Summary
Födokällan för Caenorhabditis elegans i labbet är levande Escherichia coli. Eftersom bakterier är metaboliskt aktiva utgör de en förväxlingsvariabel i metaboliska studier och läkemedelsstudier i C. elegans. Ett detaljerat protokoll för att metaboliskt inaktivera bakterier med hjälp av paraformaldehyd beskrivs här.
Abstract
Caenorhabditis elegans är en vanlig modellorganism för forskning inom genetik, utveckling, åldrande, metabolism och beteende. Eftersom C. elegans äter en diet av levande bakterier kan den metaboliska aktiviteten hos deras födokälla förvirra experiment som letar efter de direkta effekterna av olika ingrepp på masken. För att undvika de förvirrande effekterna av bakteriell metabolism har C. elegans-forskare använt flera metoder för att metaboliskt inaktivera bakterier, inklusive ultraviolett (UV)-bestrålning, värmedödande och antibiotika. UV-behandling har relativt låg genomströmning och kan inte användas i flytande odling eftersom varje platta måste undersökas för framgångsrik bakteriedödning. En andra behandlingsmetod, värmedödande, påverkar bakteriernas konsistens och näringskvalitet negativt, vilket leder till att utvecklingen av C. elegans avstannar. Slutligen kan antibiotikabehandling direkt förändra C. elegans-fysiologin förutom att förhindra bakterietillväxt . Detta manuskript beskriver en alternativ metod för att metaboliskt inaktivera bakterier med hjälp av paraformaldehyd (PFA). PFA-behandling korsbinder proteiner i bakterieceller för att förhindra metabolisk aktivitet samtidigt som cellulär struktur och näringsinnehåll bevaras. Denna metod har hög genomströmning och kan användas i flytande odling eller fasta plattor, eftersom testning av en platta med PFA-behandlade bakterier för tillväxt validerar hela satsen. Metabolisk inaktivering genom PFA-behandling kan användas för att eliminera de förvirrande effekterna av bakteriell metabolism på studier av läkemedels- eller metabolittillskott, stresstålighet, metabolomik och beteende i C. elegans.
Introduction
Caenorhabditis elegans föreslogs ursprungligen som modellorganism 19651 och har sedan dess använts i stor utsträckning i studier av genetik, utveckling, beteende, åldrande och metabolism2. På grund av sin stora kullstorlek och genomskinliga nagelband är C. elegans särskilt väl lämpad för screening med hög genomströmning med fluorescerande rapportörer3. Deras korta livscykel, hermafroditiska reproduktion och genetiska homologi med människor gör också C. elegans till ett värdefullt modellsystem för studier av utveckling4 och åldrandebiologi5. Dessutom är C. elegans relativt lättskött. Maskar kan odlas i flytande kultur eller på fasta agarplattor och konsumera en diet av levande Escherichia coli OP50-bakterier4.
Den levande födokällan för C. elegans kan dock förvirra studier av ämnesomsättning, läkemedelstillskott och beteende. Eftersom levande bakterier har sin egen ämnesomsättning förändrar experimentella förhållanden som påverkar bakterierna också de näringsämnen och metaboliter som maskarna har tillgång till. Till exempel har skillnader i bakteriella järn-, aminosyra- och folatkoncentrationer olika effekter på C. elegans utveckling, fysiologi och livslängd6. Många vanliga laboratoriemetoder kan framkalla sådana förändringar i näringssammansättningen och metaboliterna som produceras av OP50. Specifikt framkallar exponering för 5-fluoro-2'-deoxiuridin (FUdR), en förening som vanligtvis används för att förhindra reproduktion i C. elegans, breda förändringar i OP50-genuttryck, inklusive aminosyrabiosyntesvägar7. Levande bakterier kan också förvirra studier där C. elegans kompletteras med små molekyler eftersom bakterier helt eller delvis kan metabolisera de aktiva föreningarna. Dessutom kan effekterna av dessa små molekyler på bakterierna i sin tur förändra C. elegans-fysiologin, vilket rapporterades med det livslängdsförlängande läkemedlet metformin8. Slutligen kan levande bakterier förändra maskens miljö på sätt som förändrar beteendet, som att utsöndra attraktiva luktämnen9, producera exogena neuromodulatorer10 och skapa syregradienter i en tät bakteriegräsmatta11.
För att mildra de förvirrande effekterna av bakteriell metabolism på C. elegans-forskning har flera metoder för att döda bakterier utvecklats (tabell 1). Tre vanliga strategier för att döda OP50 är UV-bestrålning, värmeavdödning och antibiotikabehandling. Även om de är enkla och relativt billiga, kan var och en av dessa metoder ha oönskade effekter på både bakterier och C. elegans. UV-avdödning via en UV-tvärbindare12 är låg genomströmning och hastigheten begränsas av antalet plattor som får plats i UV-tvärbindaren. Dessutom kan effekten av UV-avdödning variera från platta till platta inom en sats, och att testa för tillväxt på alla plattor kan bli svårt i stora experiment. Att värmeavfyra OP50 genom att utsätta kulturen för temperaturer på >60 °C kommer med en separat uppsättning utmaningar. Hög värme kan skada näringsämnen som är viktiga för masken och förstöra bakteriernas cellulära struktur, vilket skapar en mjukare konsistens som minskar den tid som maskar spenderar på maten13. Denna metod kan inte heller användas under hela livscykeln för C. elegans eftersom maskar som matas med värmedödade bakterier kan stanna upp tidigt i utvecklingen13. Antibiotikabehandling är en tredje vanlig metod för att undertrycka bakteriell metabolism14, men antibiotika kan också förändra maskens tillväxt och ämnesomsättning15.
En lösning för att eliminera de metaboliska effekterna av levande bakterier samtidigt som bakteriestrukturen och viktiga näringsämnen bevaras är att döda OP50 med paraformaldehyd (PFA)16. PFA är en polymer av formaldehyd som kan tvärbinda proteiner i celler17 för att förhindra bakteriell replikation utan att förstöra inre cellstrukturer som det inre plasmamembranet18. På grund av detta bevarande av den inre cellulära strukturen uppvisar PFA-behandlade bakterier ingen tillväxt eller metabolisk aktivitet men förblir en ätbar och näringsrik födokälla för C. elegans16. Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll som visar hur man metaboliskt inaktiverar bakterier med hjälp av paraformaldehyd.
| Metod | Material som krävs | Skalbar? | Närings? | Effekter på mask? | ||||
| UV | UV-tvärbindare | Begränsad av: | Ja | Varierande effekter på livslängd på NGM12, 23, 24 | ||||
| Antal plattor som passar i UV-tvärbindare | Varierande effekter på livslängden på FUdR24, 26, 27 | |||||||
| Bestrålningstid per platta | Minskad matpreferens16 | |||||||
| Möjlighet att kontrollera varje platta för tillväxt8 | ||||||||
| Värme | >60 °C kuvös | Ja | Nej: förstör cellväggen, minskat näringsvärde | Utvecklingsstopp 13 | ||||
| Minskad matpreferens13 | ||||||||
| Förlänger livslängden på NGM31 | ||||||||
| Antibiotika | Antibiotika (kanamycin, karbenicillin, etc.) | Ja | Ja | Försenar tillväxt och utveckling15 | ||||
| Förlänger livslängden i flytande medier19 | ||||||||
| Förlänger livslängden på NGM15 | ||||||||
| PFA | 0,5% paraformaldehyd | Ja | Ja | Liten kullstorlek minskning16 | ||||
| Liten ökning av utvecklingstiden16 | ||||||||
| Minskad matpreferens16 | ||||||||
Tabell 1. Jämförelser av metoder för att döda OP50. UV-dödande, värmedödande, antibiotikabehandling och PFA-behandling har varierande effekter på bakteriernas näringsstatus och hälsan hos maskar som matas med behandlade bakterier. Dessa metoder för replikativ inaktivering av E. coli skiljer sig också åt i fråga om vilka material som krävs och hur skalbara de är.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inokulering av bakterier
- Bered Luriabuljong (LB) genom att lösa upp 10 g trypton, 5 g jästextrakt och 10 g natriumklorid (NaCl) i 950 ml destillerat vatten.
- Justera pH för LB till 7.0 genom att tillsätta 5M natriumhydroxid (NaOH). Detta bör endast kräva cirka 0,2 ml NaOH.
- Autoklavera det pH-justerade LB-mediet i en vätskecykel i 45 minuter vid 15 psi. Låt lösningen svalna och förvara i rumstemperatur.
- Inokulera en enda bakteriekoloni i 100 ml LB i en 500 ml Erlenmeyerkolv. Odla bakterierna över natten i en 37 °C shakerinkubator.
- Beroende på bakteriekolonins hälsa, storleken på kolven och hastigheten som shakern är inställd på, kan den tid det tar för bakterierna att växa variera. Efter ~14 timmar, kontrollera bakteriernas optiska densitet (OD) vid 600 nm (OD600).
- Ta bort bakterierna från skakapparaten när OD600 är 3,0 (1 x 109 kolonibildande enheter (CFU)/ml). Om OD600 är lägre än 3,0, sätt tillbaka kolven i skakinkubatorn tills önskad OD uppnås.
- Alikvot bakterierna i 50 ml koniska rör och förvara vid 4 °C eller gå vidare till nästa steg.
2. Arbeta med paraformaldehyd
OBS: Koncentrationen av paraformaldehyd (PFA) som används och exponeringens varaktighet kan variera något beroende på klimat, plats och typ av bakterier som behandlas. En bra utgångspunkt för OP50 är exponering för 0,5 % PFA i 1 timme, medan 0,25 % PFA i 1 timme kan vara tillräckligt för HT115.
- Förbered 32 % PFA-lager eller använd kommersiellt inköpt 32 % PFA-lösning. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) när du arbetar med PFA. Använd handskar och ögonskydd.
- Tillsätt PFA i ett kemiskt dragskåp med ordentlig ventilation. Kassera PFA-innehållande tvättar och tips i lämpliga behållare för kemiska faror i dragskåpet.
3. Bakteriell behandling med paraformaldehyd
- När bakterierna når en OD600 på 3,0, använd en serologisk pipett för att överföra 50 ml till en ny 250 ml Erlenmeyerkolv. Spara resten till en live-kontroll, en simulerad behandlad kontroll (se steg 4) eller för att behandla så bra med PFA efter behov.
- Undvik att hälla från en kolv till en annan och var försiktig så att du inte stänker på sidorna av den nya kolven med bakterier. Kolonier på sidan av kolven kan få en lägre dos PFA.
- Tillsätt 781 μL 32 % PFA till 50 ml bakterier i kemikaliehuven för att få den slutliga koncentrationen till 0,5 %. Kassera spetsen som används i en behållare för kemiskt avfall med fast avfall.
- Täck kolven med folie och ställ tillbaka den i skakinkubatorn för 37 °C i 1 timme. Efter 1 timme tar du ut kolven ur inkubatorn och fortsätter till steg 5.
4. Simulerad kontroll
- När bakterierna når en OD600 på 3,0, använd en serologisk pipett för att överföra 50 ml av bakterierna till ett 50 ml koniskt rör.
- Fortsätt till steg 5.3 för att slutföra tvättstegen som liknar den PFA-behandlade gruppen.
5. Tvätta bakterierna för att ta bort kvarvarande PFA
- Använd en serologisk pipett i kemikaliehuven för att överföra de behandlade bakterierna från Erlenmeyerkolven till ett 50 ml koniskt rör. Att använda en serologisk pipett istället för att hälla bakterierna förhindrar kontaminering från eventuella bakteriekolonier på kolvens kant som kan ha undvikit direkt behandling med PFA.
- Centrifugera behandlade bakterier vid ca 3000 x g i 20 min. Ta bort supernatanten genom att kassera den i en behållare för flytande avfall i kemikaliehuven.
- Tillsätt 25 ml LB och virvel för att återsuspendera bakteriepelleten (Att fylla röret helt gör det svårare att återsuspendera pelleten). Upprepa centrifugeringen och omblandningen av pellets 4 gånger.
- Återsuspendera pelleten i volymer som är optimala för olika analyser. För livslängdsanalyser, frö 60 mm plattor med 200 μL bakterier återsuspenderade i 10 ml LB. Återsuspendera bakterierna i 10 ml LB resulterar i en 5x koncentration från den ursprungliga 50 ml kulturen.
- Förvara bakterierna vid 4 °C.
6. Kvalitetskontroll av bakterietillväxt
- Efter den sista tvätten och omblandningen, stryk en LB-platta (med en steril pipettspets) med de beredda bakterierna. Det är god praxis att stryka LB som används för tvätt och resuspendera på en separat platta för att säkerställa att LB som används inte är förorenad.
- Placera plattorna i en inkubator vid 37 °C över natten. Kontrollera om det finns någon tillväxt. Bakterierna anses vara replikativt döda när kolonier inte växer på LB-plattan.
7. Kvalitetskontroll av bakteriell metabolism med hjälp av en respirometer
- Efter den sista tvätten och resuspensionen från steg 5.4, bekräfta att bakterierna är metaboliskt döda med hjälp av tillgängliga verktyg såsom respirometrar19,20 och mätning av den basala syreförbrukningshastigheten (OCR).
- Bered M9-lösning: Lös 3 g monobasiskt kaliumfosfat (KH 2 PO 4),6 g dibasiskt natriumfosfat (Na2HPO4) och 5 g natriumklorid (NaCl) i 950 ml destillerat vatten. Autoklav på en vätskecykel i 45 minuter vid 15 psi, låt sedan lösningen svalna till rumstemperatur. Tillsätt 1 ml 1 M magnesiumsulfat (MgSO4) och förvara i rumstemperatur.
- Hydrera andningsdosamen: Tillsätt 200 μL kalibrator till alla brunnar på en 96-hålsplatta. Placera patronen i plattan med 96 brunnar och inkubera över natten i en inkubator vid 37 °C.
- Analyskalibrering: Dagen efter placerar du den hydrerade patronen i maskinen och påbörjar kalibreringen.
- Inställning av analystestplattan: Använd en ny 96-hålsplatta, tillsätt 160 μL M9 och 40 μL av de förberedda bakterierna (1 x 109 CFU/ml) till testbrunnarna. Tillsätt 200 μL M9 till de 4 hörnbrunnarna för att använda som tomma brunnar. Tillsätt 160 μl M9 och 40 μl LB som används för tvätt och resuspendera för att använda som negativa kontroller. Tillsätt 200 μL M9 till resten av brunnarna som inte kommer att användas.
- Kör analysen: När patronkalibreringen är klar, sätt in analysplattan från steg 7.5 i maskinen för analys. Inställningarna inkluderar steg för att blanda, vänta, mäta och loopa. Resultaten kommer att visas som syreförbrukningshastighet (OCR). Bakterierna är metaboliskt döda och redo att användas när OCR är noll.
Figur 1. Arbetsflöde för paraformaldehydbehandling. En enda koloni av E. coli OP50-bakterier odlas över natten. PFA tillsätts till en slutlig koncentration på 0,5 % och den PFA-behandlade kulturen skakas i 1 timme vid 37 °C. Slutligen avlägsnas PFA genom att tvätta kulturen med färsk LB 5x. För att bekräfta att de behandlade bakterierna är replikativt inaktiva, stryk ut en LB-platta av de behandlade bakterierna och odla över natten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett detaljerat arbetsflöde för protokollet visas i figur 1. En metod med hög genomströmning utvecklades och optimerades för att konsekvent inaktivera bakteriell replikation (Figur 2A) och metabolism (Figur 2B) för metaboliska och läkemedelsstudier i C. elegans-forskning med paraformaldehyd16. Målet var att bestämma den lägsta koncentrationen av PFA som behövdes och den kortaste tid som krävdes för att konsekvent döda bakterierna utan att påverka olika mått på hälsa i maskarna. Dessa värden kan variera från en plats till en annan beroende på laboratoriemiljö och från en bakteriestam till en annan. Till exempel är exponering av HB101-bakterier för 0,25 % under 1 timme tillräckligt för att göra dem metaboliskt inaktiva (Figur 2C), medan Enterococcus faecalis (EF) kräver en PFA-koncentration på 1,0 % (Figur 2D) för en konsekvent effekt. Ett tillvägagångssätt för individuell labboptimering har tidigare etablerats16 och beskrivs i detta aktuella arbete.
Attraktion och konsumtion av mat
När bakterier växer och förökar sig frigör de olika metaboliter och feromoner som är attraktiva för maskarna. För att avgöra om maskarna fortfarande attraheras av den PFA-behandlade OP50 såddes plattorna med PFA-behandlad eller mock-behandlad OP50 och andelen maskar som fanns på matgräsmattan jämfört med utanför gräsmattan tabellerades. Data visar att maskar attraheras av den PFA-behandlade OP50, eftersom de flesta maskarna stannar kvar på bakteriegräsmattan efter 1 timme (Figur 3A), liknande vad som observeras med den simulerade kontrollen (Figur 3B). Som väntat visar dock en känslig parvis analys21 att C. elegans har en starkare preferens för den mock-behandlade levande kontrollen (Figur 3C) när den sås med den PFA-behandlade på samma platta. Efter att ha konstaterat att maskar attraheras av PFA-dödade bakterier, om än mindre än levande bakterier, var det absolut nödvändigt att fastställa att de äter den PFA-dödade maten. För att avgöra om maskarna konsumerar den PFA-behandlade OP50 mättes maskarnas pumphastighet på olika födotyper. Som visas i figur 3D har maskar på PFA-behandlad OP50 en högre pumphastighet (+25 %) än maskar på den simulerade kontrollen. Detta tyder på att maskar inte avsiktligt saktar ner sin äthastighet på PFA-dödad mat och kan antingen indikera en högre äthastighet eller ett kompensatoriskt svar på en förändring i hur lätt det är att pumpa den behandlade maten.
Fruktsamhet, utveckling och livslängd
Förändringar i födoförhållandena kan ha fysiologiska effekter på maskar 13,22. För att testa för breda effekter mättes förändringar i utvecklingshastighet, fruktsamhet och livslängd. PFA-behandlad OP50 fördröjer utvecklingstiden (~4 timmar) för vildtyp N2-maskar något, vilket visas i figur 4A. Övervakning av äggläggningsförmågan hos maskar som odlats under olika bakterieförhållanden visar en liten men signifikant minskning av fruktsamheten (-21 %) hos maskar som utfodrats med PFA-behandlad OP50 (figur 4B). För laboratorier som var intresserade av åldrande av C. elegans bestämdes sedan effekten av PFA-behandlad OP50 på livslängden. Intressant nog skilde sig livslängden för vildtypsmaskar som matades med PFA-behandlad OP50 inte signifikant från de maskar som matades med låtsasbehandlad OP50 på NGM-plattor (Standard Nematod Growth Medium) (Figur 4C), men PFA-behandlad OP50 ökar livslängden för vildtyp (+23 %) när FUdR är närvarande (Figur 4D). Utfodring av PFA-behandlad OP50 till en långlivad fmo-2-överuttryckande (OE) stam20 förändrar inte dess livslängd jämfört med vildtypsmaskar (Figur 4E). UV-, värme- och antibiotikadödade OP50 har också visat sig förändra livslängden för C. elegans. Specifikt har UV-behandlade bakterier rapporterats förlänga livslängden på NGM12,23 och på FUdR 24. Det finns dock motstridiga data om interaktionen mellan FUdR och UV-dödade bakterier25,26 som kan bero på olika metoder för UV-avdödning och validering av metabolisk inaktivitet i bakterierna. Dessutom förlänger värmedödade bakterier livslängden på NGM27, och antibiotika förlänger livslängden på NGM15 och i vätskekultur28.
Figur 2. Behandling av bakterier med PFA hämmar proliferation och metabolism. (A) Bakterietillväxt i kolonibildande enheter (CFU) av mock-behandlade och 0,5 % PFA-behandlade OP50. (B) Extracellulär försurningshastighet (ECAR) i mpH/min av mock-behandlad och 0,5 % PFA-behandlad OP50. (C) Basal syreförbrukning (OCR) i pmol/min för mock-behandlad, 0,25 % PFA-behandlad och 0,5 % PFA-behandlad HB101. (D) Basal syreförbrukning (OCR) i pmol/min av mock-behandlad, 0,25 % PFA-behandlad, 0,5 % PFA-behandlad och 1,0 % PFA-behandlad enterococcus faecalis (EF). Alla felstaplar som visas i figurerna representerar medelvärdets medelfel (SEM); Ett tvåsidigt T-test användes för att härleda p-värden. betecknar p-värde < 0,0001. Denna siffra har ändrats från 16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Maskar attraheras av PFA-behandlad OP50. Procent av maskarna som attraheras av (A) PFA-behandlad eller (B) mock-behandlad OP50-bakteriell gräsmatta. (C) Parvis sensibiliserad analys som testar maskpreferens för mock-behandlad och PFA-behandlad OP50. (D) Pumphastighet (pumpar per 30 s) för maskar på PFA-behandlad eller skenbehandlad OP50. En tvåsidig t-testanalys användes för att härleda p-värden för alla jämförelser. Alla felstaplar som visas i figurerna representerar medelvärdets medelfel (SEM); betecknar p-värde < 0,0001. Panelerna A-C har modifierats från 16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Maskar växer och utvecklas på PFA-behandlad OP50. (A) Utvecklingstid (h) för maskar från äggläggande vuxna på simulerad och PFA-behandlad OP50. B) Genomsnittlig avkomma (antal maskar) till maskar som utfodrats med skenbehandlad eller PFA-behandlad OP50. (C, D) Procent levande av maskar som matats med mock-behandlad eller PFA-behandlad OP50 på (C) NGM- och (D) FUdR-livslängdsplattor. (E) Procent levande av vildtyps- och fmo-2 OE-maskar som utfodrats med PFA-behandlad OP50. En tvåsidig t-testanalys användes för att härleda p-värden för utvecklings- och fruktsamhetsjämförelser. Log-rank-testet användes för att härleda p-värden för livslängdsjämförelser. Alla felstaplar som visas i figurerna representerar medelvärdets medelfel (SEM); * betecknar p-värde < 0,05, *** anger p-värde <0,001 och **** anger p-värde < 0,0001. Panelerna A, B och D har ändrats från16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fördelar med PFA-dödande i förhållande till andra bakteriedödande metoder
PFA-behandling är en metod med hög genomströmning för att förhindra bakteriell metabolism samtidigt som den bibehåller en näringsrik födokälla för C. elegans. Att döda bakterier via PFA-behandling har flera fördelar jämfört med andra metoder. Till skillnad från UV-behandling, där varje platta måste testas för framgångsrik avdödning, kan en enda platta från en sats PFA-behandlade bakterier testas för att validera batch16. PFA-behandling är också mycket effektiv för att eliminera bakteriell metabolism (Figur 2B), och PFA-behandlade bakterier uppvisar minskad metabolisk aktivitet jämfört med antibiotikabehandlade bakterier19. En annan fördel med PFA-behandling är att bakterierna bibehåller sin cellstruktur och näringsprofil. Följaktligen kan maskar utvecklas på PFA-behandlade bakterier, medan utfodring av värmedödade bakterier från ägg resulterar i utvecklingsstopp13,16.
Kritiska steg och felsökning
Även om PFA-behandling av bakterier är ett relativt enkelt protokoll, är det viktigt att validera att varje parti bakterier är replikativt och metaboliskt döda (steg 6 och 7) och att säkerställa att tvättstegen efter PFA-behandling görs noggrant (steg 5). Om kolonier växer i steg 6, vilket indikerar att bakterierna inte är helt döda, är det möjligt att felsöka koncentrationen av PFA och varaktigheten av PFA-behandlingen i steg 3. Vid optimering av PFA-behandlingsprotokollet var en koncentration av PFA på 0,5 % idealisk för att framgångsrikt döda OP50 med minimala biverkningar. 0,25 % PFA var inte tillräckligt för att metaboliskt döda alla bakteriestammar (Figur 2C-D) och en ökning av koncentrationen till 0,5 % PFA förändrade inte utvecklingstid, livslängd eller födopreferens för maskar på OP50 jämfört med 0,25 % PFA. Dessutom var 1 timmes inokulering med PFA den kortaste tiden som var tillräcklig för att förhindra all bakterietillväxt. Om bakterierna inte dödas helt av en 1 timmes inokulering med 0,5 % PFA, kan inokuleringstiden och/eller PFA-koncentrationen ökas för att felsöka avdödningseffektiviteten. Ett andra viktigt steg i protokollet är att tvätta bakterierna efter PFA-behandling (steg 5). Det är mycket viktigt att slutföra alla fem tvättar och att helt ta bort supernatanten vid varje tvätt för att säkerställa att ingen formaldehyd finns kvar i bakterierna. Om maskarna inte växer bra eller inte pumpar på de PFA-behandlade bakterierna kan ytterligare tvättar utföras.
Metodens begränsningar
Även om PFA-dödade bakterier är idealiska för att eliminera de störande effekterna av bakteriell metabolism (Figur 2B) från C. elegans-studier, finns det begränsningar för denna metod. Specifikt har C. elegans en något långsammare utveckling på PFA-behandlade bakterier jämfört med levande bakterier (Figur 4A)16. PFA-behandling förlänger också maskens livslängd om FUdR är närvarande (Figur 4D), men inte på NGM-plattor (Figur 4C)16. Men det finns också andra metoder som innebär dessa utmaningar; UV-dödade bakterier förändrar också livslängden för C. elegans. Majoriteten av rapporterna tyder på att UV-behandlade bakterier förlänger maskens livslängd på NGM12,23 och på FUdR 24, med andra studier som indikerar att UV-behandling inte påverkar livslängden 24 och att det finns en interaktion mellan UV-behandling och FUdR på C. elegans livslängd25,26. Förutom livslängdseffekterna av PFA-behandlade bakterier föredrar maskar att spendera tid på levande bakterier i förhållande till PFA-behandlade bakterier (Figur 3C)16 men har en högre pumphastighet på det PFA-behandlade fodret (Figur 3D). Detta tyder på att de kan konsumera en liknande mängd mat eller att PFA-behandlade bakterier är lättare eller svårare att äta. Många av dessa effekter observeras också med andra metoder för att döda bakterier12,13,14, vilket tyder på att metaboliskt aktiva bakterier minskar utvecklingstiden, förkortar livslängden och är mer attraktiva för C. elegans.
Potentiella användningsområden för PFA-behandlade bakterier
Sammantaget har förmågan att snabbt och tillförlitligt döda stora mängder bakterier stor potential för att eliminera de förvirrande effekterna av bakteriell metabolism i C. elegans-studier. Denna förmåga är särskilt användbar för läkemedelsscreening, tillskottsexperiment, toxicitetsanalyser, metabolomikstudier och undersökning av effekterna av mikrobiell metabolism på värdbeteende. Mer information om användningen av PFA-behandlade bakterier i var och en av dessa applikationer finns nedan.
Läkemedels-, tillskotts- och toxicitetsexperiment: Eftersom endast en platta per sats PFA-behandlade bakterier behöver testas för avdödande framgång, kan PFA-dödade bakterier tillsättas till flytande kultur för läkemedelsscreening med hög genomströmning. PFA-behandlade bakterier kan också sås ut på fasta plattor med små molekyler eller näringsämnen inkorporerade i agarmediet. Fasta plattor med PFA-behandlade bakterier kan också vara användbara för toxicitets- eller stressresponsanalyser. Opublicerade data tyder på att PFA-behandlade bakterier kan hjälpa till att skilja mellan rollen av bakteriella stressresponsvägar och maskstressresistensvägar vid parakvat- och tunicamycinresistens. Att använda PFA-dödade bakterier i dessa läkemedelstillskott och toxicitetsstudier förhindrar bakterier från att metabolisera molekylen av intresse och kommer att säkerställa att alla observerade fenotyper är resultat av en förening som verkar direkt på C. elegans. Att använda metaboliskt döda bakterier för läkemedels- och tillskottsexperiment minimerar också variabiliteten i doseringen, eftersom levande bakterier kan metabolisera olika mängder av föreningen av intresse från experiment till experiment.
Metabolomikstudier: Metabolomikstudier av C. elegans kan också förväxlas med bakteriell metabolism: för att observera förändringar i maskmetabolismen krävs frånvaro av bakteriell metabolisk aktivitet29. Även små förändringar i den bakteriella födokällan kan förändra maskens metabolom. Till exempel skiljer sig metabolomet hos maskar som matas med levande tvättade bakterier från metabolomet hos maskar som matas med levande otvättade bakterier16. Konsumtion av PFA-behandlade bakterier förändrar också maskens metabolom i förhållande till konsumtion av levande föda16 men möjliggör jämförelser mellan effekterna av experimentella förhållanden på C. elegans-metabolismen isolerat från bakteriemetabolismen.
Värd-mikrobbeteendestudier: Slutligen kan PFA-behandlade bakterier användas för att identifiera interaktioner mellan bakteriemetabolism och värdbeteende. Metaboliter som utsöndras av både patogena och icke-patogena bakterier kan vara attraktiva eller avvisande för maskar för att påverka deras födosöks- och födobeteende10,11,30. Dessutom kan bakterier producera neuromodulatorer som driver förändringar i rörelse30. Odling av C. elegans på olika bakteriestammar resulterar dessutom i förändrad yngelstorlek, utvecklingstid och fysiologi31,32. Att behandla dessa bakterier med PFA kan hjälpa till att avgöra om effekterna av en viss bakterie på C. elegans kräver aktiv bakteriell metabolism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av NIH R21AG059117 och Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research vid University of Michigan. SB finansierades av T32AG000114. ESK finansierades av NSF DGE 1841052.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
- Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
- Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
- McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
- Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
- Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
- Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
- Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
- Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 154 (4), 1597-1610 (2000).
- Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal's food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
- Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Felix, H.
- Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
- Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
- MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
- Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
- Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
- Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
- Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
- Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
- O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
- Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
- Dirksen, P., et al. Cembio - the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).
