Summary
Este protocolo presenta un sistema de pruebas utilizado para inducir lesiones por fatiga cuantificables y controladas en el tendón de Aquiles de una rata para un modelo in vivo de tendinopatía inducida por uso excesivo. El procedimiento consiste en asegurar el tobillo de la rata a un actuador articular que realiza la dorsiflexión pasiva del tobillo con un script de MATLAB escrito a medida.
Abstract
La tendinopatía es una afección crónica del tendón que provoca dolor y pérdida de función y es causada por la sobrecarga repetida del tendón y el tiempo de recuperación limitado. Este protocolo describe un sistema de pruebas que aplica cíclicamente cargas mecánicas a través de la dorsiflexión pasiva al tendón de Aquiles de la rata. El código escrito a medida consiste en mediciones de carga pre y postcíclicas para evaluar los efectos del protocolo de carga junto con el régimen de carga de fatiga cíclica basado en el control de retroalimentación.
Utilizamos 25 ratas Sprague-Dawley para este estudio, con 5 ratas por grupo que recibieron 500, 1.000, 2.000, 3.600 o 7.200 ciclos de cargas de fatiga. Se calcularon las diferencias porcentuales entre las medidas de carga pre y postcíclica de la histéresis, el estrés máximo y los módulos de carga y descarga. Los resultados demuestran que el sistema puede inducir diversos grados de daño al tendón de Aquiles en función del número de cargas aplicadas. Este sistema ofrece un enfoque innovador para aplicar diferentes grados cuantificados y fisiológicos de cargas cíclicas al tendón de Aquiles para un modelo in vivo de lesión del tendón por uso excesivo inducida por fatiga.
Introduction
Como los tendones conectan el músculo con el hueso y experimentan movimientos repetitivos diarios a lo largo de su vida, son muy propensos a sufrir lesiones por uso excesivo que son dolorosas y limitantes y dan lugar a un deterioro de la función mecánica, que afecta al 30-50% dela población. Las tendinopatías son afecciones crónicas consideradas lesiones por uso excesivo debido a movimientos repetitivos de fatiga y una cicatrización inadecuada a los niveles previos a la lesión. Tanto las extremidades superiores como las inferiores se ven comúnmente afectadas, incluyendo el manguito rotador, el codo, el tendón de Aquiles y el tendón rotuliano 2,3,4,5. La tendinopatía de Aquiles es común en actividades que involucran correr y saltar, especialmente en atletas involucrados en atletismo, carreras de media y larga distancia, tenis y otros deportes de pelota, afectando al 7-9% de los corredores 6,7. Las lesiones por correr y saltar también pueden causar una dorsiflexión limitada del tobillo, que es un factor de riesgo para las tendinopatías de Aquiles y rotuliana 8,9,10. Por lo tanto, existe la necesidad de una mejor evaluación y caracterización de la tendinopatía, que este estudio puede proporcionar como un modelo de rata de dorsiflexión pasiva del tobillo para lesiones del tendón de Aquiles por uso excesivo.
Trabajos anteriores con modelos de animales pequeños han estado dirigidos a estudiar el desarrollo y los marcadores de la tendinopatía. Estos incluyen el ejercicio en cinta rodante, el alcance repetitivo, la carga directa del tendón, las inyecciones de colagenasa, la cirugía y los estudios in vitro 11,12,13,14,15,16. Aunque la literatura se ha beneficiado de la identificación de marcadores de daño mediante el empleo de estos modelos de tendinopatía, las limitaciones incluyen la carga del tendón en movimientos articulares no fisiológicamente relevantes, como en el caso de la carga directa del tendón, la no medición directa de las cargas aplicadas, como en el caso de los estudios en cinta rodante, y la no utilización fisiológica excesiva, como en el caso de las inyecciones de colagenasa. entre otros. Con ese fin, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un sistema que aplique cargas cuantificadas de forma no invasiva al tendón de Aquiles con la aplicación de estudios de tendinopatía inducida por uso excesivo para llenar los vacíos en modelos de tendinopatía de animales pequeños desarrollados anteriormente. Realizamos un estudio piloto para demostrar que el sistema induce cambios reproducibles en las propiedades mecánicas a lo largo de un rango de ciclos de carga. Este sistema permite que el movimiento y la carga fisiológicamente relevantes induzcan el uso excesivo y, al mismo tiempo, cuantifiquen y midan las fuerzas aplicadas y experimentadas por el tendón durante el régimen de carga.
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Protocol
Este estudio se llevó a cabo según la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) en el Centro Médico Beth Israel Deaconess. Los animales fueron anestesiados con isoflurano al 5% para la inducción y al 2,5% para el mantenimiento, y se tuvo cuidado de evitar la hipotermia.
1. Configuración del sistema de pruebas
- Controle la rotación pasiva del tobillo mediante un motor paso a paso para aplicar una rotación y un par constantes. Controle el motor paso a paso con un microcontrolador. Utilice las entradas del sistema de posición y orientación 3D para marcar los grados de rotación. Utilice las salidas del sensor de par para proporcionar control de retroalimentación para aumentar el ángulo de dorsiflexión si no se alcanza el límite del umbral.
- Para comenzar, conecte el microcontrolador, el sensor de par, el posicionamiento electromagnético 3D y el sistema de orientación a una computadora y a la fuente de alimentación. Controle el sistema personalizado mediante un código de MATLAB desarrollado internamente (Figura 1). Descargue los archivos de código de MATLAB desde GitHub y siga las instrucciones específicas sobre cómo ejecutar el código desde las instrucciones de la página de GitHub (https://github.com/Nazarian-Lab/PassiveAnkleDorsiflexionSystem).
- Abra MATLAB con los archivos de código. Abra el software PDImfc para conectar el sistema de posicionamiento y orientación electromagnético 3D al programa MATLAB. Haga clic en Conectar | Operaciones continuas | StartSockExport(). Mantenga la aplicación abierta en segundo plano.
2. Ex-vivo y post-mortem
- Eutanasia a seis ratas Sprague-Dawley de 13 semanas de edad mediante inhalación de CO2 y un método secundario de eutanasia mediante toracotomía. Diseccionar el tendón de Aquiles derecho con el calcáneo y la unión miotendinosa intactos. Congele a -20 °C para realizar pruebas mecánicas en un momento posterior. Después de que el tendón se descongele, se diseccione finamente y se prepare para la prueba mecánica, realice la carga de tracción hasta la falla para obtener la resistencia máxima a la tracción (UTS) del tendón (precarga a 0.1 N, preacondicionamiento durante 10 ciclos de 0.1 a 1 N, rampa a la falla a un desplazamiento constante de 0.1 mm/s). Utilice el 15% del UTS como entrada para que el sistema realice el preacondicionamiento para un paso posterior, como se describe en el paso 3.4.
- Sacrificar a otro grupo de cinco animales con el mismo procedimiento para medir el momento, el brazo y la deformación. Realizar una radiografía de la pierna izquierda con el tobillo en dorsiflexión de 90° junto a una regla como referencia. Abra la imagen de rayos X en Fiji, utilizando la regla de la imagen como referencia, mida el brazo de momento del tendón desde el centro de rotación de la articulación del tobillo hasta la parte posterior del tobillo que se utilizará como entrada en el código de MATLAB para convertir la fuerza de entrada para el preacondicionamiento descrito en el paso 2.1 al valor de par correspondiente, así como la conversión entre el par de salida y la fuerza para el análisis de datos.
- Inmoviliza la extremidad posterior izquierda con cinta adhesiva con dos férulas para colocar la rodilla en extensión completa. Dorsiflexionar ligeramente el tobillo empujando los dedos de los pies para asegurarse de que la rotación del tobillo se produzca debido al tendón aislado en lugar de involucrar los tejidos blandos circundantes y esté en tensión. Si no está en tensión o si hay movimiento en la rodilla, vuelva a pegar la férula.
- Exponga el tendón quitando la piel alrededor del tendón de Aquiles. Coloque pegamento en una cuenta de aluminio de 1/32 de pulgada, colóquelo en el tendón libre más cercano a la unión miotendinosa del tendón de Aquiles y use un hisopo de algodón con solución salina para eliminar el exceso de pegamento. Aplique repetidamente solución salina en el tendón de Aquiles durante el procedimiento restante para garantizar la humedad del tejido.
- Mida el área de la sección transversal del tendón con un calibrador digital antes de aplicar cualquier carga. Supongamos que el tendón es una elipse y mida el ancho y el grosor por triplicado.
- Coloque a la rata en la plataforma de cuerpo completo en una posición boca abajo. Asegure el tobillo en el actuador de la articulación con una brida alrededor del tobillo y otra alrededor de los dedos de los pies, y asegure la rodilla dividida con dos bridas. Gire el eje para que el tobillo esté en flexión plantar completa.
- Conecte el lápiz digitalizador del sistema de posición y orientación electromagnética 3D al ordenador y encienda la fuente de alimentación.
- Ejecute el código del sistema (descrito con más detalle en el Paso 3) para el número especificado de ciclos (en este estudio, seis ratas sacrificadas recibieron 7.200 ciclos).
- A los ciclos 0, 500, 1.000, 2.000, 3.600 y 7.200 para las mediciones de deformación ex vivo, detenga el régimen de carga cíclica y mida la longitud del tendón desde el calcáneo hasta el cordón de aluminio en incrementos de 5° de 0 a 40° de dorsiflexión (el límite de actuación debido a las limitaciones físicas del sistema) utilizando el bolígrafo digitalizador 3D por triplicado de forma alterna.
- Calcule la tensión del tendón en diferentes ángulos utilizando las longitudes obtenidas en el paso 2.9, donde la longitud inicial es de 0° de dorsiflexión para cada número de ciclo. Realice un ajuste lineal para obtener la relación entre el ángulo de dorsiflexión y la deformación en cada número de ciclo. Utilice esta relación para convertir los datos de ángulo sin procesar en deformación para el análisis de datos.
- Calcule el área de la sección transversal del tendón utilizando un calibrador digital a 40° de dorsiflexión asumiendo incompresibilidad (volumen constante) con las mediciones de la longitud del tendón a 0° y 40° y el área de la sección transversal medida a 0°. Utilice esta área de sección transversal en cada número de ciclos para convertir la fuerza en tensión para el análisis de datos (tensión = fuerza / área de la sección transversal).
3. Protocolo de carga mecánica
- Para esta sección del estudio, utilizamos 25 ratas hembras Sprague-Dawley de 11 semanas de edad, con 5 ratas asignadas aleatoriamente cada una para recibir 500, 1.000, 2.000, 3.600 o 7.200 ciclos de carga de fatiga.
NOTA: El preacondicionamiento, la calibración inicial y la medición previa y posterior tardan alrededor de 15 minutos en ejecutarse, y el régimen de carga de fatiga cíclica tarda 1 segundo por ciclo. Por lo tanto, el tiempo más largo que la rata está bajo anestesia es de alrededor de 2 h, lo que se realizó bajo los protocolos aprobados por la IACUC. - Conecte el microcontrolador, el sensor de par, el posicionamiento electromagnético 3D y el sistema de orientación a una computadora y a la fuente de alimentación. Controle el sistema personalizado utilizando el código de MATLAB desarrollado internamente (Figura 1).
- Encienda el equipo y abra MATLAB con los archivos de código. Abra el software PDImfc para conectar el sistema de posicionamiento y orientación electromagnético 3D al programa MATLAB. Haga clic en Conectar | Operaciones continuas | StartSockExport(). Mantenga la aplicación abierta en segundo plano.
- Inducir la anestesia con isoflurano al 5% por inhalación en una cámara de inducción. Después de la inducción, asegure al animal en la plataforma de cuerpo completo con un elemento calefactor a base de agua conectado para mantener la temperatura y mantener la anestesia con isoflurano al 2.5% a través de un accesorio de cono nasal. Use un ungüento húmedo en los ojos para evitar la sequedad durante la anestesia.
- Coloque a la rata en la plataforma de cuerpo completo en una posición boca abajo. Asegure el tobillo en el actuador de la articulación con una brida alrededor del tobillo y otra alrededor de los dedos de los pies, y asegure la rodilla dividida con dos bridas. Gire el eje para que el tobillo esté en flexión plantar completa.
NOTA: Asegúrese de que las bridas no causen constricción o lesiones, tenga cuidado al apretarlas y, si es necesario, coloque una gasa entre la brida y la piel para obtener una capa de protección. - Para los siguientes pasos que implican la ejecución del código del sistema, haga clic en Ejecutar en MATLAB para cada sección del código correspondiente a la prueba de carga específica.
- Realice un ciclo del tobillo 50 veces hasta el 15% de la tensión de tracción máxima en función del valor de la tensión de tracción máxima del tendón de Aquiles desde la tracción ex vivo hasta las pruebas de falla según lo medido en el paso 2.1.
- Realice una calibración inicial del tendón dorsiflexionándolo tres veces a 12°. Utilice la pendiente de la región lineal de la región de carga de la curva de histéresis para calcular la región exponencial de la curva.
- Dorsiflexión incremental del tobillo en ángulos crecientes hasta que se obtenga la región exponencial de la curva calculando la pendiente del pico de la región de carga de la curva (calculada utilizando el código de MATLAB desarrollado internamente) o hasta que se gire a 40°, lo que ocurra primero.
- En el ángulo final obtenido, realice cinco mediciones mecánicas cíclicas como línea base de precarga.
- Realice el régimen de carga de fatiga cíclica durante un número específico de ciclos (en este estudio, durante 500, 1.000, 2.000, 3.600 o 7.200 ciclos).
- Cada 50 ciclos, calcule la pendiente de la parte de carga de la curva de histéresis (calculada a través del código de MATLAB desarrollado internamente) para asegurarse de que todavía está en la región exponencial. Aumente el ángulo de dorsiflexión en 1° a menos que ya esté a 40° hasta que se logre esta región exponencial.
- Una vez completado el régimen de carga cíclica, realice cinco mediciones mecánicas cíclicas como mediciones posteriores a la carga en el ángulo elegido inicialmente para medir las propiedades mecánicas del tendón.
- Retire las bridas y la férula. Regrese el animal a la cámara de recuperación. El animal no se deja desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente, seguido de lo cual se devuelve a su jaula. Monitorizar diariamente a los animales para detectar cualquier signo clínico adverso y, si los hubiera, administrar buprenorfina a una dosis de 1,2 mg/kg por vía subcutánea una vez cada 72 h o realizar la eutanasia precoz. Sacrificar a los animales después de 7 días de actividad en la jaula mediante inhalación de CO2 y un medio secundario de eutanasia mediante toracotomía.
NOTA: La aplicación de carga cíclica y las mediciones mecánicas se obtuvieron con una plantilla hecha a medida que consta de un sensor de par, un actuador de la articulación del tobillo impreso en 3D y una cama para animales, un sistema de posición y orientación electromagnética en 3D y un motor paso a paso que gira un eje para lograr la dorsiflexión, como informó previamente nuestro grupo17. Este sistema se controla mediante un script de MATLAB mencionado en el paso 1.2. El sensor de par y el sistema de posición y orientación capturan datos de par y posición en todo el protocolo de carga del sistema.
4. Análisis de datos
- Cargue los datos previos y posteriores a la medición por separado en MATLAB.
- Convierta el par en tensión basándose en el brazo de momento medido del paso 2.2 y el área de la sección transversal medida en el número especificado de cargas aplicadas obtenido en el paso 2.11 utilizando las ecuaciones (1) y (2):
(1)
(2) - Convierta el ángulo en deformación en función de la conversión obtenida en el paso 2.10.
- Calcule la histéresis media (área entre las curvas de carga y descarga), la tensión máxima (valor máximo de tensión del ciclo) y los módulos de carga y descarga (ajuste lineal del último 50% de la curva de carga y el primer 60% de las curvas de descarga) para los ciclos de medición previa y posterior.
- Calcule el cambio porcentual en las propiedades mecánicas del paso 4.4 entre los ciclos previos y posteriores a la medición.
(1)
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Representative Results
Con el aumento del número de ciclos aplicados, hubo una mayor reducción en las propiedades mecánicas del tendón in vivo . Hubo una reducción significativamente menor de la histéresis y de los módulos de carga y descarga para el grupo de 500 ciclos en comparación con los grupos de 3.600 y 7.200 ciclos (p < 0,05) (Figura 2). Si bien hubo una reducción significativa en el estrés máximo por ciclo desde el grupo de 500 ciclos hasta el grupo de 3.600 ciclos, no hubo una reducción significativa entre los grupos de 500 y 7.200 ciclos. Hubo una disminución porcentual constante en la histéresis, el estrés máximo y los módulos de carga y descarga para los grupos de 3.600 y 7.200 ciclos. Las imágenes teñidas con hematoxilina y eosina y tricrómico de Masson de muestras de tendones verificaron niveles más altos de daño microestructural con ciclos más altos de dorsiflexión con células más redondeadas, hipercelularidad, disrupción de fibras y engarzado de fibras (Figura 3). Se muestra que los resultados de este trabajo demuestran que los ciclos más altos de dorsiflexión causan mayores niveles de daño al tendón de Aquiles.
Figura 1: Sistema de prueba de dorsiflexión pasiva del tobillo. (A) Fuente de alimentación, (B) microcontrolador, (C) motor paso a paso, (D) sensor de par, (E) sensor de posicionamiento y orientación electromagnética 3D, (F) soporte de tobillo impreso en 3D, (G) cama de animales impresa en 3D, (H) soporte de cono de nariz impreso en 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Curvas representativas de tensión-deformación de carga cíclica. Curvas de histéresis a 0, 500, 1.000, 2.000, 3.600 y 7.200 ciclos. La flecha indica la disminución de la tensión máxima con un número creciente de ciclos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas teñidas histológicamente de muestras de tendones. Las imágenes teñidas con hematoxilina y eosina (izquierda) y tricrómico de Masson (derecha) de tendones para grupos de 500, 1.000, 2.000, 3.600 y 7.200 ciclos para este estudio demostraron que el aumento del número de ciclos aplicados da como resultado células más redondeadas, hipercelularidad (estrellas), disrupción de fibras y engarzado de fibras (flechas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este estudio presenta un método para cargar cíclicamente el tendón de Aquiles de la rata con un sistema pasivo de dorsiflexión del tobillo para un modelo de tendinopatía inducida por uso excesivo in vivo . La importancia del sistema radica en su capacidad para aislar el tendón de Aquiles, aplicar cargas cuantificables sin acceder quirúrgicamente al tendón y medir las propiedades del tendón in vivo .
En 2010, Fung et al. presentaron un modelo de fatiga del tendón rotuliano de rata con un sistema de pruebas hecho a medida14. Su estudio presentó un método para cargar directamente el tendón rotuliano exponiendo el tendón. Si bien este método también aplicó cargas de fatiga cuantificables al tendón, la aplicación directa de cargas puede introducir una respuesta adicional de cicatrización de heridas inflamatorias a la incisión de la piel y el posterior cierre. Con nuestro método, las cargas aplicadas de forma no invasiva garantizan que cualquier respuesta biológica medida se deba completamente al protocolo de carga y no a factores externos.
Un componente crítico de este protocolo de carga es el bucle de retroalimentación-control. Al comprobar la pendiente de la curva de carga de histéresis y aumentar el ángulo de dorsiflexión, si es necesario, el sistema fatiga continuamente el tendón de Aquiles. La férula de rodilla es un paso crítico, ya que asegura que la dorsiflexión solo tense el tendón en lugar de mover la rodilla y otros tejidos blandos circundantes. Para comprobar si la férula se realiza correctamente, accione manualmente el tobillo después de la férula para palpar un tendón rígido y controlar las curvas de histéresis producidas antes del paso de carga cíclica.
Una de las limitaciones de este estudio es que los valores de deformación son relativamente grandes. Sin embargo, son comparables a la dorsiflexión pasiva de los tendones de Aquiles humanos y podrían ser causadas por el alargamiento del tendón de Aquiles y del músculo gastrocnemio18. Otra limitación es que las conversiones entre el par y la tensión se limitan al área media de la sección transversal del tendón medida ex vivo y al brazo de momento alrededor de la articulación del tobillo, que puede variar entre los animales.
La patología y las primeras etapas de la tendinopatía crónica aún no se han dilucidado. Junto con la edad y otros factores de riesgo, el uso excesivo es un factor importante que contribuye al desarrollo de la tendinopatía crónica. Las lesiones reproducibles por uso excesivo se pueden simular con múltiples aplicaciones de episodios de carga cíclica por fatiga a través de nuestro sistema. Además, la no invasividad de este sistema permite evaluar los cambios biológicos y estructurales en el daño tendinoso y las respuestas de curación durante largos períodos para comprender los biomarcadores críticos en la tendinopatía.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer nuestros apoyos financieros: el Fondo de Investigación Joe Fallon, el Fondo de Investigación de Aprendices de Medicina Deportiva Dr. Louis Meeks BIDMC y una subvención intramuros (AN), todos de BIDMC Orthopaedics, junto con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (2T32AR055885 (PMW)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32'' Aluminum beads | |||
| 2.5% isoflurane | |||
| 3D digitizing pen | Polhemus, Vermont, NH, USA | ||
| 3D electromagnetic positioning and orientation sensor | Polhemus, Vermont, NH, USA | ||
| 5% isoflurane | |||
| Customized device: 1) Assembly, sensors, 3D printed animal bed and ankle mount actuator | Assembled as described in manuscript | ||
| MATLAB code | MATLAB, Natick, MA, USA | ||
| Microcontroller | Ivrea, Italy | Arduino UNO, Rev3 | |
| Nose cone | |||
| Scalpel and scalpel holder | No. 11 scalpel | ||
| Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA | 11-13 weeks old | |
| Stepper driver | SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503 | DM542T | |
| Stepper motor | SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503 | 23HE30-2804S | |
| Straight forceps | |||
| Torque sensor assembly | Futek Inc., Irvine, CA, USA | FSH03985, FSH04473, FSH03927 | |
| Water heating pad |
References
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