Summary
Hier wird ein Protokoll für mechanische Ermüdungstests bei menschlichen roten Blutkörperchen unter Verwendung eines amplitudenmodulierten Elektrodeformationsansatzes vorgestellt. Dieser allgemeine Ansatz kann verwendet werden, um die systematischen Veränderungen der morphologischen und biomechanischen Eigenschaften biologischer Zellen in einer Suspension aus zyklischer Verformung zu messen.
Abstract
Rote Blutkörperchen (RBCs) sind für ihre bemerkenswerte Verformbarkeit bekannt. Sie erleiden beim Durchlaufen der Mikrozirkulation immer wieder erhebliche Verformungen. Bestehende Techniken zur Messung der Zellverformbarkeit können nicht ohne weiteres zur Messung der Ermüdung, d. h. des allmählichen Abbaus von Zellmembranen, der durch zyklische Belastungen verursacht wird, verwendet werden. Wir stellen ein Protokoll vor, um die mechanische Degradation in Erythrozyten durch zyklische Scherspannungen unter Verwendung der auf Amplitudenverschiebung (ASK) basierenden elektrodischen Verformung in einem mikrofluidischen Kanal zu bewerten. Kurz gesagt, werden die interdigitalisierten Elektroden im mikrofluidischen Kanal mit einem Niederspannungs-Wechselstrom bei Radiofrequenzen unter Verwendung eines Signalgenerators angeregt. Erythrozyten in Suspension reagieren auf das elektrische Feld und weisen eine positive Dielektrophorese (DEP) auf, die Zellen an die Elektrodenränder bewegt. Die Zellen werden dann aufgrund der elektrischen Kräfte, die auf die beiden Zellhälften ausgeübt werden, gedehnt, was zu einer einachsigen Dehnung führt, die als Elektroverformung bezeichnet wird. Die Höhe der Schubspannung und die daraus resultierende Verformung können einfach durch Änderung der Amplitude der Anregungswelle eingestellt werden. Dies ermöglicht Quantifizierungen der nichtlinearen Verformbarkeit von Erythrozyten als Reaktion auf kleine und große Verformungen bei hohem Durchsatz. Die Modifikation der Anregungswelle mit der ASK-Strategie induziert eine zyklische Elektrodeformation mit programmierbaren Belastungsraten und Frequenzen. Dies bietet eine bequeme Möglichkeit zur Charakterisierung der Erythrozytenermüdung. Unser ASK-modulierter Elektrodeformationsansatz ermöglicht erstmals eine direkte Messung der Erythrozytenermüdung durch zyklische Belastungen. Es kann als Werkzeug für allgemeine biomechanische Tests, für Analysen der Zellverformbarkeit und -ermüdung bei anderen Zelltypen und Krankheitszuständen verwendet werden und kann auch mit Strategien zur Kontrolle der Mikroumgebung von Zellen kombiniert werden, wie z. B. Sauerstoffspannung und biologische und chemische Hinweise.
Introduction
Rote Blutkörperchen (RBCs) sind die am stärksten verformbaren Zellen im menschlichen Körper1. Ihre Verformbarkeit steht in direktem Zusammenhang mit ihrer sauerstofftransportierenden Funktionalität. Es wurde festgestellt, dass eine reduzierte Verformbarkeit von Erythrozyten mit der Pathogenese verschiedener Erythrozytenerkrankungen korreliert2. Verformbarkeitsmessungen haben uns zu einem besseren Verständnis von Erythrozyten-assoziierten Erkrankungen geführt3. Die normale Lebensdauer von Erythrozyten kann zwischen 70 und 140 Tagenvariieren 4. Daher ist es wichtig zu messen, wie ihre Verformbarkeit mit dem Alterungsprozess abnimmt, z. B. ihr Ermüdungsverhalten aufgrund zyklischer Scherspannungen3.
Die Messung der Verformbarkeit von Erythrozyten bei hohem Durchsatz ist aufgrund der Piconewton-Skalenkräfte (~10-12 N), die auf die einzelnen Zellen ausgeübt werden, eine Herausforderung. In den letzten zehn Jahren wurden viele Technologien entwickelt, um die Verformbarkeit von Zellen zu messen5. Deformationsmessungen von Erythrozyten auf Einzelzellebene können durch Pipettenaspiration und optische Pinzette durchgeführt werden, während Massenanalysen durch osmotische Gradientenektazytometrie durchgeführt werden. Ektazytometrische Analysen liefern eine Fülle von Daten, die die Möglichkeit bieten, Bluterkrankungen zu diagnostizieren 6,7. Die Verformbarkeit von Erythrozyten kann auch mit Hilfe der viskoelastischen Theorie mittels Kolloidsonden-Rasterkraftmikroskopie analysiert werden. Bei dieser Methode wird eine computergestützte Analyse angewendet, um den Elastizitätsmodul von Erythrozyten zu schätzen, wobei sowohl zeitabhängige als auch stationäre Antworten berücksichtigt werden. Die Verformbarkeit einzelner Erythrozyten kann mit der Einzelzell-Mikrokammer-Array-Methode gemessen werden. Diese Methode analysiert jede Zelle durch die Membran und zytosolische Fluoreszenzmarker, um Informationen über die Verformbarkeit von Erythrozyten und die Verteilung zellulärer Eigenschaften in komplexen Erythrozytenpopulationen zu erhalten, um hämatologische Erkrankungen zu erkennen8.
Ermüdung ist ein Schlüsselfaktor für die Verschlechterung der Eigenschaften von technischen Materialien und Biomaterialien. Die Ermüdungsprüfung ermöglicht eine quantitative Analyse der Integrität und Langlebigkeit einer Struktur, die einer zyklischen Belastung ausgesetzt ist. Die Analyse der Ermüdung in biologischen Zellen wurde lange Zeit durch das Fehlen einer allgemeinen, leicht anwendbaren, quantitativen Methode für den hohen Durchsatz und die Implementierung zyklischer Deformation in Zellmembranen behindert. Dies ist durch den Einsatz von elektrischen Signalmodulations- und Elektrodeformationstechniken möglich, die in einer mikrofluidischen Umgebung implementiert sind. Die ASK-Technik (Amplitude Shift Keying) als digitale Modulation wird in diesem Artikel durch die On-Off-Keying-Modulation (OOK) angewendet. Das Konzept der Kodierung bezieht sich auf die Übertragung digitaler Signale über den Kanal, der ein Sinuswellenträgersignal benötigt, um 9zu funktionieren. Die Ein- und Ausschaltzeiten können gleich eingestellt werden. Unter EIN-Tasten treten Erythrozyten in einen verformten Zustand über, während sie einer externen Elektroformkraft (Fdep)10 ausgesetzt sind, die durch das ungleichmäßige elektrische Feld erzeugt wird. Unter OFF-Keying befinden sich RBCs in ihrem entspannten Zustand. Wir beobachten die Ermüdung von Erythrozyten, d.h. eine fortschreitende Verschlechterung ihrer Dehnungsfähigkeit mit zunehmender Belastungszyklen. Der ermüdungsbedingte Verlust der Verformbarkeit von Erythrozyten kann Einblicke in die akkumulierte Membranschädigung während der Blutzirkulation geben, so dass wir die Zusammenhänge zwischen Zellermüdung und Krankheitszuständen weiter untersuchen können.
Hier stellen wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Verfügung, wie die Ermüdungsprüfung von Erythrozyten in einem mikrofluidischen Gerät über ASK-modulierte Elektroverformung und die Systemeinstellungen wie mikrofluidische Vorrichtung, mechanische Belastung und mikroskopische Bildgebung zur Charakterisierung der allmählichen Degradation der mechanischen Verformbarkeit von Erythrozyten implementiert wird.
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Protocol
Deidentifiziertes menschliches Vollblut wurde kommerziell gewonnen. Die Arbeit mit den Blutproben wurde in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 unter Verwendung von Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Biosafety Committee an der Florida Atlantic University genehmigt wurden.
1. Vorbereitung des mikrofluidischen Geräts
- Klebe den SU-8 Master-Siliziumwafer für das mikrofluidische Kanaldesign auf der Innenseite einer 14 cm großen Petrischale aus Kunststoff ab und reinige ihn mit N2 Gas.
- 60 g Polydimethylsiloxan (PDMS) Base und 6 g PDMS-Härter in einen Pappbecher wiegen. Mischen Sie die beiden Teile mit einem Holzspatel, bis die Mischung eine trübe weiße Farbe hat.
- Gießen Sie die PDMS-Mischung in die Kunststoff-Petrischale, in der sich der Siliziumwafer befindet. Stellen Sie die Petrischale in einen Vakuum-Exsikkator mit einem 3-Wege-Absperrhahn. Drehen Sie das Ventil des Absperrhahns, um das Vakuum mit der Exsikkatorkammer zu verbinden und Luftblasen aus dem PDMS zu entfernen.
- Führen Sie wieder Luft in die Exsikkatorkammer ein, indem Sie das Absperrventil einstellen, um die Exsikkatorkammer in ca. 5-Minuten-Zyklen mit der Umgebung zu verbinden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Luftblasen aus den Merkmalen der Kanäle entfernt sind.
- Die Petrischale für 4 h bei 70 °C in den Ofen stellen. Nach Ablauf der Zeit die Petrischale herausnehmen, auf Raumtemperatur abkühlen lassen und auf eine Schneidematte legen.
- Schneiden Sie mit einem Skalpell den Teil des PDMS über dem Siliziumwafer aus. Legen Sie das ausgeschnittene PDMS zwischen die beiden Blätter der Laborfolie. Der Spalt, der zwischen dem Einzug des Mikrokanals und der halbtransparenten Folie gebildet wird, erleichtert die Identifizierung der Position des mikrofluidischen Kanals sowie seines jeweiligen Ein- und Auslasses.
- Schneiden Sie mit einer Rasierklinge einen einzelnen Kanal aus dem großen PDMS heraus. Stanzen Sie ein 3 mm großes Einlassloch und ein 1,5 mm großes Auslassloch mit Biopsiestanzen entsprechend den beiden Größen (Abbildung 1A).
- Legen Sie den gelochten Kanal mit der Kanalseite nach oben auf einen sauberen Objektträger. Platzieren Sie ein 20 mm x 15 mm großes Glassubstrat mit interdigitierten Dünnschichtelektroden aus Indiumzinnoxid (ITO) auf demselben Objektträger mit den Elektroden nach oben.
- Legen Sie den Objektträger mit PDMS und Substrat vorsichtig in einen Plasmareiniger. Schließen Sie das Gasventil, schalten Sie den Pumpenschalter ein und warten Sie 2 Minuten, um einen Sensorwert von 600 - 800 mTorr zu erhalten.
- Schalten Sie den Netzschalter ein und warten Sie 30 Sekunden. Drehen Sie den HF-Einschaltknopf von niedrig auf hoch und warten Sie 1 Minute.
- Kehren Sie dann die Sequenz um, indem Sie den HF-Knopf auf Low, den Netzschalter auf OFF, den Pumpenschalter auf OFF drehen und das Gasventil öffnen.
- Unmittelbar nach dem Öffnen der Kammer des Plasmareinigers wird das PDMS angehoben und gedreht, so dass die Kanalseite nach unten zeigt (180°). Platzieren Sie den Kanal auf der Oberseite des ITO-Substrats. Der Klebeprozess hat begonnen.
- Drücken Sie mit einer Pinzette etwa 3 s lang vorsichtig auf die Ecken des PDMS. Vermeiden Sie es, auf den Kanal selbst zu drücken.
HINWEIS: Der Verklebungsprozess erfolgt spontan bei physischem Kontakt zwischen den beiden behandelten Oberflächen. - Geben Sie das Priming-Medium in eine 1-ml-Spritze mit einer 23-G-Nadel. Befeuchten Sie den Kanal vorsichtig, indem Sie die Nadel gerade in den Einlassschacht einführen und dann das Medium freilassen. Arbeiten Sie langsam. Führen Sie keine Luftblasen ein. Mindestens 3 Minuten inkubieren.
- Entfernen Sie das Primärmedium mit einer 10-μl-Pipettenspitze. Waschen Sie den Kanal 3 Mal mit DEP-Medium, indem Sie das DEP-Medium in den Kanal einführen. Halten Sie den Kanal immer feucht.
2. Prüfvorrichtung
HINWEIS: Die Prüfvorrichtung wird mit einer 3D-CAD-Software entworfen und besteht aus einem Basisgehäuse und einem Oberteil (Abbildung 1B). Anschließend wird es mit einer 3-Achsen-CNC-Fräsmaschine mit einer Standardtoleranzgrenze von etwa ± 0,005-Zoll-Abmessung der Prüfvorrichtung mit einem elektronischen Messschieber (nicht dargestellt) überprüft. Die Sterilität der Vorrichtung ist für die biomechanischen In-vitro-Tests nicht erforderlich.
- Löten Sie Drähte in die Lötkelchenden von zwei Sätzen von Federkolbenverbindern vor.
- Setzen Sie die Federkolbenverbinder in die obere Einheit ein und schaffen Sie eine dauerhafte Verbindung, indem Sie einen Tropfen Epoxidkleber hinzufügen.
3. Herstellung des Arbeitspuffers für die Elektroverformung
- Zur Herstellung des DEP-Mediums werden 12,75 g Saccharose und 0,45 g Dextrose mit einer Waage abgewogen.
- Lösen Sie beide Pulver in einem einzigen Behälter mit 150 ml deionisiertem Wasser (DI) und 3,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf.
- Messen Sie die Leitfähigkeit mit einem Leitfähigkeitstester im unteren Bereich und stellen Sie sicher, dass sie 0,04 S/m beträgt (Abbildung 2).
HINWEIS: Es kann ein anderer Leitfähigkeitswert verwendet werden, der das Vorzeichen und die Größe der resultierenden DEP-Kraft11 ändern kann. Die Elektroverformung erfordert jedoch eine positive DEP-Kraft. - Bestätigen Sie mit einem Osmometer, dass die Osmolarität innerhalb des normalen Bereichs des Blutplasmas liegt, 275 bis 295 mOsm/kg Wasser (Abbildung 3). Bei 4 °C lagern. Das DEP-Medium ist nun vorbereitet.
- In einem 15-ml-Röhrchen werden 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) in 10 ml des DEP-Mediums gelöst. Gründlich mischen. Das Primärmedium des Gerätes ist nun vorbereitet.
4. Herstellung der Zellsuspension
- Waschen Sie 20 μl Vollblut, indem Sie das Blut mit 1 ml PBS bei 268 x g für 3 Minuten zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Erythrozyten in 1 ml PBS. Zum Mischen vorsichtig pipettieren. Waschen Sie die Erythrozyten 3 Minuten lang bei 268 x g und entsorgen Sie den Überstand.
- Extrahieren Sie 5 μl Erythrozytenpellet mit einer 10-μl-Mikropipettenspitze und dosieren Sie es vollständig in 1 ml des DEP-Mediums. Waschen Sie die Zellen, indem Sie sie 3 Minuten lang bei 268 x g zentrifugieren.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Erythrozyten in 1 ml DEP-Medium. Zum Mischen vorsichtig pipettieren.
- Waschen Sie die Erythrozyten 3 Minuten lang bei 268 x g und entsorgen Sie den Überstand. Pipettieren Sie 2 μl Erythrozytenpellet in 500 μl DEP-Medium. Die Zellsuspension wird nun mit einer Konzentration im Bereich von 62 - 104 Zellen/μL12 hergestellt, die mit einem Standard-Zellzählobjektträger bestätigt werden kann.
5. Elektroverformungsaufbau und Ermüdungsprüfung
- Platzieren Sie das mikrofluidische Gerät im unteren Teil der Testvorrichtung. Richten Sie den oberen Teil der Halterung am Gerät aus und montieren Sie die beiden Teile mit zwei Sätzen Nylonschrauben und Muttern (Abbildung 4).
- Platzieren Sie die Prüfvorrichtung auf dem Mikroskoptisch. Lokalisieren Sie einen gewünschten Elektrodensatz unter dem Mikroskop.
- Verbinden Sie das entsprechende Elektrodendrahtpaar, das zum platzierten Elektrodensatz passt, mit der Ausgangsklemme des Funktionsgenerators (Abbildung 4).
- Entfernen Sie 5 μl des DEP-Mediums aus dem 3-mm-Einlass des mikrofluidischen Kanals. Laden Sie langsam 5 μl der Zellsuspension mit einer 10-μl-Pipettenspitze in den Einlass.
- Lassen Sie die Zellen 1 Minute lang ruhen. Falls erforderlich, fügen Sie dem Einlass ein zusätzliches DEP-Medium hinzu, um die Zellen in den Kanal zu drücken.
- Beobachten Sie den Kanal unter 20-facher Vergrößerung. Verwenden Sie einen 414/46-nm-Bandpassfilter, um den Kontrast der Abbildung zu verbessern.
- Drücken Sie die Sinustaste und definieren Sie eine Sinuswelle mit einerRMS-Amplitude von 2 V bei einer Frequenz von 3 MHz. Drücken Sie die Mod-Taste , um die Modulation zu aktivieren. Ändern Sie den Wellenmodus in ASK, indem Sie die Option Typ drücken.
- Stellen Sie die Modulationsfrequenz auf 250 mHz ein, was einer Lade- und Entladezeit von 4 s entspricht (Abbildung 5A). Schalten Sie den Ausgang des Funktionsgenerators ein.
- Nehmen Sie alle 10 Minuten ein 1-minütiges Video mit 30 Bildern pro Sekunde (fps) auf.
6. Charakterisierung der Erythrozytenverformung
- Öffnen Sie mit einer Videobearbeitungsanwendung .avi, die im vorherigen Schritt aufgenommen wurden, indem Sie Strg+O drücken. Verwenden Sie die Zeitachse, um einen gewünschten Frame auszuwählen, und legen Sie die Start- und Endframes der Auswahl so fest, dass sie identisch sind, indem Sie die Home-Taste und dann die Endtaste auf der Tastatur drücken.
- Exportieren Sie den Bildrahmen. Wählen Sie das Ausgabeformat JPEG aus und drücken Sie OK.
- Öffnen Sie die Anwendung ImageJ und laden Sie die im vorherigen Schritt gespeicherten Bilder. Beginnen Sie mit dem Festlegen der erforderlichen Messungen, indem Sie auf Analysieren > Maße festlegen drücken und sicherstellen, dass die Kontrollkästchen für Fläche, Umfang und Ellipse anpassen aktiviert sind. Drücken Sie OK.
- Konvertieren Sie als Nächstes das Bild in Graustufen, indem Sie Bild > Typ > 8-Bit auswählen.
- Konvertieren Sie das Bild dann mit Image > Adjust > Thresholding in eine Binärdatei. Passen Sie im Dialogfeld "Schwellenwert" die beiden Schieberegler nach Bedarf an. Klicken Sie auf Übernehmen , und schließen Sie dann das Dialogfeld Schwellenwert.
- Wählen Sie Analyze > Tools > ROI Manager aus. Aktivieren Sie im ROI-Manager das Kontrollkästchen "Alle anzeigen". Schließen Sie dieses Kästchen nicht.
- Wählen Sie das Zauberstab-Werkzeug (Nachzeichnen) aus, wählen Sie eine entsprechende Zelle im Bild aus und drücken Sie T auf der Tastatur. Die ausgewählte Zelle wird nummeriert. Eine neue Zelle kann erneut ausgewählt werden. Wählen Sie alle zutreffenden Zellen aus, die gemessen werden sollen. Die anwendbaren Zellen werden als diejenigen identifiziert, die von anderen Zellen isoliert sind. Die Anzahl dieser Zellen kann zwischen 50 und 200 in einem einzigen Sichtfeld liegen.
- Kehren Sie zum Feld ROI-Manager zurück, und klicken Sie auf Messen. Dadurch wird das Feld Ergebnisse geöffnet. Spalten mit den Bezeichnungen "Haupt" und "Neben" geben die Längen der angepassten Haupt- und Nebenachsen der Ellipse (in Pixeln) an. Wählen Sie Datei > Speichern unter , um die Messungen als CSV-formatierte Datei zu exportieren.
- Berechnen Sie mit einer geeigneten Computeranalysesoftware den Quotienten aus Major und Minor.
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Representative Results
Wenn die Zellsuspension in den mikrofluidischen Kanal geladen wurde, wurde eine relativ gleichmäßige Verteilung der Zellen beobachtet. Bei der Signalausgabe (z. B. einer einfachen Sinuswelle oder einer On-Keying-Phase von ASK) des Funktionsgenerators erzeugten die interdigitalen Dünnschichtelektroden ein ungleichmäßiges elektrisches Wechselstromfeld. Die suspendierten Zellen reagierten spontan auf diese elektrische Anregung und zeigten ein positives DEP-Verhalten, d.h. sie bewegten sich zu den Rändern von Elektroden mit höherer Feldstärke. Folglich wurden die Zellen entlang der Ränder der Elektroden ausgerichtet und aufgrund der Elektrodeformation gedehnt. In der On-Keying-Phase werden die Erythrozyten aufgrund der Elektroverformung gedehnt; In der Off-Keying-Phase sind die Erythrozyten entspannt (Abbildung 5B). Die Aufrechterhaltung der Zelldiskretion ist in diesem Protokoll wichtig. Unter Verwendung des in diesem Protokoll angegebenen Verdünnungsfaktors lag die Zellsuspension normaler Erythrozyten in einem Bereich von 62 - 104 Zellen/μl. Bei einer Konzentration innerhalb dieses Bereichs konnten wir aufgrund des positiven DEP-Effekts einen hohen Durchsatz der Zellmessung erzielen und gleichzeitig die Akkumulation von Zellen minimieren.
Bei der Verfolgung einzelner Erythrozyten während des 1-stündigen Ermüdungstests beobachteten wir eine allmähliche Abnahme der zellulären Deformation (Abbildung 5C). Die Verformbarkeit wurde durch das Verhältnis der Haupt- und Nebenachsen einer Ellipse quantifiziert, die zur Anpassung der einzelnen Erythrozyten unter Verwendung von Open-Source-Bildgebungssoftware verwendet wurde (Abbildung 6). Interessante Bilder wurden im Softwareprogramm geöffnet. Für die Verformbarkeitsmessung war es nicht notwendig, die Pixelgröße auf eine Längenskala zu kalibrieren. Numerische Daten können mit Hilfe von Software weiter analysiert und grafisch dargestellt werden.
In diesem Protokoll wurden Deformationsdaten von Erythrozyten im Zeitintervall von 10 min während der 1 h zyklischen mechanischen Belastung unter Verwendung des 250 mHz ASK gesammelt, um die 2 VRMS-3 MHz Sinuswelle zu modulieren. Es wurde eine allmähliche Verringerung der Zellverformbarkeit beobachtet. Der Gesamtverformbarkeitsverlust für Erythrozyten unter dieser Ermüdungstestbedingung betrug 18 % (Abbildung 7).
Abbildung 1: Mikrofluidische Vorrichtung zur Elektroverformung. (A) Schematische Darstellung des mikrofluidischen Kanals mit Biopsiestanzlöchern von 1,5 mm bzw. 3 mm für den Probenauslass bzw. -einlass. (B) Explosionsansicht der Prüfvorrichtungsbaugruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Funktionsweise des Leitfähigkeitsmessgeräts. Ein Leitfähigkeitsmessgerät wurde verwendet, um die Leitfähigkeit des DEP-Mediums auf 0,04 S/m zu überprüfen. Die Messsonden an der Basis des Messgeräts werden in die Probe eingetaucht, um einen Messwert zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Betrieb des Osmometers. Ein Osmometer wurde verwendet, um die osmotische Konzentration des DEP-Mediums zu überprüfen. Schritt 1 - Setzen Sie eine Probenspitze auf den Probenehmer und laden Sie 20 μl Probe ein. Schritt 2 - Legen Sie den Probenehmer in die Bedienschale und unter die Oberseite der Halterung. Schritt 3 - Drücken Sie die gesamte Bedienschale nach unten, bis sie einen positiven Anschlag erreicht. Schritt 4 - Das Gerät führt den Test ca. 1 Minute lang durch und zeigt das Ergebnis an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Konnektivität des Funktionsgenerators. Bild des Versuchsaufbaus für die Ermüdungsprüfung, einschließlich der Prüfvorrichtung und eines Funktionsgenerators. ITO-Elektrodenpads werden über ein BNC-zu-Krokodil-Clip-Kabel über die in die obere Einheit der Prüfvorrichtung eingepressten Pogo-Pin-Cups vorgelöteten Drähte mit dem Funktionsgenerator verbunden. Das mikrofluidische Gerät mit zwei unabhängigen parallelen Kanälen sitzt auf der unteren Einheit der Prüfvorrichtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Reaktion der Zelle auf Ein-Aus-Tasten. (A) Ein-Aus-Tastung modulierte Sinuswelle für 1 h Ermüdungstest: Sinuswelle mit einer Amplitude von 2 VRMS bei 3 MHz für die Elektroverformung, Modulationsfrequenz von 250 mHz, was zu einer Dehnung von 2 s und einer Entspannung von 2 s führt. (B) In der On-Keying-Phase werden die Erythrozyten aufgrund der Elektroverformung gedehnt; In der Off-Keying-Phase sind die Erythrozyten entspannt. (C) Die Elektrodeformation einer repräsentativen Zelle zeigt einen allmählichen Abbau der Membranverformung während 1 h zyklischer Dehnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Charakterisierung der Erythrozytenverformbarkeit mit ImageJ. Schritt 1 - Importieren Sie das Bild in eine Bildbearbeitungssoftware und konvertieren Sie es in 8-Bit-Graustufen. Schritt 2 - Passen Sie den Schwellenwert an, um Bilder in Binärdateien zu konvertieren. Schritt 3 - Wählen Sie Zellen mit dem Stab-(Nachzeichnungs-)Tool aus und verwalten Sie die Auswahl mit dem ROI-Manager. Schritt 4 - Wählen Sie die Zellen aus, um Messungen für Haupt- und Nebenachsen zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Verringerung der Zellverformbarkeit. Allmähliche Verschlechterung der Verformbarkeit der Erythrozyten durch zyklische Elektroverformung. Der Fehlerbalken zeigt die Standardabweichung (n = 69). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die ASK OOK-Modulation einer DEP-Kraft-induzierenden Sinuswelle kann verwendet werden, um die mechanische Ermüdung von Erythrozyten über einen langen Zeitraum zu testen. In diesem Protokoll haben wir die In-vitro-Ermüdungstests auf 1 Stunde begrenzt, um mögliche nachteilige metabolische Auswirkungen auf die Verformbarkeit der Zellen zu verhindern. Umfassende Ermüdungsprüfbedingungen können mit der ASK-modulierten Elektroverformungstechnik programmiert werden. Parameter wie Belastungsfrequenz, Amplitude und Belastungsrate können programmiert werden. Die Belastungsfrequenz kann auf unterschiedliche Werte programmiert werden, um die Abhängigkeit der Ermüdung von der Belastungsfrequenz sowie die Unterschiede zwischen zyklischer Belastung und statischer Belastungzu bestimmen 13.
Die Dehnungsgröße kann einfach eingestellt werden, indem ein anderes Spannungsniveau für kleine oder große Verformungen verwendet wird. Bei der Verwendung von Hochspannungspegeln zur Einbeziehung großer Verformungen wird jedoch darauf hingewiesen, dass die Elektroverformung zu flammenförmigen Erythrozyten führt (Abbildung 6, Schritt 3). Dies kann zu Fehlern beim Anpassen von Zellenformen mit Ellipsen führen, die die spitzen Kanten von Zellen abschneiden. Unter diesen Umständen, insbesondere bei der Verwendung der Elektrodeformation zur Extraktion von Viskoelastizitätsparametern für die Membranscherung, können zwei Strategien verwendet werden: (i) Die Verwendung eines Computermodells der wahren Zellformen liefert genauere Ergebnisse als das einfache analytische elliptische Formmodell; (ii) Verwendung eines kleineren Spannungspegels zum Strecken von Zellen, so dass die Zellformen gut mit Ellipsen ausgestattet werden können.
Im aktuellen Protokoll lag die Leitfähigkeit des Mediums bei 0,04 S/m, die je nach Bedarf angepasst werden kann. Da die durch Elektrodeformation induzierte Zelldehnung mit den realen Werten des komplexen Clausius-Mossotti-Faktors zusammenhängt, kann die Sinuswellenfrequenz von den gewählten 3 MHz abweichen. Der Schlüssel liegt darin, die Spannung zu minimieren, um eine elektrische Verformung zu induzieren und gleichzeitig einen vernachlässigbaren Joule-Heizeffekt aufrechtzuerhalten. Eine optimale elektrische Anregung kann mit Hilfe der DEP-Theorie oder mit Hilfe von Berechnungswerkzeugen für die dielektrische Modellierung von Zellen, wie z. B. My DEP11, bestimmt werden.
Es sollte beachtet werden, dass in diesem Protokoll keine Zellimmobilisierung erforderlich ist, da Zellen, die einer Elektrodeformation unterzogen werden, von Natur aus eine positive DEP aufweisen, die die Zellen spontan an die Elektrodenränder bewegt. Dies ermöglicht es uns, Tests an Zellsuspensionen durchzuführen und alle Zellen zu immobilisieren, die mit der Elektrode interagieren und gleichzeitig die Zellen dehnen. Sobald der Test abgeschlossen ist, können die Zellen einfach aus dem Gerät entfernt werden, indem der Kanal mit dem Medium gespült wird. Die Charakteristik des aktuellen Protokolls, die dafür sorgt, dass es gut mit Suspensionszellen funktioniert, kann seine Anwendung auf das Testen adhärenter Zellen einschränken. Wir können jedoch anhaftende Zellen mit Chemikalien wie Ethylendiamintetraessigsäure vom Substrat lösen. Da der Test so konzipiert werden kann, dass er in relativ kurzer Zeit, von Minuten bis zu 1 Stunde, abgeschlossen werden kann, haben wir genügend Zeit, um mechanische Ermüdungstests durchzuführen, bevor sich die Zellen verankern und ausbreiten14.
Im aktuellen Protokoll wurde ein kommerziell erhältlicher ITO-Chip mit interdigitalen 100-μm-Bandelektroden verwendet. Das interdigitalisierte Elektrodendesign ist vorteilhaft, um mehrere Zellen gleichzeitig für das Längen-zu-Flächen-Verhältnis zu messen, da die Zellen an den Rändern der Elektroden gestreckt werden. Der Durchsatz der Messung hängt auch vom Beobachtungsfeld ab, in dem die Zellgröße und die Verformbarkeit den minimalen Abstand der Elektroden begrenzen. Die Bandbreite der Elektroden kann weiter verringert werden, um die Anzahl der Beobachtungszellen für einen höheren Durchsatz zu erhöhen. Bei den Elektrodenmaterialien kann es sich um andere Metalle wie Titan oder Gold handeln; Die Transparenz der Elektrodenmaterialien kann jedoch eine bessere Wahl sein, da ein Teil der Zellmembranen durch die nicht-transparenten Elektroden blockiert werden kann. Die Prüfung kann immer noch durchgeführt werden, wenn ein relevantes mathematisches Formmodell der Zelle, wie z. B. ein Ellipsoid13, während der Bildverarbeitung verwendet werden kann.
Theoretisch können diese Elektrodeformations- und ASK-modulierten Elektrodeformationstechniken auch auf andere Zelltypen angewendet werden, wenn die richtigen Bedingungen gegeben sind, z. B. die Leitfähigkeit des Mediums und elektrische Anregungen. Eine Begrenzung ist, wie viel Dehnung wir beobachten können. Erythrozyten sind aufgrund ihrer großen Verformbarkeit und ihrer zirkulierenden Natur ein gutes Zellmodell. Das derzeitige Protokoll wurde zur Untersuchung menschlicher Erythrozyten sowohl bei Gesundheit als auch bei Krankheit angewendet und ist leicht mit einer Gasmikroumgebung ausgestattet, um hypoxische Müdigkeit zu untersuchen13,15.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von NSF/CMMI Mechanobiology of Hemoglobin-Based Artificial Oxygen Carriers (#1941655) und NSF/CMMI Dynamic and Fatigue Analysis of Healthy and Diseased Red Blood Cells (#1635312) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balance Scale | ViBRA | HT-224R | |
| Bandpass filter | BRIGHTLINE | 414/46 BrightLine HC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok™ Tips, 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm | Fisher Scientific | 12-460-403 | |
| Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm | Fisher Scientific | 12-460-407 | 1.5 mm and 3 mm diameter |
| Blunt needle, 23-gauge | BSTEAN | X001308N97 | |
| Bovin Serum Albumin | RMBIO | BSA-BSH | |
| Centrifuge | SCILOGEX | 911015119999 | |
| Conical Tube, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | MDX01455 | MilliporeSigma™ |
| EC Low Conductivity meter | ecoTestr | 358/03 | |
| Eppendorf Snap-Cap MicrocentrifugeTubes | www.eppendorf.com | 05-402-25 | |
| Excel | Microsoft | Graph plotting | |
| Function Generator | SIGLENT | SDG830 | |
| Glass/ITO Electrode Substrate | OSSILA | S161 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | IX81 - SN9E07015 | |
| Lab Oven | QUINCY LAB (QL) | MODEL 30GCE | Digital Model |
| Matlab | MathWorks | Graph plotting | |
| Micro Osmometer - Model 3300 | Advanced Instruments Inc. | S/N: 03050397P | |
| Parafilm Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Petri dish | FALCON | SKU=351006 | ICSI/Biopsydish 50*9 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | LONZA | 04-479Q | |
| Plasma Cleaner | Harrick plasma PDCOOL | NC0301989 | |
| Solidworks | Dassault Systemes | CAD software | |
| Sucrose | Fisher Scientific | 50-188-2419 | |
| Vacuum Desiccator | SPBEL-ART | F42400-2121 | |
| Wooden spatula | Fisher Scientific | NC0304136 | Tongue Depressors Wood NS 6" |
References
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