsine gedurende 1 minuut bij 37 °C om loslating mogelijk te maken. Tik of schud zachtjes op de petrischaal om ervoor te zorgen dat deze gelijkmatig loskomt.
- Voeg een kweekmedium toe dat serum of een trypsineremmer bevat om de activiteit te neutraliseren en verdere celdissociatie te voorkomen. Verzamel de losgemaakte cellen samen met de geneutraliseerde trypsine-oplossing.
- Voor resuspensie, zodra de cellen zijn losgemaakt door trypsinisatie, bereid ze voor op transplantatie of verdere experimenten. Centrifugeer de opgevangen celsuspensie bij 277 x g om de cellen te pelleteren.
- Verwijder voorzichtig het supernatans (vloeistof boven de celkorrel). Voeg 9 ml kweekmedium, buffer of oplossing toe aan de celpellet om de gewenste celconcentratie voor transplantatie of experimenten te bereiken.
- Resuspendeer de cellen voorzichtig door op en neer te pipetteren of door een kweekflesshaker te gebruiken. Vermijd krachtig pipetteren dat de cellen kan beschadigen.
OPMERKING: Afhankelijk van de gebruikte variant of cellijn kunnen cellen worden geresuspendeerd in een verhouding van 1:1 van opgeloste basale membraanmatrix en serumvrije media om de groei en verspreiding van zeer agressieve muizencellen na implantatie te vertragen. Alle celkweekstappen moeten worden uitgevoerd in een volledig aseptische kap in een speciaal toegewezen celkweekruimte en moeten regelmatig op mycoplasma worden getest.
- Tel de cellen met een geautomatiseerde celteller volgens het meegeleverde handmatige protocol.
- Celimplantatie
- Wijs willekeurig acht muizen toe aan de experimentele groep en acht muizen aan de controlegroep als volgt. Gebruik in de controlegroep muizen met MC38-xenotransplantaat en voer IVC-ligatie uit met een polypropyleen 5-0-hechtdraad. Gebruik in de experimentele groep muizen met MC38 xenotransplantaat en voer IVC-ligatie uit met een aangepaste vasculaire clip.
- Plaats de muis in de linker zijligging en scheer de rechterkant tussen de voor- en achterpoten. Breng alcohol en jodium aan langs het dorsale lumbale gebied om het gebied aseptisch voor te bereiden op injectie.
- Injecteer met een naald van 27 G 2 x 106 MC-38-cellen, bereid in 200 μl medium, subcutaan in de flank, halverwege tussen de meest distale rib en het bekken van het dier, terwijl u het dier voorzichtig in de niet-dominante hand houdt.
- Inspecteer de dieren na de injectie zorgvuldig en zet ze terug in de kooi. De dieren moeten worden geïnspecteerd op het volgende: 1. Veranderingen in gedrag, activiteitsniveaus en algehele mobiliteit van de muizen. Significante veranderingen kunnen duiden op ongemak of gezondheidsproblemen. 2. De algemene fysieke conditie van de muizen, met inbegrip van de kwaliteit van de vacht, de verzorgingsgewoonten en eventuele zichtbare tekenen van angst of afwijkingen 3. Terugkeer naar voedselconsumptie en waterinname 4. Eventuele veranderingen in hun activiteitenniveau, houding of interacties met kooigenoten. Lethargie of verhoogde agressie kunnen tekenen van angst zijn.
2. Opvolging van tumorgroei
- Controleer de dieren tweewekelijks op tumorgroeitrends gedurende 3-4 weken. Meet de tumoren met een schuifmaat en noteer de afmetingen van de tumor.
- Meet de tumoren langs hun langste as (L) en de as loodrecht op de lange as (W). Bereken het tumorvolume (V) met behulp van de vergelijking L x (W2) = V. Als de tumorgrootte in elke dimensie groter is dan 20 mm en/of de tumor tekenen van ulceratie vertoont, euthanaseer de dieren dan voordat het experiment wordt beëindigd.
- Zodra het tumorvolume 400 mm3 bereikt, moet u van plan zijn de muizen te gebruiken voor IVC-ligatie.
3. Anesthesie en voorbereiding
- Verdoof de muis in een isofluraankamer en injecteer de pijnstiller subcutaan: Houd het dier vast vanaf de basis van de staart. Houd het dier op het rugoppervlak van de niet-dominante hand.
- Breng het dier over naar de inductiekamer voor continue anesthesie, gevuld met 3%-4% isofluraan. Bevestig adequate algemene anesthesie met de afwezigheid van een teenknijpreflex. Gebruik een onderhoudsdosis van 1%-3% isofluraan. Breng dierenartszalf aan op beide ogen.
- Subcutane injectie met buprenorfine (opioïde voor pijnvermindering): Los de voorraad buprenorfine op in een concentratie van 0,3 mg/ml in 0,9% natriumchloride (NaCl) om de concentratie van 0,03 mg/ml te bereiken.
- Injecteer een dosering van 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml buprenorfine samen met 500 μL steriele 0,9% NaCl subcutaan vóór de operatie. In een hoeveelheid van 20 g muizen is een hoeveelheid van 2 μg of 66 μl van 0,03 mg/ml buprenorfine vereist.
- Voorbereiding van de huid: Plaats de volledig verdoofde muis in rugligging over de verwarmingsdeken. Desinfecteer de voorste buikstreek met 0,5% chloorhexidinetinctuur, 2x. Controleer tijdens de procedure regelmatig de temperatuur van de verwarmingsdeken en zorg ervoor dat de temperatuur niet daalt.
4. IVC-ligatie
- Laparotomie op de middellijn
- Snijd de buikhuid in met een fijne schaar, beginnend bij de xiphoidale eminentie tot aan de blaas. Knijp het buikvlies halverwege de huidincisie met een atraumatische pincet. Zorg voor voldoende ruimte tussen de incisie en de bovenliggende darmen (figuur 2A).
- Open het peritoneum op een longitudinale manier samen met avasculaire linea alba.
- Exterioriseren van de darmen naar de rechterbuikzijde
- Trek aan de darmen met natte wattenstaafjes. Bedek de darmen met een volledig vochtig steriel gaasje. Zorg ervoor dat de bedekte darmen zich in een tractievrije richting bevinden zonder overmatige tractie op de mesenteriale vaten.
- Volledige blootstelling van de IVC en vertakkingen, inclusief de samenvloeiing van de linker nierader met de IVC (Figuur 2B).
- Laat 200-300 μL normale zoutoplossing vallen. Verken het verloop van de urineleiders, IVC, aorta en nieraderen (Figuur 2).
- Avasculair vlak op het samenvloeiingspunt van de infrarenale IVC en de samenvloeiing van de linker nierader.
- Steek de polypropyleen 6-0 hechting voorzichtig 2x-3x door het avasculaire vlak met caudale tot cephalad-bewegingen met de atraumatische pincet met gesloten punt.
- Zorg ervoor dat minimaal sijpelen onder controle wordt gehouden met zachte druk die wordt geleverd met een tamponnade met wattenstaafjes. Verbreed het meegeleverde vlak door de 6-0 polypropyleen hechtdraad te passeren met zachte caudale tot craniale bewegingen.
- Cauteriseren van de gonadale en lumbale takken (Figuur 2D)
- Er kunnen maximaal 4 achterste of lumbale takken aanwezig zijn. Om mogelijke complicaties van spinale ischemie en claudicatio te voorkomen, moet u de lumbale takken intact laten in het huidige protocol.
- Controleer of er 2 tot 3 zijtakken aanwezig zijn, waaronder de bilaterale arteriële toevoer van de baarmoederhoorn en hypogastrische vaten. Zorg voor een consistente verstoring van de eerste bilateraal aanwezige vestigingen. Cauteriseer de bilaterale takken net distaal van de samenvloeiing van de linker nierader en IVC (infra-renale IVC). Zorg ervoor dat de veneuze drainerende vaten van de baarmoederhoorn niet worden verstoord.
OPMERKING: Er wordt gekozen voor cauterisatie van de zijtakken omdat deze methode een glad en ononderbroken oppervlak biedt, waardoor de kans op ongecontroleerde bloedingen wordt verkleind. Bovendien is cauterisatie sneller en haalbaarder dan hechtingsligatie met 10-0 hechtingen. Daarom zullen de dieren worden blootgesteld aan een kortere en veiligere procedure.
- Controleer nogmaals het verloop van de urineleiders en het vaatstelsel om er zeker van te zijn dat er geen sijpelen of onbedoeld dichtschroeien is (Figuur 2C).
- IVC-ligatie met vasculaire clips in de experimentele groep
- Pas de vasculaire clips aan met een breedte van 2-0 nylon hechting door een atraumatische pincet. Breng de op maat gemaakte vaatclips in de experimentele groep rondom de infrarenale IVC aan.
- Breng de vaatklemmen aan over de hechting. De primaire hechtingspassage biedt een voldoende avasculair vlak met twee tot drie nauwgezette caudale tot craniale bewegingen (Figuur 2E-F).
- Leid de vasculaire clips verder door het voorbereide vlak. Bereid het vlak voor op de samenvloeiing van de linker nierader en IVC die breed genoeg zijn om een rustige clippassage mogelijk te maken (Figuur 2E).
- Plaats de op maat gemaakte vaatclip horizontaal, loodrecht op het IVC-verloop, door het voorbereide vlak. Plaats de vasculaire clips over de 5-0 polypropyleen hechtdraad om ervoor te zorgen dat er voldoende resterende ruimte is (Figuur 2G).
- Zorg ervoor dat de bovenstaande stappen voorzichtig worden uitgevoerd om beschadiging van de bloedvaten of bloedingen op de plaats van de vaatklemmen te voorkomen. Observeer het operatieveld op mogelijke sijpeling. Oefen lichte druk uit met de wattenstaaf op het operatieveld in geval van sijpelen.
- IVC-ligatie met hechting in de controlegroep
- Hechtingsligatie met 6-0 polypropyleen hechtdraad. Maak een chirurgische vierkante knoophechting rond de infra-renale IVC in het voorbereide vlak over een 5-0 zijden hechtdraad.
- Zodra de hechting is voltooid, verwijdert u voorzichtig de zijden hechtdraad om ervoor te zorgen dat er voldoende restruimte is.
- Voer een subcutane injectie uit van 200 μL normale zoutoplossing.
OPMERKING: Om een vergelijkbare techniek te bieden voor gedeeltelijke IVC-occlusie met klemtoepassing, wordt de vasculaire clip in het huidige onderzoek aangepast om ruimte tussen de lippen te bieden. De vasculaire clip wordt vervolgens in het voorbereide avasculaire vlak geplaatst in de samenvloeiing van de linker nierader en IVC. - Sluit de laparotomie met continu lopende 4-0 vicryl hechtdraad.
5. Follow-up na de indexoperatie
- Bewaak het dier continu na de operatie gedurende 1 uur of totdat het evenwicht en het oprichtvermogen zijn hersteld, wat het eerst komt in een geïsoleerde, schone kooi totdat het volledig hersteld is.
- Houd het dier gedurende 2 dagen dagelijks in de gaten. Als het dier er verontrust uitziet, controleer het dan twee keer per dag gedurende 2 dagen. Dien postoperatieve analgesie en vloeistoffen toe volgens protocol.
- Los de voorraad buprenorfine met een concentratie van 0,3 mg/ml op in 0,9% natriumchloride (NaCl) om de concentratie van 0,03 mg/ml te bereiken.
- Injecteer een dosering van 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml buprenorfine subcutaan samen met 500 μL steriele 0,9% NaCl, elke 8 tot 12 uur gedurende de eerste 48 uur na de indexoperatie. In een muis van 20 g zou 2 μg of 66 μL van 0,03 mg/ml buprenorfine nodig zijn.
6. Euthanasie en het oogsten van de IVC met het stolsel
- Verdoof de muis in een isofluraankamer, houd het dier vast vanaf de basis van de staart en houd het dier op het dorsumoppervlak van uw hand.
- Breng het dier over naar de inductiekamer voor continue anesthesie, gevuld met 3%-4% isofluraan. Leg het dier in rugligging.
- Voer een lange laparotomie op de middellijn uit, beginnend bij de xiphoid tot de blaas, zoals beschreven.
- Exterioriseer de darm naar de rechterkant van de buik en oogst de geklemde IVC distaal van de iliacale bifurcatie in de mate van infrarenale IVC (Figuur 2G).
- Na de oogst van stolsels en tumoren, euthanaseert u het dier met cervicale dislocatie.
7. Statistische analyse
- Presenteer statistische analyse als het gemiddelde, de mediaan en de standaarddeviatie (SD) of de standaardfout van het gemiddelde (SEM), het 25e of 75e percentiel, of het volledige bereik van waarden, inclusief minimum- en maximumwaarden, naargelang het geval. Voer een Student t-toets uit, en de F-toets indien van toepassing. Beoordeel de statistische significantie op het niveau van p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een groep vrouwelijke C57Bl6/J-muizen, 8-12 weken oud, werd geïnjecteerd met MC-38-cellen in de logaritmische fase van de celgroei. De xenotransplantaten groeiden snel tussen de derde en vierde week na injectie18. Zodra de tumoren een gemiddeld volume van 400 mm3 bereikten, werden muizen gerandomiseerd naar de controle- en experimentele groepen. De controlegroep onderging IVC-ligatie met hechtdraad, terwijl de experimentele muizen werden onderworpen aan IVC-ligatie met vasculaire cliptoepassing. De tumorvolumes in de controlegroep en de experimentele groep waren vergelijkbaar zonder significante verschillen (353 ± 100 mm3 vs. 367 ± 46,2mm3, p = 0,445). Infrarenale IVC's naar het bifurcatiepunt van de iliacale aderen dat het stolsel bevatte, werden na 48 uur geoogst en de stolselgewichten dienden als de biologische uitlezing van veneuze trombogeniciteit. Het postoperatieve beloop bij alle dieren in controle- en experimentele groepen verliep rustig, zonder bewijs van verkleuring van de baarmoederhoorn, musculoskeletale ischemie of claudicatio problemen in de onderste ledematen. Tijdens de tweede laparotomie werd geen verplaatsing van de vasculaire clip waargenomen. Er werd geen sterfte waargenomen vóór de beëindiging van de experimenten.
Verhouding tussen stollingsgewicht en genormaliseerd lichaamsgewicht
Omdat muizen met xenotransplantaat waarschijnlijk lichaamsgewicht verliezen, werden de stolselgewichten (in mg) genormaliseerd tot het totale lichaamsgewicht op het moment van oogst (beide in mg). Bijna een 1,5-voudige toename van het genormaliseerde stolsel-tot-lichaamsgewichtgewicht werd waargenomen bij muizen in de experimentele groep (gemiddelde ± SEM, 0,002580 ± 0,00098) in vergelijking met controlemuizen (0,001453 ± 0,002666, P-waarde: 0,0019; Figuur 3).
Immunofluorescentie-test
De histopathologische evaluatie werd gebruikt om de IVC en stolsels te onderzoeken. De in paraffine ingebedde secties van infrarenale vena cava werden gekleurd met anti-CD31 (een marker van endotheelcellen)20 en anti-fibrine, en DAPI (Figuur 4A).
De infrarenale vena cava van controlemuizen vertoonde intacte CD31-kleuring en fibrine die gedeeltelijk het lumen van het vat bezette. In de experimentele groep was de CD31-expressie niet intact, wat wijst op endotheelcelbeschadiging en een groot stolsel met prominente fibrine-expressie. De vaatwand vertoonde ook fibrinekleuring (figuur 4A).
Voor immunofluorescentie werd monoklonaal antilichaam van fibrine-muizen gebruikt bij een verdunning van 1:1000 en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C. Voor CD31 werd een polyklonaal anti-CD31-antilichaam bij konijnen gebruikt, gevalideerd voor immunoblots en IF (1:1000 en 1:100 's nachts bij 4 °C). Van dit antilichaam is bekend dat het reageert tegen CD31 van muizen, mensen en varkens. Voor IF bestonden de secundaire antilichamen uit Alex Fluor 488, 594 en 647 bij een verdunning van 1:250 gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
Voor de kwantificering van het beeld werd de hele dia gescand door een gemotoriseerd podiumsysteem. De beelden werden verwerkt in ImageJ, waar het signaal werd omgezet in grijstinten, en het aantal en de intensiteit van de pixels werden geanalyseerd als geïntegreerde dichtheid. Het gebied van de ader werd gemarkeerd als het interessegebied. De geïntegreerde dichtheid van alle beelden werd genormaliseerd naar het gebied18.
Deze blijken te worden opgereguleerd in modellen van kanker-geassocieerde diepe veneuze trombose. De kwantificering van verschillende beelden werd uitgevoerd met behulp van geïntegreerde dichtheidsanalyse, zoals eerder gedaan met behulp van afbeelding J18. De controlegroep had een significant lagere fibrine-expressie in vergelijking met de experimentele groep (p:0,0080; Figuur 4B; 174 ± 104 vs. 503,5 ± 182,4 gemiddelde ± SD). Opmerkelijk is dat de varianties in de Fibrine-expressies lager waren in de experimentele in vergelijking met de controlegroep (F-statistieken, DFn, Dfd: 3.074, 4, 4).
Echografie in grijstinten
Na 2 dagen operatie en net voor de oogst van stolsels ondergingen muizen echografie in grijstinten. Muizen in beide groepen vertoonden stolsels in de infrarenale vena cava. De stolsels waren echter groter bij de muizen met vasculaire clip. Representatieve echografiebeelden worden weergegeven in figuur 5. Een echovrij gebied van het vat suggereert een open lumen en een hyperechoïsche dichtheid in het vat is indicatief voor een georganiseerd stolsel. De geligeerde infrarenale vena cava van een muis uit de controlegroep vertoont een gedeeltelijk stolsel dat wordt afgebakend door twee gele pijlpunten in figuur 5A. Figuur 5B toont daarentegen een groot stolsel dat bijna de infrarenale vena cava afsluit, gegenereerd met een vasculair clipmodel (afgebeeld door twee gele pijlpunten en gemarkeerd door witte sterretjes). Merk op dat de infrarenale vena cava instortte in de controlegroep terwijl deze werd vergroot in de experimentele groep, in overeenstemming met de grotere stolsellast in de laatste groep.
Beide tests (echografie en IF) suggereren dat de experimentele groep consistent grotere stolsels had dan de controlegroep.
Figuur 1: Een schema van de IVC-Aorta en de toepassing van de clip over de samenvloeiing van de linker nierader (LRV)-IVC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Intraoperatief IVC-trombosemodel met clips. (A) Laparotomie op de middellijn. (B) Volledige blootstelling van de IVC, inclusief de samenvloeiing van de linker nierader met de IVC. (C) Het demonstreren van het urineleiderverloop en het vermijden van iatrogeen trauma aan de linker urineleider. (D) Het dichtschroeien van de gonadale takken. (E) Dissectie van de IVC naar het linker samenvloeiingspunt van de nierader. (F) De 5-0 polypropyleen hechtdraad door het ontlede vlak halen om het vlak voor het passeren van de hechting te verbreden. (G) Het passeren van een vasculaire klem door het voorbereide vlak. (H) Stolselvorming 48 uur na de IVC-klemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De groep muizen met vasculaire clips IVC-ligatie, had een hogere genormaliseerde verhouding tussen stolsel en lichaamsgewicht. Gemiddelde genormaliseerde verhouding tussen stolsel en lichaamsgewicht. De eenheid van beide waarden, uitgedrukt in milligram. Foutbalken = SD. De t-toets van de student is toegepast. P <0,0001 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verhoogde fibrine- en CD 31-expressie in een groep muizen met vasculaire clips IVC-ligatie. De representatieve immunofluorescentiebeelden verkregen bij een vergroting van 100x van de controlegroep met IVC-ligatie met hechting en van de experimentele groep met IVC-ligatie met vasculaire clips. Getoond worden willekeurig geselecteerde beelden per muis (N= 4 muizen/groep). (A) Fibrine- en CD31-expressie in de controlegroep en de experimentele groep. Twee gele pijlpunten gemarkeerd met witte sterretjes tonen het grote stolsel dat IVC bijna afsluit, dat impliceert de gedeeltelijk afgesloten IVC. (B) De geïntegreerde dichtheid van fibrine: De lijn vertegenwoordigt de mediaanwaarde. De T-toets van de student is uitgevoerd. p-waarde = 0,0080. IF-kleuring van representatieve infrarenale vena cava-beelden, inclusief stolsels in de controle- en experimentele groepen en gekleurd met anti-CD31, en Alexa Fluro secundaire antilichamen. Er wordt een vergroting van 400x weergegeven. Schaalbalken = 100 μm. Foutbalken verwijzen naar de SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Vergroot stollingsoppervlak binnen de gedeeltelijk geklemde IVC in een groep muizen met vasculaire clips IVC-ligatie. De representatieve echografiebeelden in grijstinten van de controle- en experimentele groep. (A) Representatief grijswaarden Doppler-beeld van de controlegroep: Een gebied van IVC toont een echovrij gebied dat doet denken aan het open lumen, en het andere deel vertoont een hyperechoïsch gebied dat wijst op het stolsel. (B) Representatief grijswaarden Doppler-beeld van de experimentele groep: Het georganiseerde stolsel (witte sterretje) binnen de IVC, zoals afgebeeld met gele pijlpunten, was prominenter aanwezig in de experimentele groep. Bovendien verscheen het stolsel op twee verschillende manieren in de sagittale sectie. Aan de andere kant van IVC werd ook een stolsel afgebakend dat de significante dwarsdoorsnede van het lumen afsloot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In een syngeen xenotransplantaat-darmkankermodel zien we een hogere trombogeniciteit en expressie van stollingsmarkers in de experimentele groep in vergelijking met de controlegroep. Belangrijk is dat de variantie in al deze parameters lager was in de experimentele groep in vergelijking met de controlegroep. De modificatie omvatte het inbrengen van een vasculaire clip met een specifiek drukprofiel op het samenvloeiingspunt van de IVC en de linker nierader. De clip werd over een afstandhouder geplaatst, wat een 5-0 polypropyleen hechtdraad was. Deze modificatie vermindert de variabiliteit in stolselgrootte en trombosemarkers. Alle muizen ervoeren 100% overleving.
Technische nuances
De procedure omvatte specifieke aandacht voor verschillende stappen. Na laparotomie werden beide urineleiders grondig geïnspecteerd om onbedoeld letsel te voorkomen. Om een optimale belichting te bereiken, werden de darmen bedekt met vochtig gaas en in het rechter bovenste kwadrant gehouden zonder overmatige tractie. Vervolgens werden de IVC-zijtakken op 2 tot 3 mm afstand van de urineleiders, IVC en aorta dichtgeschroeid om schade aan aderen te voorkomen. Na volledige hemostase te hebben verzekerd, werd het vliegtuig voor IVC-ligatie voorbereid. Het is belangrijk op te merken dat de aorta en IVC bij muizen nauw met elkaar verbonden zijn tijdens hun beloop, en pogingen om ze te ontleden kunnen leiden tot bloedingen en verlies van het dier. De enige uitzondering is de linker nierader en aorta samenvloeiing punt21. Vervolgens werd een hechtdraad voorbereid met niet meer dan drie nauwgezette, scherpe divergerende bewegingen met een tang.
De IVC-diameter van een muis van 8 tot 12 weken oud ligt naar verluidt in het bereik van ongeveer 0,3 tot 0,5 mm. De partiële IVC-ligatieprocedure moet ruimte bieden om onderscheid te maken tussen volledige ligatie. In de huidige studie hebben we een 5-0 hechtkaliber overwogen, wat overeenkomt met 0,10 tot 0,15 mm voor de afstandhouder. Daarom werd de lipruimte van de vasculaire clips aangepast voor een 2-0 hechting om voldoende ruimte te bieden voor een IVC van 0,3 mm en een ruimte van 0,1 mm.
De polypropyleen hechtdraad zorgde voor een bloedeloze geleiding, waardoor het vlak kon worden verbreed met repetitieve caudaal ten opzichte van de schedelbeweging voor nog eens 1 tot 2 mm om de toepassing van de vasculaire clips mogelijk te maken. Ten slotte werden de op maat gemaakte vaatclips geplaatst met een resterende lipruimte die compatibel is met een 5-0 polypropyleen hechtdraad.
De keuze voor edele metalen clips, zoals platina, voor het afsluiten van bloedvaten, wordt gedreven door het feit dat dergelijk materiaal relatief inert is en door materiaal veroorzaakte ontstekingen vermindert in vergelijking met specifieke resorbeerbare en vertraagd resorbeerbare hechtingen22,23,24. Deze metalen clips zijn bestand tegen chemische reacties, waardoor ze stabiel zijn. Dit leidt tot een veiliger en effectiever alternatief met een lager risico op ontstekingen in vergelijking met het gebruik van hechtmaterialen.
Translationele relevantie van het model
De veneuze trombosemodellen bij muizen verschillen fundamenteel van diepe veneuze trombose bij mensen. Ten eerste wordt in knaagdiermodellen de stolselvorming in stroomopwaartse richting waargenomen. Klinische VT's worden echter stroomafwaarts gevormd van een nidus25,26. Ten tweede zijn de oorzaak-gevolgrelaties verschillend tussen mensen en muismodellen. Bij mensen is stolselvorming de indexgebeurtenis gevolgd door obstructie van de bloedstroom. Een uitzondering is het May-Thurner syndroom. Het May-Thurner-syndroom verwijst naar een medische aandoening waarbij verhoogde externe druk op de linker iliacale ader, gelegen tussen de wervelkolom en de rechter iliacale slagader, het risico op trombose van de linker iliacale ader of een bloedstolsel in de linker iliacale ader verhoogt. In muismodellen is de obstructie van de veneuze stroom de primaire gebeurtenis, wat resulteert in een trage bloedstroom en trombusvorming25.
In vergelijking met andere modellen, zoals het femurader elektrolytisch letsel model12, biedt IVC-stasis een duidelijk voordeel. Het maakt onderzoek mogelijk van lokale therapeutische maatregelen, zoals IVC-filters, kathetergerichte trombolyse en endoluminale rekanalisatie met het bieden van een omgeving voor stolselvorming in aanwezigheid van bloedstroom. Daarbij worden in dit model twee armen van het endotheelletsel en de stasis onderzocht. Stolsels bij IVC worden ook in verband gebracht met een hoger optreden van complicaties, zoals longembolieën. Een beperking is dat IVC een minder vaak voorkomende plaats is voor DVT bij mensen.
Reductie-Verfijning-Vervanging (3V) raamwerk
Het is belangrijk om het 3V-raamwerk te integreren in diermodellen. De integratie van het 3V-kader beperkt dierenleed en bevordert ethische en verantwoorde praktijken op het gebied van dierproeven. De 3V's zijn van toepassing op onze huidige bevinding, aangezien we geen sterfte bij muizen hebben waargenomen. Ook is het mogelijk om minder dieren te gebruiken in studies. Zo kunnen het aantal muizen en de kosten worden verlaagd.
Beperkingen van de studie
Een mogelijke beperking van de clipmethode is een relatief smal drukprofielbereik van de geteste vaatclips. Dienovereenkomstig kunnen verdere studies met een breed scala aan drukprofielen worden opgezet. Eerdere studies hebben aangetoond dat immuungecompromitteerde stammuizen vatbaarder zijn voor stolselvorming en dat de stolselgewichten kunnen verschillen bij immunocompetente muizen12. Toekomstige studies worden aangemoedigd om de mate van consistentie van stolselgewichten in verschillende achtergronden van muizenstammen te onderzoeken.
Conclusie
De huidige methode biedt een meer consistente maat voor veneuze trombosestudie via een partieel IVC-ligatiemodel. We hopen dat deze aanpassing het mogelijk zal maken om robuuste en betrouwbare muizenmodellen te genereren om de gevolgen van kanker-geassocieerde trombose te onderzoeken met behulp van verschillende kankermodellen die relevant zijn voor ziekten bij de mens.
Hoewel het huidige werk specifiek gericht was op kanker-geassocieerde trombose, zal het toekomstige werk het uitvoeren van een uitgebreide analyse inhouden van muismodellen van verschillende comorbiditeiten (zoals obesitas, chronisch nierfalen) en normale muizen die het risico op trombose vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center-subsidie 857078 (KR, VCC, XY en SL) en R01HL166608 (KR en VCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
References
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
- Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
- Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
- Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
- Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
- Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
- Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Cancer Research. 62 (13), 3711-3715 (2002).
- Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Research. 46 (7), 3358-3363 (1986).
- Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
- Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
- Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
- von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
- Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
- Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
- Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
- Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
- Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
- Poyyamoli, S., et al.
- Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).
