Summary
Aplysia californica न्यूरॉन्स संस्कृति में बड़ी वृद्धि शंकु कि विकास शंकु गतिशीलता और मार्गदर्शन के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए उत्कृष्ट रहे हैं विकसित करना. यहाँ, हम विच्छेदन और Aplysia बैग सेल न्यूरॉन्स के चढ़ाना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीना सेल इमेजिंग के लिए एक कक्ष की स्थापना के लिए के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
Neuronal विकास शंकु axons कि वातावरण में मार्गदर्शन cues का पता लगाने और उपयुक्त लक्ष्य कक्ष की दिशा में दिशात्मक आंदोलन में इस जानकारी transduce कर सकते हैं की नोक पर अत्यधिक गतिशील संरचनाओं हैं. पूरी तरह से समझ कैसे मार्गदर्शन जानकारी कोशिका की सतह से अंतर्निहित गतिशील cytoskeletal नेटवर्क फैलता है, एक उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प पर प्रोटीन गतिशीलता का जीना सेल इमेजिंग के लिए उपयुक्त एक मॉडल प्रणाली की जरूरत है. ठेठ हड्डीवाला विकास शंकु भी मात्रात्मक एफ actin और microtubule गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए छोटे हैं. समुद्र खरगोश Aplysia californica से न्यूरॉन्स 5-10 बार हड्डीवाला न्यूरॉन्स से बड़ा हैं, आसानी से कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है और micromanipulation और biophysical माप के लिए बहुत मजबूत कोशिकाओं रहे हैं. उनके विकास शंकु बहुत cytoplasmic क्षेत्रों और एक अच्छी तरह से वर्णित cytoskeletal प्रणाली को परिभाषित किया है. neuronal सेल निकायों विकास शंकु गतिशीलता और मार्गदर्शन के अध्ययन के लिए जांच की एक किस्म के साथ microinjected किया जा सकता है है. वर्तमान प्रोटोकॉल में हम पेट नाड़ीग्रन्थि, बैग सेल न्यूरॉन्स की संस्कृति और विकास शंकु का जीना सेल इमेजिंग के लिए एक इमेजिंग कक्ष की स्थापना के विच्छेदन के लिए एक प्रक्रिया प्रदर्शित करता है.
Protocol
समाधान
- L15 ASW सेल संस्कृति माध्यम (1l)
- L15 पाउडर के 1 बैग
- एच 2 हे ultrapure की 800 मिलीलीटर जोड़ें
- 400 मिमी NaCl
- चार 27 मिमी MgSO
- MgCl 2 28 मिमी
- एल Glutamine 4 मिमी
- Gentamicin 50 μg मिलीलीटर /
- HEPES 5 मिमी
- 7.9 पीएच को समायोजित करें
- CaCl 2 9.3 मिमी ड्रॉप द्वारा ड्रॉप जोड़ें (रोक precipitates)
- 1 एल एच 2 हे ultrapure जोड़ें
- Osmometer (भाप दबाव, Wescor +५५२० #) के साथ osmolarity (950-1000 mmol / किग्रा) की जाँच करें
- फ़िल्टर 0.22 एक सकारात्मक दबाव निस्पंदन इकाई (Millipore SVGV010RS फिल्टर) का उपयोग सुक्ष्ममापी
- 4 ° C में 1 महीने के लिए स्टोर
- पाली - एल lysine (70-150 केडी) 200 समाधान बाँझ एच 2 हे ultrapure में μg / मिलीलीटर शेयर -20 ओ सी में रखा
- 0.5 एम MgCl 2 समाधान
दिन 1: Aplysia पेट नाड़ीग्रन्थि के विच्छेदन
Enzymatic पृथक्करण समाधान की तैयारी
- एक Eppendorf ट्यूब में: Dispase एंजाइम (LS02111 Worthington, कैट) के 9-10 मिलीग्राम वजन
- L15 ASW संस्कृति माध्यम से 900 μl, और बाँझ एच 2 हे ultrapure के 100 μl जोड़ें
- और कमरे के तापमान (आर टी) पर मिक्स जगह
पेट नाड़ीग्रन्थि के विच्छेदन
- 0.5 एम MgCl 2 समाधान के साथ एक 50 मिलीलीटर सिरिंज भरें .
- टैंक से एक जानवर ले लो, धीरे संभाल करने के लिए पशु की भनक रक्षा प्रतिक्रिया से बचने के.
- सही, दुम पक्ष के लिए छोड़ दिया करने के लिए एक विच्छेदन बोर्ड पर अपने पक्ष पर Aplysia (स्टायरोफोम बोर्ड), व्याख्यान चबूतरे वाला पक्ष रखें .
- जानवरों में सिर के पीछे सिर्फ सुई और सम्मिलित शरीर गुहा में सभी MgCl 2 समाधान इंजेक्षन.
- धीरे रगड़ पशु शरीर गुहा भर MgCl 2 समाधान फैलाने, पशुओं के लिए एक कुछ मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए पूरी तरह से anaesthetized हो.
- विच्छेदन बोर्ड के दो सुइयों के साथ और जानवर के सिर और पूंछ पिन.
- त्वचा लिफ्ट, त्वचा और सिर और पूंछ की ओर बड़ी कैंची के साथ पेशी परत के माध्यम से कटौती करने के लिए पक्ष पर एक बड़े खोलने बनाने संदंश का प्रयोग करें.
- ब्रश की तरह अंडाशय के तहत पेट नाड़ीग्रन्थि का पता लगाएं. संदंश का प्रयोग पेट नाड़ीग्रन्थि के सामने में 1 सेमी के बारे में जोड़ने नसों को पकड़, संदंश धारण की स्थिति के सामने और पेट नाड़ीग्रन्थि के पीछे विच्छेदन कैंची के साथ नसों में कटौती.
- Dispase समाधान में और 22 पर 15-16 घंटे के लिए सेते प्लेस नाड़ीग्रन्थि डिग्री सेल्सियस तापमान नियंत्रित एक पानी स्नान का उपयोग कर.
2 दिन: Aplysia बैग कोशिकाओं के चढ़ाना
पाली lysine लेपित coverslips तैयारी
- बेंच में एक प्रवाह, नाड़ीग्रन्थि के विच्छेदन के लिए व्यंजन काम कर के रूप में तीन 35 मिमी पेट्री व्यंजन तैयार करते हैं, उन्हें चार मिलीलीटर l15-ASW मध्यम प्रत्येक के साथ भरने. Dispase समाधान से पाचन की 15.5 घंटे काम करने के बाद बर्तन के लिए पेट नाड़ीग्रन्थि स्थानांतरण.
- का प्रयोग संदंश ले एसिड साफ 1.5 # coverslips (22x22 मिमी) इथेनॉल में संग्रहीत, शराब हटाने और उन्हें Bunsen बर्नर से अधिक संक्षेप ज्वलंत द्वारा coverslips बाँझ. संस्कृति बर्तन में coverslips रखने से पहले उन्हें संक्षेप में शांत करते हैं.
- Bunsen बर्नर पर एक पीले रंग की टिप (लौ केवल संक्षेप में प्लास्टिक के पिघलने से बचने के लिए!) झुकने से एक घुमावदार चढ़ाना टिप तैयार.
- 200 / बाँझ एच 2 हे ultrapure साथ मिलीलीटर शेयर समाधान μg गिराए द्वारा 20 μg / एमएल पाली lysine समाधान के उचित मात्रा में तैयार करें.
- 20 μg / पाली - lysine मिलीलीटर और आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते के 500 μl के साथ प्रत्येक coverslip को कवर.
- 500 μl बाँझ एच 2 हे प्रत्येक ultrapure के साथ प्रत्येक coverslip 3-5 बार धोएं .
- Coverslips से पानी निकालें, l15 ASW संस्कृति मध्यम के 4 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक पकवान भरने.
हदबंदी के बैग कोशिकाओं
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, आधा का उपयोग कर विच्छेदन कैंची और संदंश पहले 95% इथेनॉल (चित्रा 1 पंक्ति 1) के साथ साफ में पेट नाड़ीग्रन्थि काटा.
- नाड़ीग्रन्थि, बैग सेल क्लस्टर और hemiganglion कोशिकाओं (चित्रा 1 पंक्ति 2) के बीच में कटौती, और दूर बैग कोशिकाओं के दूसरे पक्ष पर शेष तंत्रिका एक्सटेंशन (चित्रा 1 पंक्ति 3) में कटौती के एक आधे में. एक समय में नाड़ीग्रन्थि के एक आधे पर काम, पकवान में दूसरे आधे छोड़ जबकि पहली क्लस्टर से कोशिकाओं मढ़वाया किया जा रहा है.
- दो (या एक संदंश और विच्छेदन कैंची) संदंश, अलग संयोजी ऊतक बैग सेल क्लस्टर आसपास म्यान धकेलने के द्वारा रिलीज बैग सेल क्लस्टर का उपयोग करना. दूर विच्छेदन कैंची के साथ संयोजी ऊतक कट अगर जरूरत है. निचोड़ नहीं है और इस प्रक्रिया के दौरान बहुत ज्यादा बैग सेल क्लस्टर स्पर्श खबरदार.
- जब संयोजी ऊतक के सबसे निकाल दिया जाता है, ख हस्तांतरणएजी तुला पीले टिप के साथ एक नया काम डिश में सेल क्लस्टर पहले तैयार. सावधान रहो, नहीं होने बैग सेल क्लस्टर पीले टिप के अंदर फंस हो या हवा / मध्यम इंटरफ़ेस पर अटक.
- पीले रंग के लिए अलग - अलग बैग कोशिकाओं को हटाने के टिप के साथ क्लस्टर Triturate. और टिप के बाहर क्लस्टर pipetting द्वारा इस करो. कम कतरनी बलों के साथ आरंभ और बल में वृद्धि के रूप में की जरूरत है. हमेशा सबसे कम करने के लिए भी कई कोशिकाओं को मारने के बिना न्यूरॉन्स को निकालने की जरूरत बल का उपयोग करें.
- 3-5 कोशिकाओं को स्वस्थ बैग ले लीजिए और coverslip पाली lysine में लिपटे के साथ एक डिश के लिए उन्हें हस्तांतरण. मृत कोशिकाओं (वे काला / केंद्र में पारदर्शी होते हैं) और संयोजी ऊतक मलबे को उठा से बचें.
- चरण 6 दोहराएँ. और प्रत्येक coverslip के केंद्र में 15-25 रहते न्यूरॉन्स के बारे में जगह है. यदि मृत कोशिकाओं या मलबे के रूप में अच्छी तरह से स्थानांतरित कर रहे हैं, इसे उठा या यह स्वस्थ कोशिकाओं से दूर उड़ाने से अवांछित सामग्री हटा दें. इस प्रक्रिया में दोनों समूहों के लिए के बारे में 2-3 घंटे लगते हैं.
- एकबार समाप्त आरटी पर कम से कम 2 घंटे के लिए प्रवाह बेंच पर संस्कृति व्यंजन रखने के लिए कोशिकाओं की अनुमति देते हैं (प्रवाह बेंच से धौंकनी अवांछित कंपन से बचने रखने).
- एक मशीन में 14 ° सी रातोंरात, या आगे उपयोग तक व्यंजन रखें. ग्रोथ शंकु 40-10 घंटे में विकसित हो सकता है.
चित्रा 1. Aplysia californica पेट नाड़ीग्रन्थि के योजनाबद्ध. रंग लाइनों से संकेत मिलता है जहां बैग सेल समूहों प्राप्त करने में कटौती के लिए.
3 दिन: Aplysia बैग कोशिकाओं के रहते इमेजिंग के लिए कक्ष की स्थापना
इमेजिंग कक्ष की सभा
- जीना सेल इमेजिंग प्रयोगों के लिए बैग की कोशिकाओं का उपयोग करने से पहले, एक कम शक्ति सूक्ष्मदर्शी पर कक्षों का निरीक्षण किया. यदि कोशिकाओं के स्वस्थ विकास शंकु विकसित नहीं किया है, आरटी पर ताजा मध्यम और 1-2 घंटे के लिए छोड़ आपूर्ति.
- ताजा l15 ASW मध्यम के साथ प्लेटों की आपूर्ति करने के लिए, एक शून्य रेखा के साथ पुराने माध्यम से आधे (2ml ~) को हटाने, और नए 2 मिलीलीटर l15 ASW पेट्री डिश प्रति मध्यम जोड़ें. यह महत्वपूर्ण है पकवान से सभी मध्यम पूरी तरह से हटाने के एक बार में सभी के रूप में इस coverslip से कोशिकाओं को निकाल देंगे.
- बैग सेल इमेजिंग के लिए, हम एक सैंडविच की तरह इमेजिंग कक्ष में दो coverslips और दो प्लास्टिक spacers इकट्ठा. सैंडविच में शीर्ष coverslip कम कट जाता है मध्यम और अभिकर्मकों के आसान आदान - प्रदान की अनुमति है. विधानसभा के दौरान, बैग जुड़ी कोशिकाओं के साथ coverslips सभी समय l15 ASW मध्यम में डूबे हुए किया जाना चाहिए dislodging से कोशिकाओं को रोकने.
- चैम्बर तैयार करने के लिए, काट ~ हीरे (ग्लास कटर) कलम और शासक के साथ एक # 1 coverslips 22x22 मिमी के दाईं ओर से 2mm.
- 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, कम coverslip के दो पक्षों के लिए उच्च वैक्यूम तेल लागू होते हैं, और प्रत्येक पक्ष प्लास्टिक spacers देते. दोनों spacers के शीर्ष करने के लिए वैक्यूम तेल लागू करें.
- पेट्री coverglass पर बैग की कोशिकाओं से युक्त डिश में coverslip और स्पेसर, विधानसभा, और जगह उलटें. संरेखित करें और धीरे से नीचे प्रेस करने के लिए दो क्यू युक्तियाँ रिवर्स अंत के साथ नीचे coverslip शीर्ष coverslip छड़ी.
- संदंश का प्रयोग, धीरे सैंडविच विधानसभा लिफ्ट से बाहर पेट्री डिश बाहर लीक मध्यम बिना. दो coverslips संरेखित करें, अगर जरूरत है, और Kimwipe के साथ अतिरिक्त मध्यम पोंछ. खुर्दबीन स्लाइड धारक के निचले भाग पर सैंडविच प्लेस और देखभाल के साथ क्लिप का उपयोग कर कवर देते हैं.
- क्यू सुझावों के साथ सैंडविच के ऊपर की ओर केंद्र साफ़ ग्लास क्लीनर (चमक ग्लास क्लीनर के रूप में प्रयोग किया जाता है) में dabbed. जल्दी से एक दूसरे, शुष्क क्यू की नोक के साथ ग्लास क्लीनर लकीर लाइनों से बचने के सूखे. नीचे coverslip के लिए एक ही मत करो. साफ़ लकीर लाइनों से मुक्त coverslips उच्च गुणवत्ता इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं.
खुर्दबीन पर थैला कोशिकाओं
चूंकि Aplysia बैग सेल neuronal संस्कृतियों कम घनत्व पर हैं, यह सबसे अच्छा है अगर आपके खुर्दबीन सेटअप चरण स्थिति कार्यों कोशिकाओं के बीच स्विचन की सुविधा है . थैला कोशिकाओं मंच पर कई घंटे के लिए आसानी से किया जा सकता है आरटी पर इमेजिंग प्रयोगों के दौरान रखा. मध्यम समय - समय पर एक्सचेंज के लिए वाष्पीकरण से बचने के के लिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aplysia बैग सेल न्यूरॉन्स बहुत कुछ गैर neuronal कोशिकाओं के साथ एक सीरम मुक्त neuronal सेल संस्कृति प्रणाली प्रदान करते हैं. इन न्यूरॉन्स बहुत बड़ी महत्वपूर्ण सेल जैविक सवालों का एक नंबर का पता करने के लिए उपयुक्त के विकास शंकु के रूप में. थैला सेल न्यूरॉन्स आसानी से और छेड़छाड़ कर सकते हैं कई घंटे से अधिक कमरे के तापमान पर imaged. फ्लोरोसेंट का प्रयोग माइक्रोस्कोपी (FSM) धब्बा एक मात्रात्मक एफ actin और microtubule polymerization और स्थानान्तरण गतिशीलता के विभिन्न मापदंडों का विश्लेषण कर सकते हैं. हाल ही में जारी Aplysia जीनोम के रूप में अच्छी तरह के रूप में जानकारी अभिव्यक्ति में सुधार तकनीक के साथ इन इमेजिंग उपकरण एक साथ neuronal विकास शंकु गतिशीलता और मार्गदर्शन की आणविक और सेलुलर तंत्र के अध्ययन के लिए इन न्यूरॉन्स एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली बनाते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
हम विच्छेदन वीडियो संपादन के साथ सहायता के लिए हमारे प्रक्रिया और रॉडने McPhail (जीव विज्ञान विभाग, पर्ड्यू विश्वविद्यालय) फिल्माने के लिए रयान Maneri (Oystercatcher प्रोडक्शंस, LLC) धन्यवाद देना चाहूंगा. Suter प्रयोगशाला में अनुसंधान डीएमएस (NS049233 R01) NIH और पर्ड्यू विश्वविद्यालय में Bindley Bioscience केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित है
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 glass coverslips 22x22 mm | Tool | VWR international | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22x22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington Biochemical | LS02111 |
References
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
