Summary
Aplysia californica nervceller utvecklar stora tillväxten tappar i kulturen som är utmärkta för högupplöst avbildning av tillväxt konen motilitet och vägledning. Här presenterar vi ett protokoll för dissekering och plätering av Aplysia nervceller påse cell samt för att inrätta en avdelning för levande cell imaging.
Abstract
Neuronal tillväxt kottar är de mycket rörliga strukturer på spetsen av axoner som kan upptäcka vägledning ledtrådar i miljön och transduce denna information i riktad rörelse mot rätt målcellen. För att helt förstå hur vägledning information överförs från cellytan till den underliggande dynamiska cytoskelettala nätverk, behöver man en modell som passar för levande cell imaging av protein dynamik med hög temporal och spatial upplösning. Typiska ryggradsdjur tillväxt kottar är för små för att kvantitativt analysera F-aktin och dynamik mikrotubuli. Nervceller från havet haren Aplysia californica är 5-10 gånger större än ryggradsdjur nervceller, kan lätt förvaras i rumstemperatur och är mycket robusta celler för mikromanipulation och biofysiska mätningar. Deras tillväxt kottar har mycket definierat cytoplasmiska regioner och en väl beskrivna cytoskelettala systemet. Den neuronala celler kroppar kan idag injiceras med olika prober för att studera motilitet tillväxt konen och vägledning. I det nuvarande protokollet visar vi ett förfarande för dissekering av buken ganglion, kultur av nervceller påse cell och inrätta en avbildning kammare för levande cell imaging av tillväxt kottar.
Protocol
Lösningar
- L15-ASW cellkulturmedium (1l)
- 1 påse L15 pulver
- lägga 800 ml H 2 O ultrarent
- NaCl 400 mM
- MgSO fyra 27 mm
- MgCl 2 28 mM
- L-Glutamin 4 mm
- Gentamicin 50 mikrogram / ml
- HEPES 5 mM
- Justera till ph 7,9
- Tillsätt droppvis CaCl 2 9,3 mm (stopp om fällningar)
- Lägg till H 2 O ultrarent till 1 l
- Kontrollera osmolaritet (950-1000 mmol / kg) med osmometer (ångtryck Wescor # 5520)
- Filtrera 0,22 ìm hjälp av ett positivt enhet tryck filtrering (Filter: Millipore SVGV010RS)
- Förvaras vid 4 ° C upp till 1 månad
- Poly-L-lysin (70-150 kD) 200 mikrogram / ml stamlösning i sterila H 2 O ultrarent förvaras vid -20 ° C
- 0,5 M MgCl 2-lösning
Dag 1: dissekering av Aplysia buken ganglion
Beredning av enzymatisk dissociation lösningen
- Väg 9-10 mg Dispase enzym (Worthington, Cat: LS02111) i ett Eppendorf-rör
- Tillsätt 900 ìl L15-ASW odlingsmedium och 100 l av sterila H 2 O ultrarent
- Blanda och placera i rumstemperatur (RT)
Dissekering av buken ganglion
- Fyll en 50 ml spruta med 0,5 M MgCl 2-lösning.
- Ta ett djur från tank, hantera varsamt för att undvika att djur svar inking försvar.
- Placera Aplysia på sin sida om en dissekering ombord (frigolit board), rostralt sidan till höger, caudal sida till vänster.
- Stick in nålen i djuret strax bakom huvudet och injicera all MgCl 2-lösning i kroppen hålighet.
- Försiktigt gnugga djuret för att skingra MgCl 2-lösning i hela kroppen hålighet, vänta några minuter för djuret att vara helt nedsövd.
- Nåla fast huvudet och svansen på djuret till dissekering styrelse med två nålar.
- Använd pincett för att lyfta huden, skär genom hud och muskler skikt med stora saxen mot huvud och svans för att göra en stor öppning på sidan.
- Hitta buken ganglion under penseln-liknande äggstock. Använd pincett för att hålla den anslutande nerver ungefär 1 cm framför buken ganglion, klipp nerver med dissektion sax framför pincett att hålla positionen och bakom buken ganglion.
- Placera ganglion i Dispase lösning och inkubera under 15-16 timmar vid 22 ° C med en tempererad vattenbad.
Dag 2: Plätering av Aplysia väska celler
Förbereda poly-lysin-belagda täckglas
- I ett flöde bänk, förbereda tre 35mm petriskålar som arbetstid rätter för dissekering av ganglion, fylla dem med 4 ml L15-ASW medelstora vardera. Överför buken ganglion från dispase lösningen på ett av den arbetsföra disken efter 15,5 timmars matsmältning.
- Använd pincett tar syra-rengörs # 1,5 täckglas (22x22 mm) som lagras i etanol, ta bort alkohol och sterilisera täckglas genom flambering dem en kort stund över bunsenbrännare. Låt dem snabbt svalna innan du placerar täckglasen i kultur rätter.
- Förbered en böjd plätering spets genom att böja en gul spets över Bunsenbrännare (flamma endast kort för att undvika smältande plast!).
- Förbereda lämpliga belopp på 20 mikrogram / ml poly-lysin lösning genom att späda 200 mikrogram / ml stamlösning med steril H 2 O ultrarent.
- Täck varje täckglas med 500 l på 20 mikrogram / ml poly-lysin och inkubera i 20 minuter vid RT.
- Tvätta varje täckglas 3-5 gånger med 500 l steril H 2 O ultrarent vardera.
- Ta bort vattnet från täckglas, fyll varje maträtt med 4 ml L15-ASW odlingsmedium.
Dissociation av väska celler
- Enligt en dissektion mikroskop, skär i buken ganglion i hälften med hjälp av dissektion sax och pincett tidigare rengjorts med 95% etanol (figur 1 linje 1).
- På ena halvan av ganglion, snitt mellan påse cell kluster och cellerna hemiganglion (figur 1 linje 2) och klippa bort resterande nerv förlängningar på andra sidan av väskan celler (Figur 1 rad 3). Arbetet med en halv av ganglion i taget, lämna den andra hälften i skålen medan cellerna från första kluster är under pläterade.
- Med hjälp av två pincett (eller en pincett och sax dissektion), släpp väskan cell kluster genom att trycka undan bindväven slida kring klustret väskan cellen. Klipp bort bindväv med dissektion sax vid behov. Akta dig att inte pressa och röra klustret väskan cellen för mycket under denna process.
- När de flesta av bindväv tas bort, överlåta Bag cell kluster i en ny arbetsgrupp rätt med den böjda gula spetsen förberett tidigare. Var försiktig så att påsen cellen klustret vara instängd i den gula spets eller fastnat på luft / medium gränssnitt.
- Mal sönder kluster med gula spetsen för att ta bort enskild påse celler. Gör detta genom att pipettera klustret in och ut i spetsen. Börja med låga skjuvkrafter och öka kraft som behövs. Använd alltid den lägsta kraft som behövs för att ta bort nervceller utan att döda alltför många celler.
- Samla 3-5 friska väska celler och överföra dem till ett fat med en poly-lysin-belagda täckglas. Undvik att plocka upp döda celler (de är svart / transparent i mitten) och bindväv skräp.
- Upprepa steg 6. och placera ca 15-25 leva nervceller i mitten av varje täckglas. Om döda celler eller skräp överförs också, ta bort oönskat material genom att plocka upp den eller blåser den bort från friska celler. Denna process tar ca 2-3 timmar för både kluster.
- När slutade hålla kulturen rätter på flödet bänken i minst 2 timmar vid RT att låta celler att fästa (hålla flödet bänk fläkt av för att undvika oönskade vibrationer).
- Placera diskgodset i en inkubator vid 14 ° C över natten, eller tills vidare användning. Tillväxt koner kan utvecklas på 40-10 timmar.
Figur 1. Schematisk bild av Aplysia californica buken ganglion. Färg linjer indikerar var att klippa för att få kluster påse cell.
Dag 3: Ställa in kammare för live-avbildning av Aplysia väska celler
Montering av imaging kammare
- Innan du använder påse celler för live experiment cell imaging, inspektera celler på en låg effekt mikroskop. Om cellerna inte har utvecklat en sund tillväxt kottar, leverans färska medium och lämna vid RT i 1-2 timmar.
- Att leverera plattor med färska L15-ASW medium, ta bort hälften (~ 2 ml) av gamla medium med ett vakuum linje, och tillsätt 2 ml av nya L15-ASW medel per petriskål. Det är viktigt att inte helt ta bort alla medel från skålen på en gång, eftersom detta kommer att ta bort celler från täckglas.
- För påse cell imaging, monterar vi två täckglas och två plastdistanser i en sandwich-liknande avbildning kammare. Den översta täckglas i smörgåsen klipps kortare för att enkelt kunna utbyta medium och reagenser. Vid montering bör täckglas med väska bifogade celler nedsänkt i L15-ASW medelstora hela tiden för att förhindra att celler från lossnar.
- För att förbereda kammaren, avskurna ~ 2mm från höger sida av en # 1 täckglas 22x22 mm med diamant penna (glas fräs) och linjalen.
- Använd en 1 ml spruta, tillämpa höga vakuum fett på båda sidor av kortare täckglas och bifoga plastdistanser på varje sida. Applicera vakuum fett till toppen av bägge distanser.
- Vänd täckglas och spacer montering, och placera i petriskål som innehåller väska celler på ett coverglass. Justera och tryck försiktigt ner att hålla upp täckglas och ner täckglas med omvänd slutet av två Q-tips.
- Använd pincett, lyft försiktigt smörgås montering ur petriskål utan mediet läcka ut. Rikta in två täckglas, om det behövs och torka bort överflödigt medel med ett Kimwipe. Placera smörgås på den nedre delen av objektglas hållaren och fäst locket med omsorg med hjälp av clips.
- Rengör mitten av ovansidan av smörgås med Q-tips dabbed i rengöringsmedel för glas (Sparkle används som rengöringsmedel för glas). Snabbt torka bort fönsterputsmedel med en andra, torr tops för att undvika strimmig linjer. Gör samma sak för den undre täckglas. Rengör täckglas utan strimma linjer är viktiga för högkvalitativa bilder.
Bag cellerna i mikroskop
Sedan Aplysia påse cell neuronala kulturer är låg densitet, är det bäst om din mikroskop inställning har funktioner skede positionering för att underlätta växling mellan celler. Bag celler kan lätt hållas vid RT i flera timmar på scenen under avbildning experiment. Börsen på medellång regelbundet för att undvika avdunstning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aplysia påse cell neuroner ger en serumfritt neuronala system för cellodling med väldigt få icke-neuronala celler. Dessa nervceller bildar mycket stora tillväxten kottar lämpligt att ta upp ett antal viktiga cellbiologiska frågor. Bag cell nervceller kan lätt manipuleras och avbildade i rumstemperatur under flera timmar. Med fluorescerande Speckle Mikroskopi (FSM) ett kvantitativt kan analysera de olika parametrarna för F-aktin och mikrotubuli polymerisering och dynamik translokation. Dessa bildframställning tillsammans med den nyligen släppta Aplysia genetisk information samt förbättrade tekniker uttryck gör dessa nervceller en kraftfull modell för att studera molekylära och cellulära mekanismer av neuronala tillväxt konen motilitet och vägledning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka Ryan Barkot (Strandskata Productions, LLC) för filmning vårt förfarande och Rodney McPhail (Institutionen för Biological Sciences, Purdue University) för hjälp med redigering av dissektion videon. Forskning i Suter labbet stöds av anslag från NIH (R01 NS049233) och Bindley Bioscience Center vid Purdue University till DMS
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 glass coverslips 22x22 mm | Tool | VWR international | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22x22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington Biochemical | LS02111 |
References
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
