Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor mechanische vermoeidheidstests in het geval van menselijke rode bloedcellen met behulp van een amplitude-gemoduleerde elektrodeformatiebenadering. Deze algemene benadering kan worden gebruikt om de systematische veranderingen in morfologische en biomechanische kenmerken van biologische cellen in een suspensie van cyclische vervorming te meten.
Abstract
Rode bloedcellen (RBC's) staan bekend om hun opmerkelijke vervormbaarheid. Ze ondergaan herhaaldelijk aanzienlijke vervorming bij het passeren van de microcirculatie. Verminderde vervormbaarheid wordt gezien in fysiologisch verouderde RBC's. Bestaande technieken om de vervormbaarheid van cellen te meten kunnen niet gemakkelijk worden gebruikt voor het meten van vermoeidheid, de geleidelijke afbraak in celmembranen veroorzaakt door cyclische belastingen. We presenteren een protocol om mechanische degradatie in RBC's van cyclische schuifspanningen te evalueren met behulp van amplitude shift keying (ASK) modulatie-gebaseerde elektrodeformatie in een microfluïdisch kanaal. Kortom, de geïnterdigiteerde elektroden in het microfluïdische kanaal worden geëxciteerd met een laagspanningswisselstroom op radiofrequenties met behulp van een signaalgenerator. RBC's in suspensie reageren op het elektrische veld en vertonen positieve dielectroforese (DEP), die cellen naar de elektroderanden verplaatst. Cellen worden vervolgens uitgerekt als gevolg van de elektrische krachten die op de twee celhelften worden uitgeoefend, wat resulteert in uniaxiale stretching, bekend als elektrodeformatie. Het niveau van schuifspanning en de resulterende vervorming kunnen eenvoudig worden aangepast door de amplitude van de excitatiegolf te veranderen. Dit maakt kwantificeringen van niet-lineaire vervormbaarheid van RBC's mogelijk als reactie op kleine en grote vervormingen bij hoge doorvoer. Het aanpassen van de excitatiegolf met de ASK-strategie induceert cyclische elektrodeformatie met programmeerbare laadsnelheden en frequenties. Dit biedt een handige manier voor de karakterisering van RBC-vermoeidheid. Onze ASK-gemoduleerde elektrodeformatiebenadering maakt voor het eerst een directe meting van RBC-vermoeiing door cyclische belastingen mogelijk. Het kan worden gebruikt als een hulpmiddel voor algemene biomechanische tests, voor analyses van celvervormbaarheid en vermoeidheid in andere celtypen en zieke omstandigheden, en kan ook worden gecombineerd met strategieën om de micro-omgeving van cellen te beheersen, zoals zuurstofspanning en biologische en chemische signalen.
Introduction
Rode bloedcellen (RBC's) zijn de meest vervormbare cellen in het menselijk lichaam1. Hun vervormbaarheid is direct gerelateerd aan hun zuurstofdragende functionaliteit. Verminderde vervormbaarheid in RBC's blijkt te correleren met de pathogenese van verschillende RBC-aandoeningen2. Vervormbaarheidsmetingen hebben geleid tot een beter begrip van RBC-gerelateerde ziekten3. De normale levensduur van RBC's kan variëren van 70 tot 140 dag4. Daarom is het belangrijk om te meten hoe hun vervormbaarheid afneemt samen met het verouderingsproces, bijvoorbeeld hun vermoeidheidsgedrag als gevolg van cyclische schuifspanningen3.
Het meten van RBC-vervormbaarheid bij hoge doorvoer is een uitdaging vanwege de piconewton-schaalkrachten (~ 10-12 N) die op de individuele cellen worden toegepast. In het afgelopen decennium zijn er veel technologieën ontwikkeld om de vervormbaarheid van cellen te meten5. Vervormingsmetingen van RBC's op eencellig niveau kunnen worden uitgevoerd met pipetaspiratie en optische pincetten, terwijl bulkanalyses worden uitgevoerd door osmotische gradiënt ektacytometrie. Ektacytometrie-analyses bieden een overvloed aan gegevens, die de mogelijkheid bieden om bloedaandoeningen te diagnosticeren 6,7. De vervormbaarheid van RBC's kan ook worden geanalyseerd met behulp van de visco-elastische theorie door colloïde sonde atoomkrachtmicroscopie. In deze methode wordt computationele analyse toegepast om de elastische modulus van RBC's te schatten, rekening houdend met zowel tijdsafhankelijke als steady-state responsen. De vervormbaarheid van individuele RBC's kan worden gemeten met behulp van de single-cell microchamber array-methode. Deze methode analyseert elke cel door het membraan en cytosolische fluorescerende markers om informatie te verschaffen voor RBC-vervormbaarheid en de verdeling van cellulaire kenmerken in complexe RBC-populaties om hematologische aandoeningen te detecteren8.
Vermoeiing is een belangrijke factor in de degradatie van eigenschappen van technische materialen en biomaterialen. Vermoeiingstests maken een kwantitatieve analyse mogelijk van de integriteit en levensduur van een constructie die wordt blootgesteld aan cyclische belasting. Analyse van vermoeidheid in biologische cellen wordt al lang belemmerd door het ontbreken van een algemene, gemakkelijk toepasbare, hoge doorvoer- en kwantitatieve methode voor de implementatie van cyclische vervorming in celmembranen. Dit is mogelijk met het gebruik van elektrische signaalmodulatie en elektrodeformatietechnieken geïmplementeerd in een microfluïdische omgeving. De amplitude shift keying (ASK) techniek als digitale modulatie wordt in dit artikel toegepast via On-Off keying (OOK) modulatie. Het concept van keying verwijst naar de overdracht van digitale signalen over het kanaal, waarvoor een sinusgolfdragersignaal nodig is om te functioneren9. De AAN- en UIT-tijden kunnen gelijk worden ingesteld. Onder ON-keying komen RBC's in een vervormde toestand terwijl ze worden blootgesteld aan een externe elektrodeformatiekracht (Fdep)10 die wordt gecreëerd door het niet-uniforme elektrische veld. Onder OFF-keying bevinden RBC's zich in hun ontspannen toestand. We zien de vermoeidheid van RBC's, namelijk een progressieve degradatie in hun vermogen om uit te rekken met toenemende belastingscycli. Het door vermoeidheid veroorzaakte vervormbaarheidsverlies in RBC's kan inzicht geven in de geaccumuleerde membraanschade tijdens de bloedcirculatie, waardoor we de verbanden tussen celvermoeidheid en ziektetoestanden verder kunnen onderzoeken.
Hier bieden we stapsgewijze procedures over hoe vermoeiingstests van RBC's worden geïmplementeerd in een microfluïdisch apparaat via ASK-gemoduleerde elektrodeformatie en de systeeminstellingen zoals microfluïdisch apparaat, mechanische belasting en microscopische verbeelding voor de karakterisering van de geleidelijke degradatie in mechanische vervormbaarheid van RBC's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gedeïdentificeerd menselijk volbloed werd commercieel verkregen. Werk met de bloedmonsters werd uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 2-laboratorium met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door het Institutional Biosafety Committee aan de Florida Atlantic University.
1. Voorbereiding van microfluïdische apparaten
- Plak de SU-8 master silicium wafer af voor het microfluïdische kanaalontwerp aan de binnenkant van een plastic petrischaal van 14 cm en reinig deze met N2-gas .
- Weeg 60 g polydimethylsiloxaan (PDMS) base en 6 g PDMS-uithardingsmiddel in een papieren beker. Meng de twee delen met een houten spatel tot het mengsel een troebele witte kleur heeft.
- Giet het PDMS-mengsel in de plastic petrischaal met de siliciumwafer. Plaats de petrischaal in een vacuüm exsiccator met een 3-weg stopkraan. Draai de klep van de stopkraan om het vacuüm aan te sluiten op de exsiccatorkamer om luchtbellen uit het PDMS te verwijderen.
- Breng opnieuw lucht in de exsiccatorkamer door de stopkraanklep aan te passen om de exsiccatorkamer in ongeveer 5 minuten met de omgeving te verbinden. Herhaal dit totdat alle luchtbellen uit de functies van de kanalen zijn verwijderd.
- Zet de petrischaal 4 uur in een oven op 70 °C. Zodra de tijd is verstreken, verwijdert u de petrischaal, laat u deze afkoelen tot kamertemperatuur en plaatst u deze op een snijmat.
- Knip met behulp van een scalpel het gedeelte van het PDMS boven de siliciumwafer uit. Plaats de uitgesneden PDMS tussen de twee vellen labwikkelfolie. De opening tussen de inspringing van het microkanaal en de semi-transparante film vergemakkelijkt de identificatie van de locatie van het microfluïdische kanaal en de respectieve in- en uitlaat.
- Knip met een scheermesje een individueel kanaal uit het grote PDMS. Pons een inlaatgat van 3 mm en een uitlaatgat van 1,5 mm met behulp van biopsieponsen die respectievelijk bij de twee maten passen (figuur 1A).
- Plaats het geperforeerde kanaal, met de kanaalzijde naar boven gericht, op een schone glazen schuif. Plaats een glazen substraat van 20 mm x 15 mm met dunnefilm-indiumtinoxide (ITO) geïnterdigiteerde elektroden op dezelfde glasplaat met elektroden naar boven gericht.
- Plaats de glasplaat met PDMS en substraat voorzichtig in een plasmareiniger. Sluit de gasklep, zet de pompschakelaar aan en wacht 2 minuten om een sensoraflezing van 600 - 800 mTorr te verkrijgen.
- Zet de aan/uit-schakelaar aan en wacht 30 s. Draai de RF-aan/uit-knop van laag naar hoog en wacht 1 minuut.
- Draai vervolgens de volgorde om door de RF-knop naar laag te draaien, aan / uit-schakelaar naar UIT, pompschakelaar naar UIT en de gasklep te openen.
- Til onmiddellijk na het openen van de kamer van de plasmareiniger het PDMS op en draai het zodat de kanaalzijde naar beneden is gericht (180°). Plaats het kanaal op de bovenkant van het ITO-substraat. Het hechtingsproces is begonnen.
- Druk met een pincet zachtjes op de hoeken van het PDMS gedurende ongeveer 3 s. Druk niet op het kanaal zelf.
OPMERKING: Het hechtingsproces gebeurt spontaan bij fysiek contact tussen de twee behandelde oppervlakken. - Laad het primingmedium in een spuit van 1 ml met een naald van 23 G. Maak het kanaal voorzichtig nat door de naald recht in de inlaatput te steken en vervolgens het medium los te laten. Werk langzaam. Introduceer geen luchtbellen. Incubeer gedurende ten minste 3 minuten.
- Verwijder het primaire medium met een pipetpunt van 10 μL. Was het kanaal 3 keer met DEP-medium door het DEP-medium in het kanaal te steken. Houd het kanaal te allen tijde nat.
2. Testopstelling
OPMERKING: De testopstelling is ontworpen met behulp van 3D CAD-software en bevat een basisbehuizing en een bovenunit (figuur 1B). Vervolgens wordt het vervaardigd met behulp van een 3-assige CNC-freesmachine met een standaard tolerantiegrens van ongeveer ± 0,005-inch afmeting van de testopstelling wordt gecontroleerd met behulp van een elektronische remklauw (niet weergegeven). Steriliteit van het armatuur is niet vereist voor de in vitro biomechanische testen.
- Voorsoldeerdraden in de soldeerbekereinden van twee sets veerzuigerconnectoren.
- Steek de veerzuigerconnectoren in de bovenunit en creëer een permanente hechting door een druppel epoxylijm toe te voegen.
3. Voorbereiding van de werkbuffer voor elektrodeformatie
- Om het DEP-medium te bereiden, weegt u 12,75 g sucrose en 0,45 g dextrose af met behulp van een schaal.
- Los beide poeders op in een enkele container met 150 ml gedeïoniseerd (DI) water en 3,5 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Meet met behulp van een geleidbaarheidstester met een laag bereik de geleidbaarheid en zorg ervoor dat deze 0,04 S / m is (figuur 2).
OPMERKING: Er kan een andere geleidbaarheidswaarde worden gebruikt, die het teken en de grootte van de resulterende DEP-kracht11 kan veranderen. Elektrodeformatie vereist echter een positieve DEP-kracht. - Bevestig met behulp van een osmometer dat de osmolariteit binnen het normale bereik van het bloedplasma ligt, 275 tot 295 mOsm/kg water (figuur 3). Bewaren bij 4 °C. Het DEP-medium is nu voorbereid.
- Los in een tube van 15 ml 0,5 g runderserumalbumine (BSA) op in 10 ml van het DEP-medium. Meng. Het belangrijkste medium van het apparaat is nu voorbereid.
4. Voorbereiding van de celsuspensie
- Was 20 μL van het volbloed door het bloed gedurende 3 minuten te centrifugeren met 1 ml PBS op 268 x g . Gooi het supernatant weg.
- Resuspendie van de RBC's in 1 ml PBS. Pipetter voorzichtig om te mengen. Was de RBC's gedurende 3 minuten op 268 x g en gooi het supernatant weg.
- Extraheer 5 μL RBC-pellet met behulp van een 10 μL micropipettepunt en doseer volledig in 1 ml van het DEP-medium. Was de cellen door te centrifugeren op 268 x g gedurende 3 min.
- Gooi het supernatant weg en resuspensie van de RBC's in 1 ml DEP-medium. Pipetter voorzichtig om te mengen.
- Was de RBC's gedurende 3 minuten op 268 x g en gooi het supernatant weg. Pipetteer 2 μL RBC-pellet in 500 μL DEP-medium. De celsuspensie wordt nu bereid met een concentratie binnen een bereik van 62 - 104 cellen/μL12, die kan worden bevestigd met behulp van een standaard celtellingsglaasje.
5. Elektrodeformatie-instelling en vermoeiingstesten
- Plaats het microfluïdische apparaat in het onderste deel van de testinrichting. Lijn het bovenste deel van het armatuur uit op het apparaat en monteer de twee delen met behulp van twee sets nylon schroeven en moeren (figuur 4).
- Plaats de testarmatuur op het microscooppodium. Zoek een gewenste set elektroden onder de microscoop.
- Sluit het overeenkomstige paar elektrodedraden dat overeenkomt met de geplaatste elektrodeset aan op de uitgangsaansluiting van de functiegenerator (figuur 4).
- Verwijder 5 μL van het DEP-medium uit de 3 mm inlaat van het microfluïdische kanaal. Laad langzaam 5 μL van de celsuspensie in de inlaat met behulp van een pipetpunt van 10 μL.
- Laat de cellen 1 minuut bezinken. Voeg indien nodig een extra DEP-medium toe aan de inlaat om cellen in het kanaal te duwen.
- Observeer het kanaal onder 20x vergroting. Gebruik een 414/46 nm bandpassfilter om het contrast van de beeldvorming te verbeteren.
- Druk op de sinusknop en definieer een sinusgolf met eenRMS-amplitude van 2 V bij een frequentie van 3 MHz. Druk op de Mod-knop om modulatie in te schakelen. Wijzig de golfmodus in ASK door op de optie Type te drukken.
- Stel de modulatiefrequentie in op 250 mHz, wat overeenkomt met een laad-losperiode van 4 s (figuur 5A). Schakel de uitgang van de functiegenerator IN.
- Neem elke 10 minuten een video van 1 minuut op met 30 frames per s (fps).
6. Karakterisering van RBC-vervorming
- Open met een videobewerkingstoepassing .avi bestanden die in de vorige stap zijn opgenomen door op Ctrl+O te drukken. Gebruik de tijdlijn om een interessant frame te kiezen en stel het begin- en eindframe van de selectie in op identiek door op de Home-toets en vervolgens op de End-toets op het toetsenbord te drukken.
- Exporteer het afbeeldingskader. Selecteer het uitvoerformaat JPEG en druk op OK.
- Open de toepassing ImageJ en laad de afbeeldingen die in de vorige stap zijn opgeslagen. Begin met het instellen van de benodigde metingen door op Metingen analyseren > instellen te drukken en ervoor te zorgen dat de selectievakjes voor Gebied, Omtrek en Fit-ellips zijn aangevinkt. Druk op OK.
- Converteer vervolgens de afbeelding naar grijswaarden door Afbeelding > Type > 8-bits te kiezen.
- Converteer vervolgens de afbeelding naar binair met behulp van Image > Adjust > Thresholding. Pas in het dialoogvenster Drempel de twee schuifregelaars zo nodig aan. Druk op Toepassen en sluit het dialoogvenster Drempelwaarde.
- Kies > tools analyseren > ROI-beheer. Druk in de ROI Manager op het selectievakje Alles weergeven. Sluit dit vak niet.
- Selecteer het gereedschap Toverstaf (overtrek), selecteer een toepasselijke cel in de afbeelding en druk op T op het toetsenbord. De geselecteerde cel wordt genummerd. Er kan opnieuw een nieuwe cel worden geselecteerd. Selecteer alle toepasselijke cellen die moeten worden gemeten. De toepasselijke cellen worden geïdentificeerd als cellen die geïsoleerd zijn van andere cellen. Het aantal van deze cellen kan variëren van 50 tot 200 in een enkel gezichtsveld.
- Ga terug naar het vak ROI-beheer en druk op Meten. Hiermee opent u het vak Resultaten. Kolommen met het label Major en Minor zijn de lengtes van respectievelijk de aangebrachte ellips major en minor as (in pixels). Kies Bestand > Opslaan als om de metingen te exporteren als een CSV-bestand.
- Bereken met behulp van geschikte computationele analysesoftware het quotiënt van Major en Minor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer celsuspensie in het microfluïdische kanaal werd geladen, werd een relatief uniforme verdeling van cellen waargenomen. Bij de signaaluitgang (bijv. een eenvoudige sinusgolf of On-Keying-fase van ASK) van de functiegenerator genereerden de dunnefilm-geïnterdigiteerde elektroden een niet-uniform wisselstroomelektrisch veld. De zwevende cellen reageerden spontaan op deze elektrische excitatie en vertoonden een positief DEP-gedrag, namelijk bewegen naar de randen van elektroden met een hogere veldsterkte. Bijgevolg werden cellen uitgelijnd langs de randen van de elektroden en werden ze uitgerekt als gevolg van elektrodeformatie. In de On-Keying-fase worden RBC's uitgerekt als gevolg van elektrodeformatie; in de Off-Keying-fase worden RBC's versoepeld (figuur 5B). Het handhaven van celdiscretie is belangrijk in dit protocol. Met behulp van de verdunningsfactor zoals vermeld in dit protocol, lag de celsuspensie van normale RBC's in een bereik van 62 - 104 cellen / μL. Bij een concentratie binnen dit bereik waren we in staat om een hoge doorvoer van celmeting te verkrijgen terwijl de accumulatie van cellen werd geminimaliseerd vanwege het positieve DEP-effect.
Bij het volgen van individuele RBC's tijdens de 1 uur vermoeidheidstest, zagen we een geleidelijke afname van cellulaire vervorming (figuur 5C). De vervormbaarheid werd gekwantificeerd door de verhouding tussen de hoofd- en kleine assen van een ellips die werd gebruikt om de afzonderlijke RBC's te passen, met behulp van open-source beeldvormingssoftware (figuur 6). Interessante beelden werden geopend in het softwareprogramma. Het was niet nodig om de pixelgrootte te kalibreren in lengteschaal voor de vervormbaarheidsmeting. Numerieke gegevens kunnen verder worden geanalyseerd en geplot met behulp van software.
In dit protocol werden vervormingsgegevens van RBC's verzameld in het tijdsinterval van 10 minuten tijdens de 1 uur cyclische mechanische belasting met behulp van de 250 mHz ASK om de 2 VRMS-3 MHz sinusgolf te moduleren. Een geleidelijke vermindering van de celvervormbaarheid werd waargenomen. Het totale vervormbaarheidsverlies voor RBC's onder deze vermoeiingstestconditie bleek 18% te zijn (figuur 7).
Figuur 1: Microfluïdisch apparaat voor elektrodevorming. (A) Schema van het microfluïdische kanaal met biopsieponsgaten van respectievelijk 1,5 mm en 3 mm voor de monsteruitlaat en -inlaat. (B) Exploderend zicht op de testopstelling . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Werking geleidbaarheidsmeter. Een geleidbaarheidsmeter werd gebruikt om te controleren of de geleidbaarheid van het DEP-medium 0,04 S/m was. De sensorsondes aan de basis van de meter worden ondergedompeld in het monster om een aflezing te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Osmometer werking. Een osmometer werd gebruikt om de osmotische concentratie van het DEP-medium te verifiëren. Stap 1 - Klik een monsterpunt op zijn plaats op de sampler en laad 20 μL monster. Stap 2 - Laat de sampler in de bedieningswieg en onder de bovenkant van de houder rusten. Stap 3 - Duw de hele bedieningswieg naar beneden totdat deze een positieve stop bereikt. Stap 4 - Het instrument voert de test ongeveer 1 minuut uit en geeft het resultaat weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Connectiviteit van de functiegenerator. Afbeelding van de experimentele opstelling voor vermoeiingstests, inclusief de testarmaturenassemblage en een functiegenerator. ITO-elektrodepads worden verbonden met de functiegenerator via een BNC-naar-alligatorclipkabel via de draden die vooraf zijn gesoldeerd in de Pogo-pincups die in de bovenste eenheid van de testarmatuur zijn gedrukt. Het microfluïdische apparaat met twee onafhankelijke parallelle kanalen bevindt zich op de onderste eenheid van de testinrichting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Reactie van de cel op aan-uittoetsen. (A) Aan-uit keying gemoduleerde sinusgolf voor 1 uur vermoeidheidstest: sinusgolf van 2 VRMS amplitude bij 3 MHz voor elektrodeformatiewerking, modulatiefrequentie van 250 mHz resulterend in 2 s stretching en 2 s ontspanning. b) in de on-keying-fase worden RBC's uitgerekt als gevolg van elektrodeformatie; onder de Off-Keying fase worden RBC's ontspannen. (C) Elektrodeformatie van een representatieve cel vertoont geleidelijke afbraak in membraanvervorming gedurende 1 uur cyclisch uitrekken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Karakterisering van RBC-vervormbaarheid met behulp van ImageJ. Stap 1 - Importeer de afbeelding in beeldbewerkingssoftware en converteer deze naar 8-bits grijswaarden. Stap 2 - Pas de drempel aan om afbeeldingen naar binair te converteren. Stap 3 - Selecteer cellen met de toverstaf (tracering) tool en beheer selecties met de ROI manager. Stap 4 - Selecteer de cellen om metingen voor grote en kleine assen te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Vermindering van de vervormbaarheid van cellen. Geleidelijke degradatie in RBC-vervormbaarheid als gevolg van cyclische elektrodeformatie. De foutbalk toont de standaarddeviatie (n = 69). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ASK OOK-modulatie van een DEP-krachtinducerende sinusgolf kan worden gebruikt om de mechanische vermoeidheid van RBC's over een lange periode te testen. In dit protocol hebben we de in vitro vermoeidheidstesten beperkt tot 1 uur om de mogelijke nadelige metabole effecten op de celvervormbaarheid te voorkomen. Uitgebreide vermoeiingstestomstandigheden kunnen worden geprogrammeerd met behulp van de ASK-gemoduleerde elektrodeformatietechniek. Parameters zoals laadfrequentie, amplitude en laadsnelheid kunnen allemaal worden geprogrammeerd. De laadfrequentie kan worden geprogrammeerd op verschillende waarden om de afhankelijkheid van vermoeidheid van de laadfrequentie te bepalen, evenals verschillen tussen cyclische belasting en statische belasting13.
De reksterkte kan eenvoudig worden aangepast door een ander spanningsniveau te gebruiken voor kleine of grote vervormingen. Bij het gebruik van hoogspanningsniveaus om grote vervorming op te nemen, wordt echter opgemerkt dat elektrodeformatie zal resulteren in vlamvormige RBC's (figuur 6, stap 3). Dit kan fouten veroorzaken bij het aanpassen van celvormen met ellipsen, die de puntige randen van cellen afsnijden. Onder deze omstandigheden, vooral bij het gebruik van de elektrodeformatie om visco-elasticiteitsparameters voor membraanafschuiving te extraheren, kunnen twee strategieën worden gebruikt: (i) het gebruik van een computationeel model van echte celvormen zal nauwkeurigere resultaten opleveren dan het eenvoudige analytische elliptische vormmodel; ii) het gebruik van een kleiner spanningsniveau om cellen uit te rekken, zodat de celvormen goed kunnen worden voorzien van ellipsen.
In het huidige protocol was de gemiddelde geleidbaarheid 0,04 S/m, die naar behoefte kan worden aangepast. Omdat elektrodeformatie-geïnduceerde cellulaire stretching gerelateerd is aan de werkelijke waarden van de complexe Clausius Mossotti-factor, kan de sinusgolffrequentie verschillen van de geselecteerde 3 MHz. De sleutel is om de spanning te minimaliseren om elektrodevorming te induceren met behoud van een verwaarloosbaar Joule-verwarmingseffect. Een optimale elektrische excitatie kan worden bepaald met behulp van DEP-theorie of met behulp van computationele hulpmiddelen voor diëlektrische modellering van cellen, zoals My DEP11.
Opgemerkt moet worden dat celimmobilisatie niet vereist is in dit protocol, omdat cellen die elektrodeformatie ondergaan inherent positieve DEP vertonen, die cellen spontaan naar de elektroderanden verplaatst. Dit stelt ons in staat om testen uit te voeren op celsuspensies en alle cellen te immobiliseren die interageren met de elektrode en tegelijkertijd de cellen uitrekken. Zodra het testen is voltooid, kunnen cellen eenvoudig uit het apparaat worden verwijderd door het kanaal met het medium te spoelen. Het kenmerk van het huidige protocol, waardoor het goed werkt met suspensiecellen, kan de toepassing ervan beperken om aanhangende cellen te testen. We kunnen echter hechtende cellen losmaken van het substraat met behulp van chemicaliën zoals ethyleendiaminetetra-azijnzuur. Omdat het testen kan worden ontworpen om in een relatief korte tijd te worden voltooid, van minuten tot 1 uur, hebben we voldoende tijd om mechanische vermoeiingstests uit te voeren voordat cellen zich verankeren en verspreiden14.
In het huidige protocol werd een in de handel verkrijgbare ITO-chip met 100 μm band interdigitated elektroden gebruikt. Interdigitated elektrodeontwerp is voordelig voor het meten van meerdere cellen tegelijk voor de lengte-tot-gebiedsverhouding, omdat de cellen aan de randen van elektroden worden uitgerekt. De doorvoer van de meting is ook afhankelijk van het waarnemingsveld, waar celgrootte en vervormbaarheid beperkingen stellen aan de minimale opening van de elektroden. De bandbreedte van de elektroden kan verder worden verlaagd om het aantal waarnemingscellen te verhogen voor een hogere doorvoer. De elektrodematerialen kunnen andere metalen zijn, zoals titanium of goud; De transparantie van de elektrodematerialen kan echter een betere keuze zijn, omdat een deel van de celmembranen kan worden geblokkeerd door de niet-transparante elektroden. Het testen kan nog steeds worden uitgevoerd als een relevant wiskundig vormmodel van de cel, zoals een ellipsoïde13, kan worden gebruikt tijdens de beeldvormingsverwerking.
Theoretisch kunnen deze elektrodeformatie- en ASK-gemoduleerde elektrodeformatietechnieken werken op andere celtypen, onder de juiste omstandigheden, bijvoorbeeld gemiddelde geleidbaarheid en elektrische excitaties. Een beperking is hoeveel rek we kunnen waarnemen. RBC is een goed celmodel vanwege zijn grote vervormbaarheid en circulerende aard. Het huidige protocol is toegepast om menselijke RBC's te bestuderen in zowel gezondheid als ziekte en is gemakkelijk uitgerust met een gasmicro-omgeving om hypoxische vermoeidheid te bestuderen13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek is gefinancierd door NSF / CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (# 1941655) en NSF / CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (# 1635312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. Al Safi, A., Bazuin, B. 2017 IEEE 7th Annual Computing and Communication Workshop and Conference (CCWC), , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M.
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
