Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Методология метаболически инактивировать бактерии для исследования Caenorhabditis elegans

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65775
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Molecular and Integrative Physiology Department, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

Источником пищи для Caenorhabditis elegans в лаборатории является живая кишечная палочка. Поскольку бактерии метаболически активны, они представляют собой искажающую переменную в метаболических и лекарственных исследованиях C. elegans. Подробный протокол метаболической инактивации бактерий с использованием параформальдегида описан здесь.

Abstract

Caenorhabditis elegans является распространенным модельным организмом для исследований в области генетики, развития, старения, метаболизма и поведения. Поскольку C. elegans потребляют пищу из живых бактерий, метаболическая активность их источника пищи может запутать эксперименты, направленные на изучение прямого воздействия различных вмешательств на червя. Чтобы избежать сбивающих с толку эффектов бактериального метаболизма, исследователи C. elegans использовали несколько методов метаболической инактивации бактерий, включая ультрафиолетовое (УФ)-облучение, тепловое убийство и антибиотики. УФ-обработка имеет относительно низкую пропускную способность и не может быть использована в жидких культурах, поскольку каждая пластина должна быть исследована на предмет успешного уничтожения бактерий. Второй метод обработки, тепловое умерщвление, отрицательно влияет на текстуру и питательные качества бактерий, что приводит к остановке развития C. elegans. Наконец, лечение антибиотиками может напрямую изменить физиологию C. elegans в дополнение к предотвращению роста бактерий. В данной статье описывается альтернативный метод метаболической инактивации бактерий с использованием параформальдегида (PFA). Лечение PFA сшивает белки в бактериальных клетках, чтобы предотвратить метаболическую активность, сохраняя при этом клеточную структуру и содержание питательных веществ. Этот метод является высокопроизводительным и может быть использован в жидких культурах или твердых планшетах, так как тестирование одной пластины бактерий, обработанных PFA, на рост проверяет всю партию. Метаболическая инактивация с помощью лечения PFA может быть использована для устранения искажающих эффектов бактериального метаболизма в исследованиях лекарственного или метаболитного приема добавок, стрессоустойчивости, метаболомики и поведения C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans был первоначально предложен в качестве модельного организма в 1965 году1 и с тех пор широко используется в исследованиях генетики, развития, поведения, старенияи метаболизма. Благодаря большому размеру выводка и прозрачной кутикуле C. elegans особенно хорошо подходит для высокопроизводительного скрининга с флуоресцентными репортерами3. Их короткий жизненный цикл, гермафродитное размножение и генетическая гомология с человеком также делают C. elegans ценной модельной системой для исследований развития4 и биологии старения5. Кроме того, C. elegans относительно просты в уходе. Червей можно выращивать в жидкой культуре или на твердых агаровых планшетах и потреблять пищу из живых бактерий Escherichia coli OP504.

Тем не менее, живой источник пищи C. elegans может запутать исследования метаболизма, добавок лекарств и поведения. Поскольку живые бактерии имеют свой собственный метаболизм, экспериментальные условия, влияющие на бактерии, также изменяют питательные вещества и метаболиты, доступные червям. Например, различия в концентрациях бактериального железа, аминокислот и фолиевой кислоты оказывают различное влияние на развитие, физиологию и продолжительность жизни C. elegans. Многие распространенные лабораторные практики могут вызвать такие изменения в составе питательных веществ и метаболитах, продуцируемых OP50. В частности, воздействие 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUdR), соединения, обычно используемого для предотвращения размножения у C. elegans, вызывает широкие изменения в экспрессии гена OP50, включая пути биосинтеза аминокислот7. Живые бактерии также могут запутать исследования, в которых C. elegans дополняют малыми молекулами, потому что бактерии могут частично или полностью метаболизировать активные соединения. Более того, воздействие этих малых молекул на бактерии может, в свою очередь, изменить физиологию C. elegans, как это было показано с препаратом для продления жизни метформином8. Наконец, живые бактерии могут изменять среду обитания червя таким образом, что это изменяет его поведение, например, выделять привлекательные пахучие вещества9, вырабатывать экзогенные нейромодуляторы10 и создавать кислородные градиенты в густом бактериальном газоне11.

Чтобы смягчить влияние бактериального метаболизма на исследования C. elegans , было разработано несколько методов уничтожения бактерий (табл. 1). Тремя распространенными стратегиями уничтожения OP50 являются УФ-облучение, тепловое умерщвление и лечение антибиотиками. Несмотря на то, что каждый из этих методов прост и относительно недорог, он может оказывать нежелательное воздействие как на бактерии, так и на C. elegans. Уничтожение УФ-излучения с помощью УФ-сшивателя12 имеет низкую пропускную способность, и скорость ограничена количеством пластин, которые могут поместиться в УФ-сшиватель. Кроме того, эффективность УФ-уничтожения может варьироваться от планшета к планшету в рамках партии, и тестирование роста на всех планшетах может стать затруднительным в больших экспериментах. Термическое уничтожение OP50 путем воздействия культуры при температуре >60 °C сопряжено с рядом проблем. Высокая температура может повредить питательные вещества, необходимые для червя, и разрушить клеточную структуру бактерий, создавая более мягкую текстуру, которая уменьшает количество времени, которое черви проводят на пище13. Этот метод также не может быть использован на протяжении всего жизненного цикла C. elegans , потому что черви, которых кормят бактериями, убитыми теплом, могут останавливаться на раннихстадиях развития. Лечение антибиотиками является третьим распространенным методом подавления бактериального метаболизма14, но антибиотики также могут изменять рост и метаболизм червей15.

Одним из решений для устранения метаболических эффектов живых бактерий при сохранении бактериальной структуры и основных питательных веществ является уничтожение OP50 параформальдегидом (PFA)16. PFA представляет собой полимер формальдегида, который может сшивать белки в клетках17 для предотвращения репликации бактерий без разрушения внутренних клеточных структур, таких как внутренняя плазматическая мембрана18. Благодаря сохранению внутренней клеточной структуры, бактерии, обработанные PFA, не проявляют роста или метаболической активности, но остаются съедобным и богатым питательными веществами источником пищи для C. elegans16. Здесь представлен подробный протокол, который показывает, как метаболически инактивировать бактерии с помощью параформальдегида.

Метод Необходимые материалы Масштабируемый? Питательный? Влияние на червя?
УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫЙ УФ-сшиватель Ограничено: Да Вариабельное влияние на продолжительность жизни NGM12, 23, 24
Количество пластин, которые помещаются в УФ-сшиватель Переменное влияние на срок службы FUdR24, 26, 27
Время облучения на пластину Снижение предпочтений в еде16
Возможность проверить каждую пластину на рост8
Жара Инкубатор >60 °C Да Нет: разрушает клеточную стенку, снижается пищевая ценность Остановка развития 13
Снижение предпочтений в еде13
Продлевает срок службы NGM31
Антибиотики Антибиотики (канамицин, карбенициллин и др.) Да Да Задержки роста и развития15
Продлевает срок службы в жидких средах19
Продлевает срок службы NGM15
ПФА 0,5% параформальдегида Да Да Уменьшение размера маленького расплода16
Небольшое увеличение времени разработки16
Снижение предпочтений в еде16

Таблица 1. Сравнение методов уничтожения OP50. Уничтожение ультрафиолетом, тепловое уничтожение, лечение антибиотиками и обработка PFA оказывают различное влияние на питательный статус бактерий и здоровье червей, которых кормили обработанными бактериями. Эти методы репликативной инактивации кишечной палочки также различаются по требуемым материалам и масштабируемости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Посев бактерий

  1. Приготовьте отвар Лурия (LB), растворив 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г хлорида натрия (NaCl) в 950 мл дистиллированной воды.
  2. Отрегулируйте pH LB до 7,0, добавив 5M гидроксида натрия (NaOH). Для этого потребуется всего около 0,2 мл NaOH.
  3. Автоклавируйте среду LB с регулируемым pH в жидком цикле в течение 45 минут при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм. Дайте раствору остыть и храните при комнатной температуре.
  4. Инокулируют одну колонию бактерий в 100 мл LB в колбу Эрленмейера объемом 500 мл. Культивируйте бактерии в течение ночи в инкубаторе-шейкере при температуре 37 °C.
  5. В зависимости от состояния бактериальной колонии, размера колбы и скорости, на которую настроен встряхиватель, время, необходимое для роста бактерий, может варьироваться. Через ~14 ч проверьте оптическую плотность (OD) бактерий на длине волны 600 нм (OD600).
  6. Удалите бактерии из шейкера, когда OD600 станет 3,0 (1 x 10,9 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл). Если наружный диаметр600 меньше 3,0, верните колбу в встряхивающий инкубатор до тех пор, пока не будет достигнут желаемый внешний диаметр.
  7. Распределите бактерии по 50 мл в конические пробирки и храните при температуре 4 °C или перейдите к следующему этапу.

2. Работа с параформальдегидом

ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая концентрация параформальдегида (PFA) и продолжительность воздействия могут несколько варьироваться в зависимости от климата, местоположения и типа обрабатываемых бактерий. Хорошей отправной точкой для OP50 является воздействие 0,5% PFA в течение 1 ч, тогда как 0,25% PFA в течение 1 ч может быть достаточно для HT115.

  1. Приготовьте 32%-ный раствор PFA или используйте коммерчески купленный 32%-ный раствор PFA. Используйте надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) при работе с PFA. Наденьте перчатки и защитные очки.
  2. Добавьте PFA в химический вытяжной шкаф с надлежащей вентиляцией. Утилизируйте промывочные средства и наконечники, содержащие PFA, в надлежащие контейнеры для химической опасности в вытяжном шкафу.

3. Бактериальная обработка параформальдегидом

  1. Как только бактерии достигнут наружного диаметра600 3,0, используйте серологическую пипетку, чтобы переложить 50 мл в новую колбу Эрленмейера объемом 250 мл. Остальное сохраните для динамического контроля, имитационного контроля (см. шаг 4) или для обработки PFA по мере необходимости.
  2. Не переливайте из одной колбы в другую и будьте осторожны, чтобы не забрызгать стенки новой колбы бактериями. Колонии на боковой стороне колбы могут получать меньшую дозу PFA.
  3. В химическом колпаке добавьте 781 мкл 32% PFA к 50 мл бактерий, чтобы довести конечную концентрацию до 0,5%. Утилизируйте наконечник, используемый в контейнере для твердых отходов, химически опасных веществ.
  4. Накройте колбу фольгой и верните в инкубатор-шейкер с температурой 37 °C на 1 ч. Через 1 ч извлеките колбу из инкубатора и приступайте к шагу 5.

4. Контроль, прошедший имитационную обработку

  1. Как только бактерии достигнут наружного диаметра600 3,0, используйте серологическую пипетку, чтобы перенести 50 мл бактерий в коническую пробирку объемом 50 мл.
  2. Перейдите к шагу 5.3, чтобы выполнить этапы промывки, аналогичные группе, обработанной PFA.

5. Промывка бактерий для удаления остатков PFA

  1. В химическом колпаке используйте серологическую пипетку для переноса обработанных бактерий из колбы Эрленмейера в коническую пробирку объемом 50 мл. Использование серологической пипетки вместо выливания бактерий предотвратит загрязнение любыми колониями бактерий на краю колбы, которые, возможно, избежали прямой обработки PFA.
  2. Центрифугой обрабатывают бактерии при концентрации примерно 3000 х г в течение 20 мин. Удалите надосадочную жидкость, выбросив ее в контейнер для жидких отходов химической опасности в химическом колпаке.
  3. Добавьте 25 мл LB и вмешайте, чтобы повторно взвеснить бактериальную гранулу (полное заполнение пробирки затрудняет повторное суспендирование гранулы). Повторите центрифугирование и ресуспендирование гранул 4 раза.
  4. Ресуспендируйте гранулы в объемах, оптимальных для различных анализов. Для анализа продолжительности жизни засейте 60-миллиметровые планшеты 200 мкл бактерий, ресуспендированных в 10 мл LB. Ресуспендирование бактерий в 10 мл LB приводит к 5-кратной концентрации по сравнению с исходной культурой в 50 мл.
  5. Храните бактерии при температуре 4 °C.

6. Проверка качества роста бактерий

  1. После окончательной промывки и ресуспензии прополосьте пластину LB (с помощью стерильного наконечника пипетки) подготовленными бактериями. Хорошей практикой является нанесение LB, используемого для промывки и ресуспендирования, на отдельную пластину, чтобы убедиться, что используемый LB не загрязнен.
  2. Поместите планшеты в инкубатор с температурой 37 °C на ночь. Проверьте, нет ли нароста. Бактерии считаются репликативно мертвыми, когда колонии не растут на пластине LB.

7. Проверка качества бактериального метаболизма с помощью респирометра

  1. После окончательной промывки и ресуспензии, начиная с шага 5.4, подтвердите, что бактерии метаболически мертвы, используя доступные инструменты, такие как респирометры19,20 и измерение базальной скорости потребления кислорода (OCR).
  2. Приготовьте раствор М9: растворите 3 г одноосновного фосфата калия (KH 2 PO 4), 6г натрия фосфата двухосновного (Na2HPO4) и 5 г хлорида натрия (NaCl) в 950 мл дистиллированной воды. Автоклав в жидком цикле в течение 45 мин при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм, затем дайте раствору остыть до комнатной температуры. Добавьте 1 мл 1 М сульфата магния (MgSO4) и храните при комнатной температуре.
  3. Гидратация картриджа респирометра: добавьте 200 мкл калибранта во все лунки 96-луночной пластины. Поместите картридж в 96-луночный планшет и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 °C.
  4. Калибровка пробирного анализа: На следующий день поместите гидратированный картридж в машину и начните калибровку.
  5. Настройка тест-планшета: Используя новую 96-луночную планшет, добавьте 160 мкл M9 и 40 мкл подготовленных бактерий (1 x 109 КОЕ/мл) для тестирования лунок. Добавьте 200 мкл M9 в 4 угловые лунки, чтобы использовать их в качестве глухих лунок. Добавьте 160 мкл M9 и 40 мкл LB, используемых для промывки и ресуспендирования, для использования в качестве отрицательного контроля. Добавьте 200 мкл M9 к остальным лункам, которые не будут использоваться.
  6. Запустите анализ: После завершения калибровки картриджа вставьте пробирную пластину из шага 7.5 в машину для анализа. Настройки включают в себя шаги для микширования, ожидания, измерения и цикла. Результаты будут показаны в виде коэффициента потребления кислорода (OCR). Бактерии метаболически мертвы и готовы к использованию, когда OCR равен нулю.

Figure 1
Рисунок 1. Рабочий процесс для обработки параформальдегидом. Одна колония бактерий E. coli OP50 выращивается за ночь. ПФА добавляют до конечной концентрации 0,5%, а обработанную ПФА культуру встряхивают в течение 1 ч при 37 °С. Наконец, PFA удаляют, промывая культуру свежим LB 5x. Чтобы убедиться, что обработанные бактерии реплицистически неактивны, выделите пластину LB обработанных бактерий и вырастите их в течение ночи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Подробный рабочий процесс протокола показан на рисунке 1. Был разработан и оптимизирован высокопроизводительный метод последовательной инактивации репликации бактерий (рис. 2A) и метаболизма (рис. 2B) для метаболических и лекарственных исследований в исследованиях C. elegans с использованием параформальдегида16. Цель состояла в том, чтобы определить самую низкую концентрацию PFA, необходимую для последовательного уничтожения бактерий, не влияя на различные показатели здоровья червей. Эти значения могут варьироваться от одного места к другому в зависимости от лабораторных условий и от одного бактериального штамма к другому. Например, воздействие на бактерии HB101 0,25% в течение 1 ч является достаточным для того, чтобы сделать их метаболически неактивными (Рисунок 2C), в то время как Enterococcus faecalis (EF) требует концентрации PFA 1,0% (Рисунок 2D) для достижения устойчивого эффекта. Подход к оптимизации отдельных лабораторий был разработан ранее16 и подробно описан в настоящей работе.

Привлечение и потребление пищи
По мере того, как бактерии растут и размножаются, они выделяют различные метаболиты и феромоны, которые привлекательны для червей. Чтобы определить, остаются ли черви привлеченными к обработанному PFA OP50, тарелки были засеяны обработанным PFA или имитацией OP50, и процентное соотношение червей, присутствующих на пищевом газоне, по сравнению с тем, что не было на газоне, было сведено в таблицу. Данные показывают, что червей привлекает обработанный PFA OP50, поскольку большинство червей остаются на бактериальном газоне через 1 ч (Рисунок 3A), аналогично тому, что наблюдается в контрольной группе, обработанной имитацией (Рисунок 3B). Однако, как и ожидалось, чувствительный попарный анализ21 показывает, что C. elegans отдают более сильное предпочтение молодому контролю, обработанному имитационной обработкой (рис. 3C), при посеве обработанного PFA на ту же пластину. Установив, что червей привлекают бактерии, убитые PFA, хотя и в меньшей степени, чем живые бактерии, необходимо было установить, что они едят пищу, убитую PFA. Чтобы определить, потребляют ли черви обработанный PFA OP50, была измерена скорость перекачки червей на различных типах пищи. Как показано на рисунке 3D, червяки на обработанном PFA OP50 имеют более высокую скорость перекачки (+25%), чем червяки на контрольной группе, обработанной имитационной обработкой. Это указывает на то, что черви намеренно не замедляют скорость поедания пищи, убитой PFA, и может указывать либо на более высокую скорость поедания, либо на компенсаторную реакцию на изменение легкости перекачивания обработанной пищи.

Плодовитость, развитие и продолжительность жизни
Изменения условий питания могут оказывать физиологическое воздействие на глистов13,22. Для проверки широких эффектов были измерены изменения в скорости развития, плодовитости и продолжительности жизни. OP50, обработанный PFA, немного замедляет время развития (~4 ч) червей дикого типа N2, как показано на рисунке 4A. Мониторинг яйцекладки червей, выращенных в различных бактериальных условиях, показал небольшое, но значительное снижение плодовитости (-21%) у червей, которых кормили ПФА OP50 (рис. 4B). В лабораториях, заинтересованных в старении C. elegans, было определено влияние обработанного PFA OP50 на продолжительность жизни. Интересно, что продолжительность жизни червей дикого типа, которых кормили OP50, обработанным PFA, существенно не отличалась от продолжительности жизни червей, которых кормили обработанным имитацией OP50 на стандартных планшетах питательной среды для нематод (NGM) (рис. 4C), однако обработанный PFA OP50 увеличивает продолжительность жизни дикого типа (+23%) в присутствии FUdR (рис. 4D). Скармливание обработанного PFA OP50 долгоживущему штамму20 с избыточной экспрессией fmo-2 (OE) не изменяет его продолжительность жизни по сравнению с червями дикого типа (рис. 4E). Также было показано, что OP50, убитый ультрафиолетом, теплом и антибиотиками, изменяет продолжительность жизни C. elegans. В частности, сообщалось, что бактерии, обработанные УФ-излучением, увеличивают продолжительность жизни NGM12,23 и FUdR24. Тем не менее, существуют противоречивые данные о взаимодействии FUdR и УФ-убитых бактерий25,26, что может быть связано с различными методами УФ-убийства и валидации метаболической гиподинамии у бактерий. Кроме того, бактерии, убитые при нагревании, увеличивают продолжительность жизни NGM27, а антибиотики увеличивают продолжительность жизни NGM15 и в жидкой культуре28.

Figure 2
Рисунок 2. Лечение бактерий PFA подавляет пролиферацию и метаболизм. (A) Рост бактерий в колониеобразующих единицах (КОЕ) условно обработанных и 0,5% обработанных PFA OP50. (B) Скорость внеклеточного подкисления (ECAR) в мН/мин обработанного имитацией и 0,5% обработанного PFA OP50. (C) Базальная скорость потребления кислорода (OCR) в пмоль/мин для HB101, обработанного имитационной, 0,25% обработанной PFA и 0,5% обработанного PFA. (D) Базальная скорость потребления кислорода (OCR) в пмоль/мин для 0,25% обработанных PFA, 0,5% обработанных PFA и 1,0% обработанных PFA (EF). Все столбцы погрешности, показанные на рисунках, представляют собой стандартную ошибку среднего значения (SEM); Для получения p-значений использовался двусторонний t-критерий. Обозначает p-значение < 0,0001. Эта цифра была изменена с 16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Червей привлекает OP50, обработанный PFA. Процент червей, привлеченных к (А) обработанному PFA или (B) имитации бактериального газона OP50. (C) Попарный сенсибилизированный анализ червей предпочтительно для имитации и обработки PFA OP50. (D) Скорость перекачивания (насосов за 30 с) червей на OP50, обработанных PFA или имитационной обработкой. Для получения p-значений для всех сравнений был использован двусторонний t-критерий. Все столбцы погрешности, показанные на рисунках, представляют собой стандартную ошибку среднего значения (SEM); Обозначает p-значение < 0,0001. Панели A-C были изменены с 16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Черви растут и развиваются на OP50, обработанном PFA. (A) Время развития (h) червей от взрослых особей, откладывающих яйца, на обработанных имитацией и обработанных PFA OP50. (B) Среднее потомство (количество червей) червей, которых кормили ОП50, обработанными имитацией или PFA. (С, Г) Процент живых червей, получавших OP50, обработанный имитацией или PFA, на планшетах с длительным сроком службы (C) NGM и (D) FUdR. (E) Процент живых червей дикого типа и FMO-2 OE, которых кормили обработанным PFA OP50. Двусторонний t-критерий был использован для получения p-значений для сравнения развития и плодовитости. Логарифмический ранговый критерий был использован для получения p-значений для сравнения продолжительности жизни. Все столбцы погрешности, показанные на рисунках, представляют собой стандартную ошибку среднего значения (SEM); * обозначает p-значение < 0,05, *** — p-значение <0,001, а **** — p-значение < 0,0001. Панели A, B и D были изменены с16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Преимущества уничтожения PFA по сравнению с другими методами уничтожения бактерий
Обработка PFA является высокопроизводительным методом предотвращения бактериального метаболизма при сохранении питательного источника пищи для C. elegans. Уничтожение бактерий с помощью PFA-обработки имеет множество преимуществ по сравнению с другими методами. В отличие от УФ-обработки, где каждая пластина должна быть проверена на успешное уничтожение, одна пластина из партии бактерий, обработанных PFA, может быть протестирована для валидации партии16. Обработка PFA также очень эффективна в устранении бактериального метаболизма (рис. 2B), и бактерии, обработанные PFA, демонстрируют пониженную метаболическую активность по сравнению с бактериями, обработанными антибиотиками19. Еще одно преимущество PFA-обработки заключается в том, что бактерии сохраняют свою клеточную структуру и питательный профиль. Следовательно, черви могут развиваться на бактериях, обработанных PFA, в то время как кормление бактериями, убитыми при нагревании, из яйца приводит к остановке развития13,16.

Критические действия и устранение неполадок
Несмотря на то, что обработка бактерий PFA является относительно простым протоколом, важно проверить, что каждая партия бактерий является репликативно и метаболически мертвой (шаги 6 и 7), и убедиться, что этапы промывки после обработки PFA выполняются тщательно (шаг 5). Если на этапе 6 колонии растут, что указывает на то, что бактерии не полностью погибли, можно устранить неполадки с концентрацией ПФА и продолжительностью обработки ПФА на шаге 3. При оптимизации протокола лечения PFA 0,5%-ная концентрация PFA была идеальной для успешного уничтожения OP50 с минимальными побочными эффектами. 0,25% PFA было недостаточно для метаболического уничтожения всех штаммов бактерий (рис. 2C-D), а увеличение концентрации до 0,5% PFA не изменяло время развития, продолжительность жизни или пищевые предпочтения червей на OP50 по сравнению с 0,25% PFA. Кроме того, 1 ч инокуляции PFA был кратчайшим временем, достаточным для предотвращения роста всех бактерий. Если бактерии не полностью убиты при инокуляции 0,5% PFA в течение 1 ч, время инокуляции и/или концентрация PFA могут быть увеличены для устранения эффективности уничтожения. Вторым ключевым этапом протокола является промывка бактерий после PFA-обработки (шаг 5). Очень важно выполнить все пять промывок и полностью удалять надосадочную жидкость при каждой стирке, чтобы убедиться, что в бактериях не остается формальдегида. Если черви плохо растут или не размножаются бактериями, обработанными PFA, можно провести дополнительные промывки.

Ограничения метода
Несмотря на то, что бактерии, убитые PFA, идеально подходят для устранения искажающих эффектов бактериального метаболизма (рис. 2B) в исследованиях C. elegans, у этого метода есть ограничения. В частности, C. elegans несколько медленнее развиваются на бактериях, обработанных PFA, по сравнению с живыми бактериями (рис. 4A)16. Обработка PFA также продлевает срок службы червяков, если FUdR присутствует (Рисунок 4D), но отсутствует на пластинах NGM (Рисунок 4C)16. Однако эти проблемы возникают и в других методах; Бактерии, убитые ультрафиолетом, также изменяют продолжительность жизни C. elegans. В большинстве сообщений предполагается, что бактерии, обработанные УФ-излучением, увеличивают продолжительность жизни червей на NGM12,23 и FUdR 24, а другие исследования указывают на то, что УФ-обработка не влияет на продолжительность жизни 24 и что существует взаимодействие между УФ-обработкой и FUdR на продолжительность жизни C. elegans 25,26. В дополнение к эффектам продолжительности жизни бактерий, обработанных PFA, черви предпочитают проводить время на живых бактериях по сравнению с бактериями, обработанными PFA (рис. 3C)16, но имеют более высокую скорость перекачки на продуктах, обработанных PFA (рис. 3D). Это говорит о том, что они могут потреблять одинаковое количество пищи или что бактерии, обработанные PFA, легче или труднее есть. Многие из этих эффектов также наблюдаются при других методах уничтожения бактерий12,13,14, предполагая, что метаболически активные бактерии сокращают время развития, сокращают продолжительность жизни и более привлекательны для C. elegans.

Потенциальное применение бактерий, обработанных PFA
В целом, способность быстро и надежно убивать большие партии бактерий имеет большой потенциал для устранения искажающих эффектов бактериального метаболизма в исследованиях C. elegans. Эта способность особенно полезна для скрининга лекарств, экспериментов с добавками, анализов токсичности, исследований метаболомики и изучения влияния микробного метаболизма на поведение хозяина. Более подробная информация об использовании бактерий, обработанных PFA, в каждом из этих применений приведена ниже.

Эксперименты с лекарственными препаратами, добавками и токсичностью: Поскольку только одна пластина на партию бактерий, обработанных PFA, должна быть проверена на успешность уничтожения, бактерии, убитые PFA, могут быть добавлены в жидкую культуру для высокопроизводительного скрининга лекарств. Бактерии, обработанные PFA, также могут быть высеяны на твердые пластины с небольшими молекулами или питательными веществами, включенными в агаровую среду. Твердые пластины, засеянные бактериями, обработанными PFA, также могут быть полезны для анализов токсичности или стрессовой реакции. Неопубликованные данные свидетельствуют о том, что бактерии, обработанные PFA, могут помочь различить роль бактериальных путей реакции на стресс и путей стрессоустойчивости червей в резистентности к параквату и туникамицину. Использование бактерий, убитых PFA, в этих исследованиях добавок и токсичности предотвращает метаболизм бактерий в интересующей молекуле и гарантирует, что любой наблюдаемый фенотип является результатом соединения, действующего непосредственно на C. elegans. Использование метаболически мертвых бактерий для экспериментов с лекарствами и добавками также сводит к минимуму вариабельность дозировки, поскольку живые бактерии могут метаболизировать различное количество интересующего соединения от эксперимента к эксперименту.

Метаболомные исследования: Исследования метаболомики C. elegans также могут быть искажены бактериальным метаболизмом: наблюдение за изменениями в метаболизме червей требует отсутствия метаболической активности бактерий29. Даже небольшие изменения в бактериальном источнике пищи могут изменить метаболом червя. Например, метаболом червей, которых кормили живыми промытыми бактериями, отличается от метаболома червей, которых кормили живыми немытыми бактериями16. Потребление бактерий, обработанных PFA, также изменяет метаболом червей по сравнению с потреблением живой пищи16 , но позволяет сравнивать влияние экспериментальных условий на метаболизм C. elegans в отрыве от бактериального метаболизма.

Поведенческие исследования между хозяином и микробом: Наконец, бактерии, обработанные PFA, могут быть использованы для выявления взаимодействий между бактериальным метаболизмом и поведением хозяина. Метаболиты, выделяемые как патогенными, так и непатогенными бактериями, могут быть привлекательными или отталкивающими для червей, влияя на их кормовое и пищевое поведение10,11,30. Кроме того, бактерии могут вырабатывать нейромодуляторы, которые управляют изменениями влокомоции. Кроме того, выращивание C. elegans на различных штаммах бактерий приводит к изменению размера выводка, времени развития и физиологии31,32. Обработка этих бактерий PFA может помочь определить, требует ли воздействие данной бактерии на C. elegans активного бактериального метаболизма.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась NIH R21AG059117 и Лабораториями Пола Ф. Гленна по исследованию биологии старения в Мичиганском университете. SB финансировался компанией T32AG000114. ESK финансировался NSF DGE 1841052.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum Foil Staples 2549291
Bunsen burner VWR 470121-700 
Cell Density Meter Denville 80-3000-45 
Centrifuge Eppendorg 5430
Chemical fume hood Labcono 975050411384RG
Conincal tubes (50 mL) Fisher 339652
Cuvettes  Fisher 14-955-127
E. coli OP50 CGC OP50
Erlenmyer flasks Fisher 250 mL: FB501250
500 mL: FB501500
1000 mL: FB5011000
Inoculation loop Fisher 22-363-605
LB Agar Fisher BP1425500
Liquid waste collection bottle Thomas Scientific 1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma M7506
Paraformaldehyde (32%) Electron Microscopy Sciences 15714-S Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor Eppendorf Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm) Fisher FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher P2853
Seahorse XF Calibrant Agilent 100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate Agilent 101085-004
Serological pipettes (50 mL) Genesee Scientific 12-107
Shaker incubator Thermo 11 676 083
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) Sigma S374-500
Solid waste collection bucket M&M Industries  5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone Genesee Scientific 20-251
Vortex Thermo 11676331
Weighing balance C Goldenwall HZ10K6B
Yeast Extract Genesee Scientific 20-255

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  3. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
  4. Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
  5. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
  6. Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
  7. McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
  8. Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
  9. Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
  10. Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
  11. Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
  12. Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).
  13. Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal's food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
  14. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  15. Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
  16. Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
  17. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  18. Felix, H. Permeabilized and immobilized cells. Methods in Enzymology. 137, 637-641 (1988).
  19. Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
  20. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  21. Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
  22. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  23. Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
  24. Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
  25. Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
  26. Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
  27. Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
  28. Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
  29. Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
  30. O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  31. Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
  32. Dirksen, P., et al. Cembio - the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).

Tags

Метаболически инактивированные бактерии Исследование Caenorhabditis elegans Генетические исследования Исследования развития Исследования старения Исследования метаболизма Исследования поведения Бактериальный метаболизм УФ-облучение Тепловое убийство Антибиотики Лечение PFA Лечение параформальдегидом Высокопроизводительный метод
Методология метаболически инактивировать бактерии для исследования <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., … More

Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., Huang, S., Leiser, S. F. Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research. J. Vis. Exp. (197), e65775, doi:10.3791/65775 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter