Summary
מוצג כאן פרוטוקול לבדיקת עייפות מכנית במקרה של תאי דם אדומים אנושיים באמצעות גישת אלקטרודפורמציה מווסתת אמפליטודה. גישה כללית זו יכולה לשמש למדידת השינויים השיטתיים במאפיינים מורפולוגיים וביומכניים של תאים ביולוגיים בתרחיף מעיוות מחזורי.
Abstract
תאי דם אדומים (RBCs) ידועים בעיוות יוצא הדופן שלהם. הם עוברים שוב ושוב עיוות ניכר כאשר עוברים דרך microcirculation. עיוות מופחת נראה אצל RBCs בגיל פיזיולוגי. טכניקות קיימות למדידת עיוות תאים אינן יכולות לשמש בקלות למדידת עייפות, ההתפרקות ההדרגתית בקרומי התאים הנגרמת על ידי עומסים מחזוריים. אנו מציגים פרוטוקול להערכת השפלה מכנית ב-RBCs כתוצאה מלחצים מחזוריים של גזירה באמצעות אלקטרודפורמציה מבוססת אפנון היסט משרעת (ASK) בתעלה מיקרופלואידית. בקצרה, האלקטרודות הבין-ספרתיות בתעלה המיקרופלואידית מעוררות בזרם חילופין במתח נמוך בתדרי רדיו באמצעות מחולל אותות. RBCs בתרחיף מגיבים לשדה החשמלי ומציגים דיאלקטרופורזה חיובית (DEP), המזיזה תאים לקצוות האלקטרודות. לאחר מכן נמתחים התאים בשל הכוחות החשמליים המופעלים על שני חצאי התא, וכתוצאה מכך מתיחה חד-צירית, המכונה אלקטרודפורמציה. ניתן לכוונן בקלות את רמת לחץ הגזירה ואת העיוות הנובע מכך על ידי שינוי המשרעת של גל העירור. זה מאפשר לכמת עיוות לא ליניארי של RBCs בתגובה לעיוותים קטנים וגדולים בתפוקה גבוהה. שינוי גל העירור באמצעות אסטרטגיית ASK גורם לעיוות אלקטרודלי מחזורי עם קצבי עומס ותדרים הניתנים לתכנות. זה מספק דרך נוחה לאפיון עייפות RBC. גישת האלקטרודפורמציה המווסתת ASK שלנו מאפשרת, בפעם הראשונה, מדידה ישירה של עייפות RBC מעומסים מחזוריים. הוא יכול לשמש ככלי לבדיקות ביומכניות כלליות, לניתוח עיוות תאים ועייפות בסוגי תאים אחרים ובמצבים חולים, וניתן גם לשלב אותו עם אסטרטגיות לשליטה במיקרו-סביבה של תאים, כגון מתח חמצן ורמזים ביולוגיים וכימיים.
Introduction
תאי דם אדומים (RBCs) הם התאים המעוותים ביותר בגוף האדם1. העיוות שלהם קשור ישירות לפונקציונליות נשיאת החמצן שלהם. עיוות מופחת ב- RBCs נמצא בקורלציה עם הפתוגנזה של מספר הפרעות RBC2. מדידות עיוותים הובילו אותנו להבנה טובה יותר של מחלות הקשורות ל-RBC3. תוחלת החיים הרגילה של RBCs יכולה לנוע בין 70 ל -140 יום4. לכן, חשוב למדוד כיצד העיוות שלהם פוחת יחד עם תהליך ההזדקנות, למשל, התנהגות העייפות שלהם עקב לחצים מחזוריים גזירה3.
מדידת עיוות RBC בתפוקה גבוהה היא מאתגרת בגלל כוחות סולם פיקוניוטון (~ 10-12 N) המופעלים על תאים בודדים. במהלך העשור האחרון פותחו טכנולוגיות רבות למדידת עיוות התא5. מדידות דפורמציה של RBCs ברמת התא הבודד יכולות להתבצע על ידי שאיפת פיפטה ופינצטה אופטית, בעוד אנליזות בתפזורת נעשות על ידי ektacytometry שיפוע אוסמוטי. ניתוחי Ektacytometry מספקים שפע של נתונים, אשר מספק הזדמנות לאבחן הפרעות דם 6,7. ניתן לנתח את העיוות של RBCs גם באמצעות התאוריה הוויסקו-אלסטית על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי של בדיקה קולואידית. בשיטה זו, ניתוח חישובי מוחל כדי להעריך את המודולוס האלסטי של RBCs, בהתחשב הן בתגובות תלויות זמן והן במצב יציב. ניתן למדוד את העיוות של RBCs בודדים באמצעות שיטת מערך microchamber תא יחיד. שיטה זו מנתחת כל תא דרך הממברנה והסמנים הפלואורסצנטיים הציטוסוליים כדי לספק מידע על עיוות RBC והתפלגות המאפיינים התאיים באוכלוסיות RBC מורכבות כדי לזהות הפרעות המטולוגיות8.
עייפות היא גורם מפתח בפגיעה בתכונות של חומרים מהונדסים וביו-חומרים. בדיקת עייפות מאפשרת ניתוח כמותי של שלמות ותוחלת החיים של מבנה הנתון לעומס מחזורי. ניתוח של עייפות בתאים ביולוגיים כבר זמן רב הקשו על ידי היעדר שיטה כללית, ישימה בקלות, תפוקה גבוהה, כמותית ליישום עיוות מחזורי בקרום התא. זה אפשרי עם ניצול של אפנון אות חשמלי וטכניקות אלקטרודפורמציה מיושם בסביבה microfluidic. טכניקת מפתח היסט המשרעת (ASK) כאפנון דיגיטלי מיושמת באמצעות אפנון On-Off keying (OOK) במאמר זה. הרעיון של מפתח מתייחס להעברת אותות דיגיטליים על פני הערוץ, אשר דורש אות נושא גל סינוס כדי לתפקד9. ניתן להגדיר את זמני ההפעלה והכיבוי באופן שווה. תחת ON-keying, RBCs נכנסים למצב מעוות כשהם נחשפים לכוח אלקטרודפורמציה חיצוני (Fdep)10 שנוצר על ידי השדה החשמלי הלא אחיד. תחת OFF-keying, RBCs נמצאים במצב רגוע שלהם. אנו רואים את העייפות של RBCs, כלומר השפלה פרוגרסיבית ביכולתם למתוח עם הגדלת מחזורי העמסה. אובדן העיוות הנגרם על ידי עייפות ב- RBCs יכול לספק תובנות לגבי הנזק המצטבר לקרום במהלך זרימת הדם, ומאפשר לנו להמשיך לחקור את הקשרים בין עייפות תאים ומצבי מחלה.
כאן אנו מספקים נהלים שלב אחר שלב כיצד בדיקות עייפות של RBCs מיושמות במכשיר מיקרופלואידי באמצעות אלקטרודפורמציה באפנון ASK והגדרות המערכת כגון התקן מיקרופלואידי, העמסה מכנית ודמיון מיקרוסקופי לאפיון ההתפרקות ההדרגתית בעיוות מכני של RBCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דם שלם אנושי לא מזוהה הושג באופן מסחרי. העבודה הכוללת את דגימות הדם בוצעה במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 תוך שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית באוניברסיטת פלורידה אטלנטיק.
1. הכנת מכשיר מיקרופלואידי
- הדביקו את פרוסת הסיליקון הראשית SU-8 לעיצוב התעלה המיקרופלואידית בחלק הפנימי של צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 14 ס"מ ונקו אותה בגז N2 .
- שקלו 60 גרם בסיס פולידימתילסילוקסאן (PDMS) ו-6 גרם חומר מרפא PDMS בכוס נייר. מערבבים את שני החלקים בעזרת מרית עץ עד לקבלת צבע לבן עכור.
- יוצקים את תערובת PDMS לתוך צלחת פטרי פלסטיק המכילה את רקיק הסיליקון. הכניסו את צלחת הפטרי למייבש ואקום עם סטופקוק תלת-כיווני. סובב את השסתום של הסטופקוק כדי לחבר את הוואקום לתא הייבוש כדי להסיר בועות אוויר מה- PDMS.
- הכניסו מחדש אוויר לתא הייבוש על ידי התאמת שסתום הסטופקוק לחיבור תא הייבוש לסביבה תוך כ-5 דקות מחזורים. חזור על הפעולה עד שכל בועות האוויר יוסרו מתכונות הערוצים.
- מניחים את צלחת הפטרי בתוך תנור ב 70 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. לאחר שחלף הזמן, הסירו את צלחת הפטרי, הניחו לה להתקרר לטמפרטורת החדר והניחו אותה על מחצלת חיתוך.
- בעזרת אזמל, חותכים את החלק של PDMS מעל פרוסת הסיליקון. הניחו את המגרעת PDMS בין שתי היריעות של יריעת עטיפת המעבדה. הפער שנוצר בין כניסת המיקרו-ערוץ לבין הסרט השקוף למחצה מאפשר זיהוי מיקום התעלה המיקרופלואידית, כמו גם הכניסה והמוצא שלה.
- באמצעות סכין גילוח, חתכו תעלה בודדת מה-PDMS הגדול. נקבו חור כניסה בקוטר 3 מ"מ וחור יציאה בקוטר 1.5 מ"מ באמצעות ניקוב ביופסיה בהתאמה לשני הגדלים (איור 1A).
- הניחו את התעלה המנוקבת בחורים, כשצד הערוץ פונה כלפי מעלה, על מגלשת זכוכית נקייה. הניחו מצע זכוכית בגודל 20 מ"מ x 15 מ"מ המכיל אלקטרודות בין-ספרתיות מסוג Indium Tin Oxide (ITO) בעלות סרט דק על אותה שקופית זכוכית עם אלקטרודות הפונות כלפי מעלה.
- הניחו בעדינות את מגלשת הזכוכית עם PDMS והכניסו את המצע לשואב פלזמה. סגור את שסתום הגז, הפעל את מתג המשאבה והמתן 2 דקות כדי לקבל קריאת חיישן של 600 - 800 mTorr.
- הפעל את מתג ההפעלה והמתן 30 שניות. סובב את ידית ההפעלה RF מנמוך לגבוה והמתן דקה אחת.
- לאחר מכן, הפוך את הרצף על ידי סיבוב ידית ה- RF לנמוכה, מתג הפעלה ל- OFF, מתג המשאבה לכבוי ופתיחת שסתום הגז.
- מיד לאחר פתיחת התא של מנקה הפלזמה, הרימו וסובבו את ה-PDMS כך שצד התעלה פונה כלפי מטה (180°). הניחו את התעלה על גבי מצע ה-ITO. תהליך הבונדינג החל.
- בעזרת פינצטה, לחץ בעדינות כלפי מטה על פינות PDMS במשך כ -3 שניות. הימנע מלחיצה על הערוץ עצמו.
הערה: תהליך ההדבקה מתרחש באופן ספונטני במגע פיזי בין שני המשטחים המטופלים. - לטעון את המדיום priming לתוך מזרק 1 מ"ל עם מחט 23 גרם. בזהירות להרטיב את התעלה על ידי החדרת המחט ישר לתוך הכניסה היטב ולאחר מכן לשחרר את המדיום. לפעול לאט. אין להכניס בועות אוויר. יש לדגור במשך 3 דקות לפחות.
- מוציאים את המדיום הראשוני בעזרת קצה פיפטה 10 μL. שטפו את הערוץ באמצעי DEP 3 פעמים על-ידי הכנסת מדיום DEP לערוץ. שמור על הערוץ רטוב בכל עת.
2. מתקן בדיקה
הערה: מתקן הבדיקה תוכנן באמצעות תוכנת CAD תלת-ממדית וכולל יחידת דיור בסיסית ויחידה עליונה (איור 1B). לאחר מכן, הוא מיוצר באמצעות מכונת כרסום CNC בעלת 3 צירים עם מגבלת סובלנות סטנדרטית של כ -± ממד 0.005 אינץ 'של מתקן הבדיקה נבדק באמצעות קליפר אלקטרוני (לא מוצג). סטריליות של המתקן אינה נדרשת לבדיקה ביומכנית במבחנה.
- חוטי הלחמה מראש לקצוות ההלחמה של שני סטים של מחברי בוכנה קפיציים.
- הכנס את מחברי הבוכנה הקפיציים ליחידה העליונה וצור הדבקה קבועה על ידי הוספת טיפה של דבק אפוקסי.
3. הכנת חיץ עבודה אלקטרודפורמציה
- כדי להכין את המדיום DEP, לשקול 12.75 גרם של סוכרוז ו 0.45 גרם של דקסטרוז באמצעות סולם.
- יש להמיס את שתי האבקות במיכל יחיד עם 150 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה (DI) ו-3.5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS).
- באמצעות בודק מוליכות לטווח נמוך, מדוד את המוליכות וודא שהיא 0.04 S/m (איור 2).
הערה: ניתן להשתמש בערך מוליכות שונה, אשר עשוי לשנות את הסימן ואת הגודל של כוח DEP11 המתקבל. אלקטרודפורמציה, לעומת זאת, דורשת כוח DEP חיובי. - באמצעות אוסמומטר, אשרו שהאוסמולריות נמצאת בטווח הנורמלי של פלסמת הדם, 275 עד 295 mOsm/kg מים (איור 3). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. מדיום ה-DEP מוכן כעת.
- בצינור של 15 מ"ל, יש להמיס 0.5 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-10 מ"ל של מדיום DEP. מערבבים היטב. המדיום העיקרי של המכשיר מוכן כעת.
4. הכנת השעיית תאים
- לשטוף 20 μL של הדם כולו על ידי צנטריפוגה הדם עם 1 מ"ל של PBS ב 268 x גרם במשך 3 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
- להשעות מחדש את RBCs ב 1 מ"ל של PBS. פיפטה עדינה לערבוב. שטפו את RBCs במשך 3 דקות ב 268 x גרם והשליכו את supernatant.
- לחלץ 5 μL של גלולת RBC באמצעות קצה micropipette 10 μL ולהוציא באופן מלא לתוך 1 מ"ל של מדיום DEP. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 268 x גרם במשך 3 דקות.
- השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את ה-RBCs ב-1 מ"ל של מדיום DEP. פיפטה עדינה לערבוב.
- שטפו את RBCs במשך 3 דקות ב 268 x גרם והשליכו את supernatant. פיפטה 2 μL של גלולת RBC לתוך 500 μL של מדיום DEP. תרחיף התא מוכן כעת עם ריכוז בטווח של 62 - 104 תאים / μL12, אשר ניתן לאשר באמצעות שקופית ספירת תאים סטנדרטית.
5. הגדרת אלקטרודפורמציה ובדיקת עייפות
- הניחו את המכשיר המיקרופלואידי בחלק התחתון של מתקן הבדיקה. ישרו את החלק העליון של גוף התאורה למכשיר והרכיבו את שני החלקים באמצעות שני סטים של ברגי ניילון ואומים (איור 4).
- הניחו את מתקן הבדיקה על במת המיקרוסקופ. אתר קבוצה רצויה אחת של אלקטרודות מתחת למיקרוסקופ.
- חברו את זוג חוטי האלקטרודות המתאימים המתאימים לאלקטרודה הממוקמת למסוף הפלט של מחולל הפונקציות (איור 4).
- הסר 5 μL של תווך DEP מכניסת 3 מ"מ של התעלה המיקרופלואידית. טען באיטיות 5 μL של מתלה התא לתוך הכניסה באמצעות קצה פיפטה 10 μL.
- אפשר לתאים להתיישב למשך דקה אחת. במידת הצורך, הוסף אמצעי DEP נוסף לכניסה כדי לדחוף תאים לתוך הערוץ.
- צפו בערוץ תחת הגדלה של פי 20. השתמש במסנן פסים של 414/46 ננומטר כדי לשפר את ניגודיות ההדמיה.
- לחץ על לחצן סינוס והגדר גל סינוס עם משרעתRMS של 2 V בתדר 3 MHz. לחץ על לחצן Mod כדי לאפשר אפנון. שנה את מצב הגל ל- ASK על-ידי לחיצה על האפשרות סוג .
- הגדר את תדר האפנון ל- 250 MHz, המתאים לתקופת טעינה-פריקה של 4 שניות (איור 5A). הפעל את הפלט של מחולל הפונקציות.
- הקלט סרטון של דקה אחת כל 10 דקות ב- 30 פריימים לשנייה (fps).
6. אפיון עיוות RBC
- באמצעות יישום עריכת וידאו, פתח .avi קבצים שהוקלטו בשלב הקודם על-ידי הקשה על Ctrl+O. השתמש בציר הזמן כדי לבחור מסגרת עניין והגדר את מסגרת ההתחלה והסיום של הבחירה כך שיהיו זהות על-ידי הקשה על מקש Home ולאחר מכן על מקש End בלוח המקשים.
- יצא את מסגרת התמונה. בחר את פורמט הפלט להיות JPEG ולחץ אישור.
- פתח את היישום ImageJ וטען את התמונות שנשמרו בשלב הקודם. התחל על-ידי הגדרת המידות הדרושות על-ידי הקשה על נתח > הגדר מדידות וודא שתיבות הסימון עבור שטח, היקף והתאמה אליפסה מסומנות. לחץ על אישור.
- לאחר מכן, המירו את התמונה לגווני אפור באמצעות בחירה באפשרות 'תמונה' > 'סוג' > 8 סיביות.
- לאחר מכן המירו את התמונה לבינארית באמצעות Image > Adjust > Thresholding. בתיבת הדו-שיח סף, התאם את שני המחוונים לפי הצורך. הקש החל ולאחר מכן סגור את תיבת הדו-שיח סף.
- בחר נתח כלי > > מנהל החזר ההשקעה. במנהל החזר ההשקעה, לחץ על תיבת הסימון הצג הכל. אל תסגור תיבה זו.
- בחרו בכלי שרביט (עקיבה), בחרו תא מתאים בתמונה והקישו T במקלדת. התא שנבחר יהיה ממוספר. ניתן לבחור שוב תא חדש. בחר את כל התאים הרלוונטיים למדידה. התאים הרלוונטיים מזוהים כתאים המבודדים מתאים אחרים. מספר התאים האלה יכול לנוע בין 50 ל-200 בשדה ראייה יחיד.
- חזור לתיבה מנהל החזר ההשקעה ולחץ על מדידה. פעולה זו פותחת את התיבה תוצאות. עמודות המסומנות כ'מז'ור' ו'מינורי' הן האורכים של האליפסה המותאמת צירים ראשיים ומינוריים (בפיקסלים), בהתאמה. בחרו ' קובץ' >'שמור בשם ' כדי לייצא את המידות כקובץ בתבנית CSV.
- באמצעות כל תוכנת ניתוח חישובית מתאימה, לחשב את המנה של מז'ור ומינור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאשר תרחיף התא הועמס בתעלה המיקרופלואידית, נצפתה התפלגות אחידה יחסית של תאים. עם יציאת האות (למשל, גל סינוס פשוט או שלב On-Keying של ASK) ממחולל הפונקציות, האלקטרודות האינטרדיגיטציה בעלות הסרט הדק יצרו שדה חשמלי לא אחיד של זרם חילופי. התאים המרחפים הגיבו באופן ספונטני לעירור חשמלי זה והפגינו התנהגות DEP חיובית, כלומר נעה לעבר קצוות האלקטרודות עם חוזק שדה גבוה יותר. כתוצאה מכך, התאים היו מיושרים לאורך קצוות האלקטרודות ונמתחו עקב אלקטרודפורמציה. תחת שלב On-Keying, RBCs נמתחים עקב אלקטרודפורמציה; תחת שלב Off-Keying, RBCs רגועים (איור 5B). שמירה על דיסקרטיות התא חשובה בפרוטוקול זה. באמצעות גורם הדילול כאמור בפרוטוקול זה, תרחיף התאים של RBCs נורמליים היה בטווח של 62 - 104 תאים / μL. בריכוז בטווח זה, הצלחנו להשיג תפוקה גבוהה של מדידת תאים תוך מזעור הצטברות התאים עקב אפקט DEP חיובי.
כאשר עקבנו אחר RBCs בודדים במהלך בדיקת עייפות של שעה אחת, הבחנו בירידה הדרגתית בעיוות תאי (איור 5C). יכולת העיוות כומתה על-ידי היחס בין הצירים הראשיים והקטנים של אליפסה ששימשה כדי להתאים ל-RBCs בודדים, באמצעות תוכנת הדמיה בקוד פתוח (איור 6). תמונות מעניינות נפתחו בתוכנה. לא היה צורך לכייל את גודל הפיקסלים לקנה מידה של אורך לצורך מדידת העיוות. נתונים מספריים ניתנים לניתוח נוסף ולשרטוט באמצעות תוכנה.
בפרוטוקול זה, נתוני דפורמציה של RBCs נאספו במרווח זמן של 10 דקות במהלך 1 שעה של עומס מכני מחזורי באמצעות ASK של 250 מגה-הרץ כדי לווסת את גל הסינוס2 V RMS-3 MHz. נצפתה ירידה הדרגתית בעיוות התא. אובדן העיוות הכולל של RBCs בתנאי בדיקת עייפות זה נמצא 18% (איור 7).
איור 1: התקן מיקרופלואידי לאלקטרודפורמציה. (A) סכמטי של התעלה המיקרופלואידית עם חורים מנוקבים בביופסיה של 1.5 מ"מ ו-3 מ"מ עבור יציאת הדגימה והכניסה, בהתאמה. (ב) מבט מתפוצץ על מכלול מתקן הבדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פעולת מד מוליכות. מד מוליכות שימש כדי לוודא שהמוליכות של תווך DEP היא 0.04 S/m. גשושיות החישה בבסיס המונה שקועות בדגימה כדי לקבל קריאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פעולת אוסמומטר. נעשה שימוש באוסמומטר כדי לאמת את הריכוז האוסמוטי של תווך DEP. שלב 1 - הצמד קצה דגימה למקומו על הדוגם וטען 20 μL של דגימה. שלב 2 - הניחו את הדוגם בתוך עריסת ההפעלה ומתחת לראש העריסה. שלב 3 - דוחפים את כל עריסת ההפעלה כלפי מטה עד שהיא מגיעה לעצירה חיובית. שלב 4 - המכשיר מפעיל את הבדיקה במשך כדקה ומציג את התוצאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: קישוריות מחולל פונקציות. תמונה של מערך הניסוי לבדיקת עייפות, כולל מכלול מתקן הבדיקה ומחולל פונקציות. רפידות אלקטרודות ITO מחוברות למחולל הפונקציות באמצעות כבל קליפ BNC-to-alligator באמצעות החוטים המולחמים מראש לכוסות סיכות פוגו הנלחצות ליחידה העליונה של מתקן הבדיקה. המכשיר המיקרופלואידי בעל שתי תעלות מקבילות עצמאיות יושב על היחידה התחתונה של מתקן הבדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תגובת התא למפתח on-off. (A) On-off keying גל סינוס מווסת למשך שעה אחת בדיקת עייפות: גל סינוס של 2 Vמשרעת RMS ב-3 MHz לפעולת אלקטרודפורמציה, תדר אפנון של 250 MHz וכתוצאה מכך 2 שניות של מתיחה ו-2 שניות של הרפיה. (B) בשלב On-Keying, RBCs נמתחים עקב אלקטרודפורמציה; תחת שלב Off-Keying, RBCs רגועים. (C) אלקטרודפורמציה של תא מייצג מראה התפרקות הדרגתית בעיוות הממברנה במהלך שעה אחת של מתיחה מחזורית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: אפיון עיוות RBC באמצעות ImageJ. שלב 1 - ייבא את התמונה לתוכנה לעריכת תמונות והמיר אותה לגווני אפור של 8 סיביות. שלב 2 - התאם את הסף להמרת תמונות לבינאריות. שלב 3 - בחירת תאים באמצעות כלי השרביט (מעקב) וניהול בחירות באמצעות מנהל החזר ההשקעה. שלב 4 - בחר את התאים לקבלת מדידות עבור צירים ראשיים ומשניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הפחתה בעיוות תאים. השפלה הדרגתית בעיוות RBC עקב אלקטרודפורמציה מחזורית. סרגל השגיאה מציג את סטיית התקן (n = 69). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתן להשתמש באפנון ASK OOK של גל סינוס מעורר כוח DEP כדי לבדוק את העייפות המכנית של RBCs לאורך תקופת זמן ארוכה. בפרוטוקול זה, הגבלנו את בדיקת עייפות החוץ גופית לשעה אחת כדי למנוע את ההשפעות המטבוליות השליליות האפשריות על עיוות התא. ניתן לתכנת תנאי בדיקת עייפות מקיפים באמצעות טכניקת אלקטרודפורמציה מווסתת ASK. ניתן לתכנת פרמטרים כגון תדירות טעינה, משרעת וקצב טעינה. ניתן לתכנת את תדירות ההעמסה לערכים משתנים כדי לקבוע את תלות העייפות בתדירות ההעמסה וכן הבדלים בין עומס מחזורי לטעינה סטטית13.
ניתן לכוונן בקלות את גודל המתיחה באמצעות רמת מתח שונה לעיוותים קטנים או גדולים. אולם כאשר משתמשים ברמות מתח גבוה כדי לכלול עיוות גדול, מציינים כי אלקטרודפורמציה תגרום ל-RBCs דמויי להבה (איור 6, שלב 3). פעולה זו עלולה לגרום לשגיאות בעת התאמת צורות תאים עם אליפסות, אשר חותכות את הקצוות המחודדים של תאים. בנסיבות אלה, במיוחד כאשר משתמשים באלקטרודפורמציה כדי לחלץ פרמטרים של צמיגות גזירה ממברנה, ניתן להשתמש בשתי אסטרטגיות: (i) שימוש במודל חישובי של צורות תאים אמיתיות יספק תוצאות מדויקות יותר מאשר מודל הצורה האליפטי האנליטי הפשוט; (ii) שימוש ברמת מתח קטנה יותר כדי למתוח תאים כך שצורות התא יוכלו להיות מצוידות היטב באליפסות.
בפרוטוקול הנוכחי, המוליכות הבינונית הייתה 0.04 S/m, אותה ניתן לכוונן לפי הצורך. מכיוון שמתיחה תאית הנגרמת על ידי אלקטרודפורמציה קשורה לערכים האמיתיים של גורם קלאוזיוס מוסוטי המורכב, תדר גל הסינוס יכול להיות שונה מ- 3 MHz שנבחר. המפתח הוא למזער את המתח כדי לגרום אלקטרודפורמציה תוך שמירה על אפקט חימום ג'אול זניח. עירור חשמלי אופטימלי יכול להיקבע באמצעות תורת DEP או באמצעות כלים חישוביים למידול דיאלקטרי של תאים, כגון My DEP11.
יש לציין כי אימוביליזציה של תאים אינה נדרשת בפרוטוקול זה מכיוון שתאים שעוברים אלקטרודפורמציה מציגים מטבעם DEP חיובי, המעביר תאים לקצוות האלקטרודה באופן ספונטני. זה מאפשר לנו לבצע בדיקות על תרחיפים של תאים ולשתק את כל התאים באינטראקציה עם האלקטרודה ובו זמנית למתוח את התאים. לאחר ביצוע הבדיקה, ניתן להסיר תאים בקלות מהמכשיר על ידי שטיפת התעלה עם המדיום. המאפיין של הפרוטוקול הנוכחי, שגורם לו לעבוד היטב עם תאים מושהים, עשוי להגביל את היישום שלו לבדיקת תאים דבקים. עם זאת, אנו יכולים לנתק תאים דבקים מהמצע באמצעות כימיקלים כגון חומצה ethylenediaminetetraacetic. מכיוון שניתן לתכנן את הבדיקה כך שתושלם בזמן קצר יחסית, בין דקות לשעה, יש לנו מספיק זמן לבצע בדיקת עייפות מכנית לפני שהתאים עוגנים ומתפשטים14.
בפרוטוקול הנוכחי נעשה שימוש בשבב ITO זמין מסחרית עם אלקטרודות בין-ספרתיות של 100 מיקרומטר. תכנון אלקטרודות בין-ספרתיות הוא יתרון למדידת תאים מרובים בו זמנית עבור יחס אורך לאזור, מכיוון שהתאים נמתחים בקצוות האלקטרודות. תפוקת המדידה תלויה גם בשדה התצפית, שבו גודל התא ועיוותותם קובעים מגבלות על המרווח המינימלי של האלקטרודות. רוחב הפס של האלקטרודות יכול להיות מופחת עוד יותר כדי להגדיל את מספר תאי התצפית עבור תפוקה גבוהה יותר. חומרי האלקטרודה יכולים להיות מתכות אחרות, כגון טיטניום או זהב; עם זאת, השקיפות של חומרי האלקטרודות עשויה להיות בחירה טובה יותר מכיוון שחלק מקרום התא יכול להיחסם על ידי האלקטרודות הלא שקופות. הבדיקה עדיין יכולה להתבצע אם מודל צורה מתמטי רלוונטי של התא, כגון אליפסואיד13, יכול לשמש במהלך עיבוד הדמיה.
באופן תיאורטי, אלקטרודפורמציה זו וטכניקות אלקטרודפורמציה באפנון ASK יכולות לעבוד על סוגי תאים אחרים, בהינתן התנאים המתאימים, כגון מוליכות בינונית ועירורים חשמליים. מגבלה היא כמה התארכות אנחנו יכולים לראות. RBC הוא מודל תא טוב עבור עיוות גדול שלה אופי מחזור. הפרוטוקול הנוכחי יושם לחקר RBCs אנושיים הן בבריאות והן במחלות והוא מצויד בקלות במיקרו-סביבה של גז לחקר עייפות היפוקסית13,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי NSF/CMMI Mechanobiology של נשאי חמצן מלאכותי מבוססי המוגלובין (#1941655) וניתוח דינמי ועייפות של NSF/CMMI של תאי דם אדומים בריאים וחולים (#1635312).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances. Blood Cell—An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).
- Safeukui, I., et al. Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).
- Naghedi-Baghdar, H., et al. Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review. Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).
- Franco, R. S. Measurement of red cell lifespan and aging. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).
- Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -E., Duffy, S. P., Ma, H. Technologies for measuring red blood cell deformability. Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).
- Kim, J., Lee, H., Shin, S. Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review. Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).
- Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species. Cells. 11 (8), 1351 (2022).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).
- Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples. Al Safi, A., Bazuin, B. 2017 IEEE 7th Annual Computing and Communication Workshop and Conference (CCWC), , 1-7 (2017).
- Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. Circulating tumor cell isolation and analysis. Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).
- Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Frénéa-Robin, M. MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells. Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).
- Haywood, M.
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. Mechanical fatigue of human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).
- Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).
- Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia. Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).
