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Biology

Metodología para la inactivación metabólica de bacterias para la investigación de Caenorhabditis elegans

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65775
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1Molecular and Integrative Physiology Department, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

La fuente de alimento para Caenorhabditis elegans en el laboratorio es Escherichia coli viva. Dado que las bacterias son metabólicamente activas, presentan una variable de confusión en los estudios metabólicos y farmacológicos en C. elegans. Aquí se describe un protocolo detallado para inactivar metabólicamente las bacterias utilizando paraformaldehído.

Abstract

Caenorhabditis elegans es un organismo modelo común para la investigación en genética, desarrollo, envejecimiento, metabolismo y comportamiento. Debido a que C. elegans consume una dieta de bacterias vivas, la actividad metabólica de su fuente de alimento puede confundir los experimentos que buscan los efectos directos de diversas intervenciones en el gusano. Para evitar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano, los investigadores de C. elegans han utilizado múltiples métodos para inactivar metabólicamente las bacterias, incluida la irradiación ultravioleta (UV), la eliminación del calor y los antibióticos. El tratamiento UV tiene un rendimiento relativamente bajo y no se puede utilizar en cultivos líquidos porque cada placa debe examinarse para detectar una eliminación bacteriana exitosa. Un segundo método de tratamiento, la eliminación por calor, afecta negativamente la textura y la calidad nutricional de las bacterias, lo que lleva a la detención del desarrollo de C. elegans. Por último, el tratamiento con antibióticos puede alterar directamente la fisiología de C. elegans , además de prevenir el crecimiento bacteriano. Este manuscrito describe un método alternativo para inactivar metabólicamente bacterias utilizando paraformaldehído (PFA). El tratamiento con PFA retila las proteínas dentro de las células bacterianas para prevenir la actividad metabólica al tiempo que preserva la estructura celular y el contenido nutricional. Este método es de alto rendimiento y se puede utilizar en cultivos líquidos o placas sólidas, ya que la prueba de crecimiento de una placa de bacterias tratadas con PFA valida todo el lote. La inactivación metabólica a través del tratamiento con PFA se puede utilizar para eliminar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano en los estudios de suplementación con fármacos o metabolitos, resistencia al estrés, metabolómica y comportamiento en C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans fue propuesto originalmente como un organismo modelo en 19651 y desde entonces ha sido ampliamente adoptado en estudios de genética, desarrollo, comportamiento, envejecimiento y metabolismo2. Debido a su gran tamaño de cría y a su cutícula transparente, C. elegans es especialmente adecuado para el cribado de alto rendimiento con reporteros fluorescentes3. Su corto ciclo de vida, su reproducción hermafrodita y su homología genética con los humanos también hacen de C. elegans un valioso sistema modelo para estudios sobre el desarrollo4 y la biología del envejecimiento5. Además, C. elegans es relativamente fácil de mantener. Los gusanos pueden cultivarse en cultivo líquido o en placas de agar sólido y consumir una dieta de bacterias vivas Escherichia coli OP504.

Sin embargo, la fuente de alimento vivo de C. elegans puede confundir los estudios sobre el metabolismo, la suplementación con medicamentos y el comportamiento. Debido a que las bacterias vivas tienen su propio metabolismo, las condiciones experimentales que afectan a las bacterias también alteran los nutrientes y metabolitos disponibles para los gusanos. Por ejemplo, las diferencias en las concentraciones bacterianas de hierro, aminoácidos y folato tienen diversos efectos en el desarrollo, la fisiología y la esperanza de vida de C. elegans. Muchas prácticas comunes de laboratorio pueden provocar tales cambios en la composición de nutrientes y metabolitos producidos por OP50. Específicamente, la exposición a la 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR), un compuesto comúnmente utilizado para prevenir la reproducción en C. elegans, provoca amplios cambios en la expresión génica de OP50, incluidas las vías de biosíntesis de aminoácidos7. Las bacterias vivas también pueden confundir los estudios en los que C. elegans se complementa con moléculas pequeñas porque las bacterias pueden metabolizar parcial o completamente los compuestos activos. Además, los efectos de estas pequeñas moléculas sobre las bacterias pueden, a su vez, alterar la fisiología de C. elegans, como se informó con el fármaco metformina8, que prolonga la vida útil. Finalmente, las bacterias vivas pueden cambiar el entorno del gusano de maneras que alteran el comportamiento, como la secreción de olores atractivos9, la producción de neuromoduladores exógenos10 y la creación de gradientes de oxígeno en un césped de bacterias densas11.

Para mitigar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano en la investigación de C. elegans , se han desarrollado múltiples métodos para matar bacterias (Tabla 1). Tres estrategias comunes para eliminar la OP50 son la irradiación UV, la eliminación del calor y el tratamiento con antibióticos. Si bien son sencillos y de costo relativamente bajo, cada uno de estos métodos puede tener efectos indeseables tanto en las bacterias como en C. elegans. La eliminación de UV a través de un reticulante UV12 es de bajo rendimiento y la velocidad está limitada por el número de placas que pueden caber en el reticulante UV. Además, la eficacia de la eliminación de los rayos UV puede variar de una placa a otra dentro de un lote, y las pruebas de crecimiento en todas las placas pueden resultar difíciles en experimentos grandes. Matar el calor de OP50 al exponer el cultivo a temperaturas de >60 °C conlleva un conjunto separado de desafíos. Las altas temperaturas pueden dañar los nutrientes esenciales para la lombriz y destruir la estructura celular de las bacterias, creando una textura más suave que disminuye la cantidad de tiempo que las lombrices pasan enla comida. Este método tampoco se puede utilizar durante todo el ciclo de vida de C. elegans porque los gusanos alimentados con bacterias muertas por calor pueden detenerse en las primeras etapas del desarrollo13. El tratamiento con antibióticos es un tercer método común para suprimir el metabolismo bacteriano14, pero los antibióticos también pueden alterar el crecimiento y el metabolismo de las lombrices15.

Una solución para eliminar los efectos metabólicos de las bacterias vivas mientras se preserva la estructura bacteriana y los nutrientes esenciales es matar el OP50 con paraformaldehído (PFA)16. El PFA es un polímero de formaldehído que puede reticularmente proteínas dentro de las células17 para evitar la replicación bacteriana sin destruir las estructuras celulares internas como la membrana plasmática interna18. Debido a esta preservación de la estructura celular interna, las bacterias tratadas con PFA no exhiben crecimiento ni actividad metabólica, pero siguen siendo una fuente de alimento comestible y rica en nutrientes para C. elegans16. Aquí, se proporciona un protocolo detallado que muestra cómo inactivar metabólicamente las bacterias usando paraformaldehído.

Método Materiales requeridos ¿Escalable? ¿Nutricional? ¿Efectos en Worm?
UV Reticulante UV Limitado por: Sí Efectos variables sobre la esperanza de vida en NGM12, 23, 24
Número de placas que caben en el reticulante UV Efectos variables sobre la vida útil en FUdR24, 26, 27
Tiempo de irradiación por placa Disminución de la preferencia alimentaria16
Capacidad para revisar el crecimiento de cada placa8
Calor Incubadora a >60 °C Sí No: destruye la pared celular, disminuye el valor nutricional Detención del desarrollo 13
Disminución de la preferencia alimentaria13
Prolonga la vida útil de NGM31
Antibióticos Antibióticos (kanamicina, carbenicilina, etc.) Sí Sí Retrasa el crecimiento y el desarrollo15
Prolonga la vida útil en medios líquidos19
Prolonga la vida útil de NGM15
PFA 0,5% Paraformaldehído Sí Sí Disminución del tamaño de las crías pequeñas16
Pequeño aumento del tiempo de desarrollo16
Disminución de la preferencia alimentaria16

Tabla 1. Comparaciones de métodos para matar OP50. La eliminación de los rayos UV, la eliminación del calor, el tratamiento con antibióticos y el tratamiento con PFA tienen efectos variados sobre el estado nutricional de las bacterias y la salud de las lombrices alimentadas con bacterias tratadas. Estos métodos para inactivar replicativamente E. coli también difieren en sus materiales requeridos y escalabilidad.

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Protocol

1. Inoculación de bacterias

  1. Preparar caldo de Luria (LB) disolviendo 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de cloruro de sodio (NaCl) en 950 mL de agua destilada.
  2. Ajuste el pH del LB a 7.0 agregando hidróxido de sodio (NaOH) 5M. Esto solo debería requerir alrededor de 0.2 mL de NaOH.
  3. Autoclave el medio LB ajustado por pH en un ciclo de líquido durante 45 minutos a 15 psi. Deje que la solución se enfríe y guárdela a temperatura ambiente.
  4. Inocular una sola colonia de bacterias en 100 mL de LB en un matraz Erlenmeyer de 500 mL. Cultive las bacterias durante la noche en una incubadora agitadora a 37 °C.
  5. Dependiendo de la salud de la colonia bacteriana, el tamaño del matraz y la velocidad a la que esté ajustado el agitador, el tiempo que tardan las bacterias en crecer puede variar. Después de ~14 h, verifique la densidad óptica (OD) de las bacterias a 600 nm (OD600).
  6. Retire las bacterias del agitador cuando el diámetro exterior600 sea 3.0 (1 x 109 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml). Si el diámetro exterior600 es inferior a 3,0, devuelva el matraz a la incubadora agitadora hasta alcanzar el diámetro exterior deseado.
  7. Alícuota de las bacterias en tubos cónicos de 50 ml y almacenarlas a 4 °C o continuar con el siguiente paso.

2. Trabajar con paraformaldehído

NOTA: La concentración de paraformaldehído (PFA) utilizada y la duración de la exposición pueden variar un poco según el clima, la ubicación y el tipo de bacteria que se esté tratando. Un buen punto de partida para OP50 es la exposición a PFA al 0,5% durante 1 h, mientras que el PFA al 0,25% durante 1 h puede ser suficiente para HT115.

  1. Prepare existencias de PFA al 32 % o use una solución de PFA al 32 % comprada comercialmente. Use el equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando trabaje con PFA. Use guantes y protección para los ojos.
  2. Agregue PFA dentro de una campana de extracción de gases químicos con ventilación adecuada. Deseche los lavados y puntas que contengan PFA en recipientes adecuados para productos químicos peligrosos en la campana extractora.

3. Tratamiento bacteriano con paraformaldehído

  1. Una vez que las bacterias alcancen un OD600 de 3,0, utilice una pipeta serológica para transferir 50 ml a un nuevo matraz Erlenmeyer de 250 ml. Guarde el resto para un control en vivo, un control simulado (consulte el paso 4) o para tratar también con PFA según sea necesario.
  2. Evite verter de un matraz a otro y tenga cuidado de no salpicar los lados del nuevo matraz con bacterias. Las colonias en el costado del matraz pueden recibir una dosis más baja de PFA.
  3. En la campana química, agregue 781 μL de PFA al 32% a 50 ml de bacterias para llevar la concentración final al 0,5%. Deseche la punta utilizada en un contenedor de desechos sólidos para productos químicos peligrosos.
  4. Cubra el matraz con papel de aluminio y vuelva a colocarlo en la incubadora agitadora a 37 °C durante 1 h. Después de 1 h, retire el matraz de la incubadora y continúe con el paso 5.

4. Control simulado

  1. Una vez que las bacterias alcancen un OD600 de 3,0, utilice una pipeta serológica para transferir 50 ml de las bacterias a un tubo cónico de 50 ml.
  2. Continúe con el paso 5.3 para completar los pasos de lavado similares a los del grupo tratado con PFA.

5. Lavar las bacterias para eliminar los residuos de PFA

  1. En la campana química, utilice una pipeta serológica para transferir las bacterias tratadas del matraz Erlenmeyer a un tubo cónico de 50 ml. El uso de una pipeta serológica en lugar de verter las bacterias evitará la contaminación de cualquier colonia bacteriana en el borde del matraz que pueda haber evitado el tratamiento directo con PFA.
  2. Centrifugar las bacterias tratadas a aproximadamente 3000 x g durante 20 min. Retire el sobrenadante desechándolo en un contenedor de residuos líquidos peligrosos para productos químicos en la campana química.
  3. Agregue 25 ml de LB y vórtice para resuspender el gránulo bacteriano (llenar el tubo por completo dificulta la resuspensión del gránulo). Repetir la centrifugación y la resuspensión de pellets 4 veces.
  4. Vuelva a suspender el gránulo en volúmenes óptimos para diferentes ensayos. Para los ensayos de vida útil, siembre placas de 60 mm con 200 μL de bacterias resuspendidas en 10 mL de LB. La resuspensión de las bacterias en 10 mL de LB da como resultado una concentración de 5 veces mayor que el cultivo original de 50 mL.
  5. Almacenar las bacterias a 4 °C.

6. Control de calidad del crecimiento bacteriano

  1. Después del lavado final y la resuspensión, raye una placa LB (con una punta de pipeta estéril) con las bacterias preparadas. Es una buena práctica rayar el LB utilizado para lavar y volver a suspender en una placa separada para asegurarse de que el LB utilizado no esté contaminado.
  2. Coloque las placas en una incubadora a 37 °C durante la noche. Compruebe si hay algún crecimiento. Las bacterias se consideran muertas replicativamente cuando las colonias no crecen en la placa LB.

7. Control de calidad del metabolismo bacteriano mediante un respirómetro

  1. Después del lavado final y la resuspensión del paso 5.4, confirme que las bacterias están metabólicamente muertas utilizando las herramientas disponibles, como los respirómetros19,20 y midiendo la tasa de consumo basal de oxígeno (OCR).
  2. Preparar la solución M9: Disolver 3 g de fosfato de potasio monobásico (KH 2 PO 4),6 g de fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4) y 5 g de cloruro de sodio (NaCl) en 950 ml de agua destilada. Autoclave en un ciclo de líquido durante 45 minutos a 15 psi, luego deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Agregue 1 mL de sulfato de magnesio 1 M (MgSO4) y guárdelo a temperatura ambiente.
  3. Hidratar el cartucho del respirómetro: Agregue 200 μL de calibrante a todos los pocillos de una placa de 96 pocillos. Coloque el cartucho en la placa de 96 pocillos e incube durante la noche en una incubadora a 37 °C.
  4. Calibración del ensayo: Al día siguiente, coloque el cartucho hidratado en la máquina y comience la calibración.
  5. Configuración de la placa de prueba de ensayo: Con una nueva placa de 96 pocillos, agregue 160 μL de M9 y 40 μL de las bacterias preparadas (1 x 109 UFC/mL) para probar los pocillos. Agregue 200 μL de M9 a los 4 pocillos de esquina para usarlos como pocillos en blanco. Añadir 160 μL de M9 y 40 μL de LB utilizados para lavar y resuspender para usar como controles negativos. Añadir 200 μL de M9 al resto de pocillos que no se vayan a utilizar.
  6. Ejecute el ensayo: Una vez completada la calibración del cartucho, inserte la placa de ensayo del paso 7.5 en la máquina para su análisis. Los ajustes incluyen pasos para mezclar, esperar, medir y hacer un bucle. Los resultados se mostrarán como tasa de consumo de oxígeno (OCR). Las bacterias están metabólicamente muertas y listas para usar cuando el OCR es cero.

Figure 1
Figura 1. Flujo de trabajo para el tratamiento con paraformaldehído. Una sola colonia de la bacteria E. coli OP50 se cultiva durante la noche. Se añade PFA a una concentración final del 0,5% y el cultivo tratado con PFA se agita durante 1 h a 37 °C. Finalmente, el PFA se elimina lavando el cultivo con LB fresco 5x. Para confirmar que las bacterias tratadas están inactivas de forma replicativa, saque una placa LB de las bacterias tratadas y crezca durante la noche. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

En la Figura 1 se muestra un flujo de trabajo detallado del protocolo. Se desarrolló y optimizó un método de alto rendimiento para inactivar consistentemente la replicación bacteriana (Figura 2A) y el metabolismo (Figura 2B) para estudios metabólicos y de fármacos en la investigación de C. elegans utilizando paraformaldehído16. El objetivo era determinar la concentración más baja de PFA necesaria y la menor cantidad de tiempo requerida para matar las bacterias de manera consistente sin afectar varias medidas de salud en los gusanos. Estos valores pueden variar de un lugar a otro dependiendo del entorno del laboratorio y de una cepa bacteriana a otra. Por ejemplo, la exposición de la bacteria HB101 al 0,25% durante 1 h es suficiente para hacerla metabólicamente inactiva (Figura 2C), mientras que Enterococcus faecalis (EF) requiere una concentración de PFA del 1,0% (Figura 2D) para un efecto consistente. Previamente se estableció un enfoque para la optimización individual del laboratorio16 y se detalla en este trabajo actual.

Atracción y consumo de alimentos
A medida que las bacterias crecen y se replican, liberan varios metabolitos y feromonas que son atractivos para los gusanos. Para determinar si los gusanos siguen siendo atraídos por el OP50 tratado con PFA, las placas se sembraron con OP50 tratado con PFA o simulado y se tabularon el porcentaje de gusanos presentes en el césped alimentario en comparación con el resto del césped. Los datos muestran que los gusanos se sienten atraídos por el OP50 tratado con PFA, ya que la mayoría de los gusanos permanecen en el césped bacteriano después de 1 h (Figura 3A), similar a lo que se observa con el control tratado con simulacro (Figura 3B). Sin embargo, como era de esperar, un ensayo sensible por pares21 muestra que C. elegans tiene una mayor preferencia por el control vivo tratado con simulacro (Figura 3C) cuando se siembra con el PFA tratado en la misma placa. Habiendo establecido que los gusanos se sienten atraídos por las bacterias muertas por PFA, aunque menos que las bacterias vivas, era imperativo establecer que comen los alimentos muertos por PFA. Para determinar si las lombrices consumen el OP50 tratado con PFA, se midió la tasa de bombeo de las lombrices en diferentes tipos de alimentos. Como se muestra en la Figura 3D, los gusanos en OP50 tratados con PFA tienen una tasa de bombeo más alta (+25%) que los gusanos en el control tratado simulado. Esto indica que los gusanos no están disminuyendo deliberadamente su ritmo de alimentación de alimentos muertos con PFA y podría indicar una mayor tasa de alimentación o una respuesta compensatoria a un cambio en la facilidad de bombeo de los alimentos tratados.

Fecundidad, desarrollo y esperanza de vida
Los cambios en las condiciones alimentarias pueden tener efectos fisiológicos sobre las lombrices13,22. Para probar los efectos generales, se midieron los cambios en la tasa de desarrollo, la fecundidad y la esperanza de vida. El OP50 tratado con PFA retrasa ligeramente el tiempo de desarrollo (~4 h) de los gusanos N2 de tipo salvaje, como se muestra en la Figura 4A. El monitoreo de la capacidad de puesta de huevos de gusanos cultivados en diferentes condiciones bacterianas muestra una disminución leve pero significativa en la fecundidad (-21%) en los gusanos alimentados con OP50 tratados con PFA (Figura 4B). Para los laboratorios interesados en el envejecimiento de C. elegans, se determinó el efecto de la OP50 tratada con PFA sobre la longevidad. Curiosamente, la vida útil de los gusanos de tipo salvaje alimentados con OP50 tratados con PFA no fue significativamente diferente de la de los gusanos alimentados con OP50 tratados simuladamente en placas de medios de crecimiento de nematodos (NGM) estándar (Figura 4C), sin embargo, el OP50 tratado con PFA aumenta la vida útil de tipo salvaje (+23%) cuando FUdR está presente (Figura 4D). La alimentación con OP50 tratada con PFA a una cepa20 de sobreexpresión de fmo-2 (OE) de larga vida no altera su longevidad en comparación con los gusanos de tipo salvaje (Figura 4E). También se ha demostrado que la OP50 eliminada por los rayos UV, el calor y los antibióticos altera la esperanza de vida de C. elegans. Específicamente, se ha informado que las bacterias tratadas con UV prolongan la vida útil en NGM12,23 y en FUdR 24. Sin embargo, existen datos contradictorios sobre la interacción de FUdR y las bacterias muertas por UV25,26 que pueden deberse a los diversos métodos de eliminación de UV y validación de la inactividad metabólica en las bacterias. Además, las bacterias muertas por calor prolongan la vida útil en NGM27, y los antibióticos prolongan la vida útil en NGM15 y en cultivo líquido28.

Figure 2
Figura 2. El tratamiento de bacterias con PFA inhibe la proliferación y el metabolismo. (A) Crecimiento de bacterias en unidades formadoras de colonias (UFC) de OP50 tratadas simuladas y tratadas con PFA al 0,5%. (B) Tasa de acidificación extracelular (ECAR) en mH/min de OP50 simulada y tratada con PFA al 0,5%. (C) Tasa de consumo basal de oxígeno (OCR) en pmol/min de HB101 tratado simuladamente, tratado con PFA al 0,25% y tratado con PFA al 0,5%. (D) Tasa basal de consumo de oxígeno (OCR) en pmol/min de enterococcus faecalis (EF) tratado con simulación, tratado con PFA al 0,25%, tratado con PFA al 0,5% y tratado con PFA al 1,0%. Todas las barras de error que se muestran en las figuras representan el error estándar de la media (SEM); Se utilizó una prueba t de dos colas para obtener los valores de p. denota un valor p < 0,0001. Esta cifra ha sido modificada de 16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Los gusanos se sienten atraídos por el OP50 tratado con PFA. Porcentaje de gusanos atraídos por (A) césped bacteriano OP50 tratado con PFA o (B) tratado con simulacro de OP50. (C) Ensayo sensibilizado por pares que prueba la preferencia de gusanos por OP50 tratada simuladamente y tratada con PFA. (D) Velocidad de bombeo (bombas por 30 s) de gusanos en OP50 tratado con PFA o simulado. Se utilizó un análisis de prueba t de dos colas para obtener los valores p para todas las comparaciones. Todas las barras de error que se muestran en las figuras representan el error estándar de la media (SEM); denota un valor p < 0,0001. Los paneles A-C se han modificado de 16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Los gusanos crecen y se desarrollan en OP50 tratados con PFA. (A) Tiempo de desarrollo (h) de gusanos de adultos ponedoras de huevo a huevo en OP50 tratado simulado y tratado con PFA. (B) Progenie promedio (número de gusanos) de gusanos alimentados con OP50 tratados con simulacro o PFA. (C, D) Porcentaje de gusanos vivos alimentados con OP50 simulado o tratado con PFA en placas de vida útil (C) NGM y (D) FUdR. (E) Porcentaje vivo de gusanos OE de tipo salvaje y fmo-2 alimentados con OP50 tratados con PFA. Se utilizó un análisis de prueba t de dos colas para derivar los valores p para las comparaciones de desarrollo y fecundidad. Se utilizó la prueba de rango logarítmico para derivar los valores p para las comparaciones de la vida útil. Todas las barras de error que se muestran en las figuras representan el error estándar de la media (SEM); * denota un valor p < 0,05, *** denota un valor p <0,001 y **** denota un valor p < 0,0001. Los paneles A, B y D se han modificado de16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Beneficios de la eliminación de PFA en relación con otros métodos de eliminación de bacterias
El tratamiento con PFA es un método de alto rendimiento para prevenir el metabolismo bacteriano mientras se mantiene una fuente de alimento nutritivo para C. elegans. La eliminación de bacterias mediante el tratamiento con PFA tiene múltiples ventajas sobre otros métodos. A diferencia del tratamiento UV, en el que cada placa debe probarse para comprobar si se ha eliminado con éxito, se puede analizar una sola placa de un lote de bacterias tratadas con PFA para validar el lote16. El tratamiento con PFA también es muy eficaz para eliminar el metabolismo bacteriano (Figura 2B), y las bacterias tratadas con PFA exhiben una actividad metabólica disminuida en relación con las bacterias tratadas con antibióticos19. Otro beneficio del tratamiento con PFA es que las bacterias mantienen su estructura celular y perfil nutricional. En consecuencia, los gusanos pueden desarrollarse en bacterias tratadas con PFA, mientras que la alimentación de bacterias muertas por calor a partir de huevos da como resultado la detención del desarrollo13,16.

Pasos críticos y solución de problemas
Si bien el tratamiento de bacterias con PFA es un protocolo relativamente sencillo, es importante validar que cada lote de bacterias esté muerto replicativa y metabólicamente (pasos 6 y 7) y asegurarse de que los pasos de lavado después del tratamiento con PFA se realicen a fondo (paso 5). Si las colonias crecen en el paso 6, lo que indica que la bacteria no está completamente muerta, es posible solucionar problemas de concentración de PFA y duración del tratamiento con PFA en el paso 3. Al optimizar el protocolo de tratamiento con PFA, una concentración del 0,5% de PFA fue ideal para matar con éxito la OP50 con efectos secundarios mínimos. El 0,25 % de PFA no fue suficiente para matar metabólicamente todas las cepas de bacterias (Figura 2C-D) y el aumento de la concentración al 0,5 % de PFA no alteró el tiempo de desarrollo, la esperanza de vida o la preferencia alimentaria de los gusanos en OP50 en relación con el 0,25 % de PFA. Además, 1 h de inoculación con PFA fue el tiempo más corto suficiente para prevenir todo el crecimiento bacteriano. Si las bacterias no se eliminan por completo mediante una inoculación de 1 h con PFA al 0,5%, se puede aumentar el tiempo de inoculación y/o la concentración de PFA para solucionar problemas de eficiencia de eliminación. Un segundo paso clave en el protocolo es lavar las bacterias después del tratamiento con PFA (paso 5). Es muy importante completar los cinco lavados y eliminar completamente el sobrenadante con cada lavado para asegurarse de que no quede formaldehído en las bacterias. Si las lombrices no crecen bien o no bombean las bacterias tratadas con PFA, se pueden realizar lavados adicionales.

Limitaciones del método
Si bien las bacterias muertas por PFA son ideales para eliminar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano (Figura 2B) de los estudios de C. elegans, este método tiene limitaciones. Específicamente, C. elegans tiene un desarrollo ligeramente más lento en las bacterias tratadas con PFA en relación con las bacterias vivas (Figura 4A)16. El tratamiento con PFA también prolonga la vida útil del gusano si FUdR está presente (Figura 4D), pero no en las placas NGM (Figura 4C)16. Sin embargo, otros métodos también presentan estos desafíos; Las bacterias muertas por los rayos UV también alteran la esperanza de vida de C. elegans. La mayoría de los informes sugieren que las bacterias tratadas con UV prolongan la vida útil de los gusanos en NGM12,23 y en FUdR 24, y otros estudios indican que el tratamiento UV no afecta la vida útil 24 y que existe una interacción entre el tratamiento UV y FUdR en la vida útil de C. elegans 25,26. Además de los efectos de la vida útil de las bacterias tratadas con PFA, los gusanos prefieren pasar tiempo en bacterias vivas en relación con las bacterias tratadas con PFA (Figura 3C)16, pero tienen una tasa de bombeo más alta en los alimentos tratados con PFA (Figura 3D). Esto sugiere que pueden consumir una cantidad similar de alimentos o que las bacterias tratadas con PFA son más fáciles o más difíciles de comer. Muchos de estos efectos también se observan con otros métodos para matar bacterias12,13,14, lo que sugiere que las bacterias metabólicamente activas disminuyen el tiempo de desarrollo, acortan la vida útil y son más atractivas para C. elegans.

Posibles aplicaciones de las bacterias tratadas con PFA
En general, la capacidad de matar de forma rápida y fiable grandes lotes de bacterias tiene un gran potencial para eliminar los efectos de confusión del metabolismo bacteriano en los estudios de C. elegans. Esta capacidad es particularmente útil para pruebas de detección de fármacos, experimentos de suplementación, ensayos de toxicidad, estudios metabolómicos y para examinar los efectos del metabolismo microbiano en el comportamiento del huésped. A continuación encontrará más información sobre el uso de bacterias tratadas con PFA en cada una de estas aplicaciones.

Experimentos de fármacos, suplementos y toxicidad: Debido a que solo es necesario probar una placa por lote de bacterias tratadas con PFA para determinar su éxito en la eliminación, las bacterias muertas con PFA se pueden agregar al cultivo líquido para la detección de medicamentos de alto rendimiento. Las bacterias tratadas con PFA también se pueden sembrar en placas sólidas con pequeñas moléculas o nutrientes incorporados en el medio de agar. Las placas sólidas sembradas con bacterias tratadas con PFA también podrían ser útiles para ensayos de toxicidad o respuesta al estrés. Los datos no publicados sugieren que las bacterias tratadas con PFA pueden ayudar a distinguir entre el papel de las vías de respuesta al estrés bacteriano y las vías de resistencia al estrés de los gusanos en la resistencia al paraquat y la tunicamicina. El uso de bacterias muertas por PFA en estos estudios de suplementación y toxicidad de fármacos evita que las bacterias metabolicen la molécula de interés y garantizará que cualquier fenotipo observado sea el resultado de un compuesto que actúe directamente sobre C. elegans. El uso de bacterias metabólicamente muertas para experimentos de fármacos y suplementos también minimiza la variabilidad en la dosificación, ya que las bacterias vivas pueden metabolizar diferentes cantidades del compuesto de interés de un experimento a otro.

Estudios metabolómicos: Los estudios metabolómicos de C. elegans también pueden confundirse con el metabolismo bacteriano: la observación de cambios en el metabolismo de los gusanos requiere la ausencia de actividad metabólica bacteriana29. Incluso pequeños cambios en la fuente de alimento bacteriano pueden alterar el metaboloma del gusano. Por ejemplo, el metaboloma de los gusanos alimentados con bacterias vivas lavadas difiere del metaboloma de los gusanos alimentados con bacterias vivas sin lavar16. El consumo de bacterias tratadas con PFA también cambia el metaboloma del gusano en relación con el consumo de alimentos vivos16 , pero permite comparaciones entre los efectos de las condiciones experimentales en el metabolismo de C. elegans de forma aislada del metabolismo bacteriano.

Estudios de comportamiento huésped-microbio: Por último, las bacterias tratadas con PFA podrían utilizarse para identificar las interacciones entre el metabolismo bacteriano y el comportamiento del huésped. Los metabolitos secretados por bacterias patógenas y no patógenas pueden ser atractivos o repelentes para las lombrices y afectar su comportamiento de alimentacióny alimentación 10,11,30. Además, las bacterias pueden producir neuromoduladores que impulsan cambios en la locomoción30. Además, el cultivo de C. elegans en diferentes cepas de bacterias da como resultado una alteración en el tamaño de la cría, el tiempo de desarrollo y la fisiología31,32. El tratamiento de estas bacterias con PFA puede ayudar a determinar si los efectos de una bacteria determinada en C. elegans requieren un metabolismo bacteriano activo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por NIH R21AG059117 y los Laboratorios Paul F. Glenn para la Investigación de la Biología del Envejecimiento de la Universidad de Michigan. SB fue financiado por T32AG000114. ESK fue financiado por NSF DGE 1841052.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum Foil Staples 2549291
Bunsen burner VWR 470121-700 
Cell Density Meter Denville 80-3000-45 
Centrifuge Eppendorg 5430
Chemical fume hood Labcono 975050411384RG
Conincal tubes (50 mL) Fisher 339652
Cuvettes  Fisher 14-955-127
E. coli OP50 CGC OP50
Erlenmyer flasks Fisher 250 mL: FB501250
500 mL: FB501500
1000 mL: FB5011000
Inoculation loop Fisher 22-363-605
LB Agar Fisher BP1425500
Liquid waste collection bottle Thomas Scientific 1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma M7506
Paraformaldehyde (32%) Electron Microscopy Sciences 15714-S Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor Eppendorf Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm) Fisher FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher P2853
Seahorse XF Calibrant Agilent 100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate Agilent 101085-004
Serological pipettes (50 mL) Genesee Scientific 12-107
Shaker incubator Thermo 11 676 083
Sodium Chloride (NaCl) Fisher S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) Sigma S374-500
Solid waste collection bucket M&M Industries  5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone Genesee Scientific 20-251
Vortex Thermo 11676331
Weighing balance C Goldenwall HZ10K6B
Yeast Extract Genesee Scientific 20-255

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References

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Bacterias metabólicamente inactivas Investigación de Caenorhabditis elegans Investigación genética Investigación de desarrollo Investigación sobre el envejecimiento Investigación sobre el metabolismo Investigación del comportamiento Metabolismo bacteriano Irradiación UV Eliminación del calor Antibióticos Tratamiento con PFA Tratamiento con paraformaldehído Método de alto rendimiento
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Beydoun, S., Kitto, E. S., Wang, E., Huang, S., Leiser, S. F. Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research. J. Vis. Exp. (197), e65775, doi:10.3791/65775 (2023).

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